practica de agua

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Universidad Nacional de CajamarcaEscuela de Ingeniería en Industrias Alimentarias

IDENTIFICACIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN EL AGUA MEDIANTE LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE

I. INTRODUCCIÓN. El "agua " es uno de los compuestos más importantes para la vida del planeta y del universo, el cual, podemos encontrar en diferentes estados como líquido, sólido y gaseoso. Este compuesto es una sustancia líquida formada por la combinación de dos volúmenes de hidrógeno y un volumen de oxígeno, que constituye el componente más abundante en la superficie terrestre. Este compuesto es uno de los más abundantes en nuestro planeta, el cual cubre el 71% de la superficie de la terrestre formando los océanos, lagos, lagunas, glaciares, ríos, napas subterráneas, riachuelos, canales Este fundamental compuesto, permite la existencia de vida en la tierra ya que los seres vivos están constituidos por el porcentaje importante de agua. El agua es un elemento vital para la existencia humana, de su uso adecuado depende nuestra salud, alimentación y producción agrícola. El utilizar agua contaminada en la preparación de alimentos u otras actividades nos podría producir un gran número de casos de infección. La presencia y extensión de contaminación fecal es un factor importante en la determinación de la calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una variedad de microorganismos y formas de resistencia de los mismos, involucrando organismos patógenos, los cuales son un riesgo para la salud pública, al estar en contacto con el ser humano entre ellos tenemos a los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilo Gram negativos, inmóviles o móviles con flagelos. Peritricos se desarrollan en medios artificiales y todas las especies forman ácido o ácido y gas a partir de glucosa. Su composición antigénica es un mosaico que interrelaciona serológicamente varios géneros y aun familias, muchas de estas bacterias son parásitos de animales y otros patógenos. Para ver la calidad de las aguas se recorre a parámetro físico químico y biológico. Los parámetros bacteriológicos tienen mayor importancia para dictámenes higiénicos; es preciso hallar el número de gérmenes saprófilos o de coli y de bacterias procedentes del intestino humano como indicadores de la contaminación. Conviene destacar la importancia que tienen las cifras de coli y coliformes, pertenecientes a las enterobacterias que fermentan lactosa con producción de gas y ácido. El examen de muestras de agua para determinar la presencia de microorganismos del grupo coliformes que habitan normalmente en el intestino humano y de otros animales de sangre caliente, da una indicación. Dada la limitada capacidad de algunos miembros del grupo de organismos coliformes para sobrevivir en agua; sus números también pueden emplearse para estimar el grado de contaminación fecal. En el presente informe podremos apreciar el método de número más probable el cual en este caso lo utilizaremos para analizar una muestra de agua para el indicador de Coliformes fecales y totales.

Microbiología de Alimentos

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II. OBJETIVOS.

Investigar la presencia de bacterias del grupo coliformes totales y fecales en la muestra de agua mediante la técnica del número más probable (NPM).

Familiarizarse con los métodos de recuento, especialmente con el de NMP.

Detectar si la muestra (agua) traída es apta para el consumo humano.


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III. MARCO TEÓRICO.

1. Agua.

El agua es un componente de nuestra naturaleza que ha estado presente en la Tierra desde hace más de 3.000 millones de años, ocupando tres cuartas partes de la superficie del planeta. Su naturaleza se compone de tres átomos, dos de oxígeno que unidos entre sí forman una molécula de agua, H2O, la unidad mínima en que ésta se puede encontrar. La forma en que estas moléculas se unen entre sí determinará la forma en que encontramos el agua en nuestro entorno; como líquidos, en lluvias, ríos, océanos, camanchaca, etc., como sólidos en témpanos y nieves o como gas en las nubes. Gran parte del agua de nuestro planeta, alrededor del 98%, corresponde a agua salada que se encuentra en mares y océanos, el agua dulce que poseemos en un 69% corresponde a agua atrapada en glaciares y nieves eternas, un 30% está constituido por aguas subterráneas y una cantidad no superior al 0,7% se encuentra en forma de ríos y lagos. La composición del agua la podemos comprobar efectuando la electrólisis de dicha sustancia. Electrólisis. Es un conjunto de fenómenos físicos y químicos que ocurre cuando pasa la corriente eléctrica a través de un electrolito. Electrólisis del agua. Se efectúa diluyendo en el agua, una gota de ácido sulfúrico o hidrógeno de sodio, descomponiéndose al paso de la corriente eléctrica depositándose oxígeno en el ánodo e hidrógeno en el cátalo. La contaminación de las aguas:

