INTRODUCCIÓN

El agua potable de suministro público y de uso domiciliario debe estar libre de microorganismos

patógenos, minerales y sustancias orgánicas que puedan producir efectos fisiológicos adversos;

además, debe ser estar exenta de turbidez, color, olor y sabor desagradables (Borchardt y

Walton, 1971).

En Venezuela, el Decreto 883, promulgado en el año 1995, hace referencia a “Normas para la

Clasificación y el Control de los Cuerpos de Agua y Vertidos o Efluentes”; en él se presenta lo

concerniente al rango de medición y control de los parámetros para el agua potable.

La Norma Covenin 3047:1993. Agua Potable. Método de Determinación del Número Más

Probable de Bacterias Coliformes contempla el método de ensayo de rutina para la

determinación del Número Más Probable de Bacterias coliformes. La Norma Covenin

1104:1996, Determinación del Número Más Probable de Coliformes, Coliformes Fecales y de

Escherichia coli (2da Revisión), contempla el método de ensayo para la determinación del

Número Más Probable (NMP) de bacterias Coliformes, Coliformes Fecales y de Escherichia coli

en alimentos mediante la utilización de medios líquidos. Los aspectos contemplados en estas

normas deben ser tomados en cuenta para el control y monitoreo de la calidad del agua de

consumo.

La técnica del Número más Probable o NMP para el contaje de Coliformes Totales, Coliformes

Fecales y Escherichia coli, a través del método de dilución en tubos múltiples, además de estar

contemplado en las Normas COVENIN 3047:1993 y 1104:1996, está señalado en el Standard

Methods bajo el código 9221B y para Escherichia coli el código 9223 (APHA y col., 2005).

PRÁCTICA DE LABORATORIO DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y

Escherichia coli

OBJETIVOS

Determinar los organismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli en

una muestra de agua.

Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua mediante la indagación de los

coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.

Realizar el informe de las actividades.

FUNDAMENTO

La determinación de microorganismos coliformes totales por la técnica del Número más

Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano para fermentar la

lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35° C, durante 48 h, utilizando un medio

de cultivo que contenga sales biliares. En esta técnica los resultados de la fermentación en

tubos múltiples se expresan en términos de Número Más Probable (NMP) de microorganismos

existentes.

La determinación de NMP consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la

fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio, el cual

permite la activación de los microorganismos en la muestra que sean capaces de utilizar a la

lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de

cultivo caldo bilis verde brillante, el cual es selectivo y sólo permite el desarrollo de aquellos

microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.

La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a

partir de los tubos positivos de la fase presuntiva en la cual se emplea como medio de cultivo

caldo bilis verde brillante el cual es selectivo y sólo permite el desarrollo de aquellos

microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante y se

fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando

son incubados a una temperatura de 44,5o C por un período de 24 a 48 h.

La Escherichia coli se determina a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se

siembran por extensión en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina

azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas del IMVIC (Indol,

Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato) a las colonias típicas.

PROCEDIMIENTO

1. Prueba presuntiva

Agitar la muestra y transferir 1mL (y/o sus diluciones) en cada uno de los 10 tubos

volúmenes con caldo lauril sulfato de sodio. Agitar los tubos para homogeneizar la

muestra.

Incubar los tubos a 35 ± 0,5° C. Examinar los tubos a las 24 h y observar si hay formación

de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa

producción de gas, incubar 24 h más. Observar nuevamente y considerar como tubos

positivos, aquellos que presenten gas en la campana de Durham.

2. Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva,

a otro tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante, con campana de

Durham.

Agitar los tubos para su homogeneización.

Incubar a 35 ± 0,5º C durante 24 a 48 h.

Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y

producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.

Consultar la Tabla de NMP para conocer el número más probable de organismos

coliformes totales/100 mL.

3. Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva

(caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo

campana de Durham.

Agitar los tubos para su homogeneización.

Incubar a 45± 0,2º C en incubadora o un baño de agua durante 24 a 48 h.

Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y producción

de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.

Consultar la tabla de NMP para conocer el número más probable de organismos

coliformes fecales/ 100 mL.

4. Prueba confirmativa para Escherichia coli

Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por estría

cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.

Incubar las placas invertidas a 35± 1º C por 18-24 h.

Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial: Colonias con

centro negro, planas con o sin brillo metálico. Si no hay colonias con morfología típica,

probar una o más colonias lo más parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar de

conteo estándar para realizar las pruebas de morfología microscópica y pruebas

bioquímicas.

Incubar las placas a 35±1º C por 18-24 h.

Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos

cortos o cocobacilos Gram-negativos.

4. Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC).

a. Producción de indol (I)

Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35° C por 24 ± 2 h.

Adicionar entre 0,2 y 0,3 mL de reactivo de Kovacs.

La presencia de un color rojo oscuro en la superficie del tubo se considera una prueba

positiva.

b. Producción de ácidos mixtos (Rojo de metilo, RM)

Inocular (1 mL) a un tubo adicional con caldo RM-VP e incubar a 35° C por 48 ± 2 h.

Adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo.

Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo

es una prueba negativa.

c. Producción de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)

Inocular (1 mL) a un tubo con caldo RM-VP e incubar a 35° C por 48 ± 2 h.

Adicionar 0,6 mL de solución alfa naftol al 5% y 0,2 mL de solución Hidróxido de Potasio

al 40% agitar.

Dejar reposar durante 2 a 4 h sin agitar el tubo; se considera una prueba positiva

cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.

d. Utilización del citrato (C)

Inocular un tubo con agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se inocula en

línea recta en el centro del bisel (pico de flauta).

Incubar a 35° C de 24 a 48 h.

