LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍAPRÁCTICA NÚMERO 7

Facultad de Ciencias MédicasCátedra de MicrobiologíaTercer Semestre

Diagnóstico de infecciones por Estreptococos

PRÁCTICA Nº 7

TEMA: “Diagnóstico de infecciones por estreptococo”

OBJETIVO

Reconocer las características del estreptococo. Aprender diferentes modos de clasificación del estreptococo. Identificación de las diferentes enfermedades producidas por los estreptococos de mayor

importancia médica que son A, B y D. Interpretación de pruebas de ASTO y PCR

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA

Los estreptococos son un grupo grande y heterogéneo de bacterias, algunos son miembros de la flora humana normal, otros se asocian con enfermedades humanas importantes atribuibles en parte a la infección y a la sensibilización a ellos.

MORFOLOGIA

Fig. 1

Son cocos gran positivos esféricos, anaerobios facultativos, todos son catalasa-negativos que se disponen en cadenas cortas o largas de 10-15 esferas. Las cadenas largas tienen el aspecto de un rosario o un collar de perlas violetas, inmóviles.

Los carbohidratos contenidos dentro de la pared de muchos estreptococos forman la base de la clasificación serológica en los grupos de Lancefield A-H y K-U. Esta división ha sido útil para la identificación rápida de algunos patógenos estreptocócicos como por ejemplo el estreptococo pyogenes que causa faringitis estreptocócica.

Grupo A - Streptococcus pyogenes Grupo B - Streptococcus agalactiae Grupo C - Streptococcus equisimilis, Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus dysgalactiae Grupo D - Enterococcus, Streptococcus bovis Grupo E - Streptococcus milleri y Streptococcus mutans

La hemólisis o reacción de las bacterias en una placa de agar sangre es una de las características más útiles que también nos sirve para clasificar a los estreptococos y además representar un criterio de patogenicidad:

1. Beta-hemolíticos: disrupción completa de eritrocitos con formación de un halo notorio (trasparente) de hemólisis alrededor de las colonias

2. Alfa-hemolíticos: lisis incompleta de eritrocitos producen un halo verdoso

3. Gamma-hemolíticos: no producen hemólisis.

Los estreptococos de mayor importancia médica son los de los grupos A, B y DGRUPO A.- Estreptococo Pyogenes, beta hemolítico este es un patógeno considerado prototipo de afección humana que se ve asociado con invasión local o sistémica y trastornos inmunológicos postestreptocócicos.

EPIDEMIOLOGIAMuchos de estos microrgaanismos forman parte de la flor normal y s encuentran en muestra clínicas, como contaminantes o como componentes de cultivos mixtos; su importancia clínica es mínima o desconocida, sin embargo cuando invaden sitios que suelen ser estériles pueden causar infecciones potencialmente mortales. Otros microorganismos en particular S.Pneumoniae y Pyogenes son los patógenos más comunes. Aunque S. Pneumonia puede formar parte de la flora normal de las vías respiratorias superiores, también es la causa principal de neumonía y meningitis bacterianas.De forma similar aunque estreptococo pyogenes pueden encontrarse en las vías respiratorias de los seres humanos portadores es raro que integre la flora normal y debe considerarse clínicamente importante siempre que se encuentre.

PATOGENIA

ESTRUCTURA ANTIGÉNICA:

a) Proteína M.- es un factor importante para la virulencia del S. pyogenes del grupo A. La proteína M tiene la apariencia de prolongaciones semejantes a pelos de la pared celular del estreptococo. Cuando la proteína M esta presente los estreptococos son virulentos y la ausencia de anticuerpos específicos tipo M pueden resistir la fagocitosis efectuada por los leucocitos polimorfonucleares.

b) Sustancia T.- este antígeno no tiene interrelación con la virulencia de los estreptococos. Esta sustancia permite diferenciar ciertos tipos de estreptococos por aglutinación antisueros específicos

c) Nucleoproteínas.- La extracción de estreptococos con un álcali deben produce mezclas de proteínas y otras sustancias con escasa especificidad serológica llamadas: sustancias P.

