PRACTICA No. 1

“RECUENTO DE ORGANISMOS MESOFíLICOS AEROBIOS”

INTRODUCCIÓN

Dentro de nuestra legislación, el asegurar la calidad microbiológica de los alimentos es de esencial importancia, ya que éstos, por sus condiciones de elaboración y manejo, pueden convertirse en vectores de enfermedades causadas por microorganismos patógenos. La NOM-092-SSA1-1994 establece la metodología para el recuento de microorganismos mesofílicos aerobios y así, evaluar de alguna manera la inocuidad de un alimento. Esta técnica es de utilidad en productos fresco-enfriados, congelados, precocidos o alimentos preparados.

En realidad esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxígeno disponible, etc. hacen que el número de colonias contadas constituyan una estimación de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado.

Cuando la temperatura de incubación ha sido entre los 20 y los 37°C se le designa como organismos mesofílicos aerobios, cuenta total viable, cuenta estándar en placa viable general, cuenta total aeróbica o cuenta en placa aeróbica.

Al grupo de organismos mesofílicos aeróbicos pertenece una gran variedad de microorganismos, de hecho, están incluidos todos aquellos microorganismos capaces de desarrollar entre 20 y 37°C, que son los extremos de las temperaturas a las cuales suele realizarse este recuento, en condiciones de aerobiosis.

Dentro de la flora mesofílica aerobia tenemos bacilos, cocos, gram positivos y gram negativo, aislados o agrupados en todas las variedades que nos son familiares.

La utilidad de las bacterias mesofílicas aerobias en la microbiología sanitaria se ha recomendado para los siguientes objetivos:

o Como indicador de la posible presencia de microorganismos patógenos.o Como indicador del valor comercial de un alimento.o Como indicador de la idoneidad de un ingrediente cuando se va a incorporar a un

alimento.o Para seguir la eficiencia de un proceso germicida o de preservación.o Para predecir la vida de anaquel de un alimento.

El recuento de mesofílicos aerobios presenta limitaciones que deben tenerse en cuenta:

o En alimentos madurados se recurre a la adición de microorganismos, por lo que impide que puedan ser considerados como grupo indicador en estos procesos.

o En alimentos desecados los microorganismos pierden viabilidad, por lo tanto no se puede referir su número al momento en que fue envasado en la planta.

o La presencia de inhibidores en el producto.o Sólo una pequeña porción del alimento es analizada.o La técnica sólo pone de manifiesto las bacterias viables, por lo que, no puede

saberse con certeza las posibles violaciones en el manejo de los alimentos previas a un tratamiento térmico o de otra forma destruir microorganismos.

Principio base del método.

El método se basa en incubar en agar de recuento en placa, a 35ºC y durante 48 hrs., volúmenes medidos de diferentes diluciones de la muestra, y contar el número de colonias producidas para determinar el número de gérmenes viables o unidades formadoras de colonias por gramo de muestra.

OBJETIVO

Comprender el procedimiento de análisis en la determinación de la cuenta total de bacterias mesofílicas en alimentos, para evaluar su calidad microbiológica.

REQUERIMIENTOS PARA LA PRÁCTICABasados en la NOM-092-SSA1-1994

(Por equipo)MATERIALES

1 Agitador de vidrio Algodón5 Pipetas de 1 ml estériles Papel aluminio3 Pipetas de 5 ml estériles Cerillos o encendedor3 Pipetas de 10 ml estériles Cubre bocas desechables1 Termómetros de 20 – 150ºC Marcador permanente punto fino1 Vaso de vidrio para licuadora 250 ml1 Pinzas para Matraz Erlenmeyer1 Espátula6 Placas petrifilm para recuento de aeróbicos1 Aplicador para placa petrifilm1 Frasco de dilución

REACTIVOS EQUIPOAgua destilada 1 Potenciómetro calibradoFenol 5% o trifeniltetrazolio acuoso 1% 1 Balanza con sensibilidad de

0.01 gBuffer pH 4, 7, 10 1 AutoclaveNaOH 0.1N 1 Baño maríaHCl 0.1N 1 Estufa de cultivosAgua destilada estéril 1 Cuentacolonias de campo

oscuro 2 Mecheros Fisher

PROCEDIMIENTO

a) Preparación de la muestra.

Asépticamente pesar 10 g. de muestra y diluir en 90 ml. de agua peptonada al 0.1% (o agua destilada estéril) .Homogenizar la mezcla por trituración en un vaso esterilizado de licuadora durante 60-90 segundos.

b) Diluciones.

Según el número de gérmenes esperado y sobre la base de la solución inicial de 10 g. en 90 ml. (dilución 10-1), preparar diluciones decimales de 10-2, 10-3, 10-4, usando pipetas estériles para cada dilución, tomando 1 ml. de la solución anterior en 9 ml. de agua peptonada al 0.1% (o agua destilada estéril), evitando se forme espuma. Mezclar manualmente cada dilución agitándola 25 veces en 7 segundos con movimientos ascendentes y descendentes formando un ángulo de abertura aproximado de 60º entre brazo y antebrazo.

c) Técnica.

Colocar la placa petrifilm en una superficie plana. Levantar el film superior.

Con una pipeta perpendicular a la placa petrifilm colocar 1 ml de muestra en el centro del film interior.

Bajar el film superior; dejar que caiga. NO deslizarlo hacia abajo.

Con la cara lisa hacia arriba, colocar el aplicador en el film superior sobre el inóculo.

Con cuidado ejercer una presión sobre el aplicador para repartir el inóculo sobre el área circular. NO girar ni deslizar el aplicador.

Levantar el aplicador. Esperar un minuto a que solidifique el gel.

Incubar las placas petrifilm cara arriba en pilas de hasta 20 placas, a 35 2°C durante 48 2 hrs.

Leer las placas en un contador de colonias estándar o una fuente de luz con aumento.

NOTAS: Para realizar el

contaje, se toman las placas que presenten entre 30 y 300 colonias.

Recordar inocular y poner el aplicador antes de pasar a la siguiente placa.

El cálculo del valor promedio del número de unidades formadoras de colonias por gramo de muestra se efectúa multiplicando el número de colonias contadas en cada dilución de las placas seleccionadas (valor C), por el factor de dilución correspondiente (valor D).

Obtener el valor del recuento total de gérmenes expresado de la siguiente manera:

N= C x Ddonde: N= Unidades formadoras de colonia por gramo de muestra.

C= Número de colonias.D= Factor de dilución.

BIBLIOGRAFÍA

AMADOR, L. R. y otros. 1993. Manual de laboratorio de microbiología sanitaria. 2 da. edición. Instituto Politécnico Nacional. México

FERNÁNDEZ, E. E. 1981. Microbiología sanitaria, agua y alimentos. Vol. I. Universidad de Guadalajara. ANUIES-SEP. México

SSA. 1979. Técnicas generales para análisis microbiológico de alimentos. México.

http://www.ssa.gob.mx/nom/092ssa14.html

ANEXOS

Agua Peptonada para Dilución:Peptona 1 gAgua destilada 1 lt

Disolver la peptona en un litro de agua destilada ajustando el pH a 6.8 0.1 y esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 a 20 minutos.