practica 1

I. INTRODUCCION

La absorción de radiación ultravioleta o visible proviene de la

excitación de los electrones enlazantes y como consecuencia, las longitudes de

onda de los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlaces

que existen en las especies en estudio. La espectroscopia de absorción molecular

es por tanto valiosa para la identificación de los grupos funcionales de una

molécula. Sin embargo, son más importantes las aplicaciones de la

espectroscopia de absorción ultravioleta y visible para la determinación

cuantitativa de compuestos que contienen grupos absorbentes o también llamados

cromóforos.

La espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más

utilizadas para la detección específica de moléculas. Se caracteriza por su

precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza

(contaminantes, biomoléculas, etc) y estado de agregación (sólido, líquido, gas).

Los fundamentos físicoquímicos de la espectrofotometría son relativamente

sencillos.

En esta práctica se determinara la absorbancia del bromocrosol

verde, se realizara distintas medidas con distintos volúmenes; con la ayuda del

instrumento llamado espectrofotómetro.

I.1 Objetivos

- Objetivo general

Determinar la concentración del bromocrosol verde a través del

espectrómetro visible.

- Objetivos específicos

Determinar las concentraciones y absorbancias de cada una de

las muestras realizadas.

Construir la gráfica de la relación absorbancia vs concentración.

Determinar la ecuación de la gráfica de la relación absorbancia

vs concentración.

II. REVISIÓN DE LITERATURA

II.1 ESPECTROFOTOMETRÍA UV – VISIBLE

La espectrofotometría de absorción fue uno de los primeros métodos

físicos que se aplicó al análisis cuantitativo y la determinación de estructuras, La

espectrofotometría UV-vis supera en costo y sencillez al resto de métodos ópticos

de análisis cuantitativo y es también una técnica auxiliar útil para la elucidación de

estructuras.

La región del ultravioleta se divide en 2 partes: ultravioleta próximo o

cercano (que comprende de 200 a 400 nm del espectro electromagnético) y el

ultravioleta lejano o de vacío (10 a 200 nm). Este último presenta el inconveniente

de que el oxígeno atmosférico absorbe en esa región y por ello no es considerado

en el análisis por espectrofotometría UV - visible. La división entre las regiones

ultravioleta próximo y el visible (400 a 800 nm aproximadamente) se debe a que

el ojo humano sólo puede percibir las radiaciones de onda por encima de 400nm

(OLSEN, 1990).

II.1.1 FUNDAMENTO

Como es sabido, las técnicas espectroscópicas se basan en la

interacción de la radiación electromagnética con la materia. A través de esta

interacción las moléculas pueden pasar de un estado energético (m), a otro

estado energético distinto (l), absorbiendo una cantidad de energía radiante igual a

la diferencia energética existente entre los dos niveles: El - Em. Para conseguir

esto, las moléculas absorben un fotón de una radiación tal que:

Estos tránsitos energéticos son los que dan origen a los espectros

que, en definitiva no son mas que el registro de las distintas u(0k) a las que se

producen estos tránsitos energéticos.

Debido a la existencia de diferentes tipos de energía de los electrones,

de los movimientos vibracionales de las moléculas, de la rotación de las mismas,

etc; las moléculas pueden interaccionar con radiaciones electromagnéticas de un

rango muy amplio de longitudes de onda, dando lugar a distintos tipos de

espectroscopías según las diferentes regiones. Un esquema podría ser el

siguiente:

Figura N°1. Espectro de radiación

La espectroscopía UV-Visible (espectros electrónicos), se debe a la

transición de los electrones mas externos de los átomos de las moléculas, desde

niveles fundamentales a niveles mas altos de energía.