TOXINAS Y ENZIMAS:

i. Estreptocinasa.- transforma el plasminógeno del plasma humano en plasmina.

ii. Estreptodornasa.- despolimeriza el ADN

iii. Hiaulonidasa.- desdobla el ácido hialurónico en un componente importante de la sustancia fundamental del tejido conectivo.

iv. Exotoxinas pirógenas.- existen 3: A, B y C se han asociado con síndrome de choque tóxico estreptocócico y con fiebre escarlatina.

v. Difosfopiridina nucleotidasa.- esta relacionada con la capacidad de los organismos para matar leucocitos.

ENFERMEDADES ATRIBUIBLES A INVASIÓN

ERISIPELAInfección de los linfáticos de la dermis que causa manifestaciones generales y locales. Entre las generales tenemos escalofrío, fiebre de 40oC dolores articulares y cefalea. Localmente se caracteriza por una placa roja brillante, caliente de tamaño variable, bien delimitada, dolorosa a la presión especialmente en el borde de la placa.

CELULITISInfección aguda de la piel y tejidos subcutáneos de rápida diseminación. Se presenta con dolor, hipersensibilidad, tumefacción y eritema asociada con un trauma leve, quemaduras, heridas o incisiones quirúrgicas.

FASCITIS NECROTIZANTE (GANGRENA ESTREPTOCÓCICA)Se presenta necrosis extensa de la piel y tejidos subcutáneos que se disemina rápidamente. A causa de la fascitis necrotizante los estreptococos han recibido el nombre de “bacterias devoradoras de carne”.

ENFERMEDADES ATRIBUIBLES A INFECCIÓN LOCAL FARINGOAMIGDALITIS ESTREPTOCÓCICA

Infección súbita, con dolor de garganta, escalofríos y fiebre. La cefalea y el mal estado general son también frecuentes. Al examen físico la faringe esta habitualmente enrojecida con presencia frecuente de exudados; linfoadenopatía cervical puede ser prominente. ENFERMEDADES POSTESTREPTOCÓCICAS

GLOMERULONEFRITIS AGUDAEstá puede desarrollarse en ocasiones 3 semanas posteriores a la infección de la piel (piodermia o impétigo) Los complejos antígeno-anticuerpo inician la glomerulonefritis el antígeno más importante está en la membrana del protoplasto del estreptococo.El paciente en fase aguda desarrolla oliguria, hematuria, proteinuria, hipertensión arterial y edemas.

Grupo B: Streptococcus agalactiae, betahemolítico, miembro de la flora normal, agentes de meningitis, y sepsis neonatal

Grupo D: Streptococcus faecalis (Enterococo) y S. bovis o S. equinus (no enterococos) alfahemóliticos

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIOTinción gramCultivos primarios y diferencialesPruebas de identificaciónPruebas serológicas

MEDIOS DE CULTIVO

AGAR SANGRE.- Contiene hematíes de cordero 5 a 10%, demuestra reacciones de hemólisis profunda en los piques. Mejor definición con C02 al 10%. COLONIA: pequeña, translúcida o blanquecina, lisa brillante, de bordes completos, con halo de hemólisis completa y un punto negro central

TSA (AGAR-SANGRE CON SOYA TRIPTICA).-buena definición de hemólisis beta

PRUEBAS DE IDENTIFICACION

Prueba de la bacitracina (disco taxo A)Prueba de CampPrueba de anticuerpo fluorescente.Prueba PYRPrueba de reacción de QuellungPrueba de la solubilidad en bilisPruebas serológicas: ELISA, coaglutinación, anti DNAsa, anti hialuronidasa, ASTO, PCR.Pruebas antigénicas: inmunocromatográfica de muestra faríngea.

PRUEBA DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO: ASTO, ASO o Antiestreptolisina O

Método de semicuantificación que mide la respuesta de anticuerpos generados por la presencia de la estreptolisina del Estreptococo pyogenes

MATERIALES Centrífuga de 2.500 r.p.m.Mezclador, Jeringuillas de 5 ml.Tubo tapa roja de 10 ml de capacidad Tubo pequeño de 5 ml de capacidadLáminas oscuras con celdillas de 18 mm de diámetroPipetas automáticas graduablesPuntas amarillas, Torundas, Torniquete Palillos, Separadores de sueroTimerReactivo de ASTOControles de sueros humanos estabilizados (positivo – negativo)

PROCEDIMIENTO CUALITATIVO Utilizando una pipeta, se dispensa una gota de suero del paciente (0,05 ml) en un anillo de la

lámina, se utiliza suero sin diluir no plasma. Mezclar y homogenizar el reactivo de ASTO y agregar una gota junto al suero Mezclar con un palillo las dos gotas y extenderlas en toda la superficie del círculo Hacer rotar la lámina en forma de 8 horizontal o ponerla sobre el rotor durante 2 minutos Observar si se producen grumos o partículas grandes o gruesas; si no existen las partículas

quiere decir que no hay aglutinación.

