En este volumen se recogen una serie de capítulos donde se

muestra la estrecha relación que existe entre el envejecimiento y

la enfermedad. En la actualidad son muchos los grupos de

investigadores que estudian estas interrelaciones, y los avances

que se están consiguiendo son de tal magnitud, que hoy casi

ningún científico duda que, en un día no muy lejano, se podrán

curar muchas enfermedades asociadas a la vejez que, a su vez, son

la mayor causa de la morbilidad y mortalidad en nuestra sociedad.

Solo entendiendo las bases celulares y moleculares del

envejecimiento, se podrán desarrollar medios para retrasar estas

enfermedades, la mayoría de las cuales están íntimamente

conectadas con el cáncer.

¿POR QUÉ TENEMOS QUE ENVEJECER?

Enfermedades asociadas a la edad

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Consuelo Boticario Boticario

María Cascales Angosto

María Cascales Angosto

Doctora “honoris causa”

de la UNED

PORTADA

Polygonum cuspidatum

planta de donde procede

el resveratrol

Consuelo Boticario Boticario

Profesora Titular

de la UNED

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¿POR QUÉ TENEMOS QUE ENVEJECER?

ENFERMEDADES ASOCIADAS A LA EDAD

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María Cascales Angosto

Quedan rigurosamente prohibidas,

sin la autorización escrita de los titulares del “Copyright”,

bajo las sanciones establecidas en las leyes,

la reproducción total o parcial de esta obra

por cualquier medio o procedimiento,

comprendidos la reprografía y el tratamiento informático,

y la distribución de ejemplares de ella

mediante alquiler o préstamo públicos.

© UNED. Centro de Plasencia

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María Cascales Angosto

D.L.: CC-522-09 I.S.B.N.: 978-84-608-0914-2 Imprenta y encuadernación: Artes Gráficas Batanero, S.L. P.E. Mejostilla. C/ Thomas Edison, 16 T. 927 225 218 · www.agbatanero.com

Agradecimientos: Nuestro profundo agradecimiento a las profesoras doctoras Evangelina

Palacios Aláiz, y Pilar González González por prestarnos su inestimable

ayuda en la revisión y corrección de los manuscritos. También agradecemos

de manera muy especial la colaboración prestada por doña Adoración Urrea

Salazar, en la preparación de los manuscritos, en la búsqueda de la

bibliografía y en la realización del ajuste electrónico de las figuras, etc.

Agradecimientos

5

PRÓLOGO Una vez más, haciéndose eco de los problemas de nuestra sociedad el

Centro Asociado de la UNED en Plasencia, publica hoy este libro, sobre un tema de un gran interés científico y de enorme repercusión clínica y social: ¿POR QUÉ TENEMOS QUE ENVEJECER? ENFERMEDADES ASOCIADAS A LA EDAD. En este volumen se recogen una serie de capítulos realizados tomando como base las publicaciones más recientes, donde se muestra la estrecha relación que existe, a nivel molecular y celular, entre dos fenómenos, de tanta trascendencia en la vida humana, como son el envejecer y el cáncer. En la actualidad son muchos los grupos de investigadores que estudian estas interrelaciones y los avances que se están consiguiendo, son de tal magnitud, que hoy casi ningún científico duda que, en un día no muy lejano, se podrán curar muchas de las enfermedades asociadas al envejecimiento, que a su vez, son la mayor causa de la morbilidad y mortalidad en nuestra sociedad. Solo entendiendo las bases moleculares del envejecimiento, se podrán desarrollar medios para retrasar la aparición de enfermedades asociadas al envejecimiento, la mayoría de las cuales están íntimamente conectadas con el cáncer.

Los organismos multicelulares exhiben un declinar progresivo e

irreversible de las funciones fisiológicas, que es característico de la senectud. Aunque las bases moleculares de este declinar no se conocen aún en su totalidad, los mecanismos hasta ahora propuestos incluyen un incremento en la generación de especies reactivas de oxígeno y una progresiva acumulación de lesiones oxidativas en el DNA, que van a dar lugar a inestabilidad genética y a alteraciones epigenéticas. Todo ello lleva consigo el deterioro oxidativo de macromoléculas críticas, la glicación de proteínas constitutivas y el acortamiento de los telómeros en células replicativas

Es evidente que una serie de factores genéticos y ambientales determinan

el envejecimiento y la longevidad. La manipulación de estos factores puede alterar la expectativa de vida y el fenotipo senescente. Existe amplia evidencia experimental que demuestra que la mayor resistencia al estrés oxidativo conduce a mayor longevidad. La modificación de los factores ambientales adversos, la restricción dietética y la dieta con alto contenido de antioxidantes, pueden disminuir las situaciones de estrés oxidativo y elevar la longevidad. Además la modulación de la actividad de genes de longevidad, puede ayudar a ampliar la expectativa de vida en los humanos. Finalmente, la

Prólogo

7

activación de la capacidad reparadora del DNA ha de proporcionar otra estrategia, que unida a las otras, proporcione un medio de prevenir los achaques asociados a la edad avanzada.

Cáncer y envejecimiento son padecimientos que aquejan a organismos

con tejidos renovables, por eso han surgido genes supresores de tumores que suprimen el desarrollo del cáncer y limitan la longevidad. Una clase de supresores de tumores actúa previniendo el daño genético, mientras que otra inhibe la propagación de las células cancerosas potenciales. Mediante la manipulación de estos genes supresores se trata de conseguir, cómo alargar la vida sin tener el riesgo de contraer cáncer. Se han descrito dos tipos de mecanismos que juegan entre cáncer y envejecimiento: aquellos que al disminuir el daño celular, evitan el cáncer y protegen la longevidad, y aquellos diseñados para prevenir la excesiva proliferación celular, con lo cual se previene del cáncer, pero se limita la longevidad. El equilibrio entre ambos mecanismos ha de asegurar una vida saludable, libre de cáncer y de los achaques de la vejez.

Es un hecho reconocido que en el siglo XX, la longevidad media de la

población se ha elevado de manera notable, merced a los avances en la salud pública, que han logrado disminuir las enfermedades infecciosas mediante el desarrollo de terapias más avanzadas en el tratamiento a las enfermedades crónicas y las asociadas al envejecimiento. En España el promedio de esperanza de vida se ha elevado desde los 58 hasta los 80 años. En los últimos 30 años, estos logros se han conseguido retrasando la mortalidad del cáncer y de las enfermedades del corazón y cerebro. Aunque se puede argüir que el incremento en la esperanza de vida y en las enfermedades dependientes de la edad son asuntos separados, ya que la mayoría de individuos con 70 y más años disfrutan de una vida sana e independiente, los países desarrollados soportan todavía un alto costo debido a las elevadas necesidades de la población que sufre los trastornos del envejecimiento.

Las revistas científicas de más prestigio publican regularmente trabajos

con un mensaje recurrente: el envejecimiento es un proceso modificable, que se puede retrasar mediante intervenciones genéticas, farmacológicas o nutricionales. Es, por lo tanto, cuestión de tiempo averiguar la receta perfecta para conseguir vivir más años en buenas condiciones de salud. El futuro próximo nos ha de brindar nuevas formas de terapia regenerativa y preventiva, que proporcionaran mayor calidad de vida a la población de edad avanzada. El reto para este futuro será manipular estos mecanismos para

Prólogo

8

conseguir una vida larga y saludable, evitando el cáncer y el envejecimiento. Esto no es especulativo, se ha demostrado que fármacos antidiabéticos tienen efectos protectores del cáncer en humanos y elevan la longevidad en ratones.

Hay que considerar que la vida es muy difícil modificarla, porque todos

los elementos del organismo han sido ajustados de manera estricta a lo largo de la evolución. Envejecimiento y cáncer deben ir de la mano si se quiere “manipular” la longevidad. No tiene sentido alargar la vida si se desarrolla un cáncer, y viceversa; no interesa estar protegidos del cáncer, si se adelanta el envejecimiento. Hay que tener presente que el cáncer como enfermedad degenerativa, en la mayoría de los casos, es una consecuencia del envejecimiento celular.

Todas estas consideraciones nos han llevado a la realización de este

volumen, en el cual hemos desarrollado una serie de temas que detallamos a continuación: Bases celulares y moleculares del envejecimiento; Estrés oxidativo; Antioxidantes y envejecimiento; Telómeros; Supresores tumorales; Inmunosenescencia; Envejecimiento y cáncer, dos caras de la misma moneda; Manipulación de la esperanza de vida; Células madre; Restricción calórica y envejecimiento; Epigenética; Osteoporosis y Enfermedad de Alzheimer.

Por último, queremos expresar que como participantes comprometidos en

la noble y esforzada tarea de escribir y divulgar el conocimiento, aguardamos con impaciencia la aceptación por los lectores interesados, y más aún, si con ello hemos logrado transmitir el mismo entusiasmo que nos ha llevado a realizarla, nuestro esfuerzo habrá merecido la pena.

Madrid, Enero 2009 Consuelo Boticario Boticario

María Cascales Angosto

Prólogo

9

ÍNDICE Pág.

Capítulo 1. Bases celulares y moleculares del envejecimiento ..…….

13

Capítulo 2. Estrés oxidativo ..……………………………….…………

39

Capítulo 3. Antioxidantes y envejecimiento ..………………….……..

77

Capítulo 4. Telómeros y Telomerasa ..……………………….……….

115

Capítulo 5. Supresores de tumores y envejecimiento ……………….

147

Capítulo 6. Inmunosenescencia ………………………………………

173

Capítulo 7. Envejecimiento y cáncer: dos caras de la misma moneda

199

Capítulo 8. Manipulación de la esperanza de vida ………………….

225

Capítulo 9. Células madre …………………………………………….

245

Capítulo 10. Restricción calórica y envejecimiento …………………

277

Capítulo 11. Epigenética en el envejecimiento ………………………

309

Capítulo 12. Osteoporosis. Mecanismos que regulan el recambio óseo ………...…………………………………………...

341

Capítulo 13. Enfermedad de Alzheimer y estrés oxidativo ………….

385

Índice

11

Capítulo 1. BASES CELULARES Y MOLECULARES DEL ENVEJECIMIENTO

1. Introducción 2. ¿Por qué envejecemos? 3. Envejecimiento y oxidación 3.1. Generación de especies reactivas de oxígeno por la mitocondria 3.2. Sistemas de defensa antioxidante 4. Expectativa de vida y longevidad máxima entre las especies 5. Telómeros y telomerasa 6. Envejecimiento, células madre y factores sistémicos ¿medicina regenerativa? 7. Micro RNA (miRNA) transducción de señales y medicina preventiva 8. Conclusiones 9. Abreviaturas 10. Bibliografía 1. Introducción El envejecimiento es un proceso biológico de una gran complejidad, que

causa alteraciones en la estructura de órganos y tejidos, lo cual va a dar lugar a un declinar en las funciones y a una capacidad disminuida para atender a las demandas del organismo. Una característica del envejecimiento es la menor capacidad de mantener la homeostasis frente a condiciones ambientales adversas. La senectud representa no sólo un problema a nivel clínico y social, sino también una paradoja evolutiva porque se opone a la selección natural. La hipótesis evolutiva propone que el envejecimiento surge como consecuencia de la selección necesaria para mantener los procesos de la reproducción temprana, o como consecuencia de una selección más débil frente aquellos procesos post-reproductores. En la selección frente a la amenaza de la vida, la expresión genética de los mecanismos de defensa y reparación son mucho menos eficientes en la edad avanzada. Así, la muerte es menos adversa para la vida cuando ocurre en la última etapa de la vida del individuo. A pesar de haber sido comprendida la relativa tolerancia al envejecimiento, con respecto a la supervivencia de las especies, su necesidad o incluso conveniencia no ha sido aún demostrada.

Capítulo 1

13

2. ¿Por qué envejecemos? ¿Es porque lo llevamos en nuestros genes o porque sufrimos el desgaste

del tiempo y de las agresiones externas? Hoy en día los investigadores se decantan por la segunda opción. Un ser vivo es un ente individual y diferenciado que necesita gran cantidad de energía para sobrevivir en un medio ambiente adverso. Los mecanismos implicados en el mantenimiento de la supervivencia se van deteriorando a medida que transcurre la edad. No parece que exista un programa genético que se ponga en marcha a determinada edad para conducirnos a la vejez y la muerte, simplemente nuestros mecanismos genéticos de reparación van perdiendo eficacia con la edad.

En los últimos años se han identificado muchos factores ambientales y

rutas metabólicas reguladas por genes que contribuyen a retardar o acelerar el envejecimiento. La capacidad oxidativa de las especies reactivas de oxígeno, los daños al DNA por estas mismas especies, por radiaciones o por agentes químicos, la excesiva producción de energía por las mitocondrias, la hiperactividad de la hormona del crecimiento, un aporte excesivo de grasas y carbohidratos, etc., son elementos relacionados con el envejecimiento. Los especialistas en genética están empezando a vislumbrar conexiones entre diferentes mecanismos y han demostrado que existe una familia de genes maestros que rige gran parte de estos procesos, cuya modulación podría conducir a una significativa elevación de la expectativa de vida humana.

Una característica común de la vida en los organismos multicelulares es

el progresivo declinar en la eficiencia de una serie de procesos fisiológicos, una vez finalizada la fase reproductora de dicho organismo. Para estudiar la naturaleza de la plétora de mecanismos que intervienen y se asocian en el envejecimiento, se han utilizado muchos modelos y estrategias, pero quedan sin respuesta las siguientes preguntas: ¿Por qué los organismos sufren un deterioro fisiológico irreversible en la última parte de sus vidas? ¿Por qué esos mismos organismos pierden su capacidad de restauración y reparación de los tejidos u órganos?

La filosofía helenística estaba convencida que el envejecimiento era un

truco de la vida para tener más vida. Pasó mucho tiempo hasta que el contenido científico de esta frase antigua llegara a ser descifrable. El deterioro fisiológico del organismo a medida que transcurre la edad presenta una paradoja evolutiva. Si los organismos pueden funcionar bien en la

Capítulo 1

14

juventud ¿Por qué no lo hacen igual a la vejez? Se han emitido hipótesis evolutivas y no adaptativas por separado, para considerar el proceso aparentemente universal del envejecimiento. La hipótesis evolutiva predice que la tasa de envejecimiento se eleva y la supervivencia disminuye en proporción directa a como se eleva la tasa de mortalidad extrínseca. También, la tasa de envejecimiento es mayor en aquellos organismos cuya fecundidad no se mantiene elevada después de la madurez reproductora. Las teorías puramente fisiológicas del envejecimiento no predicen ninguna relación entre la mortalidad extrínseca, la fecundidad dependiente de la edad y la tasa de envejecimiento. Además se establece una asociación entre la esperanza de vida y la tasa metabólica, por lo cual los organismos con tasas metabólicas más bajas han de tener mayor expectativa de vida.

Es importante anotar que las hipótesis evolutivas no contradicen que los

mecanismos próximos, tales como que las lesiones al DNA sean responsables del envejecimiento. Ellas solo predicen que la selección natural ha de actuar sobre estos mecanismos próximos. Por ejemplo, ante una tasa menor de mortalidad extrínseca ha de disminuir la frecuencia de expresión de los genes tardíos que reducen la eficiencia de la reparación del DNA y por consiguiente causan mayor lesión al DNA. Es un hecho demostrado que la evolución de los insectos sociables como las termitas y las abejas, se asocia con un incremento de 100 veces en la longevidad máxima. Tal incremento se debe a teorías evolutivas porque estos insectos viven en colonias fuertemente defendidas de los depredadores y en ellas no existe asociación entre la tasa de mortalidad extrínseca y la esperanza de vida.

Otra forma de definir el envejecimiento es la de describir sus

consecuencias:

(a) casi todas las funciones fisiológicas pierden progresivamente eficacia y vigor;

(b) la mayoría de los órganos vitales sufren fenómenos de atrofia o degeneración, especialmente detectable en aquellos que contienen células post-mitóticas, neuronas, células musculares, células hepáticas, etc.;

(c) se registra un progresivo aumento de la sensibilidad a traumatismos, infecciones y fármacos, unido a un funcionamiento anormal del sistema inmunitario y

(d) aumenta el riesgo a enfermedades degenerativas y cáncer

Capítulo 1

15

El envejecimiento es un proceso complejo biológico universal que se detecta a nivel morfológico, bioquímico y funcional, tanto en células aisladas como en órgano entero, que termina con la muerte. Las teorías postuladas sobre el envejecimiento son muchas y tienen su origen en el estudio de los cambios que se suceden o de los cambios que se acumulan a lo largo de la vida. La teoría que ha alcanzado más adeptos entre la comunidad científica por la solidez de sus argumentos y por haber sido ampliamente comprobada, fue propuesta por Harman en 1956, y es la que responsabiliza a los radicales libres de oxígeno de las alteraciones oxidativas típicas de la edad avanzada y de la mayor parte de las alteraciones celulares que ocurren en el envejecimiento. Esta teoría se dirigió, posteriormente, hacia la generación de especies reactivas de oxígeno por la mitocondria y trata de explicar el fenómeno de la senectud por medio del estrés oxidativo. Es decir, el envejecimiento aparece a medida que el organismo acumula lesiones oxidativas

Aunque se desconocen las bases moleculares del declinar fisiológico

progresivo e irreversible característico de la senectud, se han postulado una serie de mecanismos para explicarlo. Este estos se incluye:

• el acumulo de lesiones en la molécula del DNA que conllevan a una

inestabilidad genómica;

• alteraciones epigenéticas que conducen a modificaciones en la expresión genética;

• acortamiento de los telómeros en células replicativas;

• lesión oxidativa en macromoléculas críticas; y

• glicación, no enzimática, de proteínas de cadena larga.

En el intento de explicar el declinar fisiológico y progresivo de la

senectud y para buscar respuesta a la pregunta al inicio de este capítulo ¿por qué envejecemos?, vamos a analizar una rara enfermedad, caracterizada por un envejecimiento prematuro y una enorme propensión al cáncer, que es la enfermedad de Werner. Esta enfermedad ha servido de modelo a un grupo de científicos españoles dirigidos por Manel Esteller, para comprender mejor la relación entre cáncer, genes y envejecimiento. Este síndrome hereditario, produce envejecimiento prematuro y se caracteriza por inestabilidad genómica y una elevada incidencia a padecer tumores. El envejecimiento es

Capítulo 1

16

el principal factor de riesgo para el desarrollo de tumores y como hasta hace poco no se conocían bien las razones moleculares de esta relación, era lógico pensar que tenía que existir un gen que previniera el envejecimiento y el cáncer. Este es el gen WRN, un supresor tumoral, que cuando se inactiva por metilación, no solo provoca el síndrome de Werner, sino que tiene un papel destacado en la aparición del cáncer. La pérdida de actividad de este gen por metilación de su zona reguladora, se ha detectado en diversos tipos de tumores, incluyendo blandos y sólidos, y siendo el primer gen supresor tumoral con tan amplia distribución.

La función de este gen es proteger a las células de las lesiones, gracias a

su actividad helicasa y exonucleasa que promueve la reparación del DNA. Sin embargo, su inactivación provoca el inicio de la fragmentación cromosómica y el desarrollo de la inestabilidad genómica previa al desarrollo tumoral. La reintroducción del gen en una célula deficiente tiene propiedades antitumorales, tanto en cultivos celulares como en modelos murinos, lo que abre una esperanza a la mejora del tratamiento de ciertos tumores, basándose en la comprensión de estas interacciones. Estos estudios están poniendo de manifiesto aspectos epigenéticos del envejecimiento, un campo emergente que promete revelaciones importantes. El grupo de Esteller está actualmente estudiando la significación biológica de las alteraciones epigenéticas que se acumulan en el transcurso de la edad y que tienen importantes repercusiones en la tumorigénesis.

3. Envejecimiento y oxidación La utilización del oxígeno por los organismos aerobios, en condiciones

normales, genera metabolitos reactivos de este elemento que pueden ocasionar un estado de estrés oxidativo, en el caso en el que se altere el equilibrio prooxidante/antioxidante de la célula. La intensidad del daño oxidativo se eleva a medida que un organismo envejece y se ha postulado que en ello radica la causa principal de la senectud. En favor de esta hipótesis se alegan las observaciones siguientes:

• La superexpresión de los enzimas antioxidantes retrasa el daño

oxidativo y amplia el período vital. • La longevidad de las diferentes especies es inversamente

proporcional a la velocidad de generación mitocondrial de especies reactivas de oxígeno

• La restricción calórica de la ingesta aminora las lesiones oxidativas,

Capítulo 1

17

retarda los cambios asociados a la edad y amplia la expectativa de vida.

La hipótesis que suscribe que la acumulación de daño oxidativo es la

causa principal responsable del envejecimiento, se basa en el hecho de que el oxígeno es potencialmente tóxico y su uso por los organismos aerobios, aunque necesario para su supervivencia inmediata, puede llegar a ser peligroso a lo largo de su existencia. El fenómeno de la toxicidad del oxígeno, referido como la paradoja de la aerobiosis, es inherente a su estructura atómica. El oxígeno molecular es un biradical que tras la adición secuencial de cuatro electrones y cuatro protones en la cadena de transporte electrónico mitocondrial (Figura 1), genera agua. En este proceso, en el que se produce gran cantidad de energía (ATP), pueden también generarse, como subproductos, moléculas parcialmente reducidas con uno, dos y tres electrones. Estas son, el radical superóxido, el peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo, respectivamente, que se denominan especies reactivas de oxígeno (ROS) y causan lesiones oxidativas en las macromoléculas celulares (lípidos, proteínas y DNA). Las lesiones se manifiestan como peroxidación de los lípidos insaturados de las membranas, modificaciones en el DNA (alteración de bases, roturas de las cadenas, intercambios entre las cromatidas hermanas, etc.), cruzamientos entre las proteínas y el DNA, carbonilación proteica y pérdida de los grupos SHO de las proteínas, etc.

Figura 1. Generación de especies reactivas de oxígeno por la cadena de transporte electrónico mitocondrial.

Capítulo 1

18

En condiciones normales se estima que el 2 % del oxígeno consumido por una célula aerobia se diversifica hacia la generación de especies reactivas. Una célula típica de rata, como el hepatocito, puede sufrir en su DNA unas 105 agresiones por día con estas especies. La presencia de los productos resultantes de las interacciones de las especies reactivas con las macromoléculas celulares ha llevado al convencimiento de que las defensas antioxidantes no son totalmente eficientes, que las células se encuentran sometidas a situaciones crónicas de estrés oxidativo y que el envejecimiento es una consecuencia de la acumulación del daño oxidativo. De todo lo anterior se deduce que la hipótesis oxidativa del envejecimiento se basa en el progresivo e irreversible incremento de la lesión oxidativa molecular.

La velocidad de generación de las ROS in vivo, es hoy fácil evaluar

mediante técnicas de citometría de flujo. Con estos medios experimentales se ha observado en hígado de ratas, que el estado de los pares redox tienden hacia valores más oxidados a medida que transcurre la edad, así como los niveles de peroxidación de lípidos y de oxidación de proteínas. El estrés oxidativo se detecta por el incremento exponencial de la carbonización de las proteínas, pérdida de sus grupos SH, pérdida del glutation, elevación de la concentración de productos que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico y pérdida de la actividad catalítica de determinados enzimas. La concentración de 8-hidroxiguanosina, un indicador del daño oxidativo al DNA, se incrementa progresivamente durante el envejecimiento. De tales estudios se deduce que el daño oxidativo molecular es ubicuo, sustancial y se eleva exponencialmente con la edad

La situación de estrés oxidativo en el envejecimiento puede estar ligada a

tres factores diferentes: elevación del ritmo de generación de especies reactivas de oxígeno; disminución de las defensas oxidativas, y menor eficiencia en la reparación o eliminación de las moléculas lesionadas.

3.1. Generación de especies activas de oxígeno por la mitocondria A medida que transcurre la edad se eleva el ritmo de generación de

especies reactivas de oxígeno por la mitocondria, la fuente principal de su producción. La mayor producción de estas especies inflige lesión en la membrana interna de las mitocondrias, lo cual por un mecanismo de retroregulación positiva induce un incremento en la generación de especies reactivas.

