PRACTICA 6 Esterilizacin y Preparacin de Medios de Cultivo

PARTE I Objetivos Comprender los diferentes medios de cultivo e identificacin de los microorganismos previo conocimiento de sus requerimientos nutricionales Introduccin Para el estudio de los microorganismos es indispensable contar entre otras cosas con material y medios de cultivo estriles. En Microbiologa la esterilizacin se define como el proceso mediante el cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas de resistencia) de un objeto, medio o superficie y su aplicacin garantiza la ausencia de microorganismos en el material y medios de cultivo a ser empleados. Existen diversos mtodos de esterilizacin, entre ellos: calor (seco o hmedo), filtracin (para sustancias termolbiles y aire), radiaciones y aplicacin de gas de oxido de etileno (para jeringas y cajas de plstico). Un medio de cultivo est constituido por una mezcla de agua y sustancias orgnicas e inorgnicas, los que en conjunto proporcionan los requerimientos nutricionales para el desarrollo de los microorganismos. La composicin de los medios de cultivo vara en funcin de: a) grupo microbiano que se pretende estudiar, b) complejidad qumica, c) estado fsico, y d) aplicacin. Material por grupo: Balanzas granatarias Potencimetro Esptulas Tiras de papel kraft (para envolver pipetas) Agua destilada Agar papa dextrosa Tripticasa soya agar (medio de cultivo slido deshidratado) Agar sal y manitol Caldo malonato Solucin de NaOH 1.0 N, Solucin de HCl al 10% Material por equipo: Tripie Charola metlica para tripi 1 Matraz Erlenmeyer de 50 mL 2 Matraz Erlenmeyer de 250 o 300mL

5 tubos de ensaye 16* 50 Probeta de 100 o 250 mL Varilla de vidrio Gradilla Pipeta de 10 mL Pipetas Pasteur (esterilizar para la siguiente clase) Cajas Petri estriles Asa bacteriolgica Material que deben tener los alumnos: Mecheros Piseta Papel kraft o de estraza Maskin-tape Plumones indelebles de punto grueso PROCEDIMIENTO Preparacin y esterilizacin de material de vidrio. 1. Lavar material con detergente lquido, enjuagar con abundante agua de la llave y al final con agua destilada. 2. Secar el material de vidrio de preferencia en horno, o secadora de cabello. 3. En el papel de la envoltura identificar con nombre y marcar el volumen de las pipetas. 7. Introducir el material en un horno previamente calentado a 180C, esperar a que la temperatura se estabilice nuevamente y a partir de este momento contar el tiempo de esterilizacin (1 hora). Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo. Medio de cultivo lquido 1. Leer cuidadosamente el instructivo de preparacin. 2. Calcular la cantidad necesaria para preparar 100 mL de caldo del medio de cultivo y 40 ml para cada medio solido 3.-Pesar la cantidad de medio y evitar que la humedad del ambiente no afecte el resto del contenido del frasco. 4. Disolver el medio en de agua destilada en un matraz de 250 mL, para el medio lquido y de 50 mL para los del medio slido 5. Ajustar el pH entre 6.8 y 7.2. 6. Colocar 10 mL de caldo en 5 tubos de 16x150 c/u 7.- Disolver el medio segn las instrucciones y autoclavear a una presin de 15 lb/in2 por 15 min. Antes de abrir la autoclave asegrese de que la presin de la olla ya este en cero (siga las instrucciones de su profesor y tenga CUIDADO!) 8.-Una vez estril los medio slidos enfriar poco y depositar aproximadamente 20 mL del medio slido en las cajas Petri segn corresponda el medio. Las cajas deben estar previamente rotuladas

9.- Una vez slidos los medios se sellan con parafin, de acuerdo con las instrucciones de tu profesor. Investigacin previa 1.- Investigue cuales son el requerimiento nutricionales de las bacterias entricas 2.- Investigue las temperaturas y tiempo de incubacin de bacterias y hongos 3.- Investigue el uso del contador de colonias

PARTE II

Tcnicas de sembrado 1.- La presente tcnica es para el aislamiento y seleccin del microorganismo de bacterias, a continuacin se presenta una tcnica de sembrado en cuatro cuadrantes Tecnica de sembrado por agotamiento

2.- Los hongos se sembraran con la tcnica de agotamiento, o por picadura segn indique el profesor. 3.- Realizar las incubaciones de las siembras a una temperatura segn corresponda el microorganismo. 4.- Tomar lectura del crecimiento del microorganismo segn corresponda, Tomar datos como a.- Num. De colonias (utilizar el contador de colonias el cual se ver previamente su uso en clase de laboratorio) b.- Elevacin c.- Textura aparente d.- Aspecto (seco, hmedo) sellar la caja con parafin 5.- Refrigerar para que en la siguiente practica se realice la esterilizacin de los medios.