II.2 LEY DE BEERT - LAMBERT

Cuando una onda electromagnética de cierta longitud de onda incide

sobre una sustancia, la fracción de la radiación absorbida es función de la

concentración de la sustancia que atraviesa el rayo de luz y del espesor de la

muestra, que también se llama longitud de paso óptico. La compensación de la

reflexión y la absorción en la ventana puede evitarse definiendo I0 como el poder

de radiación que pasa a través de una muestra testigo (blanco) contenida en la

misma celda de la muestra. La transmitancia T se define como la relación de las

intensidades de la radiación no absorbida I, y de la radiación incidente, de esta

forma:

La absorbancia (A) es el logaritmo del recíproco de la transmitancia

Si el porcentaje de T es 100T; el porcentaje de absorción será 100(1-

T). Las aplicaciones analíticas del comportamiento de absorción de las sustancias

pueden ser cualitativas o cuantitativas, como antes se ha mencionado. Las

primeras dependen del hecho de que una cierta especie molecular sólo absorbe

luz en regiones específicas del espectro y en grado variable característicos de

dicha especie, al resultado se le llama espectro de absorción de esa especie

molecular y es una huella dactilar para propósitos de identificación. Las

aplicaciones cuantitativas dependen de la relación entra la absorbancia y la

concentración de la solución.

A medida de que un haz de fotones pasa por un sistema de una

especie absorbente, el grado de absorción con respecto a la distancia atravesada

es directamente proporcional a la potencia (o a la intensidad) del haz de fotones I.

La reducción de la intensidad en la trayectoria x, -dI, puede escribirse

matemáticamente de la forma siguiente.

Donde k es una contante de proporcionalidad característica de la

naturaleza de la especie absorbente y de la energía de los fotones, e I representa

el poder de la radiación a cualquier distancia x en el medio absorbente.

Reordenando la ecuación anterior.

Este es el enunciado matemático de que la fracción del poder de

radiación absorbido es proporcional al espesor atravesado. Si ahora se estipula

que I0 es el poder de radiación a x=0, y que I representa el poder de la radiación

transmitida que emerge del medio absorbente a x = l. La ecuación puede

integrarse con respecto al total del trayecto de la radiación.

Esta es la ecuación de Lambert la cual indica que para una cierta

concentración de sustancia absorbente, la intensidad de la luz transmitida

disminuye logarítmicamente a medida que la longitud del trayecto aumenta en

forma aritmética. Beer determinó que al aumentar la concentración del absorbente,

se producía el mismo efecto que un aumento proporcional en la longitud del

trayecto de absorción de la radiación. De esta forma, la constante de

proporcionalidad k es, a su vez, proporcional a la concentración de la sustancia

que absorbe.

Por lo tanto la forma combinada de la ley es:

Donde a incorpora el factor de conversión del logaritmo base 10 a

logaritmo natural. Esta expresión es la ley de Lambert-Beer y se puede escribir

como:

Donde ϵ es el coeficiente de absortividad molar en unidades de L cm-1

y mol-1, l es la longitud del paso óptico (longitud de la celda) y C es la

concentración de la sustancia absorbente en unidades de mol L-1.

Figura N°2. Absorción de la radiación

Si se opera a una longitud de onda dada y con una cubeta de un

determinado espesor l, la absorbancia A, medible directamente, es proporcional a

la concentración molar de la muestra c, lo que constituye el fundamento del

análisis espectrofotométrico cuantitativo.

Existen, sin embargo distintos factores que afectan al cumplimiento de

la ley de Lambert-Beer, especialmente a concentraciones elevadas. Por ello antes

de proceder al análisis de una muestra es preciso comprobar experimentalmente

el rango de concentraciones en que dicha ley se cumple, obteniendo la curva de

calibrado que relaciona las absorbancias con las concentraciones.

