CENTRO DE CIENCIAS BSICAS DEPARTAMENTO DE INGENIERA BIOQUMICAACADEMIA DE BIOTECNOLOGAINGENIERA BIOQUMICALABORATIRIO DE BIOTECNOLOGA

PRCTICA No. 7Produccin de enzimas por fermentacin en sustrato slido

Profesor: Dr. Juan Antonio Lozano lvarezAlumnos:Alcaraz Nava Ulises Antonio.Garca Mariscal Jos Luis.Snchez Tagle Daniel Martn.Silva Muoz Vctor Manuel.Lpez Senz Vicente de Jess.Borjas Esqueda Aldo Daniel

Aguascalientes, Ags. 19 de mayo de 2015

Prctica #7Produccin de enzimas por fermentacin en sustrato slidoObjetivo:Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de realizar la recuperacin y evaluacin del producto en un proceso de obtencin de enzimas haciendo uso de la fermentacin en sustrato slidoIntroduccin:El proceso de fermentacin se conoce desde hace mucho tiempo; sin embargo, cada da se estudian nuevas tcnicas para mejorarlo, ya sea mediante el mejoramiento del microorganismo o la seleccin de los medios ptimos, as como el control de los diversos parmetros que determinan el crecimiento y produccin del microorganismo.Se conocen varios tipos de fermentacin, como son:1. La fermentacin sumergida tanto en suspensin como en clulas inmovilizadas que involucra aquellos procesos que se realizan con los agentes biolgicos inmersos en la fase acuosa. Y la fermentacin sumergida con clulas inmovilizadas que es semejante a la anterior, excepto que los agentes biolgicos estn unidos a soportes insolubles en agua.2. La fermentacin en sustrato slido que se efecta con la utilizacin de materiales insolubles en agua y con muy poca agua en el sistema.(Garca, Quintero, & Lpez-Munga, 1993)En la biotecnologa, las tcnicas de cultivo en sustratos slidos constituyen una alternativa importante para producir alimentos, productos de alto valor agregado y otros. La transformacin de residuos slidos por fermentacin slida es un potencial importante, no slo para producir desechos enriquecidos en protena y usarlos como alimento animal, sino tambin para obtener otros aditivos de alto valor agregado, como son los probiticos o los extractos crudos de enzimas ricos en celulasas, proteasas, pectinasas y lipasas.La fermentacin en estado slido consiste en el desarrollo de microorganismos sobre o dentro de sustratos slidos hmedos e insolubles, en los que el contenido de humedad est al nivel correspondiente de la actividad de agua y sin exceder el mximo nivel de retencin de lquido en el slido.(Dustet, Pea, & Prez, 2002)El diseo de biorreactores est vinculado a estas tcnicas de cultivo, aunque an se encuentra en vas de desarrollo. Entre las tendencias mundiales en el diseo de biorreactores para estado slido, se seala principalmente el uso de equipos compactos, con una altura mnima de slido de 40 cm.La mayor dificultad para aplicar la fermentacin en estado slido a gran escala est en los gradientes importantes delas variables, debido a las caractersticas intrnsecas del sistema heterogneo slido-lquido-gas. Otro aspecto de inters es mantener, durante perodos prolongados de fermentacin (ms de 24h) las condiciones adecuadas de temperatura y humedad del cultivo. En sistemas estticos, esto slo puede lograrse con una buena distribucin del aire a travs del medio de cultivo.(Dustet, Pea, & Prez, 2002)

Procedimiento:

MATERIALES Espectofotometro y celdillas de 1 cm 2 gradillas Micropipetas de 1000 y 200 l Agitador Orbital Parafilm, papel secante Puntas para micropipetas (1000 y 200 l) Tubos eppendorf de 2 ml esteriles 1 hoja de bistur con mango 1 frasco gerber con agua esteril 1 blender con recipiente de acero inoxidable 1 mechero Fischer 2 agitadores o microesptulas estriles

REACTIVOS Cepa de T. versicolor en PDA 250 ml de buffer acetatos 100 mM pH=5 500 ml de buffer fosfatos 60 mM pH=6 2,6 dimetoxifenol 2 mM 1 matraz erlenmeyer de 250 ml con 50 ml de medio liquido GMY esteril 2 matraces erlenmeyer de 250 ml con 50 g de avena y 30 ml de buffer fosfatos 60 mM pH=6 estril cada uno Cinta testigo, masking tape, algodn, gasa, rollo de aluminio, vitafilm, papel, tijeras, marcador, etc

