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PRACTICA N° 2

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS PARA EL AISLAMIENTO DE VIRUS EN CULTIVO DE CÉLULAS

- PRACTICA DEMOSTRATIVA –

Msc. William H Roldán

1. MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA EL CULTIVO DE CÉLULAS EN MONOCAPA E EN

SUSPENSIÓN

1.1. MEDIO DE CULTIVO ESENCIAL MINIMO (MEM)

Es uno de los medios más utilizados de todos los medios de cultivo celular. MEM se puede

utilizar con una variedad de células de mamíferos adherentes y en suspensión, incluyendo

HeLa, BHK-21, 293, HEP-2, HT-1080, MCF-7, fibroblastos y astrocitos de rata.

Este medio de cultivo fue desarrollado por Harry Eagle, basado en su formulación anterior de

medio basal de Eagle (BME). Muchas otras modificaciones del MEM siguieron, incluso de

Glasgow’sMEM, MEM α, DMEM, Temin’s MEM. Este medio contiene las sales de Earle para su

uso en una incubadora de CO2, o con sales de Hanks para el uso sin CO2. Este medio de cultivo

no contiene factores de crecimiento, proteínas o lípidos. Por lo tanto, se hace necesaria la

suplementación con suero fetal bovino en un 10% de concentración final. MEM usa un

sistema tampón bicarbonato de sodio (2.2 g/L) y por lo tanto requiere un entorno de CO2 al 5 o

10% para mantener el pH fisiológico.

1.2. MEDIO ESENCIAL MÍNIMO MODIFICADO POR DULBECCO (DMEM)

Es un medio basal ampliamente utilizado para apoyar el crecimiento de una amplia gamma

células de mamífero, tales como fibroblastos primarios, neuronas, células gliales, células

HUVEC, y células de músculo liso. También soporta el cultivo de diversas líneas celulares, tales

como HeLa, 293, COS-7, y PC-12.

El medio DMEM es único de otros medios de cultivo, ya que contiene 4 veces la concentración

de aminoácidos y vitaminas que el medio esencial mínimo original de Eagle. El medio DMEM

ha sido formulado con bajo nivel de glucosa (1 g/L) y piruvato de sodio, pero se usa a menudo

con niveles más altos de glucosa, con o sin piruvato de sodio. Este medio de cultivo no

contiene factores de crecimiento, proteínas o lípidos, siendo necesaria la suplementación con

suero fetal bovino en un 10% de concentración final. DMEM usa un sistema tampón

bicarbonato de sodio (2.2 g/L) y por lo tanto requiere un entorno de CO2al 5 o 10% para

mantener el pH fisiológico.

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1.3. MEDIO DE CULTIVO RPMI 1640

Conocido originalmente como el medio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, este

medio de cultivo fue desarrollado originalmente para cultivo de células leucémicas humanas

en suspensión y en monocapa. Sin embargo, este medio también es adecuado para una

variedad de células de mamífero, incluyendo a células HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC,

astrocitos y carcinomas.

El medio RPMI 1640 es único, ya que contiene el agente reductor glutation y altas

concentraciones de vitaminas. El medio RPMI 1640 que contiene biotina, vitamina B12, y

PABA, que no se encuentran en el medio esencial mínimo de Eagle o el medio de Eagle

modificado por Dulbecco (DMEM). Además, el inositol, la colina y las vitaminas están

presentes en concentraciones muy altas. El medio RPMI 1640 no contiene factores de

crecimiento, proteínas o lípidos, siendo necesario la suplementación de un 10% de suero fetal

bovino. Además, el medio RPMI 1640 utiliza un sistema de tampón de bicarbonato de sodio

(2.0 g/L) y por lo tanto requiere un entorno de CO2 de 5 a 10% para mantener el pH fisiológico.

2. SOLUCIONES TAMPONADAS PARA EL TRANSPORTE Y LAVADO DE CÉLULAS

2.1. SOLUCIÓN SALINA TAMPONADA CON FOSFATO DE DULBECCO (1954)

Es una solución salina equilibrada utilizada para una variedad de aplicaciones de cultivo de

células, tales como células de lavado antes de la disociación, las células que transportan o

tejida, diluyendo las células para el recuento, y la preparación de los reactivos. Las

formulaciones con calcio y magnesio se utilizan generalmente como medios de transporte o

para la preparación de reactivos.

