_práctica guia

Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. Blgo.M.Sc., Rafael La Rosa, Blgo.Mag.

Universidad Nacional Mayor de San Marcos(Universidad del Perú, Decana de América)

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICASDEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BOTÁNICA

Laboratorio de Fisiología Vegetal

GUÍA DE PRÁCTICAS DELCURSO

FISIOLOGIA VEGETAL

AUTOR:

Mery L. Suni Ninataype, Blga. Mág.

Rafael La Rosa Loli, Blgo. Mág.

SEMESTRE 2013-I

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CONTENIDO

PRÁCTICA TEMA PÁG.

Práctica 1. Absorción de microelementos

Práctica 2. Potencial hídrico foliar

Práctica 3. Densidad de estomas y estado hídrico foliar

Práctica 4.Medición de la tasa de fotosíntesis (Uso del IRGA)

Evaluación en campo

Práctica 5. Contenido de clorofila en la hoja

Práctica 6.Evaluación de la maduración de los órganos

reproductivos

Práctica 7.Interacción de ABA y AG3 en la germinación de semillas.

Instalación

Práctica 8. Embriogénesis somática en zanahoria. Instalación

Práctica 9. Inducción de raíces

Práctica 10.Calidad de la luz y la regulación de la germinación.

Instalación

2


PRÁCTICA 1. ABSORCIÓN DE MICROELEMENTOS

INTRODUCCIÓN.-

El desarrollo y el crecimiento óptimo de la planta dependen de la presencia en

la cantidad necesaria de los elementos minerales esenciales. Por lo tanto el

aporte insuficiente o en exceso de un elemento dará lugar a síntomas muchas

veces apreciable a simple vista. Por otra parte, se conoce que Limnobium

laevigatum, planta acuática perenne con hojas simples, cuando es mantenida

en condiciones adecuadas, posee una rápida multiplicación incrementando su

biomasa en pocos días. Estas características además de su fácil manejo hacen

de Limnobium laevigatum un material ideal para la evaluación de síntomas de

deficiencia y toxicidad. Además dado que es posible encontrar ambientes con

contenido de minerales alto pudiendo las plantas de dichos lugares mostrar

sensibilidad o tolerancia en la presente práctica se desea evaluar la respuesta

de Limnobium laevigatum a condiciones de niveles altos de cobre.

OBJETIVO.-

Evaluar el efecto de niveles altos de cobre en el crecimiento de Limnobium

laevigatum

MATERIAL.-

Soluciones hidropónicas

1 balde de 4L para las soluciones conteniendo 0,1 y 10 ppm de sulfato de Cu

6 recipientes de plástico de 500 mL

Balanza, pHmetro y conductímetro

Pipeta 10 mL

Probeta 1000 mL

Buffer de calibración para pHmetro de 7 y 10

Placas petri

Plantas de Limnobium laevigatum por cada recipiente plástico

Kit para la cuantificación de cobre

4 baterías SP357/1.55 V para pHmetro y conductímetro

Papel toalla

3


MÉTODO.-

En el presente experimento se evaluará un factor, la concentración de cobre y

se tendrá 2 tratamientos, uno con nivel alto y otro con nivel óptimo de cobre,

ambos con niveles óptimos de los demás elementos. Tendrán 3 repeticiones

cada tratamiento (Tabla 2.1).

1. Preparación de las Soluciones:

Preparar un volumen suficiente de las soluciones a fin de tener 3

repeticiones de cada tratamiento, diluyendo las soluciones como se le

indique. Se usará el agua de caño como disolvente. Añadir sulfato de cobre

al tratamiento correspondiente en cantidad q brinde los ppm de Cu a evaluar.

2. Instalación del experimento:

Vaciar 0.8 L de solución a cada reciente plástico, según tratamiento de Cu.

