Practica 1Uso del MicroscopioBiologa de protistas y algas. Grupo 5277Carlos Duran Ramrez y Noe Becerra Lobato.Facultad de Ciencias UNAM

09 Febrero 2015

Leeuwenhoek fue el primero en asomarsea un mundo nuevo, poblado de millaresde especies de seres pequesimos, nin-gn poeta ni historiador alguno evoca la figurade Leeuwenhoek, porque su vida fue una luchanica, tenaz, contra las mayores dificultades.Cuando en Leeuwenhoek naci el deseo de ha-cer investigaciones, la investigacin cientficaan no haba llegado a ser una profesin, eraaquel un mundo en que la ciencia empezaba aensayar sus primeros pasos, la ciencia que noes otra cosa sino el intento de aproximarse ala verdad mediante la observacin cuidadosa yel pensar despejado.

Objetivo:

Que el alumno aprenda a utilizar con destreza ycon cuidado el microscopio ptico y estereoscpico.

Introduccion

El microscopio es la herramienta necesaria parapoder observar a los microorganismos, como bacteriasy protozoarios. Es un instrumento ptico que amplificala imagen de los objetos pequeos, por lo que desdesu descubrimiento se ha convertido en el equipo msutilizado para el estudio de los microorganismos yobjetos que no podemos ver a simple vista. En laactualidad existe un gran nmero de microscopios,pero todos parten del mismo principio: mediante un

sistema de lentes y de iluminacin se logran hacervisibles organismos y objetos microscpicos, a cieno cientos de miles de veces. El primer microscopiosolo lograba aumentar el tamao de los organismosde 50 a 300 aumentos, ya que constaba de una lentecasi esfrica montada entre dos placas metlicas, lamuestra se colocaba sobre un pequeo alfiler y lailuminacin era proporcionada por la luz solar. Losmicroscopios pticos actuales surgieron a principiosdel siglo XIX y su caracterstica principal es que soncompuestos, lo cual quiere decir que tienen dos lentes,un ocular y un objetivo. Las fuentes de luz que seemplean para este tipo de microscopios son diversas yde ah surge una gran diversidad de modelos y tiposde microscopios pticos, por mencionar algunos:

Microscopio ptico de campo claro

Microscopio ptico de contraste de fases

Microscopio de fluorescencia

Microscopio confocal

Microscopio ultravioleta

Microscopio de luz polarizada

Los microscopios pticos Figura 1, tienen los si-guientes componentes:

a) Oculares

b) Revolver

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Figura 1: Microscopio ptico.

c) Brazo

d) Desplazamiento platina

e) Macromtrico

f) Micromtrico

g) Encendido y control de iluminacin

h) Base

i) Foco

j) Condensador

k) Control de desplazamiento platina

l) Platina

m) Objetivos

Parte mecanica

Sistema de soporte o esttico:Pie, brazo, tubo, platina y revolver.

PIE: Sirve como base del microscopio y tiene unpeso suficiente para dar estabilidad al aparato.Su forma puede variar dependiendo del modeloy la marca. En l se integra la fuente luminosa.

BRAZO: Es una columna perpendicular al pie.Puede ser arqueado o vertical y une al pie con eltubo.

TUBO: Es una cmara oscura unida al brazomediante una cremallera. Tiene el revolver conlos objetivos en su parte inferior y los ocularesen el extremo superior.

PLATINA: Es una plataforma horizontal conun orificio central, sobre el que se coloca la pre-paracin, que permite el paso de los rayos pro-cedentes de la fuente de iluminacin situada pordebajo. Dos sujetadores sirven para detener elportaobjetos sobre la platina y un sistema decremallera guiado por dos tornillos de desplaza-miento permite mover la preparacin de adelantehacia atrs o de izquierda a derecha y viceversa.En la parte posterior de uno de los laterales seencuentra una rejilla que permite fijar las coorde-nadas de cualquier campo ptico; para localizarde forma inmediata un punto de observacin.

REVOLVER: Es el sistema que sostiene losobjeticos y que gira para utilizar un objetivo uotro.