Se produce al incorporar a ese medio elementos extraños, tales como petróleos, sustancias radiactivas, minerales inorgánicos, residuos industriales, productos químicos o aguas residuales, entre otros, que deterioran su calidad. La salud humana puede quedar seriamente afectada por efecto de la contaminación de las aguas. Existen ciertos elementos químicos muy peligrosos para los seres vivos por ingestión, como el arsénico, mercurio o plomo, que pueden llegar a la cadena alimentaria al ser absorbido por los vegetales por medio de los acuíferos subterráneos o las aguas de riego, también puede estar contaminada por microorganismos y puede producir enfermedades como Salmonelosis (Tifoidea y Paratifoidea), Shigelosis, Cólera, Hepatitis, etc. Estos microorganismos son todos de origen entérico. Se sabe que los microorganismos patógenos que llegan a los depósitos de agua, proceden de las descargas intestinales de hombres y animales. Además, ciertas especies de bacterias, particularmente Escherichia coli, y varios microorganismos similares, denominados coliformes, Estreptococos fecales (como Streptococcusfaecalis) y Clostridium perfringens, son habitantes normales del intestino grueso de hombres y animales y en consecuencia siempre están en las materias fecales.


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2. Bacterias Coliformes. La denominación genérica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante como indicadores de contaminación del agua y los alimentos. Coliforme significa con forma de coli, refiriéndose a la bacteria principal del grupo, la Escherichia coli, descubierta por el bacteriólogo alemán Theodor von Escherichen 1860. Von Escherich la bautizó como bacterium coli ("bacteria del intestino", del griego κολον, kolon, "intestino"). Con posterioridad microbiológica sistemática nombraría el género Escherichia en honor a su descubridor. Las bacterias coliformes pueden concentrarse en cualquier parte en el medio ambiente: tierra, plantas y animales. Su presencia en el agua, mayormente en el agua potable indica que la reserva no está adecuadamente tratada contra los contaminantes. El agua puede haber tomado la bacteria cuando corría sobre el suelo y las plantas, o puede haber caído suciedad dentro de un pozo. La bacteria coliforme es inocua por sí misma, pero su presencia es un alerta de que la reserva de agua debe ser controlada para detectar otro tipo de contaminación.

a. Caracteres bioquímicos.

El grupo contempla a todas las bacterias entéricas que se caracterizan por tener las siguientes propiedades bioquímicas:

Son aerobias o anaerobias facultativas. Son bacilos Gram negativos; no son esporógenas fermentar la lactosa a 37 °C en 48 horas, produciendo ácido láctico y

gas.

b. Habitad del grupo coliforme.

Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir, homeotermos, pero también ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en suelos, semillas y vegetales. Los coliformes se introducen en gran número al medio ambiente por las heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayoría de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre.


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c. Los coliformes como indicadores.

Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de contaminación fecal en el control de calidad del agua destinada al consumo humano en razón de que, en los medios acuáticos, los coliformes son más resistentes que las bacterias patógenas intestinales y porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es bacteriológicamente segura. Asimismo, su número en el agua es proporcional al grado de contaminación fecal; mientras más coliformes se aíslan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de heces.

3. Bacterias coliformes totales. Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un grupo de bacterias que se definen más por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonómicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, más o menos rápidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubación comprendida entre 30-37ºC. Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo coliforme forman parte varios géneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cascara de huevo, etc. Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los Coliformes fecales.