Rotularlos indicando tratamiento, repetición y fecha de instalación. Añadir

una cantidad (tres individuos de Limnobium laevigatum) a cada recipiente,

registrar sus pesos

3. Mantenimiento:

Tanto al inicio como al término del experimento retirar un volumen apropiado

de la solución y determinar la cantidad de cobre presente en cada

tratamiento. Igualmente evaluar el pH y conductividad eléctrica (c.e.) al inicio

y término del experimento. Realizar los ajustes de pH en caso necesario.

Mantener el pH en 6,5 o menos y la c.e. en valores menores de 3. Registre

sus datos en una ficha.

4. Evaluación:

Registre los pesos de la muestra de Limnobium laevigatum al inicio y

término del experimento en la Ficha de registro. Evalúe el color, número de

hojas, senescencia de las hojitas y longitud de sus raíces

RESULTADO.-

1. Presente la Ficha de registro de datos y una Tabla con los promedios de

los datos, organizados.

2. Analizar estadísticamente sus resultados y graficar los promedios

mediante barras o líneas donde se pueda observar las diferencias

estadísticas entre los tratamientos.

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TABLA 2.1. Tratamientos a aplicar y valores de concentración de Cu

presentes en las soluciones tratamiento según el kit

FICHA DE REGISTRO DE DATOS. Evalúe al inicio y término de su

experimento las variables abajo indicadas. Registre sus datos.

0,1 ppm Cu 3,5 ppm CuTiempo To

Repetición Long raíz Pf

Nº frondas verdes,

senescentes o cloróticas Long raíz Pf

Nº frondas verdes,

senescentes o cloróticas

1

2

3 Promedio

Tiempo T1

1

2

3 Promedio

Tratamiento Cu (ppm)

Calculado

(ppm)

Concent.

inicial

(kit)

Concent.

final

(kit)

Cobre alto 10,0

Cobre óptimo 0,1

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PRÁCTICA 2. DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL HÍDRICO FOLIAR

INTRODUCCIÓN.-

Las plantas desempeñan un papel importante en el movimiento del agua en la

naturaleza y son el eslabón intermedio en el flujo del agua desde el suelo a la

atmósfera.

El cuerpo de las plantas está constituido, al menos, por un 70% de agua. Para

que un vegetal esté fisiológicamente activo precisa, entre otras condiciones, de

un balance hídrico favorable. La tendencia del agua a ser retenida por un

vegetal es la propiedad más importante para conocer los movimientos del agua

en el sistema suelo-planta/atmósfera.

El agua siempre se moverá, de manera pasiva hacia los lugares del sistema,

en donde el potencial hídrico (Ψ) sea más bajo, y sus unidades son el

megapascal (Mpa), el bar o la atmósfera. Por otro lado, el estado hídrico de la

planta influye fuertemente en su crecimiento y en la producción de biomasa.

Inclusive la tasa de fotosíntesis declinará bajo estrés hídrico debido al cierre de

los estomas.

OBJETIVO.-

Determinar el potencial hídrico foliar en plantas sometidas a condiciones de

déficit hídrico.

MATERIALES.-

Tubos con tapa

Sacabocados

48 Placas petri

10 Frascos Erlenmeyer

Soluciones de sacarosa 0.8m

10 Pipetas 10 mL

Balanza analítica y estufa

Área de cultivo

Por cada grupo de trabajo:

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Ramas de una especie vegetal con diferente condición hídrica

(sometidas a déficit hídrico y otras con riego). Este material será

colectado con el (la) profesor(a)

Pinzas de punta fina

1L agua destilada a entregar un día anterior a la práctica

Papel absorbente (toalla de papel)

Etiquetas pequeñas o marcador de tinta indeleble

MÉTODO.-

Determinación del Potencial Hídrico Foliar por el Método Gravimétrico

El potencial hídrico de un tejido vegetal mediante el método del volumen

constante o método gravimétrico, se fundamenta en la variación del peso de un

tejido vegetal debido al flujo de agua.