El desarrollo del cultivo en la superficie y la presencia de una coloración azul, debido al

viraje del indicador que contiene el medio, indica prueba positiva.

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Calcular la densidad microbiana con base en el número más probable conforme al

procedimiento señalado en la Tabla 1, (que se muestra a continuación y es utilizado para el

análisis de agua), para estimar la población de bacterias coliformes totales, bacterias coliformes

fecales y Escherichia coli de acuerdo con el número de tubos positivos. Expresar en NMP/100

mL. Utilizando volúmenes 10 mL de muestras de agua en 10 tubos, aplicar la Tabla 1:

TABLA 1. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua.

No. de Tubos Positivos NMP/100 mL 95% de Límite de Confianza (aproximado)Inferior Superior

0 <1,1 0 31 1,1 0,03 5,92 2,2 0,26 8,13 3,6 0,69 10,64 5,1 1,3 13,45 6,9 2,1 16,86 9,2 3,1 21,17 12 0,4 27,18 16,1 5,9 36,89 23 8,1 59,5

10 <23 13.5 Infinito

Tabla 2. Requisitos Microbiológicos para el agua potable según la Norma COVENIN 1431:1982 para NMP

Producto Análisis Método de Referencia

n c Límite por 100 mLm M

Agua Potable Coliformes DTM 10 1 0 4

n: Número de muestras del lote, c: Número de muestras defectuosas, DTM: Método de Dilución en Tubos Múltiples (NMP), m: Límite Mínimo, M: Límite Máximo.

Tabla 3. Perfil bioquímico de pruebas IMViC para Escherichia coli

Microorganismo Indol Rojo de Metilo Voges-Proskauer CitratoE. coli + + - -

EQUIPOS Y MATERIAL

Autoclave.

Horno de aire caliente o estufa para esterilización.

Destilador de agua.

Potenciómetro o cinta de pH universal.

Frasco de vidrio estéril y de boca ancha para el muestreo.

Equipo de baño María con una temperatura estable a 44,5 ± 0,2° C

Incubadora a 35 ± 0,5° C.

Mechero Bunsen.

Tubos de 16 x 150 milímetros (o de mayor medida) con tapones de vaquelita.

Tubos Durham.

Pipetas serológicas de 10 mililitros.

Asa de inoculación con aro de níquel, cromo o platino.

Material para la preparación de medios de cultivo: espátulas, matraces, probetas,

SOLUCIONES Y MEDIOS DE CULTIVO

Caldo lauril sulfato (caldo lauril triptosa) a doble concentración (para la prueba

presuntiva del grupo coliformes).

Caldo verde brillante lactosa bilis 2% a concentración simple para la prueba confirmativa

de coliformes totales (en función de que todos los tubos presuntivos den resultados

positivos).

Caldo EC para la prueba confirmativa de coliformes termotolerantes (en función de que

todos los tubos presuntivos den resultados positivos).

Agua destilada para la preparación de los medios.

PREPARACIÓN DE MATERIAL

Preparar el caldo lauril triptosa (lauril sulfato) doble concentración y dispensar según el

volumen de muestra que se va a sembrar (en este caso 10 mL), de tal manera que las

porciones de muestra inoculadas al medio no reduzcan la concentración de ingredientes

del medio, la cual debe mantenerse constante.

En cada tubo colocar un tubo Durham invertido y esterilizar en autoclave. Tener la

precaución de que en el momento de iniciar la prueba no estén a la temperatura de

refrigeración y cuidar de que ninguno de los tubos presente burbujas producidas en el

momento del autoclavado.

Proceder al marcado de los tubos, anotando el número designado por el laboratorio, el

volumen seleccionado de muestra que va a ser inoculado y la fecha del análisis. Esta

marcación podrá hacerse solamente en el primer tubo de la derecha en la primera fila.

Si se van a emplear diluciones, identificar los frascos de agua de dilución con el número

de muestra y las diluciones seleccionadas.

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

COVENIN 1126-89. Alimentos. Identificación y Preparación de Muestras para el Análisis

Microbiológico (1ra Revisión).

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

Covenin 1104:1996. Determinación del Número Más Probable de Coliformes, Coliformes

Fecales y de Escherichia coli (2da Revisión).

BIBLIOGRAFÍA

Madigan, M T y Martinko, J M., Brock, Biology of Microorganisms, 11a ed.

Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A.,

Microbiología Médica de Jawetz.

Pelczar

COVENIN 1431:1982. Agua Potable Envasada. Requisitos.

COVENIN 3047:1993. Agua Potable. Método de Determinación del Número Más

Probable de Bacterias Coliformes.

COVENIN 1104:1996. Determinación del Número Más Probable de Coliformes,

Coliformes Fecales y de Escherichia coli (2da Revisión).

COVENIN 1126-89. Alimentos. Identificación y Preparación de Muestras para el Análisis

Microbiológico (1ra Revisión).

DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA POTABLE

Tubos con 10 mL doble concentración de caldo lauril sulfato de sodio (CLSS)

CLSS + 10 mL de muestra Siembra con asa bacteriológica de los tubos positivos (producción de gas) de caldo lactosa a caldos verde brillante bilis 2% y EC

Tubos con 10 mL de caldo lactosa verde brillante bilis 2%

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes totales /100 ml de muestra

Tubos con 10 mL de caldo EC o EC-MUG

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes fecales /100 ml de muestra.

2 ó 3 asadas/Tubo

Siembra de tubos positivos en placas de Agar EMB para la búsqueda de Escherichia coli

Incubación a 37° Cdurante 24 - 48 h

Incubación a 37° Cdurante 24 - 48 h

2 ó 3 asadas/Tubo

Incubación a 37° Cdurante 24 - 48 h