4. Bacterias coliformes fecales. Las bacterias coliformes fecales son un subgrupo de las bacterias coliformes, que generalmente son inocuas. No obstante, las bacterias coliformes fecales viven por lo general en los intestinos y heces de los animales de sangre caliente, incluyendo los humanos y los animales cuyo estiércol es utilizado como fertilizante. Cuando se detectan bacterias coliformes fecales en el agua potable, el riesgo de salud es mucho más alto que cuando hay bacterias coliformes comunes. Las bacterias coliformes fecales indican que aguas residuales o corrientes de tierras de labranza cubiertas con estiércol están penetrando en la reserva de agua y no están siendo correctamente eliminadas. Esto significa que puede haber bacterias peligrosas y parásitos en el agua. El agua corriente y estancada del medio ambiente, como riachuelos, ríos, estanques y lagos, también son una posible fuente de bacterias coliformes fecales, en especial si están cerca de tierras cultivables o fuentes de aguas residuales humanas.


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5. E. coli

E. coli es una clase de bacteria coliforme fecal que predomina en los intestinos y las heces de las personas y animales de sangre caliente. Su presencia en el agua potable por los general significa que la reserva de agua fue recientemente contaminada por aguas residuales o corrientes de tierras de labranza fertilizadas. Algunas variedades de E. coli causan enfermedades en las personas. Cuando aparece en una reserva de agua, se considera un riesgo de salud pública. Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados.

6. Agar para Coliformes. MacConkey.

Es un medio de cultivo específico para bacterias Gram negativas y cepas que fermenten la lactosa. Sirve como un indicador visual de pH, distinguiendo así las bacterias gram negativas que pueden fermentar la lactosa (Lac+) y las que no pueden (Lac-). Lac+ Al utilizar la lactosa en el medio, bacterias Lac+ como Escherichia coli, Enterobacter y Klebsiella producen acidez, lo cual baja el PH bajo 6,8 lo que tiene como consecuencia la aparición de colonias de color rosadas o rojas. Lac- Bacterias que no fermenten la lactosa como Salmonella, Proteus y Shigella utilizaran peptona en su lugar, formando amoniaco, lo cual incrementa el pH del agar, formando colonias blancas o incoloras.

EMB agar. El Agar Levine o Agar EMB Levine es un medio de cultivo usado para el aislamiento y diferenciación de E.coli, tiene un aspecto purpúreo, aunque naranja tras su esterilización, es semisólido, y está destinado al cultivo en placa. Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de enterobacterias, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas y permite la diferenciación de bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa, dando lugar a colonias incoloras, las no fermentadoras, y colonias de color azulado-negro con cierto brillo metálico, las fermentadoras.


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La prueba del indol.

es una prueba bioquímica realizada en especies bacterianas para determinar la habilidad del organismo de romper el indol del aminoácido triptófano. Esta división molecular es lograda por una serie de enzimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con frecuencia triptofanasa. Si esta prueba sale positiva se va a formar un anillo de color rojo sobre el caldo.

Rojo de metilo

El rojo de metilo es un indicador de pH. (Fórmula: C15H15N3O2). Actúa entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la formación de ácidos que se producen durante la fermentación de un carbohidrato. El rojo de metilo se prepara con 0,1 g de este reactivo en 1500 ml de metanol. Una reacción positiva (más o menos) indica que el microorganismo realiza una fermentación acidoláctica de la glucosa por la vía ácido-mixta. Si la prueba es positiva aparece un color rojo violáceo, si es negativa no aparece coloración alguna.

Agar TSI. El Agar-hierro-triple azúcar es un medio de cultivo. Gracias a su composición es uno de los medios de cultivo más empleados para la diferenciación de enterobacterias según:

• Fermenten o no glucosa. • Fermenten o no lactosa o sacarosa. • Produzcan o no ácido sulfhídrico. • Produzcan o no gas.