La ley de Lambert-Beer puede también aplicarse al análisis

cuantitativo de mezclas de dos o más sustancias, siempre que sus respectivos

espectros de absorción sean lo suficientemente distintos. El procedimiento se

basa en que la absorbancia es una propiedad aditiva, de tal forma que la

absorbancia total de una mezcla es la suma de cada uno de los componentes. Así,

para una mezcla de dos componentes, 1 y 2, que absorben radiación de una

misma longitud de onda, se cumplirá que:

II.3 CARACTERÍSTICAS DE UN ESPECTROFOTÓMETRO UV - VISIBLE

La medida de la absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un

espectrofotómetro, que en esencia consta de un monocromador (prisma o red de

difracción) que controla la longitud de onda de la radiación que se hace incidir

sobre la muestra. La radiación no absorbida se detecta y mide convenientemente.

La absorbancia de la muestra se compara con la de una “referencia” que consta

estrictamente de disolvente.

II.3.1 INSTRUCCIONES GENERALES DE MANEJO DE UN ESPECTROFOTÓMETRO

Encendido de lámparas

Lámpara de tungsteno (zona del Visible, 900 a 340 nm), encendido

instantáneo.

Lámpara de Deuterio (zona del UV, 340 a 200 nm aprox.), necesita

un calentamiento previo.

Adaptación del espejo a la lámpara adecuada, atendiendo al

rango de longitud de onda de trabajo (sólo en los espectrofotómetros no

automáticos).

Seleccionar el valor de longitud de onda con el mando

correspondiente.

Ajuste del cero de transmitancias (tapa levantada) con ayuda

del mando “Ajuste del cero”, hasta que aparezca cero en la pantalla.

Ajuste del 100% de transmitancia (0 de absorbancia) con la

referencia, que normalmente es el disolvente de la muestra, utilizando para ello el

mando “A-T”.

Leer el valor de Absorbancia/Transmitancia de la muestra.

Figura N°3. Absorbancia/Transmitancia de la muestra

Las cubetas empleadas en el espectrofotómetro (1.00 cm de espesor)

deben estar escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus caras

esmeriladas u opacas. No es conveniente secarlas o limpiarlas con papel ordinario

por el carácter abrasivo de éste sino con un papel suave. Una de las aplicaciones

prácticas de mayor interés de la espectrofotometría de absorción UV-Visible es la

del análisis cuantitativo, basada en la aplicación de la ecuación de Lambert-Beer.

II.4 PUNTO ISOSBESTICO

En la mayoría de los casos durante la duración de una reacción

química, una especie absorbente X se transforma en una especie absorbente Y

(en el caso que sólo estén involucradas 2, para los casos en donde hay más

especies se aplica el mismo concepto). Si los espectros de los componentes puros

X e Y se cruzan a una longitud de onda, cualquier espectro registrado durante la

reacción química pasará por ese mismo punto, este punto se conoce como punto

isosbéstico, este es una buena prueba de que existe más de una especie.

En la figura se muestra un ejemplo de los espectros de absorción

que corresponde al verde de bromocresol, se puede observar que hay una

longitud de onda en que los tres espectros se cortan, este es el punto isosbéstico

y corresponde a la longitud de onda en que las dos formas tienen la misma

absortividad (HARRIS, 2007).

Figura N°4. Espectros de absorción del bromocrosol verde a diferentes valores

de pH, donde se observa el cambio de una especie a otra dejando evidencia el punto

isosbéstico

III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 MATERIALES

- Bromocrosol verde 3gr.

- (4) Tubos de Ensayo

- (1) Matraz

- (1) Pipeta

- (1) Vaso precipitado de 250 ml

- (1) Gradilla

- Agua Destilada

- Libreta de apuntes

- Lapicero

3.2 Equipo

- Espectrofotómetro 1200 RS FARLAB

- Laptop

- Cámara digital

3.3 Software

- Microsoft Excel 2013

- Microsoft Word 2013

3.2 MÉTODOLOGÍA

3.2.1 TRABAJO DE LABORATORIO

Se comenzó añadiendo al matraz 250 ml de Agua destilada, y luego

se agregó 3 gramos de Bromocrosol verde y lo mezclamos hasta que se disuelva

completamente.

