UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE QUMICA

LABORATORIO DE TECNOLOGA ENZIMTICARAL GENARO AGUILAR CABALLERO

Equipo 1 Ana Karen lvarez Velzquez Paula G. Valenzuela Ramrez Alan Garca Erick Elas Pedro Jos

PRCTICA

1

MANEJO DE DATOS

INTRODUCCINCultivo bacteriano en medio lquido

Fase lag o de adaptacin: Metabolismo a nuevas condiciones ambientales. Abundancia de nutrientes. Fase exponencial o logartmica: Consumo de nutrientes. Fase estacionaria: Acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios.

Fase de muerte: Reduccin de bacterias viables.

Objetivo:

Manejar correctamente los datos generados en experimentos de crecimiento microbiano, as como datos de rendimiento de produccin y consumo de metabolitos.

Objetivos didcticos:

A travs del desarrollo de la metodologa propuesta, reafirmar los conocimientos adquiridos en otras asignaturas donde est involucrado el fenmeno de crecimiento bacteriano.

DATOS:EN UN EXPERIMENTO DE CRECIMIENTO MICROBIANO ASOCIADO A PRODUCCIN DE CIDO LCTICO A PARTIR DE GLUCOSA SE COLECTARON LOS SIGUIENTES DATOS:Tiempo (h) Densidad ptica 600 nm 0.010 0.015 0.023 0.050 0.090 0.164 0.250 0.362 0.460 0.541 0.610 0.724 0.850 0.881 Lectura de DNS Vol. de NaOH 0.1N para titular 50 mL de muestra (mL) 0.2 0.3 0.5 0.8 0.7 0.8 1.1 2.4 5.8 15.4 25.2 32.1 34.0 35.1

0.0 1.0 2.0 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 8.0 9.0

1.800 1.657 1.401 1.308 1.185 0.924 0.757 0.575 0.352 0.245 0.151 0.085 0.018 0.007

Tabla 1. Datos obtenidos de produccin de c.lctico a partir de glucosa

ACTIVIDADES1. Construya las grficas de crecimiento microbiano y calcule la velocidad especfica de crecimiento () y el tiempo de duplicacin del microorganismo (t1/2).Crecimiento Microbiano1

0.90.8 0.7 Do(600) 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

0

2

4Tiempo (h)

6

8

10

Grfico 1.Crecimiento microbiano durante todo el experimento

VELOCIDAD ESPECFICA DE CRECIMIENTO () Y EL TIEMPO DE DUPLICACIN DEL MICROORGANISMO (T1/2).Si llamamos No al nmero de clulas inicial, y g al nmero de generaciones transcurridas, el nmero de clulas final (N) ser:

N = No 2gLlamando Td al tiempo de duplicacin y t al tiempo de cultivo transcurrido, la ecuacin anterior puede transformarse en la siguiente:Sacando logaritmos:

lnN = lnNo + t/Td ln2

Otra forma de representar la cintica es considerando el incremento en el nmero de clulas (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuacin que describe la cintica es la siguiente:

dN/dt= N N=Noet lnN=lnNo+t Tiempo de duplicacinIntervalo de tiempo que transcurre entre dos duplicaciones sucesivas

= ln2/Td

Td= ln 2/

2 1 0 -1 0 Ln Do -2 -3

Ln DO vs T

5

10

-4-5 ln DO= 0.5786 t 4.45 R2=0.925 Tiempo (h)

Grfico2. Linealizacin del crecimiento exponencial de los microorganismos

Velocidad especfica de crecimiento m = pendiente de la recta m= 0.5786 h-1 Tiempo de duplicacin T1/2 = In2/m T1/2 = 0.6931/0.5786=1.197h

2. Construya la grfica de concentracin de glucosa (mM) durante todo el experimento y diga la concentracin de glucosa inicial en porcentaje (% p/v).Curva Patrn de glucosa2

Lectura de DNS

Concentracin de glucosa (mM) 0 1 5 10

Lectura de DNS 0 0.035 0.177 0.348

1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 10 20 30 40 50 60

2050

0.7161.723

Tabla 2. Datos de la curva patrn.

Concentracin de glucosa (mM)

Lectura de DNS = 0.0345[glucosa] + 0.0052 R = 0.9997

Grfico 3. Curva patrn de glucosa

Ejemplo de clculo para obtencin de la concentracin de glucosa a partir de los datos de la curva patrn.[Glu cos a] DNS 0.0052 1.8 0.0052 52.023mM 0.0345 0.0345Lectura DNS 1.8 1.657 1.401 1.308 1.185 0.924 0.757 0.575 0.352 0.245 0.151 0.085 0.018 0.007 Concentracin de glucosa (mM) 52.023 47.878 40.458 37.762 34.197 26.632 21.791 16.516 10.052 6.951 4.226 2.313 0.371 0.052

Tiempo (h) 0 1 2 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 8 9

Tabla. 2 Datos de concentracin de glucosa durante en el experimento

Concentracin de Glucosa60

50

40 [Glucosa](mM)

30

20

10

0 0 1 2 3 4 5 Tiempo (h) 6 7 8 9 10

Grfico 4. Cambio de la concentracin de glucosa con el tiempo durante todo el experimento.