Capítulo 1

19

El principal productor de radicales de oxígeno en los organismos aerobios es la mitocondria, el orgánulo celular que, en condiciones normales, utiliza aproximadamente el 98% del O2 que ingresa en la célula reduciéndolo a agua a nivel del citocromo a3 de la cadena de transporte de electrones. Como se muestra en la Figura 1 una pequeña parte del O2 incorporado por la mitocondria, sufre una reducción monovalente y genera especies reactivas de oxígeno, tales como el radical superóxido (O2

.-), el peróxido de hidrógeno (H2O2), y radical hidroxilo (·OH), llegando a una producción diaria de 3 x 107 O2

.-/mitocondria/día. Por tanto, al ser las mitocondrias la fuente más importante de especies reactivas de oxígeno, es obvio que el DNA mitocondrial se encuentra más expuesto que el DNA nuclear a sufrir lesiones oxidativas severas que pueden conducir a mutaciones y supresiones en su propia cadena. (Figura 2).

Las mutaciones y supresiones en el DNA mitocondrial son hoy el punto de

mira de muchos gerontólogos, ya que el hecho de que se acumulen con la edad, hace pensar que las mitocondrias juegan un importante papel en las alteraciones propias del envejecimiento. Si las mitocondrias poseen un genoma lesionado ello puede influir en los propios componentes de la cadena de transporte electrónico, disminuyendo su eficacia en el proceso de reducción tetravalente del oxígeno molecular y en la producción del ATP. Por un lado, la menor producción de energía afectaría la función celular, y por otro, la alteración en la cadena de transporte electrónico elevaría la velocidad de generación de las especies reactivas de oxígeno. En este caso, la alteración localizada se agravaría al ocasionar la posterior lesión del DNA mitocondrial. La susceptibilidad del DNA mitocondrial a la agresión oxidativa es mayor que la del DNA nuclear, por encontrarse más cercano a la fuente de especies reactivas de oxígeno y carecer de histonas protectoras. Esto unido a que es más compacto y codifica todo, hace que la hipersensibilidad del DNA mitocondrial se asocie con la inestabilidad genómica que se observa en un número de enfermedades neurodegenerativas. La velocidad de mutación del DNA mitocondrial se ha estimado que es 16 veces superior que la del núcleo.

Capítulo 1

20

Figura 2. Expectativa de vida en relación con la generación mitocondrial de ROS (especies

reactivas de oxígeno) y lesión al DNA (Barja y Herrero 2000) La lesión oxidativa al DNA mitocondrial en animales viejos se acusa más

en cerebro que en otros órganos como el hígado. Esto indica que las mitocondrias del cerebro se encuentran más expuestas a situaciones de estrés oxidativo. Una de las razones que explica en parte la mayor susceptibilidad a la oxidación de las células del cerebro es que los niveles de glutation en este órgano son mucho más bajos que en hígado, lo que puede contribuir a que las neuronas se encuentren más desprotegidas frente e la agresión oxidativa

Aunque es la mitocondria la principal responsable de la generación de las

especies reactivas de oxígeno, éstas también se producen en otros orgánulos celulares, como los peroxisomas, donde la aminoácido oxidasa, la acil-CoA oxidasa y la urato oxidasa generan H2O2, o el retículo endoplásmico, donde el citocromo P-450 cataliza reacciones de monooxigenación con producción de radical superóxido y peróxido de hidrógeno por mecanismos dependientes de NADPH. Tanto el radical superóxido como el peróxido de hidrógeno no poseen una elevada reactividad frente a las macromoléculas, sin embargo, en presencia de ciertos complejos de metales de transición, como el hierro o el cobre pueden reaccionar entre si (reacción de Fenton o Harber-Weiss) y dar lugar al radical hidroxilo (.OH) que posee una elevada reactividad. Otras vías de formación del radical hidroxilo son a través del peroxinitrito, producto de reaccionar el radical superóxido con el óxido nítrico y mediante la acción de radiaciones ionizantes sobre el agua (Figura 3).

Capítulo 1

21

La generación de estas sustancias prooxidantes se encuentra controlada mediante mecanismos celulares de defensa antioxidantes, reductores o secuestrantes que se ubican de manera estratégica en los diferentes orgánulos subcelulares. En el caso de que estos mecanismos lleguen a ser insuficientes para contrarrestar la excesiva producción de especies reactivas, se originan alteraciones celulares que conducen al estrés oxidativo, que puede llegar a afectar de manera irreversible la viabilidad celular y la funcionalidad del órgano. Bien conocida es la lesión oxidativa producida sobre el DNA por el ·OH. Del mismo modo, se originan lesiones oxidativas en los lípidos y en las proteínas. Además, con la edad se producen cambios en la estructura molecular de los enzimas debido a errores en la traducción y en la conformación de su molécula a nivel de racemización de aminoácidos, desaminación, glicosilación, oxidación, etc.

A medida que transcurre la edad se incrementan las lesiones oxidativas

al DNA (evaluadas por la concentración de 8-hidroxiguanina), disminuyen los niveles de ácidos grasos poliinsaturados, se producen transcripciones anómalas, descienden los complejos I y IV de la cadena de transporte electrónico (complejos codificados por el DNA mitocondrial a diferencia de los II y III codificados por el DNA nuclear) y se produce una pérdida de la producción de energía, con el consiguiente incremento en los niveles de oxidantes al reaccionar los grupos carbonilos de las proteínas oxidadas con grupos amino libres.

El papel de la lesión oxidativa a nivel de las proteínas en el envejecimiento

celular se hace aparente en las formas inactivas o menos activas de algunos enzimas. Las modificaciones post-traduccionales son en gran parte las responsables de la acumulación de estas proteínas inactivas. La lesión oxidativa se verifica de manera selectiva en ciertas proteínas mitocondriales. Se ha descrito que la aconitasa mitocondrial, un enzima del ciclo tricarboxílico, es un objetivo específico de sufrir la oxidación durante el envejecimiento.

Las membranas mitocondriales al ser ricas en ácidos grasos altamente

insaturados son muy susceptibles a sufrir peroxidación lipídica. De hecho, en especies más longevas se ha demostrado que poseen una proporción menor de ácidos grasos insaturados de 4 o más dobles enlaces por sustitución del araquidónico por el linoleico, lo cual influye en la funcionalidad de la cadena de transporte de electrones y en la disminución de la producción de radicales libres. Además la velocidad del proceso del envejecimiento puede depender de la sensibilidad de los lípidos mitocondriales para sufrir la oxidación. El

Capítulo 1

22

análisis de la fracción de lípidos de las mitocondrias hepáticas de varias especies de mamíferos ha revelado que el número total de dobles enlaces y el índice de peroxidación de los lípidos de las membranas mitocondriales se relacionan inversamente con la longevidad. En el envejecimiento tiene lugar un ciclo vicioso en la mitocondria: el incremento en la lipoperoxidación, unido a la modificación oxidativa de las proteínas, eleva el daño oxidativo y las mutaciones en el DNA mitocondrial; a su vez, los enzimas de la cadena respiratoria que contienen las subunidades proteicas codificadas por el DNA mitocondrial lesionado, elevan la generación de especies reactivas de oxígeno, las cuales agravan el daño oxidativo en la propia mitocondria.

3.2. Sistemas de defensa antioxidante Para mantener la integridad celular, una serie de sistemas de defensa

antioxidante, ubicados de manera estratégica en distintos orgánulos subcelulares, actúan concertadamente con aquellos mecanismos responsables de los procesos reparadores de las macromoléculas lesionadas por oxidación (Figura 3). El anión superóxido y el peróxido de hidrógeno se convierten en especies inertes por la acción sucesiva de la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa y la glutation peroxidasa (GPX). La superóxido dismutasa cataliza la dismutación del anión superóxido a peróxido de hidrógeno: la catalasa reacciona con el peróxido de hidrógeno y genera agua y la glutation peroxidasa cataliza la oxidación del glutation reducido a glutation oxidado a expensas del H2O2 o de peróxidos orgánicos. La eficiente funcionalidad de estos mecanismos defensivos necesita la actividad concertada de los enzimas individuales. Así, la superoxido dismutasa, la catalasa y la glutation peroxidasa actúan de manera coordinada en los estados prooxidantes celulares. Para mantener la integridad celular, estos sistemas han de coordinarse con los sistemas celulares responsables de la reparación de las moléculas lesionadas por oxidación.

Entre los antioxidantes no enzimáticos de procedendencia endógena el

más importante es el glutation reducido (GSH), tripéptido compuesto por γ-glutamilo, cisteína y glicocola. Es el tiol de bajo peso molecular más abundante en la mayoría de células de mamíferos. La concentración intracelular de GSH en hígado en condiciones normales fluctua entre 5 y 10 mM y en el estado redox normal de la célula, menos de un 5% del glutation total existe en su forma oxidada (GSSG). El hígado es el órgano que se caracteriza por su elevada capacidad de sintetizar glutation a través de la vía de la cistationina, cuya misión es generar cisteína a partir de metionina la

Capítulo 1

23

dieta. En hígado existen dos reservorios de glutation: el citosólico y el mitocondrial. El glutation citosólico se encuentra sometido a un intenso recambio, mientras que el glutation mitocondrial no.

La pérdida de GSH inducida por agentes químicos, favorece la

peroxidación lipídica y la lesión celular. El GSH actúa principalmente sobre el H2O2 generado en el curso de la biotransformación de xenobióticos y otras vías y como coenzima de la glutation peroxidasa. También el GSH se utiliza como sustrato por la glutation-S-transferasa para la conjugación y eliminación de xenobióticos. El GSH reacciona también con el radical hidroxilo (·OH), la fuente más importante de lesión debida a radicales libres de oxígeno. El declinar de la concentración de GSH con la edad se debe a un incremento en la tasa de oxidación o a una disminución en el recambio del GSH resultante de mayor utilización/degradación y/o de una menor biosíntesis del GSH. Es importante mantener elevado el cociente GSH/GSSG para prevenir la secuela de acontecimientos que lleva consigo la pérdida de los grupos tiólicos celulares y otras alteraciones como, peroxidación lipídica, alteraciones en la homeostasis del calcio, etc. A este respecto, la continuada generación de GSH, a partir del GSSG, por acción de la glutation reductasa en presencia de equivalentes reductores, en forma de NADPH, es esencial para preservar la integridad celular.

La vitamina E es el antioxidante exógeno liposoluble más ampliamente

distribuído en la naturaleza, tanto en el reino vegetal como en el animal El α-tocoferol es el isómero mejor conocido y el que posee la actividad antioxidante más potente. Debido a la propiedad lipofílica de la molécula de α-tocoferol, la vitamina E interrumpe la reacción en cadena de los radicales en el medio liposoluble, por ejemplo, en las lipoproteínas plasmáticas. Elevadas concentraciones de α-tocoferol se encuentran en glándulas adrenales, corazón, testículos e hígado. En el interior de la célula, esta vitamina se asocia con membranas ricas en lípidos, como la mitocondria y el retículo endoplásmico, de manera que su acción antioxidante es efectiva ya que evita la lipoperoxidación de las membranas al reaccionar con los radicales peroxilo y alcoxilo. (Ver Capítulo 3, Antioxidantes y envejecimiento)

Otra defensa antioxidante muy efectiva, es la restricción calorica de la

ingesta, ya que el menor consumo de alimentos va a proporcionar un menor número de electrones, que tienen que ser procesados por la mitocondria a través de la cadena de transporte electrónico. El descenso programado de la

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dieta al aminorar la generación de especies reactivas de oxígeno por la mitocondria, se presenta como uno de los medios antioxidantes más efectivos que aseguran una buena salud e incluso prolongan la vida. Existen evidencias que demuestran el efecto de esta restricción sobre animales de experimentación. En todos ellos se ha observado una progresión más lenta del envejecimiento, un retraso en la aparición de los efectos no deseables y un aumento de la esperanza de vida.

Es, por tanto, la lesión oxidativa que se acumula en las macromoleculas

a lo largo de la vida, la responsable de una gran parte de los efectos adversos de la senectud. En hepatocitos de ratas senescentes la tasa de generación de ROS es más elevada que en los de ratas jóvenes, de tal manera que las defensas antioxidantes se encuentran en situación de no poder hacer frente a ellas, lo que conduce al estrés oxidativo. En un estudio previo en nuestro laboratorio se ha descrito que el retraso en la reparación o una reparación incompleta de las macromoléculas oxidadas de los hepatocitos de las ratas viejas, es la causa de la menor respuesta proliferativa post-necrótica en esas células. Esta menor respuesta retrasa la regeneración hepatocelular y la restauración de la funcionalidad hepática e incrementa el riesgo de la toxicidad de los fármacos debido a la incompleta restauración de los sistemas encargados de su metabolismo.

4. Expectativa de vida y longevidad máxima entre las especies Hay que distinguir entre longevidad media de la población, expectativa

de vida o supervivencia de cada individuo y la longevidad máxima referida a la especie. La longevidad media ha aumentado considerablemente a lo largo de los tiempos (curvas de supervivencia). La longevidad máxima depende de los genes de cada especie, mientras que la expectativa de vida de cada individuo depende también de los factores ambientales. La longevidad máxima no varía y es aquel punto donde caen todas las curvas, y en la especie humana se cifra en 125 años. No hay pruebas de que haya aumentado la longevidad máxima en humanos. El avance cultural ha ampliado la supervivencia, pero no ha desacelerado la intensidad del fenómeno intrínseco del envejecimiento. Esta intensidad es tanto más lenta cuanto más vive un animal.

Se define como potencial de energía vital al número de calorías

transformadas por Kg de peso corporal durante la vida. Este parámetro es muy variable entre las especies; es mayor en animales de pequeño tamaño

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corporal y elevada tasa metabólica. Por otro lado, a igualdad de tamaño corporal existen diferencias muy notables en el potencial de longevidad máxima entre los diferentes vertebrados. Así, la esperanza de vida y la longevidad máxima son mucho mayores en las aves que en los mamíferos. Por ejemplo, si se comparan las palomas con las ratas, con un peso corporal similar, las palomas pueden vivir 35 años, mientras que las ratas sólo 4 años. Diversos estudios del grupo de Barja et al., de la Facultad de Biología de la Universidad Complutense, han investigado estos problemas y han encontrado que el consumo de oxígeno por la mitocondria resulta ser similar en palomas y en ratas, pero la generación de especies reactivas de oxígeno es menor en las palomas. A igual consumo de oxígeno, la paloma genera menos radicales de oxígeno, con lo que su DNA mitocondrial resulta menos lesionado y puede ser reparado más eficazmente (Figura 2).

Los estudios comparativos entre especies de vertebrados con muy

diferente expectativa de vida, han demostrado que los niveles constitutivos de antioxidantes endógenos se relacionan de manera negativa con dicha expectativa, lo cual indica que a mayor producción de ROS por la mitocondria menor expectativa de vida. Además, el ritmo metabólico basal se relaciona con el envejecimiento y con el período de máxima longevidad. La explicación de este comportamiento diferente entre paloma y rata tienen su base en que en las palomas, a igual consumo de oxígeno, la generación de ROS es menor (Figura 2) y que las membranas mitocondriales de las palomas son menos sensibles a la lipoperoxidación. Lo primero no está claro aún, pero se atribuye a un distinto comportamiento en el funcionamiento de la cadena electrónica mitocondrial. Lo segundo se debe a que los lípidos integrantes de las membranas son menos insaturados en las palomas y esto hace que sean menos sensibles a la lipoperoxidación. En las palomas es más bajo el contenido en ácidos grasos altamente insaturados (docosahexanoico, 22:6n-3 y araquidónico, 20:4n-6). Por tanto, un bajo grado de insaturación lipídica es una característica general de animales longevos homeotermos. También se ha observado que las membranas mitocondriales de las palomas son menos permeables a los protones y que la lesión oxidativa al DNA mitocondrial se relaciona inversamente con el máximo periodo vital. También se ha detectado en aves menor glicosilación en las proteínas y en acumulación de productos terminales de glicosilación avanzada (AGE).

5. Telómeros y telomerasa En la mayoría de las células somáticas de los tejidos normales, la pérdida

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de la capacidad replicativa, que conlleva a la senescencia celular, se debe al acortamiento de los telómeros asociado con la ausencia de la actividad telomerasa. Los telómeros y la telomerasa presentan un gran interés a la hora de encontrar explicación, no sólo a los cambios relacionados con el envejecimiento, sino también a los relativos al cáncer. Son numerosas las alteraciones en la expresión genética que afectan a la diferente capacidad de las células para dividirse y que se encuentran implicadas en los mecanismos que conducen, tanto al envejecimiento como al cáncer.

Las células somáticas de los mamíferos poseen una limitada capacidad

de dividirse en cultivo, debido al acortamiento en los telómeros, la porción terminal de los cromosomas lineales. El acortamiento telomérico origina cambios transcripcionales que conllevan a la silenciación de genes subteloméricos y es causa de la inestabilidad cromosómica de la senescencia. Los telómeros son secuencias de hexanucleótidos (TTAGGG), ubicadas en los extremos de los cromosomas lineales del núcleo, las cuales son esenciales para el mantenimiento de la estabilidad cromosómica. La telomerasa es una ribonucleoproteína denominada transferasa telómero-terminal, requerida para la síntesis de la repetición telomérica, cuya porción RNA se utiliza como molde para añadir, mediante retrotranscripción, secuencias teloméricas de novo a los extremos de los telómeros. La telomerasa se expresa sólo en células germinales y en células transformadas. La pérdida progresiva de los extremos teloméricos de los cromosomas durante el envejecimiento, puede inducir señales antiproliferativas que conduzcan a un estado de senescencia celular o replicativa. La replicación de los telómeros presenta un dilema especial denominado “problema de la replicación terminal”, ya que en la división celular, los telómeros de las células somáticas normales no pueden replicarse en su totalidad por el complejo DNA polimerasa y esto se debe a la diferencia en la replicación de las dos cadenas del DNA, la conductora y la rezagada. Para resolver este problema la mayoría de las células eucariotas utilizan la telomerasa, enzima que alarga los extremos 3´ de los cromosomas que se van a replicar. (Ver Capítulo 4, Telomeros y Telomerasa)

Entre las diferentes alteraciónes típicas del envejecimiento, que

conducen a la inestabilidad genética, el acortamiento de los telómeros representa uno de los cambios estructurales más importantes. Se ha detectado una disminución en la longitud de los telómeros en células procedentes de individuos de edad elevada y en cultivos celulares senescentes, lo que indica que el acortamiento telomérico se considera un marcador del envejecimiento.

Capítulo 1

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El interés por los telómeros relativo a los procesos de senescencia e inmortalidad se basa en que el envejecimiento supone la pérdida de la capacidad replicativa celular, y la inmortalidad la ganancia de un potencial replicativo ilimitado. La importancia de la relación entre envejecimiento e inmortalidad se encuentra reforzada por el hecho que una elevada proporción de células tumorales expresan actividad telomerasa, mientras que la mayor parte de células somáticas normales muestran una ausencia casi total de esta actividad.

De acuerdo con la teoría evolutiva del soma desechable, los mecanismos

antienvejecimiento y los anticáncer han adaptado sus respectivas fuerzas a la expectativa de vida natural de cada especie y de esta manera estos mecanismos aseguran que la mayoría de los individuos estarán libres de cáncer y de envejecimiento en tanto en cuanto sean útiles o beneficiosos para sus especies.

Si comparamos mamíferos de corta expectativa de vida, tal como los

ratones y los de larga vida como los humanos, está claro que los humanos tienen una protección frente al cáncer y unos mecanismos antienvejecimiento más rigurosos que los ratones. Por tanto, es importante destacar que unos y otros mecanismos han evolucionado en paralelo y se acomodan a la expectativa de vida natural de las especies.

Sin embargo, la evolución de la protección al cáncer y al envejecimiento

tiene raíces más profundas que la simple adaptación en paralelo de los dos procesos independientes. Recientes investigaciones revelan la existencia de mecanismos que proporcionan simultáneamente resistencia al cáncer y resistencia al envejecimiento, y de otros mecanismos que proporcionan protección contra el cáncer, pero favorecen el envejecimiento. Los primeros actúan en común sobre la generación y acumulación de lesión celular. La lesión celular es el origen, tanto del envejecimiento como del cáncer. Por lo tanto, aquellos mecanismos que previenen la lesión celular proporcionan protección frente al cáncer y frente al envejecimiento. Entre estos mecanismos están los que mejoran la eficiencia del consumo de energía, disminuyendo la generación de ROS, consideradas la fuente principal de daño endógeno, y la proteína p53, el principal sensor del daño al DNA, que desencadena las respuestas de defensa y reparación. Existen evidencias experimentales que indican que aquellos mecanismos o intervenciones que disminuyen la generación de ROS y promueven la actividad de p53 proporcionan protección frente al cáncer y al envejecimiento. Sin embargo,

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se han descubierto mecanismos que ejercen efectos opuestos sobre el envejecimiento y el cáncer, evitando específicamente el cáncer, pero promoviendo el envejecimiento. Estos mecanismos incluyen el acortamiento de los telómeros y la desrrepresión del locus INK4a/ARF, cuyo propósito es prevenir la proliferación celular excesiva, lo cual supone una protección frente al cáncer, mientras que limitan la regeneración a largo plazo y la longevidad.

6. Envejecimiento, células madre y factores sistémicos.

¿Medicina regenerativa? Los numerosos estudios que se llevan a cabo en la actualidad en células

madre han proporcionado suficientes argumentos que muestran un futuro prometedor en tratamientos para paliar o evitar los efectos adversos del envejecimiento. Estos tratamientos pueden ser de gran utilidad y eficacia para la reparación de tejidos lesionados, el tratamiento de enfermedades degenerativas y en general para prevenir la disminución de las funciones de la edad avanzada. Es importante investigar si el envejecimiento es la causa o la consecuencia de las alteraciones en las células madre.

En mamíferos, las células madre residen en muchos tejidos adultos

donde producen continuamente nuevas células en los que tienen un elevado recambio (sangre, piel e intestino), o sirven como reservorio para el reemplazo celular gradual y reparación, en aquellos que poseen células con recambio más bajo (hígado cerebro y músculo). Es un hecho reconocido que la funcionalidad de las células madre, como la de otras células, decrece con la edad, pero hay que conocer hasta que grado los trastornos de la edad afectan la función reparadora y renovadora de las células madre. (Ver Capítulo 9, Células madre)

La menor capacidad regeneradora y renovadora de las células madre en

la mayoría de los tejidos, debida al envejecimiento, se debe a una combinación de cambios, que son los que van a impedir que dichas células ejerzan su función y participen en el mantenimiento y reparación de los tejidos. En el músculo esquelético adulto, donde las células madre residentes, denominadas células satélite, son capaces de regenerar de manera rápida y efectiva el tejido muscular en respuesta a cualquier lesión, existe una progresiva y ostensible pérdida del potencial regenerativo en animales a medida que transcurre la edad. La activación de las células satélite y la determinación del destino celular se encuentran controlados por una vía

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señalizadora, la vía NOTCH cuya actividad se desencadena mediante la unión con su ligando Delta, cuya expresión se inicia de manera rápida en respuesta a cualquier lesión. En músculo de animales viejos la expresión del factor Delta está notablemente disminuida, lo cual va a afectar en gran manera al funcionamiento de la vía señalizadora NOTCH y con ello al potencial regenerativo de las células satélites. Experimentos de Convoy y Rando han demostrado, que si se induce indirectamente la actividad de la vía NOTCH se puede restaurar la capacidad regenerativa de las células satélite. Esta inducción se ha conseguido mediante la exposición de las células satélite de ratones viejos a suero de ratones jóvenes, bien in vivo por emparejamiento parabiótico heterocrónico (circulación compartida), de un ratón viejo con un ratón joven, o in vitro, mediante la adición de suero de ratones jóvenes al medio de cultivo de células de ratón viejo. De esta manera se ha observado que algún componente del suero de animales jóvenes activa la vía señalizadora NOTCH y con ello la respuesta proliferativa de las células satélite y se consigue un rejuvenecimiento del animal viejo o de las células en cultivo procedentes de animales viejos, a expensas del plasma de ratones jóvenes. Estos resultados han llevado a la conclusión que el potencial regenerativo persiste en las células satélite, las cuales a pesar del envejecimiento no han perdido su capacidad de participar en el mantenimiento y reparación del tejido muscular, capacidad que recuperan al contacto con factores séricos presentes en el animal joven y que se han ido perdiendo por efecto del envejecimiento. Por tanto, el que las células madre de animales muy viejos sean capaces ejercer su misión de mantenimiento y reparación de los tejidos de animales viejos y mantengan su capacidad regeneradora intrínseca, lo proporciona un medio ambiente óptimo. Así, se ha demostrado que la capacidad regeneradora intrínseca de las células madre musculares puede ser restaurada forzando la activación de la vía señalizadora NOTCH.