Sistema de ajuste:Tornillo macromtico y micromtrico.

TORNILLO MACROMTRICO Y MI-CROMTRICO: sus tornillos de enfoque, mue-ven la platina hacia arriba y hacia abajo. Elmacromtrico lo hace de forma rpida y el mi-cromtrico de forma lenta. Llevan incorporadoun bando de bloqueo que fija la platina a unadeterminada altura.

Parte ptica:Fuente de iluminacin, condensador y diafragma, len-tes oculares (10x y 12x) y objetivos (4x, 10x, 40x y100x).

FUENTE DE ILUMINACIN: Se trata deuna lmpara halgenada de intensidad gradua-ble. Est ubicada en el pie del microscopio. Seenciende y se apaga con un interruptor.

CONDENSADOR Y DIAFRAGMA: Elcondensador es un sistema de lentes situadasbajo la platina, su funcin es la de concentrar laluz generada por la fuente de iluminacin haciala preparacin. En el interior del condensadorexiste un diafragma (iris) cuya funcin es limi-tar el haz de rayos que atraviesa el sistema de

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lentes iluminando los rayos desviados (regula lacantidad de luz y ajusta la apertura numrica).

OCULARES: Estn colocados en la parte su-perior del tubo. Su funcin es la de captar y am-pliar la imagen formada en los objetivos. En losmicroscopios actuales hay dos oculares (micros-copios binoculares) que estn unidos medianteun mecanismo que permite ajustar la distanciainterpupilar. En general los ms utilizados sonlos 10x (producen un aumento de 10 veces).

OBJETIVOS: Estn colocados en la parte in-ferior del tubo, insertados en una pieza metlicadenominada revolver que permite cambiarlos f-cilmente. Generan una imagen real invertida yaumentada. Los ms frecuentes son los de 4x, 10x,40x y 100x. ste ltimo se llama de inmersinya que para su uso se necesita utilizar aceite deinmersin sobre la preparacin. En la superficiede cada objetivo se indican sus caractersticasprincipales, aumento, apertura numrica y llevandibujado un anillo coloreado que indica el nmerode aumentos (rojo 4x, amarillo 10x, azul 40x yblanco 100x).

Cmo se calcula el aumento de una mues-tra?Para calcular el nmero que experimenta una pre-

paracin al ser observada a travs de un microscopio,se realiza el siguiente clculo: Se multiplica el aumen-to que seala el ocular por el aumento del objetivodando como resultado el aumento total de la muestra.Este aumento total representa el nmero de veces enque el objeto se encuentra ampliado con respecto asu tamao original.

At: Aumento total

Aoc: Aumento del ocular

Aob: Aumento

Ejercicio: si en un microscopio el aumento oculares de 20x y el objetivo de 45x, y se observa una mues-tra. Cul ser el aumento total de la muestraobservada?

Material de laboratorio

Microscopio ptico y estereoscpico

Figura 2: Iluminacin Khler

Figura 3: Enfoque del polgono

Cubres y portaobjetos

Pipetas Pasteur

Aceite de inmersin

Papel seda

Desarrollo de la practica

MICROSCOPIO PTICOIluminacin Khler: es una tcnica que proporcio-na una resolucin y contraste ptimo al alinear yenfocar el haz de luz para optimizar la apertura nu-mrica del objetivo. En la Figura 2 se muestran laspartes que deben ajustarse.

1. Cerrar el diafragma de campo (A). Est en laparte fija del microscopio, generalmente en labase, sobre la fuente de iluminacin.

2. Confirmar que el condensador est hacia arriba.

3. Enfocar el polgono con el tornillo macro y mi-cromtrico, lentamente y con cuidado, hasta quela imagen del diafragma se vea ntida, Figura 3

4. Centrar el polgono con los tornillos (C) que estnen el condensador en forma suave.

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5. Abrir el diafragma de campo justo antes de cubrirla totalidad del campo, los vrtices tienen quetocar el crculo.

6. Finalmente ya que est centrado abrimos todo eldiafragma.

Una vez confirmado que realizamos una buena ilu-minacin y con ello una buena imagen, procedemos acomenzar a trabajar al microscopio.

