práctica-de-fagocitosis 2

8/19/2019 Práctica-de-Fagocitosis 2

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Fagocitosis

Alatorre E, Escobar DG, Eslendy L, Gutierrez LS Rodr í guez NE, Romero V

Objetivos

General:• Observar si la administraci ón de etanol en las c é lulas blancas sangu í neas

disminuye sus ca acidad de !agocitosis contra un agente at ógeno"levadura de C á ndida Albicans # teniendo una muestra de control sin etanol$

Particulares:

• %om arar el n ú mero de c é lulas encontradas en la muestra de control y enla e& erimental$

• 'denti!icar si las c é lulas de cada una de las muestras !agocitaron alguna

levadura de C á ndida Albicans• Si las c é lulas !agocitaron levaduras, (acer el conteo de estas y com arar

los resultados entre ambas muestras$

Introducci ó n

La !agocitosis re resenta la !orma m ás rimitiva de de!ensa del (u és ed"res uesta inmune natural#, en el cual una cantidad de c élulas es ecializadas delorganismo "leucocitos# ingieren y digieren a cuer os e&tra ños ara su nutrici ón o

ara ser eliminados, mediante la roducci ón de agentes )u ímicos y enzim áticos"microbicidas#$ *

Es un gru o celular muy relacionado con los macr ó !agos aun)ue sonconsideradas una l í nea celular inde endiente$ Se llaman as í or su seme+anzacon las dendritas neuronales, ero no est á n relacionadas en modo alguno con elsistema nervioso a esar de )ue ambas tienen muc(as royecciones es icularesen su su er!icie$ Estas c é lulas dendr í ticas act ú an como cone&i ón entre lossistemas inmunes innato y ada tativo, ues resentan ant í genos a las c é lulas -$Su !unci ón !agocitaria la llevan a cabo en los te+idos )ue est á n en v í nculo con elmedio e&terno y est á n ubicados rinci almente en la iel, la nariz, los ulmones, elest ómago y los intestinos *$

Las c é lulas !agoc í ticas olimor!onucleares son c é lulas im licadas en el e)uilibrio yel mantenimiento del organismo los encontrados normalmente en la sangre,migran (acia el lugar de la lesi ón, siendo as í el ti o m á s com ú n de !agocitos,durante la !ase aguda de la in!lamaci ón, articularmente en el caso de lasin!ecciones bacterianas, or lo )ue son los rotagonistas en el control yeliminaci ón de agentes at ógenos$ *


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Los macr ó!agos y neutr ó!ilos en ocasiones tienen la ca acidad de englobar bacterias o sustancias e&tra ñas directamente$ La resencia de o soninas !acilita laingesti ón de la bacteria mediante el recubrimiento denominado o sonizaci ón$ Se(an identi!icado dos ti os de o soninas la 'g G "sub ti o * y sub ti o .# y elcom lemento %.b, las art ículas o sonizadas se !i+an a dos rece tores desu er!icie de neutr ó!ilos o macr ó!agos, /e y %.b res ectivamente$ La o sonizaci ón

uede llevarse a cabo mediante tres mecanismos0 Los anticuer os solos uedenactuar como o soninas1 los anticuer os m ás el ant ígeno, ueden activar la v íatí ica del com lemento ara roducir o sonina1 la o sonina uede elaborarsemediante un sistema termo l ábil, en )ue la inmunoglobulina y otros !actores activanel %. mediante la v ía alterna$ .