Otros experimentos han puesto de manifiesto, que el descenso en la

renovación del tejido muscular con la edad se asocia con un incremento en fibrosis tisular y esto se debe a que las células madre musculares o células satélite de animales viejos, tienden a transformarse en linaje fibrogénico. Basándose en esta observación Brack et al., han observado que este cambio está mediado por factores en el ambiente sistémico de los propios animales viejos y se asocia con la activación de la vía señalizadora Wnt, activación que puede ser suprimida por inhibidores de Wnt. Además, componentes del suero de los animales viejos, que se unen a los receptores de WNT, la familia de proteínas Frizzled, pueden ser la causa de la mayor de la señalización de

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la vía activada por Wnt. Estos resultados indican que en la transformación de las células satélites, dependiente de la edad, juega un papel crítico la vía señalizadora Wnt.

El declinar del potencial regenerativo en hígado con la edad ha sido

demostrado ampliamente por experimentos del grupo de Cascales, que fueron motivo de la Tesis Doctoral de Nuria Sanz, quienes observaron, que después de una dosis subletal necrogénica de un agente hepatotóxico (tioacetamida) a ratas, el proceso de regeneración hepatocelular postnecrótica mostró diferentes ritmos según la edad del animal: en animal joven (2 meses) el hígado mostró una recuperación total a las 96 horas de la intoxicación, el grupo de animales adultos y maduros (6 y 12 meses) mostró en su recuperación un retraso de 24 horas, y los animales viejos (24 y 30 meses), apenas se habían recuperado a las 96 horas de la intoxicación. Esto indica que el potencial proliferativo declina de manera significativa con el transcurso de la edad. Sobre la base de este declinar del potencial regenerativo hepático, el grupo de Conboy ha observado que la menor proliferación de las células progenitoras hepáticas (el propio hepatocito), se debe a la formación de un complejo formado entre la proteína de unión a CCAAT (cEBPα) y el factor remodelador de la cromatina Brm. Para examinar la influencia de los factores sistémicos sobre el hepatocito, estos autores realizaron el experimento de la parabiósis heterocrónica, antes citado, exponiendo ratones viejos a factores presentes en suero de ratones jóvenes. También en este caso se elevó la proliferación de los hepatocitos y se restauró el complejo cEBP/Brm a los niveles presentes en ratones jóvenes. Estos resultados en hígado, y los anteriores en músculo esquelético indican que el declinar de la actividad proliferativa de las células progenitoras se modula por factores sistémicos que cambian con la edad.

Los experimentos antes citados demuestran la existencia de factores en

suero capaces de modular las vías señalizadoras críticas para la activación de las células madre tisulares y que el medio ambiente sistémico de un animal joven posee esos factores que son los que promueven la activación del potencial proliferativo de las células madre, mientras que el de los animales viejos al carecer de ellos fracasa. Es importante identificar los factores que ejercen tal influencia crítica sobre las células madre adultas específicas de los tejidos, ya que las células madre de animales viejos retienen su potencial proliferativo intrínseco. Son los cambios en el medio ambiente sistémico del nicho en el que las células madre residen, los que evitan o entorpecen la activación de esas células para la renovación y regeneración tisular.

Capítulo 1

31

En los estudios anteriores se encuentran las bases de la Medicina Regenerativa frente al envejecimiento. Las células madre (células satélite o hepatocitos) no han sufrido merma alguna en su capacidad proliferativa intrínseca, es el ambiente que las rodea el que resulta afectado por el envejecimiento, ya que se ha demostrado en un caso, que el suero carece de algún factor necesario para su activación, y en el otro, que se produce algún factor que las modifica. Encontrar esos factores en el medio ambiente sistémico es lo que se tiene que conseguir para paliar los efectos adversos de la edad avanzada. Esta parte de la medicina se refiere a nuevas terapias para el reemplazo o restauración de las células perdidas, lesionadas o envejecidas en el organismo, y ha de explorar de qué manera se mantiene latente la actividad intrínseca de proliferación celular de las células madre adultas específicas de los tejidos.

7. MicroRNA (miRNA), transducción de señales y Medicina

Preventiva Hasta la fecha se han investigado muy poco los acontecimientos

celulares de los sistemas biológicos regulados por acción de los miRNA, relacionados con el envejecimiento. Sin embargo, el estudio del control que ejercen los miRNA en la senectud parece enormemente prometedor. Boehm y Slack han encontrado en el gusano C. elegans, que reduciendo la actividad del miRNA lin-4 disminuye la expectativa de vida y viceversa. Además, ha demostrado también que lin-4 regula la vía señalizadota IGF (factor de crecimiento insulínico), vía esencial para determinar la expectativa de vida. Este estudio proporciona una base para futuros trabajos encaminados al conocimiento de los cambios en la expresión de otro micro RNA let-7, también relacionado con la senectud, ya que se ha demostrado que muchos miRNA pueden ser esenciales para prevenir las enfermedades típicas del envejecimiento. Un ejemplo de tal propuesta ha sido ya realizado por Ibañez-Ventoso et al., quiénes han identificado 114 miRNA, de los cuales alrededor de unos 50 muestran cambios de expresión (disminución), que se inician a partir de la mediana edad. Los objetivos de estos 50 miRNA incluyen la vía de la insulina, la determinación de la longevidad y la función muscular.

En una sociedad que está experimentando un acelerado incremento de la

población envejecida, es de urgente necesidad dirigirse a los problemas del envejecimiento con nuevas estrategias que traten de detectarlos y combatirlos en estado previos e incipientes para evitar los efectos de la vejez que van a ser causa del desarrollo de enfermedades. Se está intentando llamar la

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32

atención respecto a que ya en la madurez comienzan a iniciarse síntomas relativos a la disminución de la salud celular, que puede implicar un cambio programático universal o específico en el sistema del control de la señalización. Este declinar, en etapas previas a la senectud, aunque todavía sub-clínico y asintomático, puede precipitar a un riesgo incrementado de enfermedades en el último período de la vida. El control en los inicios del declinar celular, puede estar gobernado por este grupo de especies moleculares, de reciente descubrimiento, los miRNAs, pequeños RNA de unos 22 nucleótidos. Los miRNA por ellos mismos no codifican proteínas, pero regulan negativamente la expresión de determinados genes, bien degradando su mensaje o inhibiendo su traducción por unión a su región 3´ no traducible (UTR). Así, la posible alteración de estos reguladores negativos de la expresión genética, en etapas previas a la edad avanzada, puede ser una llamada de atención a la alteración molecular en la señalización celular individual, que en un momento ha de conducir a una amplia disfunción tisular. Un reto para futuras investigaciones es identificar estos miRNA con el objeto de desarrollar terapias para combatir los primeros signos de los efectos de la senectud, lo que supone una clase de medicina, la medicina preventiva, que puede aminorar o retrasar el riesgo de enfermedades de la vejez. Esta medicina preventiva ha de añadir una mayor calidad de vida a la senectud lo cual ha de tener gran repercusión a nivel social y económico.

Es un hecho frecuentemente ignorado, que la mayoría de los problemas

dependientes de la edad tienen sus comienzos en la edad madura. Estos comienzos se pueden detectar en células individuales o en pequeños grupos de células sin manifestaciones fenotípicas apreciables. Sin embargo, estos inicios funcionan a modo de semillas implantadas que se desarrollarán posteriormente en la vejez. La medicina preventiva tiene que estudiar el envejecimiento desde un nuevo punto de vista tratando de resolver los problemas al principio y no al final. Los rápidos avances científicos en el campo del envejecimiento, como también los progresos recientes en la biología de las células madre, cicatrización de las heridas, regeneración hepática y muscular, defensa frente a la infección, biología de los miRNA y los avances tecnológicos en genómica, proteómica nanotecnología etc., suponen un gran apoyo y muestran que con este arsenal científico, los estudios sobre el envejecimiento pueden emplear estrategias de intervención y tomar medidas predictivas y preventivas, para evitar en lo posible las terribles enfermedades degenerativas de la senectud.

Capítulo 1

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8. Conclusiones En el siglo XX, la longevidad media de la población se elevó de manera

notable, merced a los avances en la salud pública, que lograron disminuir las enfermedades infecciosas, y proporcionar mejores tratamientos a las enfermedades crónicas y a las enfermedades asociadas genéticamente. En España el promedio de esperanza de vida se ha elevado desde los 58 hasta los 80 años. En los últimos 30 años, muchos de estos logros se han conseguido retrasando la mortalidad del cáncer y de las enfermedades del corazón y cerebro. Aunque se puede argüir que el incremento en la esperanza de vida y en las enfermedades dependientes de la edad son asuntos separados, ya que la mayoría de individuos con 70 y más años disfrutan de una vida sana e independiente, los países desarrollados soportan todavía un alto costo debido a las elevadas necesidades de la población que sufre los trastornos del envejecimiento.

Al fin y al cabo, hay algunas personas que llegan a vivir los 110-120

años, lo que indica que aún no hemos alcanzado el máximo. Incluso podríamos ir más lejos. ¿Por qué resignarnos al tope genético de nuestra especie? La naturaleza ha generado especies más longevas que la nuestra, como algunas tortugas o loros, así que sólo se trataría de averiguar qué fórmula ha utilizado. O quizás incluso haya varias fórmulas para aumentar la longevidad. De hecho, hoy podemos potenciar la función de los genes con fármacos o con distintas estrategias de terapia génica. ¿Por qué no pensar que algún día podríamos llegar a vivir mucho más de 120 años modificando o potenciando la función de nuestros genes?

Uno de los temas más candentes de la investigación biomédica actual es,

precisamente, entender ¿por qué envejecemos desde un punto de vista molecular y genético? La idea detrás de estas investigaciones es que sólo si entendemos las bases moleculares del envejecimiento podremos diseñar medios para curar, o al menos retrasar, la aparición de un gran número de achaques de la vejez. Las revistas científicas de más prestigio publican regularmente trabajos con un mensaje recurrente: el envejecimiento es un proceso modificable, que se puede retrasar mediante intervenciones genéticas, farmacológicas o nutricionales. Es, por lo tanto, cuestión de tiempo averiguar la receta perfecta para conseguir vivir más años en buenas condiciones de salud. El futuro próximo nos ha de brindar nuevas formas de terapia regenerativa y preventiva, que proporcionaran mayor calidad de vida en la población de edad avanzada.

Capítulo 1

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9. Abreviaturas AGE, productos terminales de glicoxildación avanzada; Brm, factor

remodelador de la cromatina; cEBPa, proteína de unión a CCAAT; GPX, glutatión peroxidada; GSH, glutatión reducido; GSSG, glutatión oxidado; miRNA, micro RNA; ROS, especies reactivas de oxígeno; Se, selenio; SOD, superóxido dismutasa.

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Capítulo 1

37

Capítulo 2. ESTRES OXIDATIVO

1. Introducción 2. La naturaleza radical de oxígeno 3. Toxicidad de oxígeno y estrés xidativo 4. Efectos lesivos del estrés oxidativo sobre las células 5. Especies reactivas de oxígeno como segundos mensajeros 6. Especies reactivas de oxígeno y cáncer 7. Estrés oxidativo e iniciación tumoral 7.1. Modificación oxidativa en las bases del DNA 7.2. Alteraciones en la hélice del DNA 8. Promoción tumoral y especies reactivas de oxígeno. 8.1. Promoción tumoral mediada por calcio 8.2. Otros mecanismos de promoción tumoral 9. Progresión tumoral. Influencia de las especies reactivas de oxígeno 10. Mutaciones en el gen p53 e inestabilidad genómica 11. ROS y apoptosis 12. Reparación del DNA 12.1. Mecanismos reparadores generales 12.2. Reparación de lesiones específicas del DNA 12.3. Reparación de errores de apareamiento 13. Conclusiones 14. Abreviaturas 15. Bibliografía

1. Introducción

La paradoja de la aerobiosis o la paradoja del oxígeno proviene del hecho

que los organismos aerobios no pueden existir en ausencia del oxígeno y el oxígeno es inherentemente tóxico para su existencia. Animales, plantas y muchos microorganismos cuentan con el oxígeno para una eficiente producción de equivalentes energéticos en forma de ATP. La atmósfera de nuestro planeta fue anaerobia hasta el advenimiento del oxígeno, hace 2.500 millones de años, como resultado de la rotura del agua en el proceso fotosintético de unas algas microscópicas cianofíceas. A partir de aquí y con el advenimiento de la fotosíntesis oxidativa, la acumulación progresiva del oxígeno hizo cambiar el ambiente de la atmósfera, desde predominantemente reductor (rico en hidrógeno) o neutro (CO2 y N2), hasta ocupar un 20% del aire que respiramos. Como el oxígeno es potencialmente tóxico su incremento en la atmósfera hizo que los organismos que habían vivido bajo

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condiciones anaerobias se encontraran sometidos a una presión de selección que incrementó la tasa de mutaciones y aceleró la evolución. El uso del oxígeno presentaba una serie de ventajas, mayor energía útil derivada de los alimentos para realizar nuevas transformaciones metabólicas, para destoxificar numerosos compuestos e incluso para generar luz y calor. Todas estas ventajas tenían una contrapartida, tener que proporcionarse sistemas de defensa frente a la considerable toxicidad de este gas paramagnético. Aquellos organismos que consiguieron desarrollar las requeridas defensas pudieron sacar provecho de los beneficios y ello dio lugar a una enorme variedad de formas de vida aerobia tan evidentes hoy sobre la Tierra. Sin embargo, los que no pudieron acomodarse a la toxicidad del oxígeno evolucionaron como anaerobios microscópicos y quedaron restringidos a nichos anaeróbicos.

El lado perjudicial del oxígeno se relaciona directamente con el hecho

de que cada átomo de oxígeno posee un electrón desapareado en su orbital externo y la molécula de oxígeno posee dos electrones desapareados en distintos orbitales, de manera que el átomo de oxígeno es un radical libre y la molécula de oxígeno un biradical libre. La reducción tetravalente concertada del oxígeno por la cadena de transporte electrónica mitocondrial para producir agua se considera un proceso relativamente seguro. Sin embargo, la reducción univalente del oxígeno genera intermediarios reactivos. El ambiente reducido del medio intracelular proporciona amplias oportunidades para que el oxígeno sufra la reducción univalente. El anión superóxido, el peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo son subproductos comunes de la vida en ambiente aerobio y son los responsables de la toxicidad del oxígeno.

Para superar el ambiente poco favorable, los seres vivos aerobios han

desarrollado una serie de sistemas defensa enzimáticos y una variedad de compuestos antioxidantes hidro y liposolubles, cuya misión es interceptar e inactivar las ROS que inevitablemente se generan en la reducción del oxígeno por la mitocondria. La célula posee, la capacidad de sintetizar una batería de enzimas reparadores/eliminadores de las lesiones oxidativas en proteínas, lípidos y DNA. Además, como la intensidad del estrés oxidativo puede variar de un momento a otro, los organismos han adquirido la capacidad de adaptarse a tal estrés fluctuante induciendo la síntesis de enzimas antioxidantes y de enzimas reparadores que eliminan la lesión. En condiciones perfectas los problemas de la aerobiosis terminarían aquí, pero desgraciadamente, la biología no es tan precisa. La realidad parece ser que, a pesar que la célula posee valiosos mecanismos antioxidantes y reparadores

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que suponen una defensa eficiente frente a la agresión oxidativa, en determinadas ocasiones no son suficientes y el daño oxidativo permanece como un resultado imposible de evitar de la existencia aerobia. El estrés oxidativo se encuentra involucrado en una amplia variedad de procesos degenerativos, enfermedades y síndromes tales como:

• mutagenesis, transformación celular y cáncer, • aterosclerosis, infartos y lesiones derivadas de la

isquemia/reperfusión, • enfermedades crónicas inflamatorias (artritis reumatoide, lupus

eritematosus, artritis psoriatica), • problemas agudos inflamatorios, cicatrización de heridas, • estrés fotooxidativo ocular (cataratas), • alteraciones del sistema nervioso central (esclerosis lateral

amiotrofica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer), y • una amplia variedad de alteraciones relacionadas con la edad,

incluyendo los mismos procesos del envejecimiento. Alguna de estas enfermedades relacionadas con la oxidación pueden

exacerbarse o incluso iniciarse por efecto de prooxidantes ambientales, entre los que se incluyen numerosos fármacos y alimentos.

2. La naturaleza radical del oxígeno El estrés oxidativo es un resultado inevitable de la vida en un medio rico

en oxígeno. Para los organismos aerobios el oxígeno es vital para la existencia e inherentemente lesivo. La paradoja del oxígeno deriva de su misma naturaleza química. La naturaleza de radical le permite reacciones químicas de oxidación/reducción muy interesantes. El oxígeno en su transformación para generar agua, sufre cuatro sucesivas reducciones univalentes con un electrón, catalizadas por la citocromo oxidasa de la cadena de transporte electrónico mitocondrial. En esta vía se generan intermediarios reactivos. El primero, resultante de la reducción con un electrón del oxígeno molecular, es el radical anión superóxido (O2

.-). La adición de un segundo electrón y dos protones genera la especie activa peróxido de hidrógeno (H2O2). Un tercer electrón produce el radical hidroxilo que posee una elevada reactividad. El cuarto electrón genera una molécula de agua (Figura 1).

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Es interesante destacar que el O2 y el O2.- son radicales de oxígeno (O2

es un biradical y O2.- es un monoradical), mientras que el H2O2, a pesar de ser

una especie reactiva, no es un radical ya que todos los electrones de su orbital externo se encuentran apareados. El radical hidroxilo (·OH) es una verdadera especie radical. La generación del radical superóxido ocurre frecuentemente por transferencia del hidrógeno de un reductor, vía la formación de una especie hidroxioxil (HO2

.-). El hidroxioxil es una molécula protonada que se disocia rápidamente a pH fisiológico dando lugar a anión superóxido y un proton. Como el radical hidroxioxil posee un pKa de 4.8 es posible que se consigan concentraciones limitadas de este radical en el medio acido local de la superficie externa de la membrana mitocondrial interna, donde la bomba de protones genera un pH ácido y dentro de los fagolisosomas de los neutrófilos, macrófagos y monocitos.

Las especies de oxígeno actúan como oxidantes biológicos, pero el O2

.- es un reductor suave, aunque la simple adición de un protón lo convierte en un agente oxidante activo (HO2·). El potencial redox del ·OH a unos 1,77 V, sin embargo, marca claramente a este radical como una especie muy oxidante. El oxígeno singlete (1O2) no se genera por reacciones redox, sino por absorción de energía electromagnética, la cual invierte transitoriamente el giro de uno de los dos electrones desapareados del oxígeno, de modo que los giros de los dos electrones desapareados muestran una orientación antiparalela. El oxígeno molecular (O2), estado basal o triplete, es incapaz de aceptar dos electrones directamente, reducción bivalente, porque la adición de un par de electrones antiparalelos se encuentra restringida por los giros paralelos del estado basal. El oxígeno singlete, sin embargo, con sus giros electrónicos antiparalelos no tiene tales restricciones en su reactividad y es muy buen oxidante bivalente frente a muchas biomoléculas. La absorción de grandes cantidades de energía electromagnética por el oxígeno molecular para generar oxígeno singlete se encuentra restringida a acontecimientos fotoquímicos. El interés en el oxígeno singlete se relaciona principalmente con la biología vegetal y reacciones oxidativas en tejidos expuestos al medio ambiente, como la piel y el ojo. El oxígeno singlete es muy inestable, con una vida media de 2 - 7 μsegundos, se convierte en oxígeno molecular basal en estado triplete, emitiendo luz en su descomposición.

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3. Toxicidad del oxígeno La mayor parte del oxígeno que respiramos sufre una reducción

tetravalente concertada para producir agua en una reacción catalizada por la citocromo oxidasa (citocromo c:oxígeno oxidoreductasa) del complejo IV de la cadena de transporte electrónico mitocondrial. La citocromo oxidasa es el aceptor de electrones terminal en la cadena y debe ceder sus equivalentes reductores al oxígeno para poder continuar el transporte electrónico. Si se detuviese el flujo de electrones a través de la cadena respiratoria, se disiparía la fuerza motora de protones y la síntesis del ATP no podría continuar. Por tanto, el papel principal del oxígeno en todos los organismos aerobios es actuar simplemente como un vertedero para los electrones.

Aunque la cadena de transporte electrónico mitocondrial es un sistema

muy eficiente, la naturaleza de la alternancia de las reacciones de oxidación/reducción monovalentes que cataliza (generando una constante y alternativa serie de radicales enjaulados) predispone a cada transportador de electrones a reacciones laterales con el oxígeno molecular.

El elemento oxígeno, que existe en el aire que respiramos en forma

molecular O2, fue descubierto, aislado y caracterizado independientemente por Priestley y Scheele en 1774 y poco tiempo después Lavoisier describió que la inhalación del oxígeno podía presentar efectos tóxicos. Aunque se conoce desde hace décadas que la terapia del oxígeno puede resultar beneficiosa en muchas situaciones patológicas, los tratamientos prolongados pueden suponer un riesgo de toxicidad. Binger et al (1927) reconocieron que los estudios clásicos de Bert en 1878 fueron el primer documento que demostró que el oxígeno a elevadas concentración era un veneno potente, que conducía a convulsiones y a la muerte de gorriones y animales de laboratorio. En 1899 Lorrain Smith describió que elevadas tensiones de oxígeno producían congestiones pulmonares severas en ratones, ratas y cobayas. Toda esta información ha sido ignorada a pesar de los numerosos estudios sobre la toxicidad del oxígeno que han circulado entre 1899 y 1945. La aceptación final de la toxicidad del oxígeno no llegó hasta 1967 cuando Nash et al., relacionaron la concentración y duración del oxígeno inhalado con la patología del pulmón. Ya en 1954 Gersman et al emitieron la hipótesis que el envenenamiento por oxígeno y la irradiación X tenían una base de acción común, que era a través de la formación de radicales libres de oxígeno.

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El oxígeno molecular apareció en la superficie de la Tierra hace 2,5 x 109 años y según evidencias geológicas parece ser que su aparición fue debida a la actividad fotosintética de algas microscópicas. La lenta y progresiva elevación en la concentración del oxígeno atmosférico se acompañó por la formación de la capa de ozono en la estratosfera. Ambos oxígeno y ozono actuaron como filtros protectores frente a la intensa luz ultravioleta que llegaba a la Tierra procedente del Sol. En el Universo son el hidrógeno y el helio los elementos predominantes, siendo la Tierra un centro de oxidación en un medio reducido.

El oxígeno forma parte del aire en un 20%, siendo el segundo elemento

más abundante después del nitrógeno (79%). Cuando la atmósfera terrestre cambió de su estado inicial reducido al estado oxidado de hoy, la forma de vida anaerobia cesó o quedó confinada a lugares donde no hay oxígeno. La transición de la vida anaerobia a la aerobia necesitó desarrollar mecanismos de defensa antioxidantes especializados para protegerse de las propiedades tóxicas del oxígeno.

La vida aerobia utiliza el oxígeno para oxidar (quemar) sustratos ricos en

carbono e hidrógeno (alimentos), con el objeto de obtener energía química y calor, esenciales para la vida. El oxígeno es un poderoso agente oxidante por su elevada capacidad para aceptar electrones (e-). En el interior de los átomos y moléculas, los electrones ocupan regiones conocidas como orbitales que son capaces de contener dos electrones, uno que gira en el sentido de las agujas del reloj y el otro que lo hace en sentido opuesto. Cuando un orbital contiene sólo un electrón se dice que éste se encuentra desapareado. Una especie atómica o molecular que posea un electrón desapareado se considera que es un radical libre. El propio oxígeno molecular (O2) es un biradical porque posee dos electrones desapareados cada uno en un orbital diferente que giran en la misma dirección.

Las fuentes más importantes del anión superóxido in vivo son: 1. la cadena de transporte electrónico mitocondrial, 2. las monooxigenasas de función mixta del retículo endoplasmico y 3. los cloroplastos. En la mitocondria se genera anión superóxido, vía el complejo NADH-

ubiquinona reductasa; en retículo endoplásmico a través de las monooxigenasas dependientes del citocromo P-450 (esta reacción se basa en

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la rotura de la molécula de oxígeno introduciendo un átomo de este elemento en el sustrato, en forma de grupo OH y la reducción de la otra mitad a agua). Los cloroplastos de plantas superiores también producen superóxido. El aceptor de electrones del fotosistema I puede transferir electrones directamente al oxígeno, o a través de la ferredoxina, la xantina oxidasa, NADPH oxidasa, lipooxigenasa, ciclooxigenasa, peroxidasas y hemoglobina.