Uso del microscopio optico

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicinde empleo, bajar la platina completamente y lalmpara en la menor intensidad.

2. Si el microscopio se guard correctamente en eluso anterior, ya debera estar en esas condiciones.

3. Realizar la iluminacin Khler

4. Colocar la preparacin sobre la platina sujetn-dola con las pinzas metlicas.

5. Comenzar la observacin con el objetivo 4x (yaest en posicin) o colocar el de 10x dependiendodel tamao del objeto a observar en la prepara-cin. Para realizar el enfoque:

a) Acercar al mximo la lente del objetivo a lapreparacin sin tocar la lente empleandoel tornillo macromtrico. Esto debe hacersemirando directamente y no a travs del ocu-lar, ya que se corre el riesgo de incrustar elobjetivo en la preparacin pudindose daaralguno de ellos o ambos.

b) Mirando, ahora s a travs de los oculares,ir separando lentamente el objetivo de lapreparacin con el macromtrico y cuandose observe algo ntida la muestra girar elmicromtrico hasta obtener un enfoque fino.

6. Pasar al siguiente objetivo. La imagen deberaestar ya casi enfocada y suele ser suficiente conmover un poco el micromtrico para lograr elenfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdipor completo la imagen, es preferible volver aenfocar con el objetivo anterior y repetir la ope-racin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfocaa muy poca distancia en la preparacin y por

ello es fcil que ocurran dos tipos de percances:incrustarlo en la preparacin si se descuidan lasprecauciones anteriores y mancharlos con aceitede inmersin si se observa una preparacin queya se enfoc con el objetivo de inmersin.

7. Empleo del objetivo de inmersin:

a) Bajar totalmente la platina.

b) Subir totalmente el condensador para ver cla-ramente el crculo de luz que nos indica lazona que se va a visualizar y donde habrque colocar el aceite.

c) Girar el revolver hacia el objetivo de inmersindejndolo a medio camino entre ste y el de40x.

d) Colocar una gota mnima de aceite de inmer-sin sobre el crculo de luz.

e) Terminar de girar suavemente el revolver has-ta la posicin del objetivo de inmersin.

f) Mirando directamente al objetivo, subir laplatina lentamente hasta que la lente toquela gota de aceite. En ese momento se notacomo si la gota ascendiera y se adosara a lalente.

g) Enfocar cuidadosamente con el micromtrico.La distancia de trabajo entre el objetivo deinmersin y la preparacin es mnima, anmenor que el de 40x por lo que el riesgo deaccidente es muy grande.

h) Una vez se haya puesto aceite de inmersinsobre la preparacin ya no se puede volvera usar el objetivo de 40x sobre esa zona,pues se manchara de aceite. Por lo tanto, sidesea enfocar otro campo, hay que bajar laplatina y repetir la operacin desde el paso3. Pero primero se limpia el exceso de aceitede inmersin con el papel seda del objetivode 100x.

i) Una vez finalizada la observacin de la pre-paracin se baja la platina y se coloca elobjetivo de menor aumento girando el revol-ver. En este momento ya se puede retirarla preparacin de la platina. Nunca se de-be retirar con el objetivo de inmersin enposicin de observacin.

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Figura 4: Partes de un microscopio estereoscpico

j) Limpiar el objetivo de inmersin 100x emplean-do un papel especial para ptica. Probartambin que el objetivo 40x est perfecta-mente limpio.

MICROSCOPIO ESTEREOSCPICOa continuacin se muestran las partes del microscopioestereoscpico, Figura 4.

1. Oculares 10x/20x: compensan eventualesametropas de los ojos y permiten regular la dis-tancia interpupilar.

2. Botn de zoom: grada el aumento.

3. Empuadura.

4. Botn de enfoque: enfoca ntidamente.

5. Control de iluminacin: seleccin del modode iluminacin M y regulacin de la luz +/-.

6. Iluminacin de 12V 20w: para luz transmi-tida.

7. Placa de vidrio d=84mm: sirve para colocarobjetos, platinas o dispositivo para luz transmiti-da (campo oscuro).

8. Rosca frontal: permite la aplicacin de siste-mas adicionales y de iluminadores anulares.

9. Tornillo de retencin: sirve para fijar el mi-croscopio en el estativo.

Uso del microscopio Estereoscopico

1. El microscopio estereoscpico es ms sencillo queel ptico, pero tambin hay que manejarlo conprecaucin. Este tmabin se conecta a la redelctrica.