RESULTADOSi existe aglutinación PRUEBA POSITIVASi no existe aglutinación PRUEBA NEGATIVA

El resultado es expresado en Unidades TOOD (UT)

INTERPRETACIÓNAdultos <160 UT/mlNiños menores de 2 años < de 50 UT/mlNiños entre 2 y 4 años < de 160 UT/mlNiños entre 4 y 12 años 160 - 300 UT/mlFiebre Reumática 500 UT/ml

Fiebre reumática con complicación 5000 UT/mlFiebre reumática inactiva 120-150 UT/ml

FALSOS POSITIVOSPor el uso de sueros hemolizados, contaminados o lipémicosExceso de tiempo de reacción por desecación de la muestra

FALSOS NEGATIVOSCuando hay exceso de antígeno no se produce la aglutinación (fenómeno de prozona) si hay sospecha clínica se puede repetir el procedimiento con dilución del suero 1:10

PRUEBA DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO: PCRProteína .C. Reactiva

FUNDAMENTO DE LA TÉCNICAEn la cápsula del neumococo existe una sustancia “C”, que es un ácido teicoico que contiene colina como parte de la pared celular, esta sustancia reacciona con una beta globulina que se llama proteína “C” que se encuentra en el suero del paciente. Esta proteína forma un complejo que activa la cascada del complemento y da origen a la emisión de mediadores inflamatorios. El método se fundamenta en una reacción de aglutinación de una suspensión de partículas de látex polietileno sensibilizadas con anticuerpos altamente purificados de anti proteína C-reactiva. La aglutinación es visible a una concentración de PCR en suero igual o superior a 6mg/L

MATERIALES Reactivo de látex P.C.R.Controles de sueros humanos estabilizados (positivo – negativo)Lámina de vidrio con círculos grabadosPipetas dispensadorasPalillosPROCEDIMIENTO CUALITATIVO (MÉTODO RÁPIDO) Utilizando una pipeta, se dispensa una gota de suero del paciente (0,05 ml) en un anillo de la

lámina Mezclar y homogenizar el reactivo de P.C.R. y agregar una gota junto al suero Mezclar las dos gotas y extenderlas en toda la superficie del círculo Hacer rotar la lámina en forma de 8 horizontal o ponerla sobre el rotor durante 2 minutos

RESULTADOSi existe aglutinación PRUEBA POSITIVASi no existe aglutinación PRUEBA NEGATIVA

INTERPRETACIÓN Debido a que la PCR es un examen general, un resultado positivo puede indicar cualquier estado inflamatorio agudo bacteriano, viral o inmune, así en la fiebre reumática, en infarto de miocardio con necrosis, en procesos neoplásicos con amplias metástasis, artritis reumatoide, tuberculosis, neumonía neumocócica, lupus, enfermedades del colágeno.También se observan resultados positivos en PCR durante la segunda mitad del embarazo o con el uso de anticonceptivos orales.La proteína C reactiva se encuentra también en otros fluidos corporales asociados a estados inflamatorios como: peritoneal, sinovial o en cualquier otro exudado seroso o inflamatorio.Es una prueba muy sensible pero no es específica para un determinado estado inflamatorio, sin embargo, una persona completamente sana y de buena salud registra una de P.C.R. totalmente negativa.

Existe también el método semicuantitativo por diluciones seriadas del suero que se investiga en 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Es de utilidad estas mediciones a intervalos de tiempo para evaluar la eficacia de la terapia en el tratamiento de pacientes con fiebre reumática aguda, es decir como índice de recuperación clínica

TEMA DE CONSULTA.-

Cuáles son las hemolisinas del estreptococo características de cada una de ellas ¿Qué acción cumple los estreptococos en la fiebre puerperal? ¿A qué antibiótico es susceptible el Estreptococo Pyogenes? Consultar enfermedades producidas por enterococos

BIBLIOGRAFÍA.

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Microbiología Clínica, Guillermo Prats.