ras la ad(erencia tiene lugar la ingesti ón$ En este roceso la membranacito lasm ática del !agocito emite unas royecciones denominadas seud ó odos)ue engloban al microorganismo$ 2na vez rodeado el at ógeno los seud ó odosse re únen, se !usionan y los encierran en una bolsa conocida como !agosoma oves ícula !agoc ítica$ La membrana !agos ómica contiene enzimas )ue bombean

rotones "34# en el !agosoma, lo )ue reduce el ( cerca de -$ A este 5( seactivan las enzimas (idrol íticas$ En esta !ase de la !agocitosis el !agosoma sese ara de la membrana cito lasm ática y enetra en el cito lasma, en cuyo interior entra en contacto con los lisosomas )ue contienen enzimas digestivas ysustancias bactericidas$ ras el contacto las membranas del !agosoma y dellisosoma se !usionan ara !ormar una estructura única y m ás grande denominada!agolisosoma$ El contenido del !agolisosoma tarda s ólo de *6 a .6 minutos aradestruir la mayor ía de los ti os de bacterias$ Entre las enzimas lisos ómicas )ueatacan directamente a las c élulas microbianas se encuentra la lisozima, )ue(idroliza el e tidoglicano de las aredes celulares bacterianas$ Otras enzimas,como las li asas, las roteasas, la ribonucleasa y la deso&irribonucleasa,(idrolizan distintos com onentes macromoleculares de los microorganismos$ Loslisosomas tambi én contienen enzimas )ue ueden elaborar roductos del o& ígenotó&icos como el radical su er ó&ido, el er ó&ido de (idr ógeno, el o& ígeno singulete

y el radical (idro&ilo$ Los roductos t ó&icos del o& ígeno se !orman a trav és de unroceso como estallido res iratorio$ -

7ediante estudios cl í nicos y e& erimentales se (a demostrado )ue el alco(ol es un! á rmaco inmunomodulador )ue aumenta la susce tibilidad del (u é s ed a contraer in!ecciones or la inducci ón de !actores es ec í !icos innatos y la res uesta celular$ *

Numerosos traba+os (an demostrado )ue el consumo de alco(ol su rime lares uesta del sistema inmunitario innato e incrementa el riesgo de adecer


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in!ecciones "8oe et al$, 966.1 Goral and :ovacs, 966;1 ar, 966=#$De (ec(o, el tratamiento agudo dealco(ol disminuye la activaci ón de la v í a de se ñ alizaci ón de los rece tores LR enmacr ó !agos (umanos y de rat ón, su rimiendo la activaci ón de .?, ER:, N/@ κ 8e in(ibiendo la roducci ón de citocinas "Goral and :ovacs, 966;1 7andre>ar et al$,96691 5ruett et al$, 966-c#$ El etanol tambi é n in(ibe la activaci ón de los rece tores

LR- y LR., a!ectando a los mecanismos de de!ensa de los macr ó!agos !rente adiversos microorganismos "Dai etal$, 966;1 5ruett et al$, 966-a#$

El alco(ol aguda su rime la ca acidad del sistema inmune ara eliminar Streptococcus pneumoniae , agrava se sis, y aumenta el riesgo de com licaciones en el trauma y)ueman acientes 9

El etanol tambi é n su rime li o olisac á rido "L5S# inducida or el !actor nuclear@8 "N/@8# launi ón a ADN, inter!iere con la roducci ón de la cito)uinas ro@in!lamatorias0 !actor de

necrosis tumoral " N/@ α # la 'L@B en ambos macr ó !agos, er+udicando la !unci ón de lascé lulas dendr í ticas$ . La se ñ alizaci ón se inicia mediante rece tores LR rece tores dereconocimiento de atrones e& resado en las c é lulas del sistema inmune innato, estostienen rece tores ara 'L@*$ 5ara oder dar una res uesta de se ñ alizaci ón$

odo esto se da en una reacci ón de !ase aguda del consumo de alco(ol, ero en una !asecr ó nica (ay un da ñ o in!lamatorio en ( í gado y cerebro$ - Se (a encontrado )ue balsas delí idos rovocan una erturbaci ó n en los rece tores y la se ñ alizaci ón ; en el cerebro y enel ( í gado$

