prÁctica 7

FORMATO DE GUÍAS DE LABORATORIO

CODIGO:FO-M-DC-05-01

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UNIVERSIDAD DE LA AMAZONIAFACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

PROGRAMA DE QUÍMICALABORATORIO DE QUÍMICA DE PRODUCTOS NATURALES.PROFESOR: PAULA LILIANA GALEANO GARCÍA. Qco. M.Sc.

PRÁCTICA N° 7. EVALUACIÓN DEL CONTENIDO DE ANTOCIANINAS TOTALES EN FRUTAS, MEDIANTE EL MÉTODO DEL DIFERENCIAL DEL pH.

ANTOCIANINAS

Las antocianinas representan el grupo más importante de pigmentos hidrosolubles detectables en la región visible por el ojo humano (Strack y Wray, 1994). Estos pigmentos son responsables de la gama de colores que abarcan desde el rojo hasta el azul en varias frutas, vegetales y cereales, y se encuentran acumulados en las vacuolas de la célula. Las antocianinas poseen diferentes funciones en la planta como son la atracción de polinizadores para la posterior dispersión de semillas y la protección de la planta contra los efectos de la radiación ultravioleta y contra la contaminación viral y microbiana.

El interés por los pigmentos antociánicos y su investigación científica se ha incrementado en los últimos años, debido no solamente al color que confieren a los productos que las contienen sino a su probable papel en la reducción de las enfermedades coronarias, cáncer, diabetes; a sus efectos antiinflamatorios y mejoramiento de la agudeza visual y comportamiento cognitivo. Por lo tanto, además de su papel funcional como colorantes, las antocianinas son agentes potenciales en la obtención de productos con valor agregado para el consumo humano.

A pesar de las ventajas que ofrecen las antocianinas como sustitutos potenciales de los colorantes artificiales, factores como su baja estabilidad y la falta de disponibilidad de material vegetal limitan su aplicación comercial (Wrolstad, 2000).

ESTRUCTURA DE LAS ANTOCIANINAS Y COLOR

Las antocianinas son glucósidos de antocianidinas, pertenecientes a la familia de los flavonoides, compuestos por dos anillos aromáticos A y B unidos por una cadena de 3 C. Variaciones estructurales del anillo B resultan en seis antocianidinas conocidas (Fig. 1).

El color de las antocianinas depende del número y orientación de los grupos hidroxilo y metoxilo de la molécula. Incrementos en la hidroxilación producen desplazamientos hacia tonalidades azules mientras que incrementos en las metoxilaciones producen coloraciones rojas.



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Aglicona

λMáx (nm)

R1 R2 Espectro- visible

Pelargonidina H H 494 (Naranja)

Cianidina OH H 506 (Naranja- Rojo9

Delfinidina OH OH 508 (Azul- Rojo)

Peonidina OCH3 H 506 (Naranja- Rojo)

Petunidina OCH3 OH 508 (Azul- Rojo)

Malvidina OCH3 OCH3 510 (Azul- Rojo)

Figura 1. Estructura de las antocianinas.

En la naturaleza, las antocianinas siempre presentan sustituciones glicosídicas en las posiciones 3 y/o 5 con mono, di o trisacáridos que incrementan su solubilidad. Dentro de los sacáridos glicosilantes se encuentran la glucosa, galactosa, xilosa, ramnosa, arabinosa, rutinosa, soforosa, sambubiosa y gentobiosa. Otra posible variación en la estructura es la acilación de los residuos de azúcares de la molécula con ácidos orgánicos. Los ácidos orgánicos pueden ser alifáticos, tales como: malónico, acético, málico, succínico u oxálico; o aromáticos: p-coumárico, caféico, ferúlico, sinápico, gálico, o p-hidroxibenzóico. Stintzing et al., 2002, demostraron que el tipo de sustitución glicosídica y de acilación producen efectos en el tono de las antocianinas; es así como sustituciones glicosídicas en la posición 5 al igual que acilaciones aromáticas, producen un desplazamiento hacia las tonalidades púrpura.

ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE LAS ANTOCIANINAS



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El interés en los pigmentos antociánicos se ha intensificado recientemente debido a sus propiedades farmacológicas y terapéuticas. Durante el paso del tracto digestivo al torrente sanguíneo de los mamíferos, las antocianinas permanecen intactas (Miyazawa et al., 1999) y ejercen efectos terapéuticos conocidos que incluyen la reducción de la enfermedad coronaria, efectos anticancerígenos, antitumorales, antiinflamatorios y antidiabéticos; además del mejoramiento de la agudeza visual y del comportamiento cognitivo.Los efectos terapéuticos de las antocianinas están relacionados con su actividad antioxidante.