a) Rotular y preparar en 5 frascos Erlenmeyer, soluciones de sacarosa con

las siguientes concentraciones de 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 y 0.8 molal a partir

de la solución 0.8m. Determinar el volumen a preparar considerando el

número de repeticiones y grupos de trabajo más un pequeño excedente.

b) Con la ayuda de una pipeta retirar 10 ml de sacarosa, de cada

concentración, y verterlo a cada placa petri previamente rotulada.

c) Luego con la ayuda de un sacabocado obtener 25 discos foliares por

cada condición hídrica, y los ponemos en un frasco con tapa, con la

finalidad de evitar la deshidratación de los mismos.

d) Pesar 5 discos de cada condición hídrica para cada concentración de

solución de sacarosa. Estos valores corresponden al peso inicial de

muestra (Po).

e) Introducir los cinco discos, de cada condición hídrica, a cada placa petri

con la concentración de sacarosa correspondiente.

f) Trascurridos 15 minutos, de cada placa petri sacar con una pinza los

discos, secarlos con papel toalla y pesar los discos (P15).

g) En seguida devolver los discos a las placas petri. Repetir este proceso

con cada uno de las placas con las concentraciones restantes, siguiendo

el mismo orden.

8


h) A los 45 minutos repetir este proceso, anotando los pesos y estos serán

(P45).

Dado que las soluciones están a presión atmosférica el potencial de presión

(Ψp) =0. Por lo que el potencial hídrico (Ψ) de la solución depende del potencial

osmótico (Ψs).

El potencial osmótico se calcula a partir de la ecuación de Van Hoff.

Ψs=miRT

m= molalidad

i= constante de ionización del soluto (para sacarosa=1)

R= constante de los gases (0.00831 kg Mpa/`oK mol);

T= temperatura absoluta (oK)= oC+ 273

RESULTADO.-

1. Registre sus datos en una tabla y determine en qué concentración de

sacarosa no ocurre cambio de peso del tejido foliar (Ψh).

2. Grafique el porcentaje de cambio de peso inducido por el potencial de

soluto de las soluciones de sacarosa versus su potencial osmótico.

3. Determine el contenido de hídrico de las hojas según la condición de

estrés y explique.

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Ficha de registro de datos. Determinación del potencial hídrico foliar

Sacarosa

(m)

Repeti

ción

Ψs

(Mpa)

P0 (g) P15 (g) P45(g) ∆(P45 - P0) % Cambio

c/Est s/Est c/Est s/Est c/Est s/Est c/Est s/Est c/Est s/Est

0.4

1

2

3

4

5

Prom.

0.5

1

2

3

4

5

Prom.

0.6

1

2

3

4

5

Prom.

0.7

1

2

3

4

5

Prom.

0.8

1

2

3

4

5

Prom.

10


PRÁCTICA 3. DENSIDAD DE ESTOMAS Y ESTADO HÍDRICO FOLIAR

INTRODUCCIÓN.-

La epidermis posee estomas usualmente más numerosos en el lado abaxial de

la hoja. La epidermis está usualmente cubierta por una capa denominada

cutícula. Esta previene de una excesiva pérdida de agua por transpiración. En

otras plantas, sin embargo, las hojas pueden estar reducidas o aun estar

ausente, como en las xerofitas. Las plantas en sí regulan el intercambio de

gases a través de sus estomas permitiendo el control de las relaciones hídricas

y la asimilación del carbono. Por lo tanto la apertura del estoma refleja un

compromiso entre el requerimiento fotosintético de CO2 y la disponibilidad de

agua.

La cantidad de agua en el vegetal puede ser expresado de diversas maneras.

Todas consideran la medida del peso fresco al momento del muestreo (Pf), el

peso seco (Ps, usualmente a 80°C) y el peso túrgido (Pt) de la muestra. Esta

última medición se obtiene al flotar hojas o secciones de hojas en agua en

condiciones de punto de compensación de la luz hasta que se alcance el peso

constante.