Luego se usó 4 tubos de ensayo con su respectiva gradilla, y se

agregó las cantidades de 1, 2, 4 y 8 ml de la mezcla y agregamos agua destilada

en cada uno de los 4 tubos de ensayo hasta que en cada uno halla la cantidad de

10 ml (agregamos 9, 8, 6, 2 ml de agua destilada respectivamente).

Posteriormente y previas explicaciones del docente a cargo, se

encendió el espectrofotómetro y se calibró colando agua en la cubeta transparente

del espectofrotómetro.

Finalmente se colocó cada muestra de los 4 tubos de ensayo en la

cubeta transparente del espectofrotómetro para medir la absorbancia.

- Trabajo de Gabinete

Con los datos obtenidos del trabajo de laboratorio de concentración y

absorbancia, construimos una gráfica de absorbancia vs concentración en

Microsoft Excel.

Al construir la gráfica hallamos la línea de tendencia generada por un

ajuste de curva lineal.

Con dicha ecuación podremos determinar la concentración para la

absorbancia requerida.

3.4 Consideraciones

- Si la muestra que analizamos con el espectrofotómetro no nos dio un

dato de absorbancia, no considerar para encontrar el ajuste de curva.

- Debido a que la cubeta transparente del espectofotrómetro solo

utiliza 3.5ml se tuvo que retirar 6.5ml del total del volumen

IV. RESULTADOS

IV.1 Determinación de la concentración inicial

m = 3g (Bromocrosol verde)

v = 250 ml (Agua)

N1= mv

N1= 3 g250ml

= 0.012 g/ml

IV.2 Volumen total

V1 = 1 ml (Mezcla) + 9 ml (Agua) = 10 ml




VT = 10 ml

IV.3 Determinación de las distintas concentraciones

N1 * V1 = N2 * V2

Donde:

N1 = Concentración inicial

V1 = Volumen de cada concentración

N2 = Concentración final

V2 = Volumen total

IV.3.1 Para la concentración 1

N2-1 = 0.012

gmlx1ml

10ml = 0.000012 g/ml


N2-2 = 0.012

gmlx2ml

10ml = 0.0024 g/ml


N2-3 = 0.012

gmlx 4ml

10ml = 0.0048 g/ml


N2-4 = 0.012

gmlx8ml

10ml = 0.0096 g/ml

IV.4 Calculo de la absorbancia

Tabla N°1. Concentración y absorbancia de la muestra en estudio

CONCENTRACIÓN ABSORBANCIAN2-1 = 0.000012 g/ml 1.294N2-2 = 0.0024 g/ml 1.424N2-3 = 0.0048 g/ml 1.938N2-4 = 0.0096 g/ml No se efectuó la lecturaN2-5 = x 1.540

Gráfica N°1. Representación de la absorbancia vs concentración

1 1.2 1.4 1.6 1.8 20

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

f(x) = 0.00709751607677581 x − 0.00877695365961416R² = 0.954936833477586

Absorbancia vs Concentración

AbsorBancia

Concentración

Dada la siguiente ecuación de la gráfica, podemos hallar el valor de la

concentración teniendo como dato la absorbancia.

y = 0.0071x – 0.0088

Donde:

x = absorbancia

y = concentración (g/ml)

Y = 0.0071 * (1.540) – 0.0088

Y = 0.002134 g/ml

Por lo tanto, la concentración N2-5 es 0.002134 g/ml

V. DISCUSIÓN

Según la Ley de Beer (WALTON, 2005); para la obtención de la curva

de calibración, se representan gráficamente las absorbancias y las

concentraciones de las muestras, cuya relación debe mostrar un comportamiento

lineal; concordando con el autor, obtuvimos una ecuación lineal de las

concentraciones c1= 0.000012g/ml, c2= 0.00024g/ml, c3= 0.0048 g/ml, c5=

0.000012g/ml, con sus respectivas absorbancias a1= 1.294, a2= 1.424, a3= 1.938,

a5=1.540.