A. CRECIMIENTO E INDUCCIN DE LA PRODUCCIN DE ENZIMAS POR EL MICROORGANISMOa) Inocular en una caja Petri con PDA la cepa del hongo T. versicolor, colocando un pequeo trozo de agar con micelio en el centro de la caja con medio.b) Incubar a 28C por un periodo de 7-10 das para dar oportunidad que el hongo crezca.c) Cortar un trozo de micelio crecido en PDA con el bistur previamente esterilizado y enfriado en agua y aadirlo al recipiente metlico que contiene medio GMY estril, homogenice usando el blender.d) Retorne este homogenizado l matraz Erlenmeyer de donde originalmente se tomo el medio GMY y selle la boca del matraz con tapon de algodn estril y fjelo al matraz con vitafilm.e) Colocar los matraces en un agitador orbital e incubar a 28-30C durante 4 a 7 das, para promover la formacin de los pellets del hongo.f) Aada aproximadamente de 30-50 ml de los pellets crecidos en medio GYM al recipiente de acero inoxidable y homogenicelos. De ah coloque este homogenizado en la avena humedecida con buffer fosfatos, mezcle con una esptula o agitador estriles para que el hongo quede esparcido en toda la avena. Selle la boca del matraz con tapn de algodn estril y fjelo al matraz con vitafilm.g) Coloca la avena humedecida con buffer fosfatos inoculada con el hongo en la oscuridad a 28 C durante 20-30 das. Al sptimo da se observar que el micelio de color blanco invadi completamente al grano. Realice la extraccin de la enzima del da 20 al 30 para obtener una mxima expresin de la enzima.B. EXTRACCIN DE LA LACASAa) Aada 100 ml de buffer acetatos pH=5 al cultivo de T. versicolor crecido en la avena humedecida con buffer fosfatos y mezcle con una esptula o varilla de vidrio y filtre en una gasa. Centrifugue el sobrenadante a 15000 rpm por 5 min. Y utilice el sobrenadante para realizar el ensayo enzimtico de la lacasa.C. ENSAYO ENZIMTICOa) Dispense las cantidades indicadas de cada reactivo para completar un volumen total de 2000 l de acuerdo a la siguiente tabla:Buffer acetatos1800170016001400900

2,6-dimetoxifenol100100100100100

Extracto enzimtico1002003005001000

b) Cada columna indica un ensayo, inicie del que tenga la mayor cantidad de extracto enzimtico y micelios con los respectivos volmenes de 2,6-DMF y buffer. Considere que el blanco es el extracto mas el buffer.c) Mida el incremento de la Absorbancia a 477 nm y determine la actividad especfica en UI/ml a los diferentes tiempos tomando en cuenta que el coeficiente de absortividad molar del 2,6-DMF a 477 nm es de: = 0.0148 M-1cm-1

Resultados:D. Desarrollo de T. versicolor

Ilustracin 1-2. Desarrollo de pelets de T. versicolor, para su homogenizado e inoculacion. Pellets en forma esferica de color crema, pastosos.

Ilustracin 3. Avena estril con buffer (medio solido).Ilustracin 4. Desarrollo de micelio de T. versicolor, sobre avena estril durante 20 das. Micelio blanco algodonoso.