Correspondientemente las reacciones sobre agar TSI son: • Si la bacteria problema fermenta la glucosa, acidificará el

medio haciendo virar a amarillo el indicador en el fondo del tubo, mientras que si no es fermentadora de glucosa, el medio permanecerá de color rojo.

• Si la bacteria problema fermenta lactosa o sacarosa, acidifica el medio en su superficie volviéndolo de color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie del medio continuará de color rojo.

• Si produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de las sales de hierro), se presentará un ennegrecimiento del tubo. La producción de sulfhídrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentación de la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa.


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• Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora de gas.

Agar Simmus citrato. En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.

IV. MATERIALES Y MÉTODOS.1. Materiales:

▪ Agua peptonada. ▪ Tubos de ensayo tapa rosca. ▪ Campanas Durham. ▪ Pipetas de 1ml. ▪ Probetas. ▪ Incubadora.▪ Gradilla.▪ Mecheros.▪ Placas Petri ▪ Agua ▪ Aza de siembra ▪ Alcohol

2. Metodología.

a. Número más probable.

Existen diversos métodos para cuantificar el número de microorganismos presentes en muestras líquidas y sólidas. Dentro de las técnicas más comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, así como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintéticos sólidos o líquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias


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(UFC) o la estimación por el método del Número Más Probable (NMP). El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este método fue empleado para estimar el número de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que también puede ser aplicado para la determinación de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este método es aplicable para estimar el número de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias. Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a 44º C en vez de 37 ºC como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces están formados por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia decontaminación fecal. Éstos últimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas más elevadas. Esta es la característica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotérmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgánica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminación fecal. Su presencia se interpreta como una indicación de que los organismos patógenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades.


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Prueba presuntiva

Primero medimos en una probeta 225 ml del diluyente.(agua peptonada)

De los 225ml del diluyente sacamos 9ml a dos tubos de ensayo.

Medimos en una probeta 25ml de la muestra (agua) y lo añadimos al diluyente esta mescla vendría a ser la disolución que sería (10−1 ¿, luego de la disolución (10−1 ¿ sacamos con una pipeta 1ml para pasarlo al tubo ( 10−2¿ de la disolución (10¿¿−2)¿ con una pipeta sacamos 1ml para pasarlo al tubo (10−3), luego de cada uno sacamos 1ml de a cada tubo por triplicado.

Después de esto de cada disolución (10−1 ¿, ( 10−2¿ ,(10−3).sacamos con una pipeta 1 ml para colocarlo en los tubos de ensayo que contenían caldo lactosado con una campana de durgan esto confirma la presencia de e.coli total.

Luego de esto llevamos a incubara a baño maría a 44C por un tiempo de 24 a 48 horas. y observamos los resultados.

Prueba confirmativa.

De los tubos que salen positivos sacamos una peliculita y lo sembramos en los tubos que contiene caldo lauril sulfato o verde brillante, luego nuevamente llevamos a incubar a baño maría a 44C por 48 horas. el caldo lauril sulfato confirma la presencia de e.coli fecal.

Luego sembramos en medios específicos (agar Mac conkey (MC) y eosina azul de metileno (EMB)) incubamos a una temperatura de 37°C por 24 horas. Luego observamos los resultados.


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Diluyente muestra

Incubamos a baño maría por 48 horas a 44ºC sacamos y vemos los resultados que 2 tubos salieron positivos (10-1, 10-2).

Presencia de gas y turbidez presencia de coliformes totales.


Medimos en una probeta 250ml

Medimos en una

Medimos 25 ml de muestra en la

probeta mesclamos

(10¿¿−3)¿

(10¿¿−1)¿

9 ml

9 ml

(10¿¿−1)¿(10¿¿−1)¿(10¿¿−1)¿

(10¿¿−2)¿ (10−1)

(10¿¿−3)¿(10¿¿−3)¿ (10¿¿−3)¿

(10¿¿−2)¿ (10−1)

(10¿¿−2)¿ (10−1)

(10¿¿−2)¿ (10−1)

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Luego para para realizar la prueba confirmativa sembramos las muestras en MC y EMB


(10¿¿−1)¿Sacamos una peliculita y sembramos en

caldo lauril sulfato en ambos casos presencia de coliformes fecales

(10¿¿−1)¿

Incubamos a baño maría por 48 horas a 44ºC

(10¿¿−2)¿

(10¿¿−2)¿ (10−1)

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V. RESULTADOS.