4. Efectos lesivos del estrés oxidativo sobre las células Fue en 1954 cuando Rebeca Gersman y sus colaboradores, describieron

por primera vez, que los efectos tóxicos del oxígeno se debían a la formación de radicales libres de oxígeno. Posteriormente, la propuesta de McCord y Fridovich en 1969, acerca de que la formación de los radicales de oxígeno era una parte integral del metabolismo normal de la célula, no fue tomada muy en serio. Ya no existe duda de la participación de las especies reactivas del oxígeno (ROS = reactive oxygen species) en numerosos procesos fisiológicos y patológicos.

La rotación de cargas eléctricas genera campos magnéticos. El

apareamiento de electrones con giros opuestos neutraliza este efecto. La mayoría de sustancias no se encuentran influenciadas por campos magnéticos porque los electrones que poseen se encuentran en parejas de giro opuesto. Tales sustancias son diamagnéticas. Esto no ocurre con el oxígeno, que es paramagnético, lo que implica que posee giros electrónicos desapareados que tienen el mismo sentido de rotación. Esta estructura electrónica constituye una barrera para la inserción de una pareja de electrones (Fridovich 1998).

Un radical libre es una especie química con un electrón desapareado en

el orbital externo. Como los orbitales se encuentran normalmente con una pareja de electrones, una definición alternativa y similar es que un radical libre es una especie química con un número impar de electrones. La especie química puede ser un átomo, como el hidrógeno o el cloro, un metal de transición o una molécula, en cuyo caso el electrón desapareado se localiza en un orbital molecular. El electrón desapareado en el orbital externo confiere a la molécula una reactividad relativamente elevada, debido a la fuerte tendencia a adquirir un segundo electrón en el orbital. Sin embargo, los metales de transición con un número impar de electrones y los radicales libres de moléculas orgánicas grandes, son relativamente poco reactivos y estables.

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Las reacciones originadas por los radicales libres en sus reacciones en cadena, pueden ser de iniciación, propagación o terminación. En las reacciones de iniciación, un radical se forma a partir de una especie química estable no radical: AB + C Α· + B + C

En la propagación, un radical libre reacciona con una molécula estable: A· + CD ==> AC + D·

En la terminación dos radicales libres comparten sus electrones desapareados y originan un producto estable: A· + B· −−> AB

La reactividad química de los radicales libres se determina por la molécula que posee el electrón desapareado, por consiguiente, la reactividad varía enormemente entre los diferentes radicales libres. Una manera de expresar y comparar la reactividad química es evaluando la vida media (t1/2) de las especies químicas.

Tabla 1.- Vida media de radicales libres en sistemas biológicos (Boveris,

1998)

Radical libre

t1/2 segundos Radical hidroxilo (·OH) Radical alcoxilo (RO·) Radical peroxilo (ROO·) Óxido nítrico (NO·) Ubisemiquinona (UQH·) Melaninas (Complejo) Semiquinonas (Complejo)

10-9 10-6 10-1 1 - 10 10-2 días días

Una vida media corta la poseen los radicales libres de elevada

reactividad, lo que indica que los radicales ·OH son los más reactivos. La formación de ·OH implica reacción con cualquier molécula orgánica cercana. Otras especies reactivas producidas en condiciones normales no son radicales libres, pero poseen elevada reactividad, como es el oxígeno singlete (1O2), estado de oxígeno excitado electrónicamente, con una vida media de 5 x 10-6 segundos, y el poderoso oxidante peroxinitrito (ONOO-) con vida media de 0,05 - 1 segundos.

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Especies reactivas de oxígeno El átomo de oxígeno (1s2, 2s2, 2px

2, 2py, 2pz), es muy reactivo y reacciona consigo mismo para formar el oxígeno molecular. Sin embargo, en vez de formar un par de σ-π ligandos orbitales con los 2py y 2pz formando uniones y-y y z-z, la configuración de menor energía es una en la cual existe un ángulo recto de rotación y formación de un z-y σ; dos enlaces de tres electrones se forman entre un par de electrones de un átomo de oxígeno y un sólo electrón del otro átomo de oxígeno. Este enlace químico tan particular fue descrito por Linus Pauling como dos enlaces de tres electrones para explicar la configuración electrónica de la molécula de oxígeno. O ::: O.

A pesar de su naturaleza biradical, la molécula de oxígeno es, desde el

punto de vista químico, bastante estable y se ha descrito como radical perezoso. La mayoría de las biomoléculas, proteínas, azúcares, DNA y algunos lípidos, son estables por largos períodos de tiempo en nuestra atmósfera. Sin embargo el oxígeno es bastante reactivo para combinarse con los átomos de hierro de la hemoglobina y la citocromo oxidasa (constantes de reacción de segundo orden 107-108 M-1 s-1), para proporcionar las bases químicas para el transporte y respiración del oxígeno.

La molécula de oxígeno con su carácter de biradical puede ser reducido

por transferencias sucesivas de cuatro electrones y este proceso se denomina la reducción univalente del oxígeno. Dos de los intermediarios O2

.- y ·OH son radicales libres. El O2

.- se disocia a pH fisiológico y se carga como un anión. El radical anión superóxido es bastante poco reactivo y en medios biológicos se comporta como un reductor débil, reduciendo el hierro de la ferritina, del citocromo c y de la citocromo oxidasa. Además, como anión, su permeabilidad para atravesar membranas es muy reducida excepto en los eritrocitos que poseen un sistema especial de transporte del O2

.-. El radical hidroxilo es una de las especies químicas activas más reactivas y sustrae hidrógeno de otras moléculas a velocidades cercanas a las controladas por difusión. El peróxido de hidrógeno no es un radical y es químicamente estable, pero en sistemas biológicos puede romperse homolíticamente por acción de metales de transición tales como el Fe+2 y Cu+, para liberar ·OH. Finalmente el cuarto producto de la reducción del oxígeno es el agua (Figura 1).

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Figura 1. Distribución de electrones en el oxígeno molecular y los productos de su

reducción univalente. Otros orgánulos subcelulares, además de la mitocondria, son capaces de

reducir parcialmente el O2 a O2.- y H2O2. La producción primaria de O2

.- y H2O2 y la producción secundaria de ·OH constituye el mecanismo molecular de la toxicidad del oxígeno.

La mitocondria produce en primer lugar O2

.- que posteriormente sufre la dismutación, por acción de la superóxido dismutasa dependiente de manganeso (Mn-SOD), localizada principalmente en la matriz mitocondrial.

El retículo endoplásmico, por autooxidación de la flavoproteína

NADPH citocromo P450 reductasa y el citocromo P-450, produce O2.- y

H2O2. Los peroxisomas generan H2O2 por transferencia de dos electrones desde

las flavin oxidasas al oxígeno. Otros enzimas presentes en el citosol como la xantina oxidasa producen también O2

.- y H2O2. Las mitocondrias, presentes en todas las células aerobias, son la fuente biológica más importante del anión superóxido. En hepatocitos, por ejemplo, su bien desarrollado retículo endoplásmico, supone una fuente importante de anión superóxido. Otros corpúsculos subcelulares son fuentes relevantes de O2

.- en algún tipo de células.

La forma semiquinona de dos componentes de la cadena respiratoria

mitocondrial, la ubisemiquinona y la flavin semiquinona de la NADH- deshidrogenasa, producen O2

.- por autooxidación en una reacción vectorial dirigida a la matriz microsómica. El anión superóxido no puede pasar a través de la membrana mitocondrial interna y se encuentra confinado en la matriz donde la Mn-SOD y el NO· son los agentes que reaccionan con este anión dando lugar a peróxido de hidrógeno y peroxinitrito como productos finales, respectívamente, en dos reacciones muy rápidas controladas por

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difusión. La producción mitocondrial de O2.- se cifra, en condiciones

normales, en un 2% del oxígeno total incorporado por la mitocondria en hígado y corazón perfundidos de rata.

El radical libre de nitrógeno La molécula de nitrógeno se encuentra presenta en la atmósfera que

respiramos en un 79% y está formada por dos átomos de nitrógeno que como átomo libre posee tres electrones desapareados (1s2, 2s2, 2px, 2py y 2pz), que forman tres enlaces covalentes completos (σ y 2π), en la estable e inerte molécula de N2. Cuando un átomo de N con sus tres electrones desapareados, se combina con un átomo de oxígeno con sus dos electrones desapareados, la molécula resultante, NO, posee un número impar de electrones. Se forma un doble enlace completo N=O y el electrón desapareado y deslocalizado es el que le da el carácter de radical libre al NO·. El NO· es un radical por poseer un electrón desapareado, pero su carácter de radical libre es restringido, porque no se le conoce ninguna reacción de propagación en sistemas condensados. Sin embargo, el NO· reacciona fácilmente con el O2

.- para formar peroxinitrito en una reacción clásica de terminación.

Reacción de Fenton-Haber-Weis La producción primaria de O2

.- y H2O2 es capaz de iniciar y sostener una reacción en cadena en condiciones fisiológicas que abarca las reacciones de lipoperoxidación. Las especies O2

.- y H2O2 son los reactivos responsables de los procesos de iniciación de las reacciones siguientes:

O2

.- + Fe3+ O2 + Fe2+ H2O2 + Fe2+ ·OH + Fe3+ + HO- Estas reacciones generan el radical hidroxilo (·OH), y se denominan de

Fenton-Haber Weiss quienes describieron originalmente la descomposición del peróxido de hidrógeno por sales de hierro. Además, la acción protectora de la SOD y la catalasa se comprende que mantenga baja la tasa de generación del ·OH. El efecto antioxidante de SOD y catalasa se ha reconocido como el dogma Fridovich. El ·OH es capaz de empezar las reacciones de propagación con ácidos grasos no saturados (RH) para generar hidroperóxidos estables, según las reacciones:

·OH + RH R· + H2O R· + O2 ROO· ROO· + RH R· + ROOH

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Los radicales peroxilos (ROO·) son capaces de sufrir reacciones de terminación con la formación de productos excitados electrónicamente, como el oxígeno singlete (1O2), aldehidos (ROH) y cetonas (RO), con grupos carbonilo excitados (= C*):

ROO· + ROO· RHO + RO + 1O2 ROO· + ROO· CO* + RO+ O2 Estas reacciones y la siguiente: 1O2 + 1O2 2O2 + hν

proporcionan, a través de quimioluminiscencia, las bases químicas y moleculares de un ensayo para determinar la tasa de reacción de lipoperoxidación por radicales libres en condiciones fisiológicas.

Reacciones del radical libre de nitrógeno El reconocimiento de la producción de óxido nítrico, por la óxido nítrico

sintasa (cNOS) del endotelio, como factor relajante del endotelio (ERF) y de la reacción del anión superóxido con el óxido nítrico, abrió un nuevo campo en la bioquímica de los radicales libres. El descubrimiento de la producción de NO· por la NOS mitocondrial (mNOS) localizada en la membrana interna de la mitocondrial, supuso una revolución en términos, tanto de la regulación de la incorporación de oxígeno por los tejidos, como de la toxicidad de los radicales libres. El NO está producido por una serie de NOS, la constitutiva (cNOS), la inducible (iNOS) y la mitocondrial (mtNOS), que comparten la propiedad común de utilizar arginina y NADPH como sustratos, según la reacción: arginina + NADPH citrulina + NADP+ + NO·

La reacción entre el anión superóxido y el óxido nítrico se comprende

fácilmente si se considera que una colisión entre dos moléculas con electrones desapareados y deslocalizados, que dan lugar a la formación de enlace, tiene que ser mucho más rápida que una colisión molecular.

NO· + O2.- ONOO-

El ONOO- es además capaz de sustraer átomos de hidrógeno de los ácidos grasos insaturados y de generar ·OH, e iniciar las reacciones de propagación de la peroxidación lipídica:

ONOO- + RH + H+ NO2 + H2O + R·

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5. Radicales de oxígeno como segundos mensajeros Todas las células aerobias producen constitutivemente radicales de

oxígeno y pequeñas cantidades de estos radicales se liberan por varios tipos celulares cuando son estimuladas por el factor de necrosis tumoral (TNF), la interleuquina 1 (IL-1) y los ésteres del forbol. Todos ellos activan una forma citoplasmática del factor de transcripción NFκB que resulta al eliminar una subunidad proteica inhibidora. Esta activación se inhibe por agentes que eliminan radicales de oxígeno y puede recuperarse mediante exposición a un débil estrés oxidativo.

Cada tipo celular genera especies reactivas de oxígeno de forma

constitutiva, que en determinados casos pueden producirse en cantidad suficiente como para llegar a ser tóxicas. Algunas células sanguíneas, por ejemplo, son forzadas a sintetizar radicales de oxígeno durante la inflamación aguda y crónica. Pacientes que sufren artritis reumatoide producen elevadas cantidades de ROS en sus articulaciones y estos radicales son la causa directa de los síntomas de esta enfermedad crónica, porque los agentes que inhiben su producción son fármacos antiinflamatorios potentes.

En estudios sobre los efectos de los radicales de oxígeno en cultivos

celulares, se ha observado que una célula puede sufrir la agresión oxidativa débil o citotóxica dependiendo de la dosis de ROS que se generan. En el caso citotóxico se observa alteración de las proteínas, proteolisis, fragmentación del DNA y lipoperoxidación, que conducen a la lisis celular. Los diversos tipos de ROS pueden reaccionar entre ellos en presencia de metales, cobre o hierro y también dar lugar a productos reactivos secundarios como peróxidos lipídicos e hipoclorito. A lo largo de la evolución han surgido sistemas enzimáticos ubicuos, especializados en la eliminación de estos intermediarios entre los cuales se incluyen las superóxido dismutasas, la catalasa y la glutation peroxidasa.

Las ROS no son sólo producidas como agentes citotóxicos por células

especializadas en condiciones patológicas, sino tambien se generan en cada tipo celular como subproductos de las reacciones de transferencia electrónica. La mitocondria es la fuente principal de formación del radical superóxido, radical poco reactivo que se difunde rápidamente por la célula hasta que encuentra una reacción apropiada. Este radical se origina por transferencia de un electrón al oxígeno molecular. Para la eliminación rápida

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del superóxido la mitocondria contiene su propia superóxido dismutasa, sistema enzimático inducible, dependiente de manganeso.

El H2O2 no es un radical de oxígeno, pero puede servir como precursor

de ellos. Se produce intracelularmente por los peroxisomas y la mitocondria y puede difundirse en el interior de las células desde el espacio extracelular a partir de células especializadas que lo producen en grandes cantidades durante la inflamación. Las ROS intracelulares proceden, por tanto, de una producción intracelular incrementada del H2O2 extracelular o por inhibición de los enzimas que los eliminan.

Los granulocitos y los macrófagos poseen un sistema enzimático de

membrana denominado NADPH oxidasa que puede producir el radical superóxido a partir del NADPH y oxígeno en respuesta a un estímulo apropiado. La inducción de este enzima se controla por la proteina quinasa (PKC), enzima que se activa por los ésteres del forbol dando lugar a la formación de ROS. Existen pruebas evidentes que demuestran que el éster del forbol PMA (phorbol 12-miristato 13-acetato) requiere la producción de ROS, ya que el efecto promotor del PMA depende de estado prooxidante de las células.

La citoquina inmunomoduladora TNF (tumor necrosis factor) puede

inducir la síntesis de otras citoquinas en linfocitos T y en macrófagos activando los respectivos genes. Sin embargo, es citotóxico sobre otras líneas celulares no linfoides. Esta citotoxicidad depende, al menos en parte, de las ROS porque la superexpresión de la SOD (superóxido dismutasa) y la disminución de la presión parcial de oxígeno protegen a estas células de los efectos citotóxicos del TNF.

La unión de las citoquinas IL1 y TNF a sus respectivos receptores en la

superficie celular, así como la del éster de forbol PMA y peróxidos extracelulares, promueve la elevación en la concentración intracelular de especies reactivas de oxígeno. Las ROS intracelulares actúan como segundos mensajeros en la cascada iniciada por ligandos extracelulares. Además existe una reacción intracelular de transducción de señales provocada específicamente por los radicales de oxígeno. La forma citoplasmática del factor de transcripción inducible, el NFκB es un objetivo fisiológico importante para los ROS (Figura 3).

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Figura 3. Especies activas de oxígeno como segundos mensajeros. La unión de las

citoquinas IL1 y TNF a sus respectivos receptores en la superficie celular, así como la del ester de forbol PMA y peróxidos extracelulares, promueve la elevación en la concentración intracelular de especies reactivas de oxígeno. Las ROS intracelulares actúan como segundos mensajeros en la cascada iniciada por ligandos extracelulares. Además existe una reacción intracelular de transducción de señales provocada específicamente por los radicales de oxígeno. La forma citoplasmática del factor de transcripción inducible, el NFκB es un objetivo fisiológico importante para los ROS. La acción de antioxidantes tales como NAC (N-acetil cisteína), impide que se realice la cascada señalizadora que llega al núcleo y promueve la expresión de genes.

La respuesta intracelular, como consecuencia de la reacción de las ROS

con las macromoléculas celulares, lípidos, proteínas y DNA, induce la expresión de genes de respuesta al estrés oxidativo (sistemas antioxidantes, reparadores, proteasas y antiproteasas, proto-oncogenes, etc. Esto conlleva a la situación de adaptación al estrés oxidativo y al mantenimiento de la función celular normal. En caso de no adaptación, la célula puede sufrir una proliferación aberrante, que conduce al cáncer o la muerte por apoptopsis o necrosis (Figura 4).

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Figura 4. Respuesta celular a las especies reactivas de oxígeno (ROS) y decisiones

biológicas). La respuesta intracelular, como consecuencia de la reacción de las ROS con las macromoléculas celulares, lípidos, proteínas y DNA, induce la expresión de genes de respuesta al estrés oxidativo (sistemas antioxidantes, reparadores, proteasas y antiproteasas, proto-oncogenes, etc.). Esto conlleva a la situación de adaptación al estrés oxidativo y al mantenimiento de la función celular normal. En caso de no adaptación, la célula puede sufrir una proliferación aberrante, que conduce al cáncer o la muerte por apoptopsis o necrosi.

6. Especies reactivas de oxígeno y cáncer Como se ha comentado anteriormente, las ROS de varios tipos se forman

in vivo y muchas de ellas, los agentes oxidantes más potentes, son capaces de dañar al DNA y otras macromoléculas celulares. La mayor formación de ROS puede promover el desarrollo de enfermedades malignas y la tasa “normal” de generación de ROS explica el incremento del riesgo de cáncer en edades avanzadas. En efecto, en animales knockout en varios enzimas de la defensa antioxidante, se eleva el daño oxidativo y se promueve el desarrollo del cáncer. Para explicar esto, la mayor atención se ha dado al daño oxidativo al DNA por ciertas ROS, tales como el radical hidroxilo (OH·). No obstante, el incremento en los productos de oxidación de bases del DNA, tal como la 8-hidroxi-2-desoxiguanosina (8-OHdg), no siempre conduce a la malignidad, aunque los tumores malignos a menudo muestran

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elevados niveles de oxidación de las bases. Por tanto, acciones adicionales de las ROS son importantes, posiblemente sus efectos sobre la proteína p53, la proliferación celular, la invasión y la metástasis. La inflamación crónica predispone al desarrollo tumoral, pero el papel de las ROS es complejo porque las ROS actúan a veces como agentes antiinflamatorios.

Aunque son muchas las moléculas afectadas por las ROS, destacan por

su disponibilidad, concentración y localización, los fosfolípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos. Los fosfolípidos de las membranas celulares son esenciales para el mantenimiento de la viabilidad celular. Las proteínas son las ejecutoras de un sinfín de funciones celulares, entre ellas, la regulación de la expresión génica. Los ácidos nucleícos son los portadores de todas estas funciones. Alteraciones colectivas o individuales en cualquiera de estas macromoléculas han de inducir trastornos importantes en la función y supervivencia de las células. A pesar de la presencia de eficaces sistemas antioxidantes y reparadores, una parte de las agresiones oxidativas consigue escapar de la acción de estos sistemas y se van acumulando y ocasionando alteraciones de importancia clínica diversa.

A lo largo de la evolución el DNA se convirtió en la molécula encargada

de almacenar la información genética. El DNA es más estable que el RNA porque carece del hidroxilo en posición 2´ de la desoxiribosa. Además su estructura de doble hélice le confiere fiabilidad en la replicación y en la reparación, ambas aseguradas por la otra cadena que actua como molde. A estas ventajas hay que añadir una protección adicional que se debe a su localización nuclear y su empaquetamiento merced a un tipo de proteínas específicas, las histonas. Sin embargo, la producción excesiva de radicales libres de oxígeno y de los productos de su oxidación, pueden lesionar de manera irreversible las moléculas de DNA. Estas lesiones, de no ser reparadas de inmediato, pueden llegar a dar mutaciones que participan y desencadenan mecanismos que conducen al fenotipo transformado de las células. La interacción entre los radicales libres y el genoma representa uno de los aspectos de mayor importancia fisiopatológica. Estas especies por su elevada reactividad actúan sobre mecanismos que controlan el ciclo de división celular a nivel de factores de transcripción y de la expresión genética interviniendo en la iniciación, la promoción y en la progresión o expansión de las células tumorales.

Las ROS se encuentran involucradas en la iniciación y promoción de la

carcinogenesis. Estas especies reactivas pueden actuar como iniciadores y

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promotores, causan daño al DNA, activan los procarcinógenos y alteran los sistemas antioxidantes celulares. A pesar de los multiples mecanismos antioxidantes, la lesión celular originada por las ROS es ubicua y aquellas lesiones oxidativas que no causan muerte celular, pueden estimular el desarrollo del cáncer. Es interesante observar de qué manera influye el estrés oxidativo en el proceso multiescalonado que conduce a las diferentes fases de la carcinogénesis. La mutagénesis, ocasionada por la agresión oxidativa al DNA, se considera un acontecimiento frecuente en la célula humana normal. Existen numerosas pruebas experimentales que atribuyen papeles importantes a las ROS en la expansión de clones tumorales y en la adquisición de propiedades malignas. Por ello actualmente se considera a las ROS como una clase importante de carcinógenos

Las ROS se generan de manera continuada en la célula normal expuesta

a un medio aerobio. Los sistemas antioxidantes defensivos han evolucionado a la par que el metabolisno aerobio para contrarrestar la lesión ocasionada por las ROS. A pesar de la existencia de la defensa antioxidativa, el daño infligido por las ROS a las proteínas y al DNA se va acumulando paulatinamente a lo largo de la vida y ello puede conducir a enfermedades degenerativas dependientes de la edad como son la aterosclerosis, la artritis, la enfermedad de Alzheimer, el cáncer, etc. Un gran número de factores de riesgo carcinogénico, endógenos y exógenos, generan ROS in vivo. Por tanto, existe la esperanza que la mayor incidencia de cáncer en la población senescente pueda ser revertida si se eliminan esos factores de riesgo generadores de ROS y si se incrementan las defensas antioxidantes.

El desarrollo del cáncer se reconoce ya como un proceso evolutivo, que

requiere la acción acumulativa de acontecimientos múltiples en un clon celular y que pueden incluirse en un modelo simple de tres etapas:

1. inducción de una mutación en el DNA en una célula somática

(iniciación), 2. estimulación de la expansión tumorigénica del clon celular

(promoción) y 3. la conversión maligna del tumor en cáncer (progresión). Los radicales reactivos responsables de causar daño tisular son

generalmente especies de vida muy corta que se generan in situ. Los radicales libres se producen en el metabolismo celular normal o patológico, a partir de los xenobióticos o a través de las radiaciones ionizantes. Una

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característica importante de las reacciones con radicales libres es que originan nuevos radicales, lo cual conlleva a reacciones en cadena. Los aceptores de electrones, tales como el oxígeno molecular, reaccionan fácilmente con radicales libres y se convierte ellos mismos en radicales, las ROS. Esto explica el por qué, en el mundo aerobio, donde el oxígeno molecular se encuentra en todas partes, las ROS sean los mediadores primarios de las reacciones celulares con radicales libres.

La incorporación de un electrón al oxígeno molecular produce el anión

superóxido. Este anión superóxido actúa in vivo, tanto como agente reductor (con el Fe3+) como como oxidante (en la oxidación de grupos tioles). Aunque el O2

.- posee relativamente poca actividad y toxicidad, puede funcionar como un segundo mensajero en la célula. Sin embargo, una parte de los efectos biológicos del O2

.- se derivan de productos secundarios. La dismutación del O2

.- origina peróxido de hidrógeno, mediante una reacción espontánea o catalizada por la superóxido dismutasa. La elevada reactividad del peróxido de hidrógeno in vivo se explica por la reacción de Fenton, donde el H2O2 reacciona con iones metálicos parcialmente reducidos tales como Fe2+ y Cu+, para formar el radical hidroxilo ·OH. Esta reacción puede mantenerse in vitro por la presencia de agentes reductores débiles como el O2

.- o el ácido ascórbico, que reciclan los iones metálicos oxidados.