2.2. SOLUCIÓN SALINA EQUILIBRADA DE HANK (HBSS)

Esta solución se utiliza para una variedad de aplicaciones de cultivo de células, tales como

células de lavado antes de la disociación, las células que transportan o muestras de tejido,

diluyendo las células para el recuento, y la preparación de los reactivos. Las formulaciones con

calcio y magnesio se utilizan generalmente como medios de transporte, o para la preparación

de reactivos.

2.3. SOLUCIÓN SALINA EQUILIBRADA DE EARLE (EBSS)

Esta solución se utiliza para una variedad de aplicaciones de cultivo de células, tales como

células de lavado antes de la disociación, las células que transportan o tejido, diluyendo las

células para el recuento, y la preparación de los reactivos. Las formulaciones con calcio y

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magnesio se utilizan generalmente como medios de transporte o para la preparación de

reactivos.

3. SOLUCIONES UTILIZADAS PARA EL DESPRENDIMIENTO DE CÉLULAS

3.1. SOLUCIÓN DE TRIPSINA 0.25% /EDTA 1MM

Contiene tripsina, una enzima proteolítica derivada de páncreas porcino que cliva la región c-

terminal de los residuos aminoácidos lisina o arginina de una cadena polipeptídica. Debido a su

fuerza digestiva, la tripsina se utiliza ampliamente para la disociación celular, pasaje de cultivo

celular y la disociación de tejido primario. La concentración de tripsina requerida para la

disociación varía con el tipo celular y las necesidades experimentales.

3.2. SOLUCIÓN DE COLAGENASA (50 A 200 UI/ML) EN HBSS

La colagenasa es una proteasa que cliva la unión entre un aminoácido neutral (X) y la glicina en

la secuencia Pro-X-Gly-Pro, que se encuentra con alta frecuencia en el colágeno. La colagenasa

es única entre las proteasas por su capacidad para degradar las fibrillas de colágeno nativo que

se encuentran comúnmente en los tejidos conectivos tales como la piel, tendones, vasos

sanguíneos y los huesos. La desagregación por colagenasa es adecuada para el cultivo de

tumores humanos, células de riñón de ratón, de cerebro fetal o adulto humano y epitelio. La

colagenasa es relativamente suave, disociando bien a las células a temperatura y pH

fisiológicos y no requiere agitación mecánica o equipo especial.

MEDIOESENCIAL MÍNIMO MODIFICADO POR DULBECCO (DMEM)