De los tubos sembrados en el caldo lactosado (prueba presuntiva) se obtuvo los siguientes resultados (a las 48 horas) para coliformes totales.

TUBOS DILUCIONES TOTAL

10-1 1 0 1 7 UFC/MLCT

10-2 1 0 0 4 UFC/MLCT

Las muestras (10−1 ¿, ( 10−2¿salieron positivas con presencia de gas y un poco de turbidez por lo tanto hay presencia de e.coli total.

De los tubos que salieron positivos sembramos una peliculita en tubos que contengan caldo lauril sulfato, este medio nos determinara si hay la presencia de e. Coli fecal en la muestra trabajada. Después de ser incubada por 48 horas a 44ºC salió positiva (presencia de e. Coli fecal).

De los tubos positivos para realizar la prueba confirmativa se sembró en agar MAC CONKEY y AGAR EMB, luego de las incubaciones por 24 horas se obtuvo que todas las siembras realizadas salieron positivas por lo tanto se puede decir que hay presencia de e. coli fecal


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VI. CONCLUSIONES.

Hemos podido observar la presencia de bacterias del grupo coliformes totales y fecales en la muestra de agua mediante la técnica del número más probable.

Los resultados del presente estudio dan una idea del alto riesgo para los consumidores del consumo de agua de donde fue obtenida la muestra , debido a la contaminación fecal, la cual puede ser la causa de las diferentes enfermedades.

Aprendimos a realizar pruebas con método de recuento de número más probable y que aspectos nos indican que hay presencia de coliformes fecales y totales.

Es importante realizar este método de número más probable para tener bases para aplicarlo, saber su fundamento y su respectivo procedimiento, además nos permite realizar otro tipo diferente de análisis. Además nos permite aprender las características biológicas de los microorganismos ya que en esta práctica realizada nos ha indicado la presencia de coliformes totales y fecales que se da por la producción de gases.

VII. DISCUSIONES.

Pudimos observar que la muestra en este caso agua potable presento tipos de coliformes (fecales y totales) lo cual nos indica que dicha agua no es apta para el consumo humano.

Se utilizó la técnica de tubos de fermentación múltiple (dilución en tubo) del número más probable (NMP), el cual proporciona una estimación estadística de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo


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disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado. El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubada a 35 ° C (coliformes totales) ó 44.5 °C (coliformes fecales) durante 24 a 48 h, resultando en la producción de ácidos y gas, el cual se manifiesta en las campanas de fermentación. en nuestra practica tanto para las coliformes totales como fecales se ha incubado a una temperatura de 44ªC.

VIII. BIBLIOGRAFÍA

▪ MICROBIOLOGIA APLICADA: Manual de Laboratorio (2006) Coliformes totales y Fecales en agua de consumo humano. Obtenido el 07 de febrero de 2008.

▪ FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS (1989). Medios de Cultivo en Microbiología: Manual de Laboratorio. Editora Tricelm S.A. 3º Edic. Lima.

▪ MICROBIOLOGÍA CARPENTER 1969 1ª edición Editorial: Interamericana S.A. México.

▪ MÉTODO MICROBIOLÓGICO C.H. Collins; Patricia M. Lyne 1989 Editorial: ACRIBIA; S.A. Zaragoza – España.

▪ ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA (2005) Obtenido el 07 de febrero de 2008

▪ ttps://www.google.com.pe/search?q=numero+mas+probable+para+coliformes&es_sm=93&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=pJJ7U_iEEIHq8QGX5YH4AQ&ved=0CAgQ_AUoAQ&biw=1600&bih=799#facrc=_&imgdi


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