El ·OH tiene capacidad para infligir directamente lesión en el DNA. El

·OH se considera como el radical más importante respecto a su influencia en ocasionar lesión celular, aunque parece que existen otros intermediarios implicados en reacciones que se atribuyen al ·OH.

Además de los subproductos de la reducción del oxígeno molecular,

muchos otros radicales juegan un importante papel propagando los efectos de las ROS in vivo. Las reacciones de las ROS con macromoléculas celulares da lugar a radicales orgánicos que propagan la lesión oxidativa. Así, la peroxidación de los lípidos de membrana se verifica mediante una reacción en cadena que puede explicar muchos de los efectos de las ROS sobre dichas membranas.

Está también ampliamente demostrado el papel del óxido nítrico, NO·, en

las reacciones redox celulares. El NO· puede reaccionar con el O2.- para

formar el anión peroxinitrito (ONOO-) y el radical hidroxilo (·OH). Sin embargo, el NO· puede también actuar como un antioxidante rompiendo las reacciones en cadena de la peroxidación lipídica. Las ROS no radicales

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incluyen el H2O2, el HOCl, el O3 y el oxígeno singlete 1O2. El efecto carcinogénico de estos oxidantes debe ser atribuído a su elevada reactividad la cual origina radicales libres in vivo.

Como ya se comentó anteriormente, en la vida aerobia las ROS se

forman en el metabolismo celular normal a partir del oxígeno molecular. A pesar de la existencia de defensas antioxidantes, estas ROS causan un daño constante a las moléculas oxidables, las cuales, una vez oxidadas, han de ser reparadas o reemplazadas en un equilibrio dinámico. El estrés oxidativo surge, bien de la superproducción de ROS o de la deficiencia de la defensa antioxidante o de los mecanismos reparadores. Los resultados de una situación de estrés oxidativo, son una lesión tisular reversible o irreversible. Ejemplos de estrés oxidativo a corto plazo los tenemos en el síndrome isquemia/reperfusión, en la inflamación aguda y en la hiperoxia (oxígeno hiperbárico). Dado el desarrollo a largo plazo del cáncer, estas condiciones, en contraste con el estrés oxidativo crónico, no se espera que causen cáncer, a menos que sean la fuente de acontecimientos mutagénicos primarios.

Una causa endógena importante de estrés oxidativo crónico es la

respuesta inflamatoria. Los leucocitos activados generan O2.- y HOCl, lo cual

representa una importante fuente de ROS in situ. Las ROS generadas por los fagocitos, no sólo median la muerte de las células objetivo, sino que inducen estrés oxidativo en las células de los tejidos adyacentes. Los neutrófilos activos estimulan la mutagénesis in vivo y el estrés oxidativo derivado de la inflamación crónica, favorece el desarrollo del cáncer en muchos órganos. Se ha especulado que la inflamación crónica es la responsable de la tercera parte del cáncer que se padece en el mundo. La inducción del cáncer por inflamación crónica se observa frecuentemente en la colitis ulcerosa. Otros ejemplos de carcinogénesis relacionada con inflamación son los mesoteliomas causados por depósitos de asbestos y el cáncer de vejiga urinaria causado por infecciones con el Schistosoma haematobium. La inducción del carcinoma hepatocelular por la hepatitis vírica se cita a menudo como modelo en este aspecto. Además, en hepatitis crónica se ha encontrado elevada la lesión oxidativa del DNA. Sin embargo, en esta patología, el estrés oxidativo ha de considerarse como un cofactor de la carcinogénesis estimulada por la activación de oncogenes mediante la integración del DNA del virus de la hepatitis y por la necrosis y regeneración tisular mediada por el virus.

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Ejemplos importantes de causas exógenas de estrés oxidativo en nuestra sociedad y sus consecuencias carcinogénicas se muestran en la Tabla 1. El fumar, la causa principal del carcinoma broncogénico, expone el epitelio bronquial a la acción de las ROS. La situación de estrés oxidativo surge a partir del tabaco debido a:

1. la potente mezcla de oxidantes reactivos, en particular óxidos de

nitrógeno y radical hidroxilo, 2. la depleción intracelular del glutation y 3. la inducción de inflamación crónica. La carcinogénesis inducida por las ROS se potencia por la presencia de

varios cocarcinógenos en el humo del tabaco, entre los que se incluyen nitrosaminas e hidrocarburos aromáticos policíclicos, tales como el benzopireno. El papel de las ROS en la carcinogénesis inducida por benzopireno es doble: primero, las ROS estimulan el metabolismo del benzopireno a diolepóxidos que inician los tumores mediante la formación de aductos con el DNA, y segundo, el metabolismo del mismo benzopireno puede generar H2O2 .

Tabla 1.- Principales causas exógenas de estrés oxidativo implicado en la

carcinogénesis (Dreher y Junod, 1996)

Causa de estrés oxidativo Radicales de oxígeno Cáncer asociado con la exposición

Humo del tabaco Luz ultravioleta

Ácidos grasos en alimentos Iones hierro y cobre, etanol

NO·, ·OH ·OH y radicales orgánicos

Peróxidos lipídicos ·OH Peróxidos lipídicos

Carcinoma broncogénico Melanoma y otros cánceres de piel, Cáncer colorrectal y mamario Cáncer colorrectal Carcinoma hepatocelular y cáncer mamario

La radiación ultravioleta y las radiaciones ionizantes de elevada energía

(rayos X y radiación γ) estimulan la mutagénesis vía generación de ROS in situ, tales como radical hidroxilo y radicales libres, que inducen lesión en el DNA. La implicación de reacciones independientes de las reacciones de radicales libres puede explicar una serie de lesiones del DNA

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cuantitativamente diferente de la observada en otras formas de estrés oxidativo. Existen pruebas evidentes que sugieren que las ROS que surgen de las reacciones de peroxidación lipídica son las responsables de la asociación entre la ingesta de grasa y el cáncer colorectal. Para los ácidos grasos que se ingieren con la carne, el hierro (Fe2+) es un cofactor importante que eleva la producción de ROS en el colon. El cobre (Cu+) es tan efectivo como el hierro por su efecto catalizador de la reacción de Fenton y su acción como mutágeno in vitro es más potente que la del hierro. Esto se explica por las interacciones del cobre con las bases del DNA. La correlación epidemiológica entre la grasa alimenticia y el cáncer de mama se cree que es una consecuencia de las productos carcinogénicos derivados de la peroxidación lipídica. El etanol es otro importante factor de riesgo carcinogénico a través de los radicales libres generados durante su metabolismo.

7. Estrés oxidativo e iniciación tumoral

La carcinogénesis es un proceso multiescalonado en el que pueden

distinguirse tres etapas: iniciación, promoción y progresión. La iniciación, como primer eslabón en la carcinogénesis, requiere una permanente modificación del material genético de una célula. Se estima que el número de agresiones oxidativas que recibe el DNA de una célula humana se cifra en el orden de 10.000/día. La lesión causada al DNA por las ROS está siendo continuamente eliminada por mecanismos reparadores específicos y no específicos. A pesar de ello, una pequeña parte de las lesiones oxidativas en el DNA escapa de la reparación y puede representar un potencial mutagénico importante que va acumulandose a medida que transcurre la edad. Elevadas concentraciones de ROS incrementan la posibilidad de que las lesiones al DNA puedan no ser reparadas con efectividad, por lo que la exposición de células al estrés oxidativo incrementa la mutagénesis. Sin embargo, cuando el estrés oxidativo es lo suficientemente intenso como para causar la muerte celular, será menos efectivo en introducir modificaciones en el DNA en una población celular. Estos efectos resultarían de una relación dosis-efecto entre las ROS y la iniciación mediante mutagénesis que es donde los intermediarios del estrés oxidativo son los más efectivos (Figura 5). Sin embargo en esta figura hay que anotar que es difícil acotar los límites respecto a los efectos dependientes de la dosis, ya que una sola especie de oxígeno puede causar la muerte celular si inactiva una sola copia de un gen esencial mediante una mutación puntual y que los efectos biológicos de una determinada intensidad de estrés oxidativo depende de manera crítica de

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otros parámetros como la composición de las ROS implicadas, la presencia de cocarcinógenos y la posición del ciclo celular en el momento de la exposición.

Figura 5. Modelo hipotético que establece una relación de dosis-respuesta entre las

ROS, estrés oxidativo y carcinogénesis .

7.1. Modificación oxidativa en las bases del DNA

La lesión oxidativa del DNA puede ser definida desde el punto de vista químico o estructural, aunque el daño estructural está siempre causado o acompañado por lesión química y al contrario, cada modificación química implica algún cambio estructural en la doble hélice. A pesar de ello hay que estudiar por separado las modificaciones de las bases y las alteraciones de las hélices. Las agresiones de las ROS a las bases muestran un tipo de lesiones características. En varios tejidos cancerosos se ha encontrado un incremento en las modificaciones específicas debidas a las ROS. La mayoría de estos cambios pueden reproducirse in vitro con sistemas que generan el radical hidroxilo ·OH. Por ejemplo, el sistema H2O2-Fe2+ ácido ascórbico o el sistema hipoxantina-xantina oxidasa, que generan anión superóxido y H2O2, en presencia de iones hierro, generan el ·OH. Esto no implica que sea el ·OH el único radical que media los efectos mutagénicos del estrés oxidativo in vivo.

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El radical ·OH reacciona con los componentes de la molécula del DNA: el esqueleto de la desoxiribosa y las bases púricas y pirimidínicas. Las alteraciones químicas del esqueleto de la desoxiribosa pueden originar la liberación de las bases produciendo sitios abásicos, que son mutagénicos. La agresión del ·OH sobre la doble cadena del DNA origina la formación de aductos del radical con las bases púricas o pirimidínicas. Los aductos ·OH de la adenina o guanina pueden dar lugar a rotura del anillo de las bases, tales como el 5-formamido-4,6-diamino-pirimidina o a la formación de hidroxipurinas, como la 8-hidroxiguanina. Ejemplos de productos de la timina y la citosina son la timina glicol y la 5-hidroxi citosina, respectívamente (Figura 6).

Figura 6. Modificaciones de las bases del DNA, características de la agresión oxidativa

por las ROS. FDP-Ade = 5-formamido-4,6-diamino-pirimidina; 8-OH-Gua = 8-hidroxi-guanina; 5,6-OH-Tim = timina glicol; y 5-OH-cit = 5,6- dihidroxi citosina

Aunque muchas de las modificaciones en las bases del DNA dan como

resultado un bloqueo en la replicación, algunas de estas modificaciones pueden inducir mutaciones puntuales que se interpretan mal en la replicación. La más común de las modificaciones oxidativas en el DNA es la 8-OH-guanina, que en una célula normal, aparece en una de cada 100.000 resíduos de guanina. La 8-OH-guanina puede producir trasversiones GC a TA como resultado de un mal apareamiento entre la 8-OH-guanina y la adenina. Esta transversión se suele encontrar en el oncogen ras y representa un posible mecanismo de iniciación tumoral inducida por las ROS. Las transversiones GC a TA en el gen supresor p53 han sido observadas en

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cáncer de pulmón e hígado, y puede reproducirse vitro con un sistema generador de ROS. Mediante la activación de oncogenes o la inactivación de genes supresores de tumores, estas mutaciones puntuales inducidas por ROS pueden conducir a la iniciación, como primera etapa de la carcinogénesis, como también participar en la progresión tumoral en una etapa tardía.

7.2. Alteraciones en la hélice del DNA

Las alteraciones en la hélice del DNA incluyen distorsión, rotura de una

cadena, rotura de las dos cadenas, cruzamientos entre cadenas y aberraciones cromosómicas. La distorsión más importante puede ocurrir cuando aparece un enlace adicional entre una base y el esqueleto de la desoxiribosa o a partir de la dimerización de residuos de purina en una misma cadena. Los dimeros de pirimidina entre bases de una misma cadena es la alteración más común en el DNA, inducida por luz ultravioleta, mientras que las roturas de la(s) cadena(s) del DNA es la lesión más común originada por radiaciones de alta energía. Roturas de la(s) cadena(s) del DNA pueden ser también producidas directamente por efectos de las ROS o por estimulación directa de la rotura enzimática del DNA. Las modificaciones de la estructura cromosómica puede inducir nuevas y diferentes lesiones estructurales del DNA en el proceso de replicación. La inestabilidad genética resultante en el clon celular favorece la progresión tumoral y es una de las características de las células cancerosas.

8. Papel de las ROS en la promoción tumoral

Además de la mutagénesis inducida por las ROS implicadas en la

iniciación y la progresión del cáncer, el estrés oxidativo puede estimular la expansión de los clones celulares mutados al haber sido alterados los genes relacionados con la proliferación o muerte celular. Existe amplia evidencia que las ROS pueden promover la proliferación en células de mamíferos después de la iniciación por radiación o por agentes químicos mutagénicos. Aunque elevados niveles de estrés oxidativo inhiben la proliferación por efectos citotóxicos, niveles moderados pueden estimular la división celular y promover el crecimiento tumoral. La relación entre los niveles de ROS y la promoción tumoral puede explicar por qué una tolerancia más elevada al estrés oxidativo (debida a una elevada actividad de enzimas antioxidantes), puede conducir a un fenotipo capaz de sufrir promoción. Este ejemplo ilustra cómo las ROS pueden promover selectivamente el crecimiento de las células iniciadas, a pesar de que su concentración ejerza un efecto tóxico sobre

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poblaciones de células normales. Sin embargo, se ha sugerido un papel más general de las ROS en la promoción tumoral con la hipótesis que los promotores químicos, tales como los ésteres del forbol, actúan vía estimulación de la producción de ROS.

8.1. Promoción tumoral mediada por calcio

Las ROS pueden inducir grandes elevaciones en el calcio citosólico, a

través de la movilización de los reservorios de calcio intracelular y mediante el influjo del calcio extracelular. Los cambios en el calcio intracelular inducidos por las ROS, pueden regular la transcripción de genes implicados en el crecimiento y proliferación celulares, por un efecto directo o indirecto del calcio sobre el gen. Se ha encontrado que la inducción de los protooncogenes c-fos por dosis moderadas de ROS está medida directamente por el calcio citosólico. Un ejemplo de un efecto indirecto de los cambios relacionados con las ROS y el calcio es la fosforilación de los factores de transcripción por las proteínas quinasas dependientes del calcio. Se ha demostrado que la activación de la proteína quinasa C (PKC) en situación de estrés oxidativo, se encuentra mediada en parte por el incremento de calcio intracelular relacionado con las ROS. La activación de la PKC y otras proteína quinasas fosforila y activa la S6-quinasa implicada en la adquisición de competencia del crecimiento. Ambas PKC y S6-quinasa regulan la actividad de factores de transcripción vía cascadas de fosforilación y pueden así mediar muchos de los efectos de las ROS sobre la proliferación celular.

8.2. Otros mecanismos de promoción tumoral Además de la regulación mediada por el calcio, las ROS pueden modular

directamente la actividad PKC mediante la oxidación de los residuos de cisteína en el dominio regulador del enzima. La poli ADP-ribosilación de las proteínas cromosómicas en respuesta a la lesión del DNA, representa otro mecanismo que modula la expresión génica en situación de estrés oxidativo y se piensa que se encuentra implicada en la promoción tumoral. La expresión de genes relacionados con la proliferación o con la muerte celular puede también ser modulada directamente por los efectos redox intracelulares sobre los factores de transcripción. En bacterias, la oxidación directa del regulón oxy-R es responsable de la activación génica transcripcional en respuesta al estrés oxidativo. En mamíferos, los efectos directos de las ROS regulan la actividad del factor de transcripción NFκB, un miembro de la familia oncogénica rel. Una serie de genes, entre los que

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se incluye factores de crecimiento y diferenciación están bajo control de las proteínas Rel.

9. Progresión tumoral. Influencia de las ROS.

La etapa final en el desarrollo del cáncer es la adquisición de las

propiedades malignas por el tumor. Estas propiedades incluyen: crecimiento acelerado, escape de la vigilancia inmune, invasión tisular y formación de metástasis. La mayoría de estos cambios implican lesiones adicionales al DNA. Se ha sugerido que la elevada generación de ROS en células tumorales causa un persistente estado de estrés oxidativo que incrementa la inestabilidad genómica. Además, la sensibilidad de las células tumorales a las ROS puede elevarse ante una menor actividad de los enzimas antioxidantes. Sin embargo, en tanto en cuanto concierne a los efectos mutagénicos, la relación dosis-respuesta entre el estrés oxidativo y la progresión tumoral debe ser comparable a la descrita para la iniciación. A pesar de ello, estos efectos no explican del todo el papel de las ROS en la progresión hacia el cáncer. El primer lugar, las células tumorales muestran a menudo cambios genéticos específicos que contrarrestan los mecanismos inmunes mediados por las ROS, previniendo la apoptosis en respuesta al estrés oxidativo. En segundo lugar, la progresión hacia el cáncer puede acelerarse por elevaciones en la inestabilidad genética de las células tumorales ocasionadas por el estrés oxidativo.

10. Mutaciones en el gen p53 e inestabilidad genómica

inducida por ROS

Las alteraciones en el gen p53 son de las mutaciones más frecuentes encontradas en cáncer humano. La proteína p53 se encuentra implicada en el control del ciclo celular. Las células normales responden a las radiaciones ionizantes y a otras fuentes de ROS, que conllevan una acumulación de lesiones en el DNA, deteniendo el ciclo celular, para permitir la reparación del DNA antes de la replicación. Este efecto de frenado del ciclo celular se corresponde con una elevación en la expresión de la proteína p53. Si una célula carece del gen p53 funcional, continua replicando el DNA y dividiéndose, permitiendo así que la lesión del DNA se propague a la generación siguiente. Por tanto, la división celular incontrolada, en ausencia de p53, puede causar reordenamientos continuos de los cromosomas a partir de la lesión inicial del DNA. A la vista de estos mecanismos, no es sorprendente observar en ratones deficientes en p53 una gran susceptibilidad

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a ser lesionado el DNA por las radiaciones ionizantes. En animales deficientes en el gen p53 son similares la frecuencia y distribución de los diferentes tumores inducidos por radiaciones ionizantes. Como dichas radiaciones ionizantes inducen el daño al DNA a través de las ROS, se sugiere que una de las principales funciones de la proteína p53 es la de proteger de las ROS espontáneamente generadas.

Figura 7. Vías utilizadas por las ROS para inducir el desarrollo tumoral: i) lesión del DNA, ii) activación de quinasas y iii) activación de factores de transcripción.

11. ROS y apoptosis

La mayor parte de los cánceres estimulan una respuesta inmune de

intensidad variable en los organismos donde se hospedan. En términos, tanto de la intensidad de la respuesta como de la susceptibilidad de las células tumorales, las ROS generadas por los leucocitos activados pueden causar:

• inflamación crónica que no elimina las células tumorales, • la muerte celular por apoptosis a través de la redistribución del

calcio intracelular y otros mecanismos y • la muerte celular por citotoxicidad directa.

Solo los niveles citotóxicos de ROS, que son de importancia para los

tejidos del organismo hospedador, dan como resultado alguna eliminación de

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las células del tumor. Por el contrario, cuando la producción de ROS por las células inflamatorias es demasiado baja y/o la muerte celular inducida por ROS está bloqueada, entonces, el estrés oxidativo puede contribuir a la progresión del cáncer por promocionar posteriores lesiones en el DNA y estimular el crecimiento.

El proto-oncogen bcl-2 protege las células cancerosas de la muerte por

apoptosis y específicamente inhibe la apoptosis inducida por ROS. Ello ha hecho que se especule que las células cancerosas que sobre expresan el gen bcl-2 pueden escapar de su eliminación por el sistema inmune mediante su resistencia frente a la apoptosis inducida por las ROS. Si esta hipótesis es cierta, los antioxidantes podrían, al igual que bcl-2, interferir con la eliminación mediada por las ROS, de los clones tumorales in vivo. Esta idea es importante porque sugiere que la situación in vivo puede ser fundamentalmente diferente de la de los experimentos in vitro, donde los antioxidantes inhiben la progresión tumoral.

Figura 8. Lesión del DNA, reparación, parada del ciclo celular y apoptosis. Ante el

daño al DNA promovido por cualquier agente agresivo (ROS), la respuesta celular inmediata es reparar dicha lesión, para lo cual la proteína p53 y la p21, detienen el ciclo celular. En caso de que los enzimas reparadores no actúen adecuadamente en tiempo y espacio, se activarán sistemas apoptogénicos que llevarán a la célula a la apoptosis. La proteína Bcl-2, trata de evitar la apoptosis impidiendo la activación de la caspasa 9.

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12. Reparación del DNA

La importancia de los mecanismos reparadores de las lesiones al DNA causadas por las ROS se demuestran en el síndrome transmitido por herencia de la Xeroderma pigmentosum, donde los defectos en la reparación del DNA alteran la eliminación de los dímeros de pirimidina y otras lesiones inducidas por las ROS. En estos pacientes, las consecuencias de la agresión por radicales libres al DNA no esta limitada a múltiples cánceres de piel inducidos por la radiación ultravioleta, sino que además presentan una notable susceptibilidad a diversos tipos de cáncer.

12.1. Mecanismos reparadores generales El sistema nucleasa de escisión (exinucleasa) es el único sistema

reparador que elimina aductos voluminosos del DNA. Los genes implicados en este sistema son uvrA, uvrB y uvrC en E.coli y el grupo ERCC (Excision Repair Cross Complementing) en humanos. Las lesiones voluminosas del DNA incluyen los dímeros de pirimidina inducidos por luz UV y otras condiciones que implican la generación de ROS. Además de estas lesiones que alteran la estructura de la hélice del DNA, el sistema exinucleasa del E.coli también posee una débil actividad reparadora sobre la timina glicol, 8-OH-guanina y sitios abásicos. El estudio de enfermedades hereditarias asociadas a un incremento en la inestabilidad genética ha proporcionado el medio de conocer algo sobre el sistema reparador de escisión. Los defectos de reparación en el síndrome Xeroderma pigmentosum, afectan la eliminación de los dímeros de pirimidina por el sistema exinucleasa y se ha demostrado que incluye diversos grupos de complementación genéticos. La actividad reparadora defectiva de la lesión del DNA inducida por ROS en extractos de células de pacientes con Xeroderma pigmentosum, se ha visto que se restauraba in vitro por adición de los grupos de complementación A, B, C, D, y G. Estos datos sugieren: (1) que las lesiones al DNA inducidas por las ROS se reparan por el mismo mecanismo de reparación por escisión que los dímeros de pirimidina inducidos por luz UV, y (2) que la lesión al DNA inducida por las ROS pueden contribuir a la frecuencia incrementada de cáncer interno en Xeroderma pigmentosum.

Un segundo sistema reparador del DNA no específico se basa en el

reconocimiento de las anomalías entre los pares de bases dentro de la hélice del DNA. Este sistema de reparación en E.coli, está formado por los productos de los genes MutH, MutL, MutS, y MutU. Se han identificado en

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humanos los correspondientes a MutL y MutS. Las mutaciones en el HMSH, el homólogo humano del MutS, se ha demostrado que son las responsables de la inestabilidad genética observada en el cáncer de colon no poliposico hereditario. Los entrecruzamientos entre las cadenas y las roturas en las dos cadenas, no reconocidos por las exinucleasa o por el sistema reparador de las alteraciones en el emparejamiento de las bases, están entre las alteraciones más importantes de la hélice del DNA inducidas por estrés oxidativo. Estas, como también otras alteraciones de la hélice, inducidas por las ROS, con excepción de las aberraciones cromosómicas, se reparan por sistemas de reparación recombinacionales en E. coli. Sin embargo, los detalles de este mecanismo recombinacional se desconocen hasta ahora en células de mamíferos.