Concentracin de glucosa inicial

[52.023mmol][180mg/1mmol]=9364.14mg 9.36414g[9.36414g/1000ml]x100=0.9364%p/v

3.

Construya la grfica de concentracin de cido lctico durante todo el experimento (mM) y diga el rendimiento final de la produccin de este metabolito con respecto a la fuente de carbono (g de c. lctico / g de glucosa).Vol. de NaOH 0.1Npara titular 50mL de muestra (mL)

Tiempo (h) 0.0 1.0 2.0 3.0

[Ac. Lctico] (mM)80 70 [Ac.Lctico] 60 50 40 30 20 10 0 0 2 4 t (h) 6 8 10

0.2 0.3 0.5 0.8

3.54.0 4.5 5.0

0.70.8 1.1 2.4

5.56.0 6.5 7.0 8.0 9.0

5.815.4 25.2 32.1 34.0 35.1

Tabla 3. Datos del experimento.

Grfico 5. Cambio de la concentracin de cido lctico con el tiempo durante todo el experimento.

Ejemplo de clculo para obtencin de la concentracin de cido lctico a partir de los ml de NaOH.

[ Ac.Lctico]

0.2mlNaOH | 0.1NNaOH | 1mmolAcLctico | 0.4mM 0.05L

Calculo del rendimiento final de cido lctico con respecto a la glucosa.

6.318 gAc.Lctico | Re n dim iento 0.675 9.36 gGlu cos a

TABLA 3. DATOS PARA LA CONCENTRACIN DE CIDO LCTICO Y RENDIMIENTO FINALtiempo (h)0 1 2 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 8 9

c. Lctico (mM)0.4 0.6 1 1.6 1.4 1.6 2.2 4.8 11.6 30.8 50.4 64.2 68 70.2

c. Lctico %p/v0.0036 0.0054 0.0090 0.0144 0.0126 0.0144 0.0198 0.0432 0.1044 0.2772 0.4536 0.5778 0.6120 0.6318

Rendimiento0.0038 0.0057 0.0096 0.0153 0.0130 0.0154 0.0212 0.0462 0.1115 0.2962 0.4846 0.6173 0.6538 0.675

4. Grafique sus tres curvas (crecimiento,concentracin de glucosa y concentracin de cido lctico vs tiempo)

La produccin de cido lctico a partir de glucosa est asociada al crecimiento? Si, el cido lctico es uno de los productos del metabolismo de la glucosa, siempre y cuando se lleve a cabo bajo condiciones anaerobias. A mayor crecimiento de los microorganismos, mayor es la cantidad de cido lctico producido y por lo tanto, que podra cuantificarse, para relacionarse con el aumento en la poblacin de bacterias.

El consumo de glucosa est asociado al crecimiento microbiano?Si.

La glucosa es la fuente de carbono.

Obtencin de energa.Sntesis de estructuras celulares. Al aumentar la poblacin de microorganismos, la concentracin de glucosa inicial disminuye. Prueba DNS mide la concentracin de azcares reductores.

El consumo de glucosa est asociado directamente a la produccin de cido lctico?

Si. El metabolismo de glucosa en condiciones anaerobias produce cido lctico. El monitoreo de cido producido da idea del metabolismo de glucosa por parte de las bacterias.

CONSIDERACIONES FINALES

1.- Por qu se puede evaluar el crecimiento microbiano por su densidad ptica?En la determinacin de la masa bacteriana, los mtodos basados en la determinacin de la turbidez son tiles para establecer la masa celular. Se mide la densidad de una suspensin por su extincin (turbidimetra).

La dependencia lineal entre los valores medidos y la masa bacteriana solo se da en turbidimetra y nefelometra cuando se trabaja en la zona de muy baja densidad celular. Como la dispersin de la luz depende del dimetro, la forma y el ndice de refraccin de las partculas dispersantes, tambin de los componentes internos de la clula las relaciones entre los valores pticos y otras magnitudes ms directas como masa seca, contenido de nitrgeno o carbono son los siguientes:

= tasa de divisin (divisiones por hora), esta dada por = n / t = log N log N 0 / log 2 * (t t 0 ) Donde n = nmero de divisiones N = nmero de clulas despus de n divisiones N 0 = nmero inicial de clulas g = tiempo de generacin (tiempo necesario para un ciclo de divisin) definido por g = t / n = 1 / m = tasa de crecimiento, relacionada con el reciproco del tiempo de duplicacin o tiempo de generacin y la tasa de crecimiento m = ln 2 / g = * ln 2

2.-Investigue el mtodo de DNS para la determinacin de glucosa y en qu se basa.

Fundamentado en la reduccin de los grupos reductores con el reactivo de cido dinitrosalicilico (DNS). Los azucares reducen al cido dinitrosalicilico para la obtencin de amidas, mientras que el aldehdo es oxidado. No todos los azucares producen la misma intensidad de color, por lo tanto se hace una curva patrn para cada azcar a analizar. Esta prueba se basa en la colorimetra.

La prueba positiva da un color rojo-marrn.La coloracin se mide espectrofotomtricamente a 540 nm.

3.-Investigue la aplicacin en la industria alimentara del cido lctico. Regulador

de acidez Conservador En cosmticos como alternativa al uso de glicerina como suavizante Materia prima para sntesis orgnica