OBJETIVO.-

Comparar la densidad, apertura de los estomas (en el haz y envés) y estado

hídrico de las hojas de una especie vegetal, sometida a dos condiciones de

humedad del suelo.

MATERIAL.-

Ramas foliares de especies sometidas a estrés hídrico y otra a riego normal.

Portaobjetos y cubreobjetos

Goteros, pinza, estilete

Hoja de afeitar y papel lente, esmalte de uñas

Tubos con tapa

Sacabocados

18 Placas Petri

11

http://botanydictionary.org/cuticle.html


06 Pipetas 10 mL

Balanza analítica

Etiquetas para rotulación

Área de incubación

MÉTODO.-

1. Densidad y apertura de los estomas

Sin mover a la hoja de su posición original, aplicar con la ayuda del pincel,

una o dos capas de esmalte en la superficie superior e inferior de una hoja

madura. Permitir que seque. Luego con la ayuda de una pinza de punta

fina, levantar desde un extremo la película que se ha formado y preparar

una lámina para su observación con el microscopio. Reconozca las células

epidérmicas y las de guardia. A 400X contabilice el número de estomas

que observa y expréselo como densidad de estomas (n°estomas/mm2) o

índice estomático [(n°estomas/n°células epidérmicas + n°estomas) * 100].

Asimismo contabilice el número de estomas abiertos y cerrados presentes

en la muestra observada.

2. Contenido relativo de agua

Obtener 5 discos de las hojas de cada condición hídrica con la ayuda del

sacabocados y colocarlos en los tubos con tapa. Pesarlos inmediatamente

(Pf). Colocar los discos en las placas con agua destilada a 20°C por 3

horas en su punto de compensación de la luz. Cumplido el tiempo secar

cuidadosamente entre hojas de papel absorbente y volver a pesar (Pt).

Secar las muestras en la estufa a 70°C hasta peso constante (Ps).

Determine el contenido de agua, contenido relativo de agua, déficit de

saturación de agua, relación peso túrgido-peso seco para los discos según

el tratamiento, en base a las siguientes fórmulas:

Contenido de agua = ((Pf – Ps)/Ps) *100

Contenido relativo de agua (R*) = ((Pf – Ps)/ (Pt – Ps)) * 100

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Déficit de saturación de agua = 100 – R*

Relación peso túrgido- peso seco = Pt/Ps

RESULTADO.-

Esquematice sus observaciones (o edite sus fotografías) indicando el aumento

de la imagen y las características de las estructuras observadas.

Relacione los resultados obtenidos con la especie y el momento de colecta.

Ficha de registro de datos.- Determinación del estado hídrico foliar (una repetición

por cada subgrupo de trabajo)

Repetición Pf Ps Pt Déf sat Pt/Ps Apert

estoma

c/Est

1

2

3

s/Est

1

2

3

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PRÁCTICA 4. MEDICIÓN DE LA TASA DE FOTOSÍNTESIS

INTRODUCCIÓN.-

El crecimiento de un vegetal es explicado en última instancia por la Tasa

Fotosintética (o Fotosíntesis Neta) que se expresa como la cantidad de CO2

que fija la planta por unidad de área foliar y de tiempo, y se define como la

cantidad neta de carbono (descontando la respiración) que se incorpora al

vegetal en un momento dado, esto es:

Fotosíntesis neta = fotosíntesis - respiración - fotorrespiración

El dióxido de carbono atmosférico difunde a los espacios intercelulares de la

hoja a través de los estomas, mientras estos están abiertos, igualmente el

vapor de agua puede difundir fácilmente de los tejidos vegetales internos que

se encuentran turgentes hacia el exterior (transpiración). El Analizador de

Gases Infrarrojo (IRGA) permite la medición de ambos. Se basa en la

propiedad de ambos gases de absorber luz infrarroja de manera proporcional a

su concentración. Debido a que ambos gases presentan picos de absorción en

el espectro infrarrojo en zonas próximas o solapadas, el equipo incorpora filtros

específicos al evaluar las concentraciones de cada uno. La cuantificación

considera un gas de referencia de concentración conocida.