A pesar de que los mecanismos reparadores del DNA de los eucariotas

parece que incluyen los elementos que se encuentran en bacterias, han emergido nuevos mecanismos a medida que la organización de los cromosomas se ha hecho más compleja. El DNA de eucariotas se asocia con proteínas histonas y no histonas, que proporcionan una protección relativa frente a la nucleasa y frente a la agresión mediada por los radicales libres. Esta protección se elimina localmente antes de que tenga lugar la reparación por excisión. Así, la lesión del DNA inducida por las ROS estimula la poli(ADP ribosa) polimerasa para producir polímeros de ADP-ribosa, que temporalmente atraen y separan las histonas del DNA. Este mecanismo es importante para la reparación del DNA eucariota, pero puede presentar implicaciones adicionales:

• primera, los cambios resultantes en la accesibilidad al DNA para los

factores de transcripción puede representar un mecanismo que regula la expresión genética en respuesta al estrés oxidativo.

• segunda, frente a niveles elevados de lesión del DNA, la depleción del NAD+ por la poli(ADP ribosa) polimerasa, llega a ser lo suficientemente importante como para interferir con la síntesis del ATP. Como la depleción del ATP induce la apoptosis, la activación de la poli(ADP ribosa) polimerasa puede ser una vía alternativa de la apoptosis inducida por ROS.

• tercera, se ha especulado que la rápida depleción del “pool” NAD+ puede considerarse como un mecanismo de defensa para prevenir la reacción de Fenton dependiente de NADPH en casos de estrés oxidativo.

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12.2. Reparación de lesiones específicas del DNA.

Las ROS inducen una variedad de modificaciones en las bases del DNA, las cuales, si no se eliminan, pueden conducir a la mutagénesis. La inactivación de sistemas específicos de reparación del DNA en Escherichia coli, incrementa significativamente la tasa de mutaciones espontáneas y las inducidas por ROS. La importancia de la modificación de la base, 8-OH-guanina, inducida por ROS está subrayada por un sistema de reparación del DNA sinérgico en E coli que incluye tres productos genéticos: MutM, MutY y MutT. El primero, MutM, es una DNA glicosilasa que inicia la reparación de los sitios con 8-OH-guanina y una variedad de lesiones similares en el DNA, hidrolizando la unión base-desoxiribosa correspondiente. La detección de un enzima reparador en levadura sugiere la existencia de un gen correspondiente al MutM en eucariotas. La 8-OH-guanina que escapa al mecanismo de reparación del MutM, tiene un potencial descodificador al emparejarse con la adenosina, lo que conduce a las transversiones GC-TA. El gen MutY que codifica una glicosilasa, reconoce y elimina la adenosina que se inserta en oposición a la 8-OH guanina. Un homólogo de MutY se ha caracterizado en mamíferos. Finalmente, las hidrolasas codificadas por MutT hidrolizan el 8-OH-GTP para eliminarlo del reservorio de desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP) que se utilizan para la síntesis del DNA. Este nivel múltiple de seguridad frente a la lesión del DNA, relativa a la 8-OH-guanina, puede explicar como el potencial mutagénico intrínseco de esta frecuente lesión del DNA se mantiene a un aceptable bajo nivel. Se ha demostrado que otras endonucleasas del E. coli, con o sin actividad glicosilasa, se encuentran implicadas en la reparación del daño oxidativo infligido al DNA. La DNA glicosilasa endonucleasa III reconoce al timina glicol y a una amplia selección de otras modificaciones de las bases, oxidativas y no oxidativas. Algunas endonucleasas sin actividad glicosilasa reconocen sitios abásicos que han sido agredidos por radicales libres. Se ha demostrado que todos estos sistemas reparadores son esenciales para la eliminación del bloqueo de la replicación inducido por las roturas de una cadena por las ROS.

12.3. Reparación de errores de apareamiento

Los mecanismos de reparación anteriormente citados actúan al poco

tiempo de producirse la lesión, antes de que se perpetue debido a la replicación. Existen además otros mecanismos de reparación post-replicación, que corrigen errores cometidos en la replicación o errores que la

Capítulo 2

70

impiden. Entre estos se encuentra la reparación por errores de apareamiento (MMR).

Los apareamientos incorrectos se producen por errores de la replicación

o como consecuencia de recombinación. La mayoría de los errores cometidos inicialmente por la DNA polimerasa se rectifican gracias a su propia actividad correctora o exonucleasa 3´, pero unos pocos pueden permanecer sin corregir. Es entonces cuando entra en juego este mecanismo de reparación de apareamientos incorrectos, que está formado por proteínas que reconocen la presencia de un par de bases incorrectamente apareadas y eliminan la base errónea o bien el tramo de la cadena de DNA que la contiene. En humanos se han podido identificar una serie de genes que codifican proteínas de este sistema de reparación. Los productos de estos genes son: hMSH2, nMSH1 hPMS1, hPMS2 y GTBP/hMSH6.

Las enfermedades inflamatorias crean situaciones significativas de estrés

oxidativo en células y tejidos. Incidencias elevadas de cáncer se han detectado en pacientes con gastritis crónica, pancreatitis crónica y enfermedad inflamatoria intestinal. Los tejidos de pacientes con estas enfermedades muestran inserciones y/o deleciones en regiones microsatélites del DNA que se han denominado inestabilidad microsatélite (MSI). Los microsatélites son secuencias simples de 1 a 6 nucleótidos repetitivas en tandem, que se dispersan ampliamente a lo largo de todo el genoma humano. Los MSI se asocian con un defecto en el sistema de reparación de errores de apareamiento. Este sistema mantiene la integridad genómica corrigiendo los errores replicativos.

En el sistema MMR humano, la proteína hMSH2 forma los complejos

hMutSα y hMutSβ con hMSH6 y hMSH3, respectivamente, mientras que hMLH1 y hPMS2 forman el heterodímero hMutLα. Estos complejos, junto con otros componentes del sistema MMR, corrigen errores de apareamiento de una sola base y bucles pequeños de inserción/deleción, que ocurren durante la replicación del DNA. La inestabilidad de los microsatélites (MSI) ocurre cuando los bucles en los microsatélites no se corrigen debido a un malfuncionamiento del sistema MMR. Inestabilidad de los microsatélites de baja frecuencia (MSI-L) se han detectado en algunos tejidos inflamados crónicos en ausencia de inactivación genética del sistema MMR. Chang et al., han emitido la hipótesis que el estrés oxidativo asociado con la inflamación crónica lesionan los componentes proteicos del sistema MMR lo que conduce a su inactivación funcional. Ellos mismos han demostrado que

Capítulo 2

71

concentraciones no tóxicas de peróxido de hidrógeno impiden las actividades reparadoras de los errores de apareamiento y las de los bucles de inserción/deleción del sistema MMR de forma dependiente de la dosis. Ensayos in vitro de complementación usando proteínas de MMR recombinante, han demostrado que esta inactivación se debe probablemente a la lesión oxidativa de los complejos proteicos hMutSα y hMutSβ y hMutLα. Es probable que la inactivación de la función del MMR en respuesta al estrés oxidativo pueda ser la responsable de la inestabilidad de los microsatélites que se observan en tejidos cancerosos asociados a la inflamación crónica.

13. Conclusiones

Las ROS cuando reaccionan con los ácidos nucleicos originan una serie

de alteraciones: modificación de bases, errores de apareamiento y rotura de cadenas. La lesión al DNA inducida por ROS es un intermediario en procesos patológicos tales como el cáncer y el envejecimiento. Los productos de esta lesión pueden ser mutagénicos y citotóxicos. La mutagénesis inducida por las ROS, que puede dar lugar a la iniciación y progresión al cáncer, es un acontecimiento frecuente en células humanas normales. La promoción tumoral mediada por ROS se ha demostrado directamente en humanos, ya que existe evidencia experimental convincente que el estrés oxidativo puede diferencialmente inducir la proliferación de las células tumorales. Así, las ROS han de ser reconocidas como una importante clase de carcinógenos que estimulan el desarrollo del cáncer en multitud de etapas. Las estrategias para prevenir los efectos carcinogénicos de las ROS han de tener en cuenta la complejidad química de los radicales libres in vivo y la complejidad del proceso multiescalonado del desarrollo del cáncer. Por ello, el efecto del estrés oxidativo en una etapa dada de la carcinogénesis depende de la composición y de la intensidad de las ROS implicadas. Por tanto, la actuación de enzimas antioxidantes que aceleran la conversión de las ROS, unas en otras, o con antioxidantes no enzimáticos, puede llegar a ser una espada de doble filo que puede intensificar el efecto del estrés oxidativo.

La gran diversidad de lesiones del DNA inducidas por ROS se refleja por

los correspondientes mecanismos de reparación que se encuentran en todas las formas de vida aerobia. Sin embargo, se necesita aún más conocimiento sobre la bioquímica de la mutagénesis y de los mecanismos reparadores del DNA en eucariotas antes de que se realicen intervenciones para intensificar el sistema reparador. La reconstitución de los mecanismos que median la

Capítulo 2

72

parada del ciclo celular en respuesta a la lesión del DNA y/o al estrés oxidativo, puede ser utilizada en el futuro para retrasar la progresión tumoral inducida por ROS.

14. Abreviaturas ERF, factor relajante del endotelio; H2O2, peróxido de hidrógeno; HO2

.-, radical hidroxioxil; Hb, hemoglobina; IκB, inhibidor kappa B; IL2, interleuquina 2, citoquina; IL2R, receptor de la IL-2; MMR, reparación de errores de apareamiento; MS, microsatélites; MSI, inestabilidad de los microsatélites; NAC, N-acetilcisteína; NFκB, factor nuclear kappa B; NO·, oxido nítrico; cNOS, óxido nítrico sintasa constitutiva; iNOS, óxido nítrico sintasa inducible; mitNOS, óxido nítrico sintasa mitocrondrial; Mb, mioglobina; O2

.-, radical superóxido; 1O2, oxígeno singlete; ONOO-, peroxinitrito; PKC, proteína quinasa dependiente de calcio; PMA, forbol miristato acetato; R·, radical alquilo; RO·, radical alcoxilo; ROO·, radical peroxilo; SOD, superóxido dismutasa; TNF, factor de necrosis tumoral; TNFR, receptor del factor de necrosis tumoral.

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Capítulo 2

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Capítulo 3. ANTIOXIDANTES Y ENVEJECIMIENTO 1. Introducción 2. Radicales de oxígeno 3. Respuesta adaptativa al estrés oxidativo. Antioxidantes 3.1. Sistemas anzimáticos 3.2. Antioxidantes no enzimáticos 3.3. Otros antioxidantes 4. Acción sinérgica de antioxidantes: vitaminas E y C 5. Mecanismo de acción de los antioxidantes 6. Causas del envejecimiento 7. Perspectivas y conclusiones 8. Abreviaturas 9. Bibliografía

1. Introducción

La integridad y la supervivencia de un organismo vivo dependen de la

regulación de su propia homeostasis. En condiciones fisiológicas normales la homeostasis celular se encuentra continuamente agredida por agentes exógenos y endógenos. Para hacer frente a estos agresores, la célula ha desarrollado su propia protección o mecanismos de defensa, que implica la movilización de constituyentes celulares y la integración funcional de componentes específicos, entre los que se incluyen enzimas, tanto los asociados a membrana como los solubles citosólicos, que neutralizan la acción de dichos agentes lesivos, regulando sus efectos perjudiciales, aminorando las alteraciones del medio celular interno y preservando la actividad celular.

Una de las mayores amenazas internas de la homeostasis celular en los

organismos aerobios surge de los intermediarios reactivos de oxígeno generados a partir del propio oxígeno. Para evitar este peligro y asegurar su supervivencia, los organismos aerobios han evolucionado desarrollando una serie de mecanismos para eliminar los efectos de los subproductos tóxicos derivados del oxígeno. Estos sistemas protectores se clasifican como sistemas de defensa antioxidante. El funcionamiento de estos sistemas es más eficiente cuando las actividades de sus componentes individuales actúan coordinadamente. Para conseguir el mayor grado de efectividad las defensas antioxidantes coordinadas actuan, a su vez, de manera concertada con los sistemas de reparación dedicados a restaurar las moléculas alteradas por oxidación.

Capítulo 3

77

Un ser vivo es un ente individual y diferenciado que necesita gran cantidad de energía para sobrevivir en un medio adverso. Los mecanismos implicados en el mantenimiento de la supervivencia se van deteriorando a medida que transcurre la edad. No parece que exista un programa genético que se ponga en marcha a determinada edad para conducir a la vejez y la muerte, simplemente los genes que expresan los mecanismos de reparación van perdiendo eficacia con la edad.

Se han identificado muchos factores ambientales y rutas metabólicas

reguladas por genes que contribuyen a retardar o acelerar el envejecimiento. La capacidad oxidativa de las especies reactivas de oxígeno, los daños al DNA por estas mismas especies, por radiaciones o por agentes químicos, la excesiva producción de energía por las mitocondrias, la hiperactividad de la hormona del crecimiento, un aporte excesivo de grasas y carbohidratos, etc., son elementos relacionados con el envejecimiento. Se está empezando a vislumbrar conexiones entre diferentes mecanismos y se ha demostrado que existe una familia de genes maestros que rige gran parte de estos procesos cuya modulación podría conducir a una significativa elevación de la expectativa de vida humana.

2. Radicales de oxígeno Los radicales de oxígeno son un resultado inevitable de la vida en un

medio rico en oxígeno. Para los organismos aerobios el oxígeno es vital para la existencia e inherentemente lesivo. La paradoja del oxígeno deriva de su misma naturaleza química, ya que su naturaleza de radical le permite reacciones químicas de oxidación/reducción muy interesantes. En una reducción univalente el oxígeno puede sufrir cuatro sucesivas reducciones con un electrón, catalizadas por la citocromo oxidasa al final de la cadena de transporte electrónico. En esta vía se generan especies reactivas de oxígeno (ROS): el primero, resultante de la reducción con un electrón del oxígeno molecular, genera el radical superóxido (O2

.-); la adición de un segundo electrón y dos protones genera la especie activa peróxido de hidrógeno (H2O2); un tercer electrón produce el radical hidroxilo (·OH) que posee una elevada reactividad. El cuarto electrón genera una molécula de agua.

Para sobrevivir en un ambiente poco favorable, los organismos aerobios

han desarrollado una serie de sistemas enzimáticos y una variedad de compuestos antioxidantes hidro y liposolubles, cuyo papel es interceptar e inactivar las ROS que se sintetizan inevitablemente. Además, la célula posee la

Capítulo 3

78

capacidad de sintetizar una batería de enzimas reparadores/eliminadores de la lesión en proteínas, lípidos y DNA. Finalmente, como el ritmo de generación de estas especies puede variar de un momento a otro, los organismos son capaces también de adaptarse a tal estrés fluctuante induciendo la síntesis de enzimas antioxidantes y de enzimas reparadores que eliminan la lesión. Sin embargo, a pesar que la célula posee estos valiosos mecanismos antioxidantes y reparadores que suponen una defensa eficiente frente a la agresión oxidativa, en determinadas ocasiones no son suficientes y el cociente prooxidantes/antioxidantes se eleva, como resultado imposible de evitar de la existencia aerobia y dá lugar a la situación intracelular de estrés oxidativo, situación involucrada en una amplia variedad de procesos degenerativos, enfermedades y síndromes que incluye los siguientes: mutagenesis (transformación celular y cáncer), aterosclerosis, ataques al corazón, infartos y lesiones derivadas de la isquemia/reperfusión, enfermedades crónicas inflamatorias (artritis reumatoide, lupus eritematosus, artritis psoriática), problemas agudos inflamatorios, estrés fotooxidativo ocular (cataratas), alteraciones del sistema nervioso central (esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer) y una amplia variedad de alteraciones relacionadas con la edad, incluyendo los mismos procesos naturales del envejecimiento. Alguna de estas enfermedades ligadas a la oxidación pueden exacerbarse o incluso iniciarse por efecto de numerosos prooxidantes ambientales, entre los que se incluyen numerosos fármacos o alimentos.

3. Respuesta adaptativa al estrés oxidativo. Antioxidantes

La respuesta adaptativa se refiere a la capacidad de un organismo o una célula de resistir a los efectos perniciosos de un agente tóxico cuando éste se ha administrado previamente a pequeñas dosis. Es este un fenómeno ampliamente distribuído entre procariotas, levaduras, plantas y animales. Son muchos los agentes agresivos que inducen la respuesta adaptativa, entre los cabe destacar: las ROS, el choque térmico, la radiación, agentes alquilantes, metales pesados, etc. La adaptación implica la modulación de la expresión de una serie de genes.

A nivel fisiológico, el beneficio principal de la respuesta celular adaptativa

es claro: proteger a la célula y al organismo de la agresión infligida por agentes extraños. Tal respuesta protectora indica que la célula, una vez expuesta al agente agresor, está preparada para hacer frente a una dosis subletal de dicho agresor. Aunque los primeros estudios sobre la respuesta adaptativa, implicaron a los mecanismos de resistencia adquirida, la relevancia fisiológica de las

Capítulo 3

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respuestas adaptativas son de naturaleza más sutil. Por ejemplo, el ejercicio físico, que implica en sí una elevación en la situación de estrés oxidativo, conlleva una reducción en la tasa de peroxidación lipídica producida durante el ejercicio. Los linfocitos de las personas expuestas por su trabajo a dosis bajas de radiaciones ionizantes, muestran una capacidad más elevada de reparación.

Se ha demostrado, tanto en bacterias como en eucariotas, que las células

pueden sufrir una respuesta adaptativa frente la concentraciones subletales de oxidantes. En esta situación, es importante constatar, que las células presentan dos líneas defensivas; la primera implica sistemas enzimáticos antioxidantes involucrados directamente en la prevención de la lesión oxidativa, como la superóxido dismutasa, la catalasa y la glutation peroxidasa, y moléculas antioxidantes de bajo peso molecular, como el glutation y el ascorbato. La segunda línea defensiva consiste en los sistemas reparadores que reparan o eliminan las moléculas lesionadas por oxidación.

Las sustancias que neutralizan el efecto pernicioso de las ROS se agrupan

en los sistemas de defensa antioxidante. Por definición, antioxidante es aquel compuesto químico que inhibe o previene la oxidación de un sustrato. Halliwell y Gutteridge consideran que antioxidante es la sustancia que, cuando se encuentra en pequeñas concentraciones comparadas con aquellas de un sustrato oxidable, retrasa o inhibe significatívamente la oxidación de tal sustrato. Krinsky define como antioxidante aquel compuesto que protege los sistemas biológicos de los efectos potencialmente perjudiciales de procesos o reacciones que causan excesivas oxidaciones.

Los sistemas de defensa antioxidante reciben diferentes nombres:

antioxidantes, agentes atrapadores de radicales libres, agentes reductores, etc. Estos sistemas, responsables de la protección celular se encuentran tan diversificados como los mismos radicales. Los antioxidantes se encuentran compartimentados estratégicamente en los diferentes organulos subcelulares. Por ejemplo, la superóxido dismutasa (SOD) y la glutation peroxidasa (GPX), se encuentran distribuídas tanto en el citosol como en la mitocondria; mientras que la catalasa se distribuye entre el citosol y los peroxisomas. Además de la integración de las defensas intracelulares, la interacción cooperativa entre los diversos antioxidantes en el plasma es de importancia crucial para la máxima supresión de las reacciones de los radicales libres en el compartimento extracelular.

Capítulo 3

80

3.1 Sistemas enzimáticos Diversos enzimas han emergido a lo largo de la evolución con la misión

primaria de disminuir los niveles intracelulares de ROS y por tanto, proporcionar protección frente a los oxidantes biológicos. El sistema enzimático de defensa antioxidante consiste en una serie de enzimas que actúan coordinadamente: las superóxido dismutasas dependientes de cobre y cinc (Cu,ZnSOD) y de manganeso (MnSOD), la catalasa (CAT), la glutation peroxidasa dependiente de selenio (GPX). En el esquema de la Figura 1 se muestra la actuación y coordinación de estos sistemas y su relación con el ciclo redox del glutation.

Figura 1. Mecanismos de defensa antioxidante enzimáticos: Superóxido dismutasa (SOD),

catalasa, glutation peroxidasa dependiente de selenio (GPX), y no enzimáticos: Glutation (GSH/GSSG reducido/oxidado), Selenio (Se) vitamina E, L-cisteína, etc. Destoxificación de ROS por sistemas enzimaticos de defensa antioxidante. La acción concertada de estos sistemas se encuentra complementada por una serie de antioxidantes noenzimáticos

Superóxido dismutasa (SOD). La SOD cataliza la dismutación del radical

superóxido a peróxido de hidrógeno según la siguiente reacción: 2O2

.- + 2H + O2+ H2O2

Capítulo 3

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La velocidad de dismutación enzimática es 104 veces mayor que la dismutación química. La familia SOD consiste en cuatro metaloenzimas: dos contienen cobre y cinc, una manganeso y otra hierro. La Cu,ZnSOD se encuentra en el citosol de las células eucariotas, una forma diferente de Cu,ZnSOD (EC) aparece en los fluidos extracelulares. La MnSOD se localiza en la matriz mitocondrial de eucariotas y en bacterias, mientras que la forma FeSOD se encuentra en muchas bacterias aerobias. La Cu,ZnSOD citosólica tiene un peso molecular de 32 kDa con dos subunidades idénticas. La Cu,ZnSOD (EC) tiene un peso molecular de 135 kDa compuesta por cuatro subunidades unidas no covalentemente. La MnSOD de la matriz mitocondrial posee un peso molecular de 88 kDa con cuatro subunidades iguales. La Cu,ZnSOD es sensible al cianuro pero resistente al tratamiento con cloroformo/etanol, por el contrario, la MnSOD es resistente al cianuro, pero se detruye por tratamiento con cloroformo/etanol. Los genes humanos codifican las Cu,ZnSOD y la MnSOD que se encuentran en el cromosoma 21q22.1 y en el 6q21, respectivamente. Un exceso de SOD que no vaya acompañado por la catalasa, puede resultar perjudicial al acumularse peróxido de hidrógeno. Esta situación sucede en pacientes con el síndrome de Down, que poseen trisomía en el cromosoma 21 que es donde se encuentra el gen que codifica la Cu, ZnSOD.

Catalasa. Cataliza la conversión del peróxido de hidrógeno en agua. Uno de los productos de la acción de la superóxido dismutasa es el H2O2. Esta molécula puede ser eliminada por varios enzimas tales como la catalasa y la glutation peroxidasa, que catalizan la siguiente reacción:

H2O2 2 H2O + O2 En ausencia de la catalasa se acumula el H2O2, el cual, en presencia de

metales de transición tales como hierro o cobre, genera el radical hidroxilo (Reacción de Fenton) que posee elevada reactividad para reaccionar con las macromoléculas:

O2

.- + Fe3+ O2 + Fe2+ H2O2 + Fe2+ ·OH + OH- + Fe3+ (Reacción de Fenton) Muy difundida entre los seres vivos, en animales se encuentra en los

órganos principales del organismo, apareciendo concentrada en hígado, riñón y eritrocitos. A nivel subcelular la catalasa se encuentra en los peroxisomas (80%) y en el citosol (20%). Posee un peso molecular de 240 kDa y consiste en

Capítulo 3

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cuatro subunidades que contiene cada una un grupo hemo (Fe (III) protoprofirina) unido a su grupo activo. Los inhibidores de la catalasa incluyen la azida, el cianuro, el 3-amino-1,2,4-triazol, GSH y ditiotreitol. El gen que codifica la catalasa humana se encuentra en el cromosoma 11p13

Glutation peroxidasa (GPX). Cataliza la oxidación del GSH a GSSG a

expensas del H2O2 o de peróxidos orgánicos: H2O2 + 2GSH GSSG + H2O ROOH + 2GSH GSSG + H2O + ROH Por su dependencia del selenio (Se), la GPX puede dividirse en dos

formas: dependiente e independiente de selenio. La primera es un tetrámero de peso molecular 84 kDa con gran actividad frente al H2O2 y los hidroperóxidos (ROOH). Contiene un residuo de selenocisteína en cada uno de los sitios activos y se encuentra en el citosol (70%) y en la mitocondria (30%). Entre los inhibidores de esta actividad enzimática cabe citar el iodoacetato, el cianuro y el radical superóxido. El gen que codifica esta enzima se localiza en el cromosoma 3p13-q12.

La forma no dependiente del Se tiene un peso molecular menor, es

dimérica y solo elimina los ROOH. En rata se ha demostrado que la GPX no dependiente de Se, se corresponde con isoformas de la glutation transferasa, enzima implicada en la destoxificación de xenobióticos. Se ha caracterizado, otra GPX dependiente del Se que actúa sobre los hidroperóxidos de fosfolípidos, que se encuentra distribuída en numerosos tejidos.