OBJETIVOS

Cuantificar el contenido de antocianinas totales en diferentes frutales, mediante el método de diferencial de pH.

EQUIPOS Y REACTIVOS

Reactivo Cantidad Equipo Cantidad

Cloruro de potasio 20 g Espectrofotometro UV-Vis 1

Acetato de sodio 20 g Balanza analítica 1

Etanol ó metanol 100 ml Micropipeta 100-100 μL 2

HCl 10 ml

Cada grupo de trabajo debe llevar 4 frutas diferentes, preferiblemente de coloraciones rojas- moradas (uvas, fresas, moras, arándanos) y de la región (uva caimarona, corozo, azulejo). No se debe repetir frutos entre grupos (Ponerse de acuerdo).

Buffer pH: 1.0 (0,025 M de Cloruro de potasio).

Buffer pH: 4.5 (0,4 M de Acetato de sodio).

METODOLOGÍA

1. Extracción de las antocianinas.

5 g de muestra de cada fruta por separado, se someten a maceración con pequeñas cantidades de HCl (0,1- 1.0 %) en metanol o etanol. Se filtra y se completa un volumen de 10 ml.

2. Determinación de la concentración de las antocianinas.

Para la obtención de la concentración de la antocianina, se utiliza el método del diferencial de pH. La antocianina experimenta una transformación reversible con los cambios de pH, manifestando una variación en la absorbancia. La forma oxonium predomina a pH 1.0 y el hemiacetal a pH 4.5. Este



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método permite una rápida y exacta medida de la cantidad de antocianina total, incluso en presencia de pigmentos degradados y otros compuestos interferentes.

- Calentar el equipo, encendiéndolo 30 min antes de iniciar las lecturas.

- Calibrar el equipo usando agua destilada.

- Tomar 300 μL del extracto metánolico y mezclar con 600 μL de buffer pH:1.0, depositar en una cubeta

- Tomar 300 μL del extracto metánolico y mezclar con 600 μL de buffer pH:4.5, depositar en una cubeta.

- Se lee la absorbancia de cada una de las mezclas colocadas en las cubetas en un rango de 400- 700 nm, de tal manera que la absorbancia sea menor de 0,8 UA.

- Se toma la lectura de los picos más altos a pH. 1.0 y a pH: 4.5, así como las lecturas a 700 nm.

La concentración de antocianinas se calcula mediante la siguiente ecuación:

A= (Aλ vis-máx - Aλ 700nm)pH: 1.0 - (Aλ vis-máx - Aλ 700nm)pH: 4.5

Donde:

Aλ vis-máx: Es la lectura del pico más alto a pH:1.0 y a pH:4.5

Aλ 700nm: Es la lectura a 700 nm tanto a pH:1.0 y a pH:4.5

La concentración de la antocianina expresada como cianidina- 3- glucósido en la muestra original se determina con la siguiente fórmula.

C(mg/L) = (A) * 482,82 * (1000/ε)FD

Donde:

449,2: Es la masa molecular de la cianidína-3-glucósido.

ε: Es la absortividad molar. (26.900 g/mol. cm)

FD: Es el factor de dilución.

ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS

- Realizar diagrama de flujo de la metodología propuesta. (Presentar antes de entrar al laboratorio).

- Profundizar el tema de antocianinas.



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- Elaborar listado de materiales y entregar una semana antes al profesor.

CUESTIONARIO

1. Esquematice las reacciones químicas que se llevan a cabo en el experimento del laboratorio (Explicando el mecanismo).

2. Realice una búsqueda bibliográfica de investigaciones en torno a las antocianinas reportadas en las frutas trabajadas en el laboratorio y la actividad biológica que reportan. (Referenciar artículos científicos de revistas indexadas).

BIBLIOGRAFÍA

MIYAZAWA T, NAKAGAWA K, KUDO M, MURAISHI K, SOMEYA K. Direct Intestinal Absorption of Red Fruit Anthocyanins, Cyanidin-3-Glucoside and Cyanidin-3,5-Diglucoside, Into Rats and Humans. J Agric Food Chem. 1999; 47:1083-1091.

STINTZING FC, STINTZING AS, CARLE R, FREI B, WROLSTAD RE. Color and Antioxidant roperties of Cyanidin-based Anthocyanin Pigments. J Agric Food Chem. 2002; 50:6172-81.

STRACK D, WRAY V. The Anthocyanins. In: HARBONE JB, editor. The Flavonoides. Advances in Research Since 1986. Boca Raton FL: CRC Press; 1994. WROLSTAD R E. Anthocyanin Pigments-bioactivity and Coloring Properties. J Food Sci. 2004; 69(5):C419-C425.

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