Componentes Concentración (mg/L) mM

Aminoácidos

Glycine 30 0.40

L-Arginine hydrochloride 84 0.40

L-Cystine 2HCl 63 0.20

L-Glutamine 584 4.00

L-Histidine hydrochloride-H2O 42 0.20

L-Isoleucine 105 0.80

L-Leucine 105 0.80

L-Lysine hydrochloride 146 0.80

L-Methionine 30 0.20

L-Phenylalanine 66 0.40

L-Serine 42 0.40

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L-Threonine 95 0.80

L-Tryptophan 16 0.08

L-Tyrosine disodium salt dihydrate 104 0.40

L-Valine 94 0.80

Vitaminas

Choline chloride 4 0.03

D-Calcium pantothenate 4 0.01

FolicAcid 4 0.01

Niacinamide 4 0.03

Pyridoxine hydrochloride 4 0.02

Riboflavin 0.4 0.00

Thiamine hydrochloride 4 0.01

i-Inositol 7.2 0.04

Sales inorgánicas

Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) 200 1.80

Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) 0.1 0.00

Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.) 97.67 0.81

Potassium Chloride (KCl) 400 5.33

Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 3700 44.05

Sodium Chloride (NaCl) 6400 110.34

Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O) 125 0.91

Otros Componentes

D-Glucose (Dextrose) 4500 25.00

Phenol Red 15 0.04

MEDIO DE CULTIVO RPMI 1640

Componentes Concentración (mg/L) mM

Aminoácidos

Glycine 10.00 0.13

L-Arginine 200.00 1.15

L-Asparagine 50.00 0.38

L-Aspartic acid 20.00 0.15

L-Cystine 2HCl 65.00 0.21

L-Glutamic acid 20.00 0.14

L-Glutamine 300.00 2.05

L-Histidine 15.00 0.10

L-Hydroxyproline 20.00 0.15

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L-Isoleucine 50.00 0.38

L-Leucine 50.00 0.38

L-Lysine hydrochloride 40.00 0.22

L-Methionine 15.00 0.10

L-Phenylalanine 15.00 0.09

L-Proline 20.00 0.17

L-Serine 30.00 0.29

L-Threonine 20.00 0.17

L-Tryptophan 5.00 0.02

L-Tyrosine disodium salt dihydrate 29.00 0.11

L-Valine 20.00 0.17

Vitaminas

Biotin 0.20 0.00

Choline chloride 3.00 0.02

D-Calcium pantothenate 0.25 0.00

Folic acid 1.00 0.00

Niacinamide 1.00 0.01

Para-AminobenzoicAcid 1.00 0.01

Pyridoxine hydrochloride 1.00 0.00

Riboflavin 0.20 0.00

Thiamine hydrochloride 1.00 0.00

Vitamin B12 0.01 0.00

i-Inositol 35.00 0.19

Sales inorgánicas

Calcium nitrate (Ca(NO3)2 4H2O) 100.00 0.42

Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.) 48.84 0.41

Potassium chloride (KCl) 400.00 5.33

Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 2000.00 23.81

Sodium Chloride (NaCl) 6000.00 103.45

Sodium Phosphate dibasic (Na2HPO4) anhyd. 800.00 5.63

Otros Componentes

D-Glucose (Dextrose) 2000.00 11.11

Glutathione (reduced) 1.00 0.00

Phenol Red 5.00 0.01

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SOLUCIÓN DE TRIPSINA 0.25% /EDTA 1mM

Componentes Peso (g/L) Concentración (mM)

Tripsina 2.5 0.105

EDTA tetra sódico 4H2O 0.38 1

PBS (c.s.p) 1L -

BUFFER FOSFATO SALINO (PBS) SEGÚN DULBECCO, 1954

Componentes Peso (g/L) Concentración (mM)

NaCl 8.0 137.9

Na2HPO4 1.15 8.1

KH2PO4 0.2 1.47

KCl 0.2 2.6

MgCl2 0.047 0.49

CaCl2 0.1 0.9

SOLUCIÓN DE SALES BALANCEADAS (HBSS) SEGÚN HANKS, 1949

Componentes Peso (g/L) Concentración (mM)

NaCl 8.0 137.9

Na2HPO4 0.05 0.34

KH2PO4 0.06 0.44

KCl 0.4 5.3

NaHCO3 0.35 4.16

MgCl2.6H2O 0.1 0.49

MgSO4.7H2O 0.1 0.40

CaCl2 0.14 1.26

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TABLA N° 1

LÍNEAS CELULARES Y MEDIOS DE CULTIVO RECOMENDADOS POR LA ATCC

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TABLA N° 2

LINEAS CELULARES UTILIZADAS PARA EL AISLAMIENTO DE DIFERENTES TIPOS DE VIRUS

REFERENCIAS:

Eagle H. Amino acid metabolism in mammalian cell cultures. Science. 1959; 130 (3373): 432-437.

LockartRz Jr, Eagle H. Requirements for growth of single human cells. Science. 1959; 129 (3344): 252-254.

Dulbecco R, Freeman G. Plaque production by the polyoma virus. Virology. 1959; 8(3): 396-397.

Dulbecco R, Vogt M. Plaque formation and isolation of pure lines with Poliomyelitis viruses. J. Exp. Med. 1954;98: 167-182.

Hanks JH Wallace RE. Relation of Oxygen and Temperature in the Preservation of Tissues by Refrigeration. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1949; 71: 196-200.

Moore GE, Gerner RE, Franklin HA. Culture of normal human leukocytes. JAMA. 1967; 199(8): 519-524.