Glutation reductasa (GR). Cataliza la reacción que restaura el glutation en su forma reducida a expensas de equivalentes reductores en forma de NADPH:

GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+ La proteína enzimática, de peso molecular 120 kDa, contiene 2

subunidades, cada una de ellas lleva un grupo FAD en su sitio activo. Se encuentra en el citosol y en la mitocondria, y se inhibie por la 1,3-bis-2-cloroetil-1-nitrosourea. El gen que codifica su expresión se encuentra en el cromosoma humano 8p21.1.

Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH). La existencia de una vía

Capítulo 3

83

para la oxidación de la glucosa-6-fosfato se demostró por primera vez en extractos de levadura en 1936. Sin embargo, la purificación no se consiguió hasta 1961. En el rango de pH 7 a 8 y con baja fuerza iónica, la G6PDH de eritrocitos humana existe en equilibrio entre el tetrámero de 210 kDa y el dímero de 105 kDa. La reacción de la G6PDH asociada a los sistemas enzimáticos de defensa antioxidante tiene como misión regenerar el coenzima NADPH, que quedó en su forma oxidada NADP+ por acción de la glutation reductasa. La reacción catalizada por la G6PDH es la siguiente:

Glucosa-6-fosfato + NADP+ 6-fosfogluconolactona + NADPH + H+

El enzima se inhibe en presencia de quelantes de metales, especialmente por sustancias que bloquean los grupos sulfhidrilos como el p-cloromercuribenzoato y las hormonas esteroideas. El gen que codifica este enzima se encuentra en el cromosoma humano Xq28.

3.2. Antioxidantes no enzimáticos

Glutation. El glutation reducido (GSH) es un tripéptido compuesto por γ-glutamilo, cisteína y glicocola (Figura 2). Es el tiol de bajo peso molecular más abundante en la mayoría de células de mamíferos. La concentración intracelular en hígado puede llegar a alcanzar 10 mM. En el estado redox normal de la célula, menos de un 5% del glutation total existe en su forma oxidada (GSSG). El GSH se caracteriza por su grupo tiólico reactivo y su enlace γ-glutamilo al que se debe su resistencia al ataque de las peptidasas. Por sus propiedades químicas presenta una gran versatilidad que le permite ser a la vez nucleófilo y reductor efectivo. Puede reaccionar con muchos compuestos electrofílicos y oxidantes, tales como H2O2, O2

.- y ·OH, y como eficaz reductor el GSH juega un importante papel en una variedad de procesos de destoxificación. Entre estos se incluye la anulación del daño peroxidativo, que se evidencia por la simultánea desaparición del GSH. La menor concentración de GSH eleva la susceptibilidad del organismo a los agentes citotoxicos y afecta la intervención de fármacos en enfermedades neoplásicas.

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Figura 2. Estructuras de antioxidantes; liposolubles e hidrosolubles.

El hígado es el órgano que posee mayor capacidad de sintetizar glutation a través de la vía de la cistationina, cuya misión es generar cisteína a partir de metionina de la dieta. Esta vía, operativa solo en el hígado, capacita a este órgano para suministrar GSH o GSSG a diversos tejidos extrahepáticos a los que les aporta la cisteína precursora de la síntesis del tripéptido. En hígado existen dos reservorios de glutation: el citosólico y el mitocondrial. El citosólico se encuentra sometido a un intenso recambio, mientras que el mitocondrial no. La disminución de GSH inducida por agentes químicos favorece la peroxidación lipídica y la lesión celular. El GSH actúa principalmente sobre el H2O2 generado en el curso de la biotransformación de xenobióticos y otras vías y como coenzima de la glutation peroxidasa. También el GSH se utiliza como sustrato por la glutation-S-transferasa para la conjugación y eliminación de xenobióticos (Figura 3).

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Figura 3. Enzimas antioxidantes y ciclo redox del glutation. GPX, glutation peroxidasa; GRED, glutation reductasa; G6PDH, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; GST, glutation transferasa; G6P, glucosa-6-fosfato; 6PG, 6-fosfogluconato; GSH y GSSG, glutation reducido y oxidado, respectivamente.

El GSH reacciona también con los radicales libres, especialmente con el radical hidroxilo (·OH) y con los radicales centrados en carbono cediéndoles un átomo de hidrógeno. Tales reacciones neutralizan la reactividad del ·OH el cual se considera como la fuente más importante de lesión debida a radicales libres de oxígeno. Tal inhibición se relaciona con la vitamina E, la cual sufre una serie de reacciones en las que esta implicada la regeneración del GSH a expensas de la vitamina C (Figura 4).

Figura 4. Posible papel de los radicales de glutation (GS·) en la regeneración de las

vitaminas C y E

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Al igual que otros sistemas antioxidantes, los niveles de GSH fluctúan en diversas condiciones fisiológicas incluyendo el envejecimiento y algunas enfermedaαdes neoplásicas. La disminución en la concentración de glutation, o lo que es mejor, en el cociente GSH/GSSG va acompañada por una elevación en la peroxidación lipídica. El declinar con la edad de la concentración de GSH puede ser debido a un incremento en la tasa de oxidación o a una disminución en el recambio del GSH que resulta de una mayor utilización y degradación y/o de una menor biosíntesis del GSH total (Figura 5). La biosíntesis del GSH a partir de los aminoácidos que lo constituyen está catalizada por la γ-glutamil cisteina sintetasa y por la GSH sintetasa. Como la γ-glutamil transferasa se localiza en la membrana plasmática, con su sitio activo mirando hacia el espacio extracelular, el ritmo de salida del GSH celular gobierna su velocidad de degradación. La mayor demanda de GSH se verifica cuando se elevan los peróxidos a medida que transcurre la edad. Por tanto, es probable que la acumulación de sustancias tóxicas durante la senectud eleve la actividad de los enzimas que consumen GSH, como la glutation peroxidasa y la glutation-S-transferasa, lo que conlleva a una disminución del GSH intracelular. (Figura 5)

Figura 5. Efecto de la edad (meses) sobre la concentración de GSH, malondialdehido (MDA) y proteínas-SH, en homogenados de hígado de rata de 2, 6, 12, 18 y 30 meses de edad. Los resultados son media de cuatro determinaciones experimentales (Sanz 1996).

En base al esquema de la Figura 3, en el que se muestra la coordinación de los sistemas enzimáticos antioxidantes antes mencionados, se han realizado estudios para observar el efecto del envejecimiento sobre la actividad y la

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expresión génica de las proteínas enzimáticas implicadas en el sistema de defensa antioxidante. En la Figura 6 se muestran las siguientes actividades: Cu, Zn SOD, MnSOD, CAT, GPX y GRED, evaluadas en homogenados de hígados de ratas de 2, 6, 12, 18 y 30 meses de edad. Es interesante observar la influencia de la edad sobre estos sistemas de defensa antioxidante, y se detectan, en general, elevaciones notables en las actividades enzimáticas ensayadas. Los cambios en estas actividades coincidieron con la expresión génica de estos enzimas determinada ensayando sus mRNA respectivos.

Figura 6. Efecto de la edad sobre las actividades de los sistemas de defensa antioxidante

en fracciones subcelulares de hepatocitos de rata: Los resultados son media de cuatro determinaciones experimentales. MnSOD, superóxido dismutasa dependiente de manganeso (mitocondrial; Cu,ZnSOD, superóxido dismutasa dependiente de cobre y cinc (soluble); GPX, glutation peroxidasa; y GRED, glutation reductasa (Sanz et al., 1997).

Si se comparan estos datos con los que se muestran en la Figura 5, se puede observar que los incrementos en estas actividades van paralelos a los niveles de malondialdehido (metabolito marcador de la peroxidación lipídica) y al grado de disminución de los niveles intracelulares de GSH y de proteínas SH. Estos datos indican que estos sistemas de defensa celular se inducen ante una elevación de oxidantes intracelulares dependiente de la edad.

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Aunque se han hecho muchos esfuerzos para encontrar la concentración precisa de GSH a la cual se inician los procesos lesivos, hasta la fecha no puede responderse a esta pregunta. Por un lado, el GSH intracelular está compartimentalizado, y por otro lado, la pérdida de tioles proteicos, acompañada por la pérdida total del GSH, puede jugar un papel clave en la viabilidad celular, pero solo la pérdida del GSH no conduce necesariamente a la lesión y muerte celulares. A favor de este punto de vista se ha observado que existe una disociación entre la disminución del GSH celular y la pérdida de la viabilidad. Por ejemplo, los agentes quelantes del hierro o los antioxidantes que previenen la peroxidación lipídica, son capaces de inhibir el incremento en la permeabilidad de la membrana y la muerte celular sin afectar la concentración del GSH. A la misma conclusión se puede llegar a partir del hecho que el estrés oxidativo, inducido por xenobióticos en presencia de un inhibidor de la disminución del GSH, conlleva a una pérdida extrema de la viabilidad celular y sólo a un modesto incremento en la peroxidación lipídica. A pesar de estos resultados contradictorios, se acepta por la mayoría de los investigadores, que es importante mantener elevado el cociente GSH/GSSG para prevenir la secuela de acontecimientos que lleva consigo la disminución de los grupos tiólicos celulares: peroxidación lipídica, aparición de protuberancias en la superficie celular, alteraciones en la homeostasis del calcio, etc. A este respecto, la continuada generación de GSH, a partir del GSSG, por acción de la glutation reductasa en presencia de equivalentes reductores, en forma de NADPH, es esencial para preservar la integridad celular.

Un precursor del glutation reducido es la N-acetilcisteina (NAC),

compuesto que no tiene propiedades antioxidantes per se, pero que eleva la disponibilidad del GSH, ya que actúa como reservorio de cisteína y como precursor del GSH. La NAC reduce el envenenamiento por plomo en el ratón y protege las neuronas del hipocampo despues de la isquemia en ratas. La NAC muestra in vitro una gran capacidad antiapoptogénica, observada en cultivos de células PC12 donde previene la apoptosis inducida por glutamato.

Vitamina E. Es la vitamina antioxidante liposoluble más ampliamente

distribuída en la naturaleza, tanto en el reino vegetal como en el animal. El término genérico vitamina E se refiere a los ocho isómeros estructurales del tocoferol. Entre ellos, el α-tocoferol es el isómero mejor conocido y el que posee la actividad antioxidante más potente. Debido a la propiedad lipofílica de la molécula de tocoferol, la vitamina E interrumpe la reacción en cadena de los radicales en el medio liposoluble, por ejemplo, en las lipoproteínas plasmáticas. Elevadas concentraciones de α-tocoferol se encuentran en tejidos de mamíferos

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tales como, glándulas adrenales, corazón, testículos e hígado. En el interior de la célula, la vitamina E se asocia con membranas ricas en lípidos como la mitocondria y el retículo endoplásmico, de manera que la acción antioxidante de esta vitamina es efectiva ya que protege la lipoperoxidación de las membranas al reaccionar con los radicales peroxilo y alcoxilo.

Por su efectividad como inhibidor de la propagación de la peroxidación

lipídica, cada mlolécula de α-tocoferol puede reaccionar con dos radicales peroxilo (LOO·):

α-tocoferol + LOO· α-tocoferoxlilo· + LOOH α-tocoferilo· + LOO· LOO-α-tocoferol El primer producto es el radical α-tocoferoxilo·, un radical centrado en

oxígeno, que puede reaccionar con otro radical peroxilo para formar un aducto estable. La efectividad relativa del α-tocoferol como antioxidante en liposomas y preparaciones de membrana es sólo del 1 - 2 % de aquella que tiene lugar en soluciones homogéneas. Esto se ha atribuído a la menor movilidad del α-tocoferol en las membranas y a la mayor probabilidad de propagación en cadena en el ajustado medio estructurado de las membranas.

La vitamina E toma parte en reacciones de transferencia de hidrógeno

sirviendo a veces como oxidante y otras veces como reductor. El orden de capacidad de los antioxidantes naturales para actuar como donador de hidrógeno es: GSH > ascorbato > vitamina E > β-caroteno. Por otra parte la vitamina E, además del ascorbato, es el donador de electrones más potente cuando se compara con el GSH o el β-caroteno. La vitamina E está íntimamente ligada a las reacciones que rompen la cadena peroxidativa que tienen lugar en los tejidos en condiciones fisiológicas y patológicas. Debido a sus propiedades redox, la vitamina E se encuentra también involucrada en reacciones de transferencia de electrones.

Esta vitamina se encuentra en el germen de trigo, aceite de soja, germen de

cereales o cereales de grano entero, aceite de oliva, vegetales de hoja verde y frutos secos.

Vitamina C. Al contrario que la vitamina E, la vitamina C o ácido

ascórbico, es hidrosoluble y funciona mejor en un ambiente acuoso. Su papel como agente antioxidante y reductor, se conoce por su capacidad para reaccionar con los radicales libres. Reacciona directamente con el radical

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superóxido (O2.-), el radical hidroxilo (·OH) y diversos lípido hidroperóxidos.

Se supone que la función más importante de la vitamina C es la de restaurar las propiedades antioxidantes de la vitamina E al reciclar el radical α-tocoferilo·. La vitamina C se encuentra ampliamente distribuída en tejidos de mamíferos, pero su presencia es mayor en las glándulas adrenales y pituitaria.

Cuando se compara con otros antioxidantes hidrosolubles, (bilirubina,

urato, grupos sulfhidrilos, etc.) la vitamina C ofrece la protección más efectiva frente a la peroxidación de los lípidos plasmáticos. El ácido ascórbico sirve como antioxidante y prooxidante. Como antioxidante ejerce un efecto economizante de la vitamina E y el selenio. Cuando se encuentra en altas concentraciones (1mM), en presencia de metales de transición Fe3+ o Cu2+, la vitamina C actúa como prooxidante, generando ROS durante la promoción de la peroxidación lipídica. Se ha demostrado que la acción prooxidante del ascorbato inductora de la lipoperoxidación, reside en su capacidad para reducir Fe3+ a Fe2+, ya que el Fe2+ es un potente inductor de la generación de radicales libres. La complejidad de este doble papel del ascorbato se magnifica en presencia de otros antioxidantes, como la vitamina E. Por ejemplo, la peroxidación lipídica se eleva, por efecto del ascorbato en los microsomas de animales deficitarios en vitamina E, pero disminuye por efecto del ascorbato en condiciones normales. Parece ser que la concentración y distribución subcelular de ascorbato son factores importantes que contribuyen a su acción dicótoma.

Debido a que el pKa del ácido ascórbico es 4,25, el anión ascorbato (AH-)

es la forma predominante que existe a pH fisiológico. El anión AH-, por oxidación reversible, genera el ácido dehidroascórbico (DHA), a través de la formación de un intermediario, el radical ascorbilo (A·). El DHA posee propiedades prooxidantes y anti-oxidantes como el mismo ascorbato.

Los sistemas de defensa antioxidante son más efectivos cuando actúan

concertadamente. El conocimiento de las características peculiares de las dos vitaminas y las diferencias entre ellas, ha potenciado el interés por las propiedades básicas y el modo de acción de estos antioxidantes. En tejidos, la concentración de vitamina C es considerablemente más alta que la de vitamina E. Por ejemplo, en hígado, la concentración de vitamina C y E son 2 y 0.02 mM, respectivamente. Se ha propuesto que el mecanismo responsable de la acción economizadora de la vitamina C sobre la vitamina E se encuentra unida a la capacidad del ácido ascórbico de reducir los radicales tocoferilos formados al reaccionar la vitamina E con el radical libre:

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ROO· + Vitamina E ROOH + Vitamina E· Vitamina E· + AH- Vitamina E + A· Carotenoides. La mayoría de los miembros de esta gran familia de

polienos conjugados poseen similar actividad antioxidante. Los carotenoides se han considerado antioxidantes desde hace tiempo, debido a su capacidad para reaccionar con los radicales libres. Los carotenoides protegen los lípidos de la peroxidación, eliminando los radicales libres y las ROS, especialmente el oxígeno singlete. El β-caroteno muestra una eficiente actividad antioxidante, atrapadora de radicales libres, mediante la inhibición de la peroxidación lipídica inducida por la xantina oxidasa. Esta actividad se debe a la disposición estructural de los β-carotenos con su larga cadena de dobles enlaces conjugados

La efectividad del β-caroteno como antioxidante es mayor a

concentraciones de oxígeno poco elevadas. El β-caroteno reacciona directamente con el radical peroxilo (LOO·) para formar un radical centrado en carbono de resonancia estable:

CAR + LOO· LOO-CAR· Llegado el caso, los carotenoides pueden ser capaces de bloquear dos

radicales peroxilo, como hace también el α-tocoferol: LOO-CAR· + LOO· LOO-CAR-OOL Sin embargo, la capacidad bloqueadora de radicales no necesita parar aquí,

ya que puede continuar con la formación de múltiples radicales centrados en carbono sobre una sola molécula de β-caroteno:

LOO-CAR-OOL + LOO· (LOO)2-CAR-OOL· + LOO· (LOO)2 -

CAR - (LOO)2 Los productos formados de la reacción de los radicales peroxilo con el β-

caroteno son derivados carbonilos y algunos epóxidos. Ubiquinol. El ubiquinol o coenzima Q (QH2) reducido se considera que

ejerce funciones antioxidantes, a pesar de encontrarse implicado en el metabolismo energético mitocondrial. Su forma reducida, ubiquinol QH2, actúa como un antioxidante natural, ya que, al contrario que el α-tocoferol o el β-

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caroteno, su capacidad no puede agotarse como resultado del estrés oxidativo. Esta peculiaridad se debe a su intervención en actividades biológicas de transferencia de equivalentes reductores, las cuales reciclan los productos antioxidantes derivados del QH2 a la forma antioxidante activa. Además el coenzima Q existe en la mitocondria 5 a 10 veces en exceso estequeométrico con respecto a otros compuestos que transfieren electrones en la cadena electrónica. Por tanto, el coenzima Q se considera como un reservorio de actividad antioxidante.

Se asume que la función de QH2 como un antioxidante in vivo se debe a su

capacidad de reciclar los radicales del β-tocoferol a su forma original antioxidativa. Los radicales cromanoxilos se originan en la interacción de los radicales lipídicos con la vitamina E en las biomembranas sometidas a estrés oxidativo. La presencia de ubiquinol, además de α-tocoferol, proporciona una reacción alternativa en la que amdos compiten por el lípido y por el radical cromanoxilo. En base a la casi idénticas actividades atrapadoras de los radicales peroxilos de la vitamina E y el ubiquinol, la actividad antioxidante del QH2 no se espera que esté exclusivamente restringida a una interacción con el producto derivado del α-tocoferol. Esta consideración está apoyada por el hecho que en la mitocondria, donde el QH2 es importante como antioxidante, su concentración molar excede la del α-tocoferol en ocho veces. De todas formas, se asume que mientras exista QH2 el α-tocoferol no se agota. El coenzima Q existe en tres formas, ubiquinol (QH2), semiubiquinol (SQH·) y ubiquinona.(Q):

QH2 + LOO· LOOH + SQH· SQH· SQ.- + H+ SQ.- + O2 Q + O2

.- 2O2

.-+ 2H+ + SOD H2O2 + O2 2 H2O2 + catalasa 2 H2O + O2 El esquema de la Figura 7 muestra las posibles reacciones que tienen lugar

por interacción de QH2 con los radicales peroxilo y alcoxilo de lípidos. SQH·, el producto derivado de la reacción de QH2, parece que juega el papel más crítico en la determinación de la la eficiencia antioxidante del QH2. La interacción del antioxidante con los radicales lipídicos puede conducir a una variedad de radicales secundarios con actividades prooxidantes.

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Figura 7. Actividad prooxidante compulsiva del radical SQH· que emerge de la función

antioxidante del QH2.

Proteínas que se unen a metales. Algunas proteínas que poseen la capacidad de unirse a metales, reducen la

concentración efectiva de los metales de transición capaces de reaccionar con los peróxidos y generar radicales libres:

LOOH + Fe2+ LO· + OH- + Fe3+. La transferrina en condiciones normales lleva sólo 20-30% de su

capacidad total para el hierro. Debido a su elevada afinidad por este metal, la concentración de hierro libre en el plasma humano permanece a niveles muy bajos. La lactoferrina, que se sintetiza en los neutrófilos, pero que se libera en el plasma, posee propiedades muy similares a la transferrina. La ceruloplasmina parece que posee dos propiedades antioxidantes: la primera, se une a los iones de cobre y previene que este metal de transición catalice la descomposición de los hidroperóxidos a radicales; la segunda, la ceruloplasmina oxida eal Fe2+ a Fe3+ y convierte concomitántemente el oxígeno en agua. A diferencia de los procesos no enzimáticos descritos antes, en esta reacción no se forman especies radicales. La albúmina puede tambien unirse a los iones de cobre, previniendo que inicien reacciones generadoras de radicales.

La acción de dos agentes antioxidantes, vitamina E y desferroxamina se ha

investigado en nuestro laboratorio, sobre el efecto citotóxico de la cocaína en

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cultivo de hepatocitos de rata. La elección de la vitamina E se debe a su acción bloqueante de la peroxidación lipídica, y la de la deferroxamina por su capacidad como quelante del hierro. El parámetro evaluado fueron los niveles intracelulares de glutation, el cual disminuye notáblemente por efecto de dosis citotóxicas de cocaína. En ambos casos los agentes antioxidantes ensayados actuaron previniendo la depleción del glutation (Figura 8).

Figura 8. Efecto de los antioxidantes N-acetilcisteína y desferroxamina (DFO) sobre los niveles intracelulares de GSH en hepatocitos de rata tratada con cocaína. (Zaragoza 2000)

Flavonoides. Los flavonoides son un gran grupo de compuestos fenólicos que aparecen en la naturaleza, ampliamente distribuídos en el reino vegetal. Hasta el momento se han identificado unas 5.000 clases de flavonoides. Muchos poseen los colores atractivos que aparecen en flores, frutos. Los flavonoides se forman en las plantas, a partir de los aminoácidos fenilalanina y tirosina combinadas con unidades de acetato. Son derivados benzo-γ-pirona consistentes en un anillo bencénico (A) inserto a un anillo heterocíclico (C) que lleva en C2 un grupo fenilo (B). El anillo (C) puede ser una γ-pirona (flavonas y flavonoles) o su derivado 2,3, dihidro (flavanonas y flavanoles). En los isoflavonoides, el grupo fenilo (B) es un sustituyente en posición 3 del anillo pirona. Los

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flavonoides pueden hidrolizarse en las posiciones C3, C5 y C7 (anillos A y C) o en C3´, C4´, y C5´, (anillo B). Los ésteres metílicos y etílicos de los grupos OH se encuentran en la naturaleza. En los vegetales, los flavonoides están generalmente presentes en forma glicosilada. La unión con el carbohidrato (glucosa, ramnosa, glucoramnosa, galactosa o arabinosa), se localiza en C3 y C7. Los flavonoides y los tocoferoles comparten como característica común el grupo cromano (anillos A y C) (Figura 9).

Figura 9. Estructura de los flavonoides y vegetales donde se encuentran.

El promedio diario de la dieta en los paises occidentales fluctua entre 20 mg a 1 g de mezcla de flavonoides. Los flavanoles, particularmente las

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catequinas, son los principales constituyentes del te verde y negro y del vino tinto. Los flavonoles como la quercetina se encuentra también en el té y el vino, pero los contienen en mayor proporción la cebolla, brocoli, manzanas, fresas. Las flavanonas se encuentran principalmente en frutos cítricos. La absorción de flavonoides en humanos ha sido controvertida, pero se ha demostrado que la quercetina ingerida con la dieta se absorbe de manera significativa. Después de la ingestión de derivados glucosídicos equivalentes a 64 mg de quercetina, el pico de concentración plasmática de este flavonoide se alcanzó a las 2,9 horas mostrando valores de 196 μg/L .

Se han descrito muchos efectos biológicos de los flavonoides, entre ellos

cabe destacar su actuación como: antiinflamatorios, antialérgicos, antihemorrágicos, antimutagénicos, antineoplásicos y hepatoprotectores. Por todo ello, los flavonoides se consideran como componentes esenciales de la dieta y van ganando considerable interés como agentes terapéuticos frente a una gran variedad de enfermedades. Incluso se ha visto, que muchos de los efectos terapéuticos de la medicina tradicional se deben a estos compuestos. Los efectos farmacológicos de los flavonoides en mamíferos son el resultado de dos propiedades: (1) inhibición de ciertos enzimas y (2) su actividad antioxidante.