Los componentes básicos del IRGA son: la cámara foliar y una consola con

teclado, pantalla y memoria (figura 1). Los "sistemas abiertos" modernos de

fotosíntesis también incorporan un cilindro de gas comprimido pequeño y

tuberías de suministro de gas. Esto es porque el aire exterior tiene

fluctuaciones naturales en el contenido de CO2 y vapor de agua, lo que puede

introducir “ruido” de medición. Los modernos "sistemas abiertos" de fotosíntesis

eliminan el CO2 y el vapor de agua por el paso a través de cal sodada (soda

lime) y Silica Gel o Drierite, luego añade CO2 a una velocidad controlada para

obtener una concentración estable de CO2, de tal manera que cuantifica la

diferencia de concentraciones en CO2 y vapor de agua en el aire entre la

entrada y salida de la cámara.

Algunos sistemas cuentan con control de temperatura y una unidad extraíble de

luz, por lo que también se puede medir el efecto de estas variables

ambientales. La consola puede tener una ranura para tarjetas PC. Los datos

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almacenados pueden verse en la pantalla LCD, o enviados a un PC. Algunos

sistemas de fotosíntesis permiten la comunicación por internet usando

protocolos estándar de comunicación de internet.

El IRGA contiene en la cámara foliar (figura 2) una fuente de radiación infrarroja

de bajo voltaje que usualmente es una espiral de aleación níquel-cromo o

tungsteno que se calienta a aproximadamente a 800 ºC; (2) una celda de

análisis de gas con una entrada y una salida de gases a través de la cual pasa

el haz de radiación infrarroja, y (3) un detector de radiación infraroja de estado

sólido hace pasar el flujo que atravesó la cámara con la muestra y el flujo de

referencia alternadamente a través de la celda de análisis por períodos de 2

segundos cada uno. La radiación infrarroja que atraviesa la celda es filtrada

siendo finalmente la señal incrementada y almacenada. Una bomba interna en

el instrumento hace pasar el flujo que atravesó la cámara con la muestra y el

flujo de referencia alternadamente a través de la celda de análisis por períodos

de 2 segundos cada uno. Posteriormente es comparada con la señal recibida

en ciclos posteriores y en función de las diferencias entre muestra y referencias

se calculan las variables de interés.

Modernos sistemas fotosintéticos también pueden ser diseñados para medir la

temperatura de las hojas, temperatura de aire de la cámara, PAR (radiación

fotosintéticamente activa), y presión atmosférica. Estos sistemas pueden

calcular la eficiencia del uso del agua (A/E), la conductancia estomática (gs),

eficiencia de uso de agua intrínseca (A / gs) y concentración de CO2 sub-

estomática (IC). Temperaturas de la Cámara y hoja son medidas con un sensor

termistor. Algunos sistemas también están diseñados para controlar las

condiciones ambientales.

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Figura 1 Sistema Portátil de medición de fotosíntesis. Marca Li-cor, modelo Li-

6400XT-R

Figura 2. Esquema básico mostrando las diferentes partes de la cámara foliar

en un sistema IRGA modelo Li-6400XT-R y la trayectoria del haz de radiación

infrarroja dentro del sistema.

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Consola con pantalla, teclado y memoria

Cámara foliar


OBJETIVO.-

Determinar la tasa fotosintética foliar de varias especies, herbáceas, arbustivas o

arbóreas en el periodo de máxima radiación.

MATERIAL.-

especies, herbáceas, arbustivas o arbóreas presentes en la C.U.

Analizador de Gases Infrarrojo (IRGA) marca Li-Cor modelo modelo Li-

6400XT-R

PROCEDIMIENTO.-

1. Se transporta el IRGA a campo (con sumo cuidado)

2. Elegir la especie a evaluar

3. Determinar la hoja a ser evaluada. Se recomienda que sea la primera

hoja adulta más próxima al ápice.