Según SIERRA (2010), se debe seleccionar la longitud de onda más

adecuada para realizar las medidas que corresponden a un máximo de

absorbancia, con la finalidad de obtener los resultados dentro de los límites

permitidos. Para la práctica se se escogió una longitud de onda de (240 nm) por lo

tanto el valor de R² = 0.9549 de la ecuación de la gráfica de la relación

absorbancia vs concentración, concordando con el autor, puesto que se trabajó

dentro de la medida adecuada.

VI. CONCLUSIONES

- Se determinó la concentración del bromocrosol verde a través de

espectrofotómetro visible, siendo este 0.000012g/ml para una absorbancia de

1.540.

Se determinaron las concentraciones de cada una de las muestras

realizadas siendo estas c1= 0.000012g/ml, c2= 0.00024g/ml, c3= 0.0048 g/ml, c5=

0.000012g/ml.

Se obtuvieron las absorbancias de cada una de las muestras, siendo

éstas a1= 1.294, a2= 1.424, a3= 1.938, a5=1.540.

Se determinó la ecuación de la gráfica de la relación absorbancia vs

concentración, siendo esta y=0.0071x - 0.0088, a partir de la cual se calculó la

absorbancia teniendo como dato la concentración.

Se determinó que la relación de la concentración vs absorbancia es

directamente proporcional, es decir, a mayor concentración mayor será la

absorbancia.

No se trabajó con la concentración c4=0.0096 g/ml, debido a que el

espectrofotómetro no efectuó la medición.

VII. RECOMENDACIONES

Diluir completamente la muestra.

Vigilar que al momento del análisis de la muestra en el

espectrómetro, en la habitación no se produzca cambios bruscos en la circulación

de las masas de aire, para que así no haya interferencia en el análisis.

Esperar que el dato proporcionado por el espectrómetro se vuelva

constante para considerarlo valido.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

OLSEN E. 1990. Métodos ópticos de análisis. Madrid, España. Editorial Reverte

S.A. España. 756 p.

HARRIS D. 2007. Análisis químico cuantitativo. 3 ed. Madrid, España, Editorial

Reverte S.A. 418 p.

WILLARD H., et al. 1986. Métodos instrumentales de análisis. México D.F,

México, Editorial Continental S.A. 593 p.

CONNOR, K. 1980. Curso de análisis farmacéutico. 1 ed. Madrid, España,

Editorial Reverté S.A. 228 p.

MIÑONES, J. 1978. Manual de técnicas instrumentales. México D.F, México,

Círculo editor Universo. 146 p.

WALTON H. 2005. Análisis químico e instrumental moderno. 4 ed. Barcelona,

España, Editorial Reverté. 385 p.

UMHE. 2013. Ley de Lambert-Beer [En línea]:

(http://repositorio.innovacionumh.es/Proyectos/P_22CursoMateriales/

Miguel_Angel_Sogorb/Wimba/Espectroscopia_05.htm, 4 de junio del 2015)

IX. ANEXOS

Figura N°5. Mezcla del bromocrosol verde con agua

Figura N°6. Pruebas para el análisis con volúmenes de 8ml, 4ml, 2ml, 1 ml

respectivamente

Figura N°7. Espectrofotómetro

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS

AMBIENTALES

ANALISIS INSTRUMENTAL

ESPECTROSCOPÍA DE RADIACIÓN UV-VIS

DOCENTE : Ing. DIONISIO MONTALVO, Franklin

ALUMNOS : BARRUETA PAUCAR, Mayori

CRISTANCHO ARIZA, Krystell

FERNÁNDEZ ESCOBAR, Angie

MANRRIQUE GUERRA, Luis

OSORIO PEDRAZA, Erick

POMA CATALÁN, Maribel

CICLO : I - 2015

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

DE LA SELVA

JUNIO 2015

practica 1

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