Los flavonoides inhiben la actividad catalítica de una serie de enzimas,

tales como, hexoquinasa, aldosa reductasa, fosfolipasa C, proteina quinasa C, ciclooxigenasa, lipooxigenasa, mieloperoxidasa, NADPH oxidasa y xantina oxidasa. Sin embargo, los diferentes flavonoides varían mucho en su eficacia de inhibición. Un flavonoide puede inhibir un enzima a bajas concentraciones (por ejemplo a 1 μM), mientras que inhibe otro enzima a concentraciones de 100μM. Por ejemplo, la sibilina, flavonoide utilizado en la terapia hepática, inhibe fuertemente la 5´-lipooxigenasa, mientras que para inhibir la ciclooxigenasa de granulocitos y células endoteliales se necesitan concentraciones de sibilina cuatro veces superiores y en células de Kupffer humanas no se observó influencia alguna con concentraciones de sibilina de 100μM. Estos descubrimientos son importantes, ya que los leucotrienos se sabe que contribuyen a la lesión de los tejidos, mientras que las prostaglandinas poseen propiedades citoprotectoras. La inhibición específica de la 5´-lipooxigenasa se ha observado en otros flavonoides, lo cual puede contribuir a las propiedades antiinflamatorias y antialérgicas de estos compuestos. La inhibición de las oxidasas que liberan anión superóxido y peróxido de hidrógeno, justifica la actividad antioxidante de los flavonoides. Las 7-OH flavonas inhiben competitivamente la xantina oxidasa, mientras las 3´, 4´, -OH o las 3´,4´,5´-OH flavonas inhiben la actividad de este enzima de manera no

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competitiva. Los flavonoides pueden afectar la actividad de las oxidasas indirectamente, por ejemplo, en granulocitos previenen la activación de la NADPH oxidasa al interferir con proteína quinasas implicadas en la cascada de señalización.

Además de la directa o indirecta inhibición de las oxidasas, las propiedades

antioxidantes de los flavonoides se deben a su capacidad de atrapar los radicales libres, de reaccionar con las ROS no radicales y de formar complejos con el hierro. También la regeneración del α-tocoferol mediante reducción del radical α-tocoferoxilo·, puede contribuir a su actividad antioxidante. Los flavonoides atrapan radicales libres tales como: ·OH, O2

.-, LOO· y NO·, etc. En esta reacción atrapadora, el flavonoide cede un átomo de hidrógeno al radical agresor:

Flavonoide-OH + ·R Flavonoide-O· + RH El radical formado, flavonoide-O· es más estable que el radical ·R que lo

genera. A mayor grado de sustitución del OH, más fuerte es la actividad atrapadora de radicales de un flavonoide. Características adicionales en la estructura, tales como un grupo catecol o un pirogalol en el anillo C, parece que eleva la actividad neutralizadora de los radicales libres. Debido a sus características estructurales, estos flavonoides poseen un potencial oxidativo bajo que les permite reducir los iones Fe3+ y Cu2+, de sufrir la autooxidación o incluso de encontrarse implicados en ciclos redox. Por tanto, los flavonoides pueden actuar como pro-oxidantes, una característica que contrarresta sus propiedades antioxidantes, la cual es posiblemente responsable de los efectos genotóxicos que se han descrito para algunos flavonoides analizados en sistemas experimentales. Cuanto menor es la reactividad del radical libre, mayor y más importantes son los requerimientos estructurales descritos con anterioridad, para que un flavonoide actúe como un agente efectivo atrapador de radicales. Los flavonoides reaccionan con los radicales hidroxilo sólo con débiles diferencias respecto a las constantes de velocidad, entre 109 a 1010 M-1 sec-1, mientras las constantes de velocidad para la reacción con anión superóxido varía entre 102 y 106 M-1 sec-1. Los flavonoides con un doble enlace C2 - C3 pueden reaccionar con 1O2 para formar el respectivo intermediario dioxetano, el cual se puede descomponer en dos fragmentos carbonilados. Existen también evidencias de que los flavonoides pueden atrapar el HOCl. El flavonoide silibinina no sólo atrapa el HOCl sino que además protege la α1-proteinasa uno de los supuestos objetivos de HOCl, frente a la inactivación oxidativa de HOCl.

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3.3. Otros antioxidantes Zinc. Es un elemento químico esencial, a veces clasificado como metal de

transición aunque estrictamente no lo sea, que presenta cierto parecido con el magnesio y el berilio y con los elementos de su grupo. Prácticamente el único estado de oxidación que presenta es el +2. Reacciona con ácidos no oxidantes pasando al estado de oxidación +2 y liberando hidrógeno y puede disolverse en bases y ácido acético.

El zinc se encuentra en diversos alimentos como las ostras, carnes rojas,

aves de corral, algunos pescados y mariscos, habas y nueces. La ingesta diaria recomendada ronda los 10 mg. La deficiencia de zinc produce retardo en el crecimiento, pérdida del cabello, diarrea, impotencia, lesiones oculares y de piel, pérdida de apetito, pérdida de peso, tardanza en la cicatrización de las heridas y anomalías en el sentido del olfato. Las causas que pueden provocar una deficiencia de zinc son la deficiente ingesta y la mala absorción del mineral caso de alcoholismo que favorece su eliminación o dietas vegetarianas en las que la absorción de zinc es un 50% menor por su excesiva eliminación.

Cobre. Este elemento participa en la formación de enzimas, proteínas y

neurotransmisores cerebrales, y facilita la síntesis del colágeno y la elastina necesarios para el buen estado de los vasos sanguíneos, los cartílagos, los pulmones y la piel.

El 90% del cobre en el organismo se encuentra en músculos, huesos e

hígado. Participa en la formación de la hemoglobina, y es fundamental para el desarrollo y mantenimiento de huesos, tendones, tejido conectivo y el sistema vascular. El cobre esta presente en el hígado, riñón, mollejas y otras vísceras, en carnes, cereales integrales, frutas secas y legumbres. Es raro ver excesos de cobre, pero estos pueden producir hepatitis, mal funcionamiento de riñones y desórdenes neurológicos. Una dificultad metabólica determinada genéticamente que se caracteriza por aumentar los depósitos de cobre en hígado y cerebro es la enfermedad de Wilson.

La carencia de cobre en el organismo es anormal en personas que llevan

una alimentación adecuada. Sin embargo las formas en que se puede manifestar la ausencia de cobre en el organismo es por anemias moderadas a severas, edemas, desmineralización ósea, retraso del crecimiento, anorexia y vulnerabilidad a infecciones. Las necesidades diarias son de aproximadamente de 2 mg.

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Selenio. Es un oligoelemento cuya actividad antioxidante se relaciona directamente por su intervención en la actividad de la glutation peroxidasa. El selenio se encuentra en: coles de Bruselas, brécol, cereales integrales, cítricos, rábano, alfalfa, levadura de cerveza revivificada, cereales, algas marinas, ajos, cebollas, puerros, champiñón, germen de trigo, hígado de ternera, marisco.

Existen estudios que indican que en zonas donde hay carencia de este

mineral aparecen anormalidades en la población tales como: envejecimiento prematuro, encanecimiento del cabello, problemas cardiovasculares, arteriosclerosis, enfermedades degenerativas, cáncer, artritis reumatoide, artrosis, gota, osteoporosis, Infertilidad femenina o masculina, cirrosis hepática, prostatitis crónica, impotencia, frigidez, infecciones graves como el SIDA, alteraciones inmunológicas, acné, micosis. Los requerimientos son 50-75 μgramos por día. Una dieta equilibrada, satisface las necesidades cotidianas de selenio.

Magnesio. Es un elemento esencial por intervenir en más de 300

reacciones enzimáticas. Participa en el metabolismo y en la síntesis de numerosos productos orgánicos. Se establece como aceptable un rango de ingesta para la población adulta sana de 150 a 500 mg/día. El magnesio se encuentra principalmente entre los frutos secos: girasol, sésamo, almendras, pistacho, avellanas y nueces. Entre los cereales: germen de trigo, levadura, mijo, arroz y trigo, carnes, lácteos y frutas, legumbres.

Este elemento es componente del sistema óseo, participa en la transmisión

de los impulsos nerviosos, en la contracción y relajación muscular, en el transporte de oxígeno a nivel tisular y en el metabolismo energético. Un déficit de magnesio origina excitación nerviosa y muscular (calambre muscular), latidos cardiacos irregulares, reducción de la presión sanguínea, etc. Los músculos y en particular el corazón, no funcionan correctamente si no contienen suficiente magnesio. Además, este elemento es necesario para la transferencia y la liberación de energía. El esfuerzo genera una pérdida de magnesio, y la falta del mismo conduce a una reducción de la resistencia y de adaptación al esfuerzo. Por todo ello, es fundamental valorar la disponibilidad de magnesio en la dieta del deportista.

Una dieta que aporte menos de 2000 calorías provoca insuficiencia de

magnesio en el organismo. La ingesta diaria de magnesio debe estar entre los 300 y 350 mg./día para los hombres, 280 mg/día para las mujeres y entre 320 a 350 mg/día para las embarazadas.

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Proteínas del estrés. El estrés oxidativo tiene lugar como consecuencia de

una generación elevada de ROS. Pueden detectarse elevaciones de estas ROS en células expuestas a diversos estímulos, como luz UV, presencia de citoquinas inflamatorias (TNFα, IL1), etc. Las ROS, además de su papel citotóxico cuando su producción es excesiva, a concentraciones moderadas actúan como segundos mensajeros en diferentes mecanismos de transducción de señales, como son aquellos mediados por la activación del NFκB.

Las células que producen elevadas cantidades de ROS se exponen a su

propia toxicidad y deben contar con mecanismos defensivos para hacer frente a la agresión oxidativa. Puede que las HSP sirvan para tal función y representen una clase original de proteínas con capacidad antioxidante. La posibilidad de que las HSP formen parte de los mecanismos de defensa frente al estrés oxidativo, viene avalada por una serie de observaciones que ha llevado a sugerir que las ROS actúan como moduladores o segundos mensajeros en la respuesta al estrés.

Se ha observado que las células o los tejidos sometidos a estrés oxidativo

inducen la síntesis in vivo e in vitro de las HSP. Así, el peróxido de hidrógeno es capaz de inducir una respuesta al estrés en células humanas in vitro, mientras que el daño por isquemia-reperfusión induce la síntesis de las HSP in vivo. La isquemia se asocia con una disminución de los niveles de ATP por desacoplamiento de la fosforilación oxidativa, que da lugar a la acumulación de xantina e hipoxantina. Estos sustratos se metabolizan normalmente por acción de la xantina deshidrogenasa, pero durante la isquemia y en presencia de calcio, este enzima actúa como xantina oxidasa. En casos de isquemia/reperfusión, la xantina se metaboliza vía xantina oxidasa, y da lugar a grandes cantidades de radical superóxido. El exceso de estos radicales de oxígeno son la causa de la inducción de las HSP en el órgano isquémico. Se ha observado que los roedores y conejos sometidos a una hipertermia causante de la elevación de HSP en corazón, sufren menor daño miocárdico cuando se someten a un episodio de isquemia/reperfusión.

Otros argumentos en favor del papel protector de las HSP frente al daño

oxidativo son:

- protección parcial por un choque térmico de la muerte celular inducida por H2O2 en una línea premonocítica humana U937 y de la muerte celular inducida por oligomicina en células DS7;

Capítulo 3

101

- protección por un choque térmico de la estimulación con glutamato en un modelo usado in vitro para conseguir un daño isquémico en células neuronales;

- protección de una hipertermia frente al daño inducido por la exposición a la luz (mediado por oxidación) en retina de rata; así como también

- identificación de una proteína de 32 kDa, la hemooxigenasa, específica de la oxidación del grupo hemo, como un enzima con propiedades antioxidantes.

El choque térmico previene las alteraciones en el potencial de membrana, en la masa y en la ultraestructura inducidas en la mitocondria por el H2O2. Esto parece indicar que este orgánulo representa una diana selectiva para la protección, por choque térmico, frente al daño oxidativo. También se ha demostrado que tras un choque térmico, la HSP70 se traslada al núcleo acumulándose transitoriamente en el nucleolo. Por el contrario, cuando lo que se adiciona es H2O2, la traslocación nuclear es diferente y puede relacionarse con el daño al DNA por radicales de oxígeno.

El papel que las HSP puedan jugar como atrapadores (scavengers) de las

especies reactivas de oxígeno, puede ser importante en aquellas condiciones en las que los clásicos sistemas antioxidantes, superóxido dismutasa, glutation peroxidasa, catalasa, vitamina E, etc., sean insuficientes. Por ejemplo, la disminución de la concentración intracelular de glutation potencia la inducción de las HSP. La iodoacetamida es un típico agente alquilante citotóxico que reacciona con los grupos sulfhidrilo de las proteínas para formar aductos S-acetamido tioeter. Aunque la formación de aductos se asocia con la síntesis de las HSP y la muerte celular, la unión covalente de la iodoacetamida no causa la muerte celular directamente, sino que ésta va unida a una disminución del glutation, estrés oxidativo y peroxidación lipídica. Usando este compuesto se ha observado que la perturbación en el estado redox tiólico puede ser una señal importante para la activación de la respuesta al estrés común a aquellos tóxicos que forman intermediarios reactivos. La pérdida de GSH favorece la oxidación de los grupos tiólicos de las proteínas por formación de puentes disulfuro, proteina-S-S-proteínas o proteína S-SG. Esta mezcla de proteínas oxidadas parece que se encuentra involucrada en la activación del HSF1 y en el aumento de la transcripción de los genes hsp. Por otro lado, la protección que las HSP ejercen sobre la citotoxicidad inducida por TNFα, parece también estar en relación con su capacidad de mantener la concentración intracelular del glutation.

Capítulo 3

102

Por tanto, los mecanismos de protección de las HSP podrían incluir:

- prevención de la degradación de proteínas y de la peroxidación lipídica de las membranas,

- mantenimiento de los niveles de ATP, - inducción de los enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa

o de moléculas como el glutation, e - inhibición de cualquiera de los múltiples pasos involucrados en la

muerte celular inducida por un daño oxidativo como puede ser el desacoplamiento de la fosforilación oxidativa, activación de la fosfolipasa A2 y el mantenimiento de la ultraestructura celular.

A pesar de que las ROS se consideran como segundos mensajeros ubicuos

en la inducción de las HSP, se ha investigado la implicación de estas especies endógenas sobre la síntesis de las HSP. La fagocitosis a través de la activación de la NADPH oxidasa que genera cantidades masivas de O2

.-, ha servido de modelo para estudiar en monocitos de sangre periférica la inducción de las HSP. Los resultados obtenidos sugieren que no es la producción de O2

.- la responsable directa de la inducción de las HSP durante la fagocitosis, sino el radical hidroxilo resultante de la transformación del radical superóxido en ·OH en presencia de hierro. Sólo el ·OH tiene capacidad de oxidar las proteínas de forma similar a la la agresión térmica, siendo la presencia de proteinas alteradas la señal última para la inducción de las HSP. Existe una diferente inducción de la expresión según que el estímulo sea la agresión térmica o la activación de la proteína quinasa C (PKC) por el éster de forbol, PMA. En el primer caso se inducen todas las HSP clásicas, HSP 110, HSP 90, HSP 70, HSC 70, HSP 65 etc., y en el segundo se induce la HSP 90 y en menor grado la mezcla HSC 70 y HSP 70. Esto es consecuencia de la implicación de dos segundos mensajeros distintos y diferentes mecanismos de regulación molecular de la expresión de las HSP. La regulación de la inducción de las HSP por la agresión térmica implica principalmente acontecimientos transcripcionales, mientras que la inducción de las HSP mediada por el PMA (mitógenos) se verifica por un mecanismo post-transcripcional que estabiliza el mRNA.

Se han detectado pequeñas HSP en mitocondrias de células PC12 de ratas

estresadas por calor, las cuales no aparecen en controles sin el tratamiento térmico. La inactivación funcional de estas pequeñas HSP con anticuerpo murino HSP25, ha indicado que estas HSP protegen la NADH: ubiquinona oxidoreductasa y la NADH deshidrogena (complejo I) en vesículas submitocondriales durante el estrés oxidativo y choque térmico. Estos datos son

Capítulo 3

103

de gran interés ya que:

- confirman la existencia de múltiples HSP de pequeño tamaño en mamíferos e indican que varias de ellas se hallan asociadas a las mitocondrias,

- muestran la existencia de una función conservada entre las HSP mitocondriales de plantas y mamíferos, que protegen el transporte electrónico durante el estrés, y

- sugieren que estas HSP pueden jugar un papel importante en enfermedades cuya etiología se basa en el daño oxidativo al complejo I mitocondrial.

Otra defensa antioxidante muy efectiva, es la restricción calórica de la

ingesta, ya que el menor consumo de alimentos va a proporcionar un menor número de electrones, que tienen que ser procesados por la mitocondria a través de la cadena de transporte electrónico. El descenso programado de la dieta al aminorar la generación de especies reactivas de oxígeno por la mitocondria, se presenta como uno de los medios antioxidantes más efectivos que aseguran una buena salud e incluso prolongan la vida. Existen evidencias que demuestran el efecto de esta restricción sobre animales de experimentación. En todos ellos se ha observado una progresión más lenta del envejecimiento, un retraso en la aparición de los efectos no deseables y un aumento de la esperanza de vida.

4. Acción sinérgica de antioxidantes: Vitaminas C y E.

Se ha sospechado desde hace tiempo, y se comentó anteriormente, que los

sistemas de defensa antioxidante son más efectivos cuando varios de ellos actúan concertadamente. Ya en el año 1940 se vislumbró que el ácido ascórbico, que por sí sólo es un antioxidante moderadamente efectivo, actuaba sinérgicamente con la vitamina E para intensificar la actividad antioxidante de la última. Se observó entonces, que la vitamina C disminuía el consumo de vitamina E a modo de efecto economizador. El conocimiento de las características peculiares y las diferencias entre las vitaminas C y E informa sobre las propiedades básicas y del modo de actuación de estas vitaminas antioxidantes. Considerando que en tejidos la concentración de vitamina C es considerablemente más alta que la de vitamina E (unas cien veces en hígado), se ha propuesto que el mecanismo responsable de la acción economizadora del ácido ascórbico (A) sobre la vitamina E se encuentra unida a la capacidad del ácido ascórbico para reducir los radicales tocoferilos formados cuando la

Capítulo 3

104

vitamina E reacciona con un radical libre: ROO· + Vitamina E ROOH + Vitamina E· Vitamina E· + AH- Vitamina E + A· Una serie de estudios se han ocupado de la significación y las ventajas

fisiológicas de este sinergismo. Sin embargo, los resultados no han sido totalmente consistentes. Experimentos in vitro indican que el anión ascorbato reduce una serie de radicales fenoxilo en medio acuoso a través de un proceso de transferencia electrónica. Estudios de resonancia electrónica han establecido que el ascorbato reduce el radical tocoferoxilo. La confirmación de estos datos se verificó cuando las dos vitaminas actuaron disminuyendo la formación de malondialdehido al suprimir la peroxidación lipídica en microsomas hepáticos en los que se había inducido dicha peroxidación en presencia de Fe 2+. El modo de interacción entre estas dos vitaminas ha sido dificil de explorar dada la diferencia en sus propiedades. La vitamina E es lipofílica, mientras que que la vitamina C es hidrofílica. La separación de fases y las distribuciones de estos dos antioxidantes juegan probablemente un papel en su acción cooperativa. La caracterización de estas propiedades físicas parece ser un camino largo para elucidar, in vivo, el grado de acción cooperativa entre los dos vitaminas. Utilizando varios sistemas, por ejemplo liposomas y radicales lipofílicos e hidrofílicos, han podido realizarse estos experimentos. La oxidación de metil linoleato en un medio orgánico, por generadores de radicales lipofílicos, puede utilizarse para probar tales interacciones, porque en este sistema se generan hidroperóxidos sin período de inducción. Ambas vitaminas C y E, por separado, son capaces de neutralizar radicales libres con este sistema. Sin embargo, cuando ambas vitaminas estuvieron presentes, la desaparición de la vitamina C ocurrió primero, y los cambios en la concentración de vitamina E no se observaron hasta que la mayor parte de la vitamina C había sido consumida. Este efecto economizador de la vitamina C hacia la E se demostró cuando la adición posterior de más cantidad de vitamina C inhibió la desaparición de la vitamina E.

Usando una preparación liposómica de fosfolípidos poliinsaturados, se

demostró también que la cooperación entre ambas vitaminas suprimía la peroxidación lipídica de las membranas. Como era de esperar de la liposolubilidad de la vitamina E, se observó que la vitamina E es mejor antioxidante frente a un sistema de membrana que la vitamina C. El sinergismo entre las dos vitaminas es también evidente en ciertos estados de toxicidad. Por

Capítulo 3

105

ejemplo, durante la formación de compuestos N-nitrosos carcinogénicos, la inhibición de la nitrosación a partir del nitrito, por la vitamina C se verificó en la fase acuosa, pero el nitrito puede fácilmente difundirse en la fase lipídica donde se convierte en nitrosato, amina o amidas. En esta situación, la vitamina C podría promover la nitrosación en lugar de inhibirla. Como la vitamina E puede perfectamente suprimir el proceso de nitrosación en la fase lipídica, la acción cooperativa entre estas dos vitaminas ofrece la más efectiva inhibición de la formación de compuestos N-nitrosos en una mezcla heterogénea de fases acuosa y lipídica. La acción economizadora de la vitamina C frente a la E ocurre también in vivo. En dos grupos de cobayas alimentados con diferentes cantidades de vitamina C, se encontró una concentración más elevada de vitamina E en los animales alimentados con la cantidad más elevada de vitamina C.

5. Mecanismo de acción de los antioxidantes

Efectos sobre procesos iniciados por un radical Los procesos biológicos en los cuales se encuentran involucrados los

radicales libres son corrientes y el más fácil de comprender es la iniciación de la peroxidación lipídica a partir de ácidos grasos poliinsaturados. Casi todos los fluídos biológicos contienen esta clase de ácidos grasos en los ésteres del colesterol, triacilgliceroles y fosfolípidos, o incluso como ácidos grasos libres, por lo tanto, la peroxidación lipídica iniciada por radicales libres supone una cascada de reacciones muy común entre los seres vivos. En defensa de estas reacciones ha surgido una amplia variedad de antioxidantes para contrarrestar la acción de aquellos factores que causan la peroxidación lipídica (Figura 10).

(1) Iniciación: Es la primera etapa en el proceso de peroxidación lipídica a

partir de un ácido graso poliinsaturado (LH) cuando es agredido por una especie radical (R·) capaz de sustraer uno de los átomos de hidrógeno del átomo de carbono entre dos dobles enlaces. Una amplia variedad de radicales libres, como el radical hidroxilo (OH·), el peroxilo (LOO·), el alcoxilo (LO·) o el alquilo (L·), pueden desencadenar la reacción de iniciación. Cualquier compuesto que sea capaz de reaccionar con estos radicales iniciadores sin generar otra especie reactiva puede ser considerado como un antioxidante que inhibe la iniciación.

(2) Propagación: El producto de la agresión de un radical sobre un ácido

graso poliinsaturado (LH), es un radical alquilo (L·) que puede reaccionar muy

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106

rápidamente con el oxígeno molecular para formar el radical peroxilo (LOO·). El radical peroxilo puede entonces sustraer un átomo de hidrógeno de un ácido graso insaturado, formándose un radical alquilo (L·) y un peróxido (LOOH). Cualquier agente que disminuya la concentración local de oxígeno y disminuye la formación de radicales peroxilo en la peroxidación lipídica, actuará como antioxidante. Por ejemplo, un agente reductor.

(3) Iniciación con oxígeno singlete: El oxígeno singlete (1O2), especie de

oxígeno excitada electrónicamente, puede iniciar la oxidación lipídica de lípidos poliinsaturdos, y a ello se debe su toxicidad. Aunque los efectos del oxígeno singlete se limitan generalmente a reacciones fotosensibilizadas, esta especie de oxígeno puede ser generada por los eosinófilos o a partir de la reacción del ozono con material biológico. Por ello, que este oxidante pueda jugar un papel más amplio de lo que originalmente se pensó. Los carotenoides (CAR) son excelentes eliminadores del oxígeno singlete, en tanto en cuanto reaccionan a una velocidad controlada de difusión sin ser consumidos en el proceso:

1O2 + CAR 3O2 (estado basal del oxígeno) + 3CAR 3CAR CAR + calor _____________________________________________ suma: 1O2 3O2 + calor Los carotenoides no sólo neutralizan el oxígeno singlete sino que también

pueden, como se comentó anteriormente, reaccionar directamente con radicales implicados en