E. Actividad enzimtica de lacasa extrada de T. versicolor, sobre 2,6-dimetoxifenol:

F. Actividad enzimtica de lacasa extrada de Pleurotus ostreatus, sobre 2,6-dimetoxifenol:

Discusin:A. Se ha reportado que la lacasa con un peso molecular de 61.5 kDa y pI de 3.7, capaz de oxidar a un pH de 3.5 ABTS y 2,6-dimetoxifenol a temperaturas de 60C (Matnez, 2010). Se seleccion a Trametesversicolorpor su capacidad para degradar distintos compuestos fenlicos (fenol, cido glico, 2,6-dimetoxifenol y guayacol) como lo comenta el autor y por su habilidad para utilizar el fenol como nica fuente de carbono. Esto se representa en la ilustracin 5, que tiene un color marrn oscuro (oxidacin) donde se mostr muy brusco el vire, teniendo al principio una solucin incolora; al agregar la enzima lacasa junto con el 2,6-dimetoxifenol tenemos una reaccin de oxidacin rpida, cambiando en cuestin de segundos.Bioqumicamente, la lacasa es una enzima que oxida una variedad de compuestos aromticos; cataliza la remocin de un electrn y un protn de hidroxilos fenlicos o de grupos amino-aromticos, para formar radicales libres fenoxilo y radicales amino, respectivamente. De esta manera fue como se logr oxidar al 2,6-dimetoxifenol,aunque los productos iniciales de la oxidacin con lacasa pueden llegar a ser bastante inestables, por lo que pueden sufrir reacciones espontneas de hidratacin o desprotonacin, y de esta manera dan lugar a compuestos insolubles de tipo melanina, o bien produciendo radicales que pueden reaccionar entre ellos mismos formando dmeros, oligmeros o polmeros covalentemente unidos. Cabe mencionar adems que la lacasa oxida directamente al oxgeno molecular a agua a travs de un mecanismo de transferencia de cuatro electrones, de una manera general se puede ver que la actividad cataltica de las lacasas es de tipo ping-pong bisustrato en dos sitios (Petersen y Degn 1978), ya que los productos son liberados antes de que tenga lugar la unin de nuevos sustratos, esto hace a la enzima buena en produccin y de buen rendimiento.Estudios especializados con la estructura de la lacasa de T. versicolor, cristalizada con un sustrato aromtico, sugieren que la transferencia de electrones desde el sustrato a la protena tendra lugar a travs de una de las histidinas que ligan el tomo de cobre (Bertrand et al., 2002). Por este detalle en su estructura, el nmero de sustratos que es susceptible a la oxidacin es muy grande, aunque muy pocos han sido tomados como modelo, y entre ellos se encuentra el reactivo utilizado (2,6-dimetoxifenol), el cual tambin pudo ser comparado en su actividad con otras peroxidasas. Si bien la actividad enzimtica obtenida fue detectable en la medicin espectrofotomtrica debido al mtodo de diluciones que se utiliz donde la cantidad de enzima fue la ms alta en la muestra, puede ser un tanto baja, y esto fue posiblemente ocasionado por la inhibicin en el crecimiento del hongo.Se puede observar cmo es el desarrollo del T. versicolor en las ilustraciones 1 a 4, que como medio de cultivo se utiliz medio GMY, este medio es muy semejante al utilizado originalmente por el Institute of Hygiene and EpidemiologyMycology de Blgica cambiando algunas cantidades de los reactivos (CIT, 1994). Posteriormente, al hacer el licuado de hongo, tuvimos buena respuesta por parte del hongo con la avena como sustrato, como se puede observar en la ilustracin 4, teniendo un desarrollo de micelio blanco algodonoso, muy caracterstico de T. versicolor. Sin embargo, el crecimiento no fue el deseado, ya que al momento de hacer la preparacin en medio slido, la cantidad de medio lquido que qued fue muy alta, de esta manera, el crecimiento se vio inhibido por el alto porcentaje de humedad en el medio.Conclusin:B. El sustrato slido es ideal para el crecimiento de hongos ya que estos no requieren grandes cantidades de humedad en el medio, sin embargo presenta dificultades para el control de pH, humedad y aireacin.Se observ que el sustrato induce la produccin de enzimas especficas por parte del hongo inoculado.El extracto crudo de enzima presenta actividad y degrada el sustrato.Cuestionario:1: Aplicaciones de la fermentacin en sustrato solido Se emplea este proceso defermentacindesde muy antiguo en elLejano Oriente, como por ejemplo en la preparacin delkjienChinay enJapn(arrozcocido y fermentado) es la base de la elaboracin delsak, delteiupehhabitual en la actualidad enIndonesia, elshoyu, elmisoy elontjom.Es frecuente el uso en la elaboracin dearomas artificiales dealimentosBibliografa:C. Garca, M., Quintero, R., & Lpez-Munga, A. (1993). Biotecnologa Alimentaria. Mxico: Limusa.Dustet, J. C., Pea, J. J., & Prez, W. (2002). Evaluacin de un nuevo prototipo de biorreactor para fermentaciones en estado slido de residuos fibrosos. Revista Cubana de Ciencia Agrcola , 36(4), 373-386.Matnez D. et al, (2010), Hacia un Desarrollo Sostenible del sistema de produccin-consumo de los Hongos Comestibles y Medicinales en Latinoamrica: Avances y Perspectivas en el Siglo XXI, Red Latinoamericana de Hongos Comestibles y Mediciales-COLPOS-UNS-CONACYT-AMC-UAEM-UPAEP-IMINAP, Puebla, pg. 193-196.Petersen, L. C. y Degn, H. (1978). Steady-statekinetics of laccasefromRhusvernicifera. Biochim. Biophys. Acta, 526:85-92.CIT, (1994), Informacin Tecnolgica, Vol. 5, N 6, Casilla de Correos 593, La Serena, Chile, pg. 66.Bertrand, T., et al. (2002). Crystalstructure of a four-copperlaccasecomplexedwithanarylamine: insightsintosubstraterecognition and correlationwithkinetics. Biochemistry, 41:7325-7333.