Prctica 6

Prctica 6 del 18 al 25 de Junio 11 de febrero.

Lunes 8

10 Cajas de Petri con agar nutritivo.

Jueves 18.

1. Preparar Medio para reactor e inculo: Medio para biorreactor 2.5 L, 4 matraces de 500 mL con 300 mL para inculo. 2. Del medio anterior recuperar 100 ml agregar 1.5 g de agar y preparar tubos inclinados3. Realizar tincin de Gram y cuenta en placa del medio antes de esterilizar. 4. Preparar10 tubos de ensaye de 20 mL estriles para el muestreo.5. Preparar charolas para peso seco. 6. Montar reactor, esterilizar, tomar muestra de medio estril y hacer cuenta en placa (directa) y tincin de gram.7. Inocular en la noche los cuatro matraces del inculo 8. Preparar sustrato, Sacarosa 30 g/L de buffer de acetatos 0.025 M, pH 5.

Lunes 22

Inocular el reactor (al 10 % v/v de inculo) a las 8 AM e iniciar el muestreo, La cintica se seguir por 24 h, tomando una muestra de 15 mL a cada tiempo para todo el grupo.

Operacin de Biorreactor 150 rpm, aireacin de 1 vvm y 28 C

1 mL para determinaciones de biomasa por DO y cuenta directa, los 14 mL restantes se centrifugan, se recupera el sobrenadante y refrigera (se puede refrigerara y luego centrifugar). Con la pastilla, determinar peso seco.

Se va a determinar:

Por Grupo pH, Peso Seco (de la pastilla) DO y Tincin de gram (el frotis tres tiempos inicio, medio y final)

Jueves 25Por equipo Protena (0.25 mL por triplicado .75 mL) = 5.25 mLAE (.05 mL x 3= .15 mL) =1.2 mLDNS (.1 x 3= .3) = 2.1 mL.

AE: .900 ml de sacarosa 30g/l de buffer de acetatos 0.025 M pH 5 y 0.1 ml de sobrenadante del cultivo. Dejar reaccionar 3 min.

Toma de muestra: 1. El Biorreactor (BR) ya tiene el tubo para la toma de muestra, 2. Colocar un mechero cerca para evitar contaminacin (no se quemen) 3. Abrir la llave del puerto de muestreo y tomar la muestra haciendo vaco con la jeringa 4. Cerrar la lleve del puerto5. Tener un segundo tubo estril listo 6. Sacar el tubo con cuidado y taparlo con el tapn del siguiente tubo estril y colocar el tubo en el puerto para la siguiente muestra.7. Tomar 1 ml para DO (600 nm) y Cuenta (para el blanco de D.O. tomar medio de cultivo estril fresco)8. Pasar 13 mL (exactos) de la muestra restante a un tubo Falcn, centrifugar y separar sobrenadante para anlisis (guardar en otro falcn limpio y en REFRIGERACIN bien etiquetado con numero de muestra, hora, grupo etc etc ) Si no tienen tiempo o la centrifuga guardar la muestra en refrigeracin y centrifugar a la hora de clase. 9. La pastilla celular se resuspende en 1 mL de sol salina y se pasa a la charola y se lleva a secar a 60-70 C/24 h. Las charolas estn ya marcadas con marcador (1,2,3 y pesadas) MANIPULAR con pinzas , NO tocar con las manos. 10. Si sobra cultivo de la muestra guardarlo en refrigeracin bien etiquetado 11. Del resto de la muestra determinar D.O en el mismo espectrofotmetro que es el lambda que est junto (si hay que hacer diluciones, se dejara medio de cultivo fresco) 12. Determinar pH con las tiras y con potencimetro (en el sobrenadante clarificado o en el cultivo).

TODO el material est en la gaveta o cerca del reactor.

NO DEJAR papeles, residuos o lo que sea en ningn momento

Cuando haya otra clase, solicitar permiso al maestro y hacer las actividades en orden y hacer el mnimo ruido.

A la hora de clase, si no se pudo hacer, se realizara el centrifugado, cuenta directa, cuenta en placa (de lo que se tenga), pH , etc.

Las muestras ya centrifugadas se guardaran en refrigeracin y el lunes se determinar a cada una

Determinar al sobrenadante clarificado:

Protena (0.25 mL por triplicado .75 mL) = (sera la enzima extracelular ) AE (.1 mL x 3= .3 mL) = 0.1mL es del sobrenadante).DNS (.1 x 3= .3) = Sustrato hidrolizado en el sobrenadante

Por cada muestra tener tres tubos con 900 mL de sacarosa 30 g/L de buffer de acetatos 0.025 m pH 5, y agregar 0.1 mL del sobrenadante del cultivo y dejar reaccionar 3 min y pasar 0.1 mL a un tubo con 0.1 mL de DNS y determinar azcares reductores.