4. Colocar la cámara foliar cuidadosamente de tal manera que encierre la

hoja a ser medida manteniendo su posición original. Registrar el valor

de la tasa de fotosíntesis.

5. En caso de haber estado en otra posición, colocarlo en posición

perpendicular a la incidencia de la radiación solar y registrar el valor de

la tasa. Registre los datos que muestra la Pantalla de cristal líquido en la

consola.

6. En el laboratorio, en caso de haber almacenado la información en la

memoria del equipo, descargar la información y se procede a analizarla

RESULTADOS.-

Llene la ficha que se adjunta. Realice un gráfico que compare la tasa de

fotosíntesis y otras variables evaluadas para las especies estudiadas.

CONCLUSIONES

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Considerando los resultados obtenidos y la bibliografía existente, justifique los

resultados obtenidos.

Referencias.-

María Elena Fernández, Javier E. Gyenge. 2010.Técnicas en medición en

ecofisiología vegetal: conceptos y procedimientos / editores – Buenos Aires :

Ediciones INTA, 2010.140 p.

Ficha de evaluación

Especies

Fotosíntesis

neta (μmol m-2 s-1)

Concentració

n de H2O

(mmol mol-1)

Conductanci

a estomática

PAR

Especie 1

Especie 2

Especie 3

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PRÁCTICA 6. MADURACIÓN DE LOS ÓRGANOS REPRODUCTIVOS

INTRODUCCIÓN.-

El éxito del mejoramiento genético y de los trabajos de polinización está

relacionado con el momento y la duración de la receptividad del estigma y la

viabilidad de los granos de polen. Además estos estudios pueden permitir

conocer si una especie presenta esterilidad, homogamia o dicogamia (si es

protandra o proterogina). De modo que en la presente práctica se desea

evaluar la receptividad del estigma y relacionarlo con el momento de la

apertura natural de la antera en diferentes etapas del desarrollo floral.

OBJETIVO.-

Evaluar la variación de la maduración de los órganos reproductivos

(receptividad de estigma y liberación de polen) desde la antesis hasta el inicio

de senescencia floral

MATERIAL.-

Material biológico: flores en diferentes etapas de desarrollo de Aloe sp, u otra

especie vegetal

Equipos de laboratorio:

Microscopio estereoscópico

Materiales:

H2O2

Debe traer el estudiante: Regla (flexible de preferencia), ficha de registro de

datos, lápiz, papel toalla.

Portaobjeto, cubreobjetos, pinzas, estiletes, gotero,

METODO.-

Evaluación de la dehiscencia de la antera y receptividad del estigma:

a. Colectar flores en cada etapa básica de desarrollo: yema, flor y

flor senescente, de 3 a 5 de cada etapa.

b. Obtener los datos de las columnas 2 y 3 de la Ficha de Registro

de Datos. Realizar las mediciones bajo el microscopio estereoscópico si

fuera necesario.

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c. Identificar en qué etapa ocurre el inicio y término de la apertura

natural de las anteras y registrar sus datos en la Ficha (columna 4)

d. Determinar la receptividad del estigma aplicando sobre su

superficie H2O2. Asociar la intensidad del burbujeo con el grado de

receptividad del estigma. Realizar la prueba a los pistilos de las diferentes

etapas encontradas a fin de caracterizar cada etapa.

RESULTADO.-

Registre sus datos en la ficha que se adjunta. Prepare una tabla con el

promedio obtenido para las variables evaluadas en cada etapa de desarrollo.

Grafique “dispersando” todos sus datos de cada variable e identificando con un

color diferente cada etapa de desarrollo en función del tiempo

Ficha de Registro de Datos

Estadío y repetición (ej Y1, F1 y S1)

long de filamento / long de antera

long de pistilo / long de ovario

Dehiscencia de la antera b

Receptividad del estigma a

a = registrar si el burbujeo es leve, moderado o abundanteb = indicar si la dehiscencia es inicial, parcial o total

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