2. Se coloca en la base el objeto a observar, si esmaterial seco se coloca directo o sobre una basede papel, si es material en lquido se coloca enuna caja Petri para poder observar.

3. Encender la luz. Existen microscopios con luzreflejada o con luz transmitida, es decir, luz di-recta de arriba hacia abajo o luz de abajo haciaarriba, en algunos casos cuenta con ambas lucesdependiendo del microscopio.

4. Algunos tienen el tornillo macromtrico en laparte derecha, este se mueve para acercar o alejarnuestro objeto y obtener el mejor enfoque. Eltornillo izquierdo se utiliza para fijar.

5. Existen otros microscpicos que tienen otro tor-nillo que nos permite mayor acercamiento y conello un mayor aumento, de igual manera se ale-ja si se quiere ver ms pequeo y si se acercaqueremos un mayor aumento.

Mantenimiento y precauciones:Microscopio optico y estereoscopico

Al finalizar el trabajo hay que apagar los micros-copios (ptico y estereoscpico) y asegurarse dedesconectar el enchufe. Para el microscopio p-tico dejar puesto el objetivo de menor aumentoen posicin de observacin, asegurarse de que laparte mecnica de la platina no sobresalga delborde.

Cuando no se utilizan los microscopios, hay quemantenerlos cubiertos con su funda para evitarque se ensucien y daen las lentes. Si no se usande forma prolongada se deben guardar en su cajadentro de un armario para protegerlo del polvo.

Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Sise ensucian limpiarlas muy suavemente con unpapel de ptica o papel filtro(menos recomenda-ble).

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Para el microscopio ptico no dejar preparacionessobre la platina si ya no se utilizar. Para elmicroscopio estereoscpico, no dejar muestrassobre la base si ya no ser utilizado.

Para el microscopio ptico, despus de utilizar elobjetivo de inmersin hay que limpiar el aceiteque se queda en el objetivo con pauelos especia-les para ptica o con papel filtro. En cualquiercaso se pasar el papel por la lente en un solosentido y con suavidad, si el aceite ha llegado asecarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlocon una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol.No hay que abusar de ese tipo de limpieza porqueestos disolventes en exceso se pueden daar laslentes y su sujecin.

Nunca forzar los tornillos giratorios de los mi-croscopio (macromtrico, micromtrico, platina,revolver y condensador).

Para el microscopio ptico el cambio de objetivosse hace girando el revolver y dirigiendo siemprela mirada a la preparacin para prevenir el rocede la lente con la muestra. No cambiar nunca elobjetivo agarrndolo por el tubo del mismo nihacerlo mientras se est observando a travs delocular.

Mantener seca y limpia la platina del microscopio(ptico) y la base (estereoscpico). Si se derramaalgn lquido, secarlo con un pao. Si el micros-copio ptico se mancha de aceite, limpiarla conun pao humedecido de xilol.

Es conveniente limpiar y revisar siempre los mi-croscopios al finalizar la sesin prctica y al finaldel curso, encargar a un tcnico un ajuste y revi-sin general de los mismos.

Cuestionario

1. Por qu es importante calibrar el microscopio?

2. Qu diferencia existe entre un aumento y reso-lucin?

3. Qu es la apertura numrica y como se relacionacon el poder de resolcin?

4. Para qu nos sirve el aceite de inmersin?

Figura 5

5. Cuntos tipos de microscopios existen en la ac-tualidad en base al tipo de energa que utilizan?Elabora un cuadro comparativo.

6. Qu papel juegan el diafragma y el condensadoren la iluminacin?

7. Indica las partes del esquema, Figura 5.

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