El estallido res iratorio es el roceso or el cual se roducen en los macr ó !agos y los57N los intermediaros reactivos del o& í geno RO', como el ani ón su er ó&ido, el radical(idro&ilo y el er ó&ido de (idr ógeno en los macr ó !agos y los leucocitos

olimor!onucleares$ El estallido res iratorio est á mediado or la enzima o&idasa del!agocito y lo desencadenan (abitualmente mediadores in!lamatorios, como el L 8-, el5A/ y el N/, o roductos bacterianos, como los é tidos N@!ormilmetionil$B

La resencia de o& í geno es un re)uisito vital ara la destrucci ón y digesti ón de losagentes at ógenos or los !agocitos, ero no es necesaria ara la !agocitosis misma$%antidades considerables de o& í geno se consumen en el estallido res iratorio$ C

Los leucocitos olimor!onucleares "57N#, son movilizados a los sitios de in!lamaci óndonde destruyen a los agentes invasores, mediante la liberaci ón de radical su er ó&ido,es ecies reactivas del o& í geno derivadas y enzimas roteol í ticas$ C

Los 57N ad)uieren la ca acidad de roducir es ecies activas de o& í geno "ROS# cuandoe& erimentan la activaci ón$ Este !en ómeno se caracteriza or el aumento s ú bito delconsumo de o& í geno "O 9#, antes citado, no asociado al trans orte electr ónicomitocondrial, catalizado or el sistema NAD53@o&idasa y denominado " estallidores iratorio $ 9 Los mecanismos utilizados ara la eliminaci ón de agentes at ógenos or los !agocitos se dividen en de endientes "RO' de endientes# e inde endientes "RO'inde endientes# de radicales libres de o&igeno1 en cuanto a la destrucci ón de at ó geno o


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material !agocitado, es indis ensable la roducci ón de radicales libres de o& í geno en el!agocito activado ara e+ercer su !ase e!ectora y rovocar la muerte de las bacterias!agocitadas y la !ragmentaci ón de material ingerido$ Las c é lulas !agociticas de enden deNAD53 o&idasa "ion su er ó&ido# tienen actividad antimicrobiana directa$ ?

Hip ó tesis

De una muestra de sangre de una com a ñ era del e)ui o, las c é lulas blancas sinadministraci ón de alco(ol resentar á n un me+or mecanismo de !agocitosis )ue lascé lulas blancas a las )ue se les administre alco(ol al ser e& uestas a levadurasde C á ndida Albicans $

Material y m é todos

*$ omar una muestra de sangre de *6ml con una +eringa est é ril de *6 ml$9$ Se coloca la muestra en un tubo est é ril de ta ón de rosca de *B&*66 )ue

contiene - erlas de vidrio

.$ Agitar el tubo de ta ón de rosca, inclin á ndolo (acia el ta ón, ara evitar )ueel tubo se rom a or la !ricci ón de las erlas "des!ibrilar la sangre y evitar)ue se coagule#


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-$ Sacar la sangre des!ibrinada con una i eta 5asteur y se coloca en un tuboest é ril de ta ón de gasa *.&*66$

;$ Re artir en 9 tubos est é riles de ta a de gasa "a ro&imadamente ; ml desangre en cada

uno#$ 2n tubo decontrol y unoe& erimental$

B$ A la muestrae& erimental sele agrega alco(oldel =B @.gr$ dealco(ol

C$ En la ca+a de5etri colocar en

el !ondo el a el absorbente y agregar soluci ón salina est é ril "cá mara( ú meda#$ %on una micro i eta de *66 a *666 µl de ca acidad, se coloca*ml de sangre a uno de los cubreob+etos de+ando caer la muestracuidadosamente ara evitar )ue se derrame$

?$ 7eter la ca+a en la incubadora una (ora a .C °%$ se van a egar las c é lulasblancas al ortaob+etos$

=$ Des u é s de la incubaci ón, se lavan los cubreob+etos con soluci ón salina al?$; est é ril$ 5or goteo y or las es)uinas con la i eta de 5asteur, (asta)ue los cubreob+etos est é n libres de eritrocitos$

*6$Estimulo0 %olocar el ant í geno "levaduras de %$albicans# dentro de laincubadora colocar el re arado de ant í geno D@7E74*66 µL de N8 "azul


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de nitrotetrazolium#$ Se adiciona *ml or cada muestra de cultivo y se de+aincubando a .C °% or una (ora$

**$9° lavado$ Se lavan los cubreob+etos 9 veces con soluci ón salina$

*9$Secar cuidadosamente los cubreob+etos y de+arlos secar a tem eraturaambiente$

*.$ e ñ ir los cubreob+etos con sa!ranina 6$; durante C minutos$

*-$En+uagar con agua de la llave y de+ar secar$

*;$7ontar el cubreob+etos en un ortaob+etos y se le va z colocar resina, ara!i+arlos y as í oder observarlas en el microsco ioó tico ara (acer el conteo de c é lulas )ue!agocitaron$

*B$Realizar observaci ón y conteo de c é lulas$

Resultados

E& erimental

• Se contar á n las c é lulas )ue est é n enteras• Se descartar á n acumulaciones de c é lulas• Se contar á n las levaduras )ue sean endocitadas• Se contar á n levaduras )ue se observen de color morado• Se sumar á el toral de c é lulas )ue s í !agocitaron levaduras

%elulas orcam o

%é lulas )ue se!agocitaronlevaduras

Levaduras!agocitadas

Levaduras decolormorado"reduc

ció n de N8 #6 6 6 B


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%elulas orcam o



Levaduras decolormorado"reducció n de N8 #

6 6 6 C

6 6 6 =

* * * =

6 6 6 *6

6 6 6 C

* * - *6

otal 9 9 ; ;?

*66 de las c é lulas !agocitaron levaduras%ada una de las c é lulas !agocitaron de * y - levaduras

%ontrol

• Se contar á n las c é lulas )ue est é n enteras• Se descartar á n acumulaciones de c é lulas• Se contar á n las levaduras )ue sean endocitadas• Se contar á n levaduras )ue se observen de color morado• Se sumar á el toral de c é lulas )ue s í !agocitaron levaduras


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%é lulas orcam o



Levaduras decolormorado"reducció n de N8 #

9 9 . ;

* * * B

- * * 9

; 6 6 .

- * * -

. . . ;

6 6 6 B

otal *= ? = .*

-9$*6 de las c é lulas !agocitaron levaduras%ada una de las c é lulas !agocitaron entre * y . levaduras

Conclusi ó n.

2na vez realizada la r á ctica y obtenidos los resultados del conteo de las c é lulasel e)ui o analiz ó los datos y concluye )ue0

• La muestra de control resenta mayor n ú mero de c é lulas )ue la muestrae& erimental$


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• Las c é lulas de la muestra control !agocitaron mayor n ú mero total delevaduras )ue las c é lulas e& erimentales, sin embargo no todas las c é lulasde la muestra control !agocitaron levaduras mientras )ue las de la muestrae& erimental s í $

• La cantidad de levaduras )ue !agocitaron las c é lulas de la muestrae& erimental es mayor )ue las de la muestra control$

• odo esto indica )ue en la muestra control (ubo menor n ú mero de muertescelulares o la t é cnica de lavado !ue me+or )ue en la muestra e& erimental$

Adem á s se uede observar )ue las c é lulas control tienen una ca acidad de!agocitar levaduras, mientras )ue en las e& erimentales est á disminuida acausa del etanol agregado$

La (i ó tesis lanteada !ue corroborada y es cierta dado )ue en la muestra control(ay un mayor n ú mero de c é lulas identi!icadas y estas !agocitaron m á s levaduras)ue en la muestra e& erimental1 los ob+etivos !ueron alcanzados y con todos losdatos se uede concluir tambi é n )ue este !en ómeno odr í a estar resente en lascé lulas blancas de los acientes alco( ó licos, reduciendo su ca acidad de!agocitosis y aumentando la robabilidad de adecer in!ecciones o en!ermedades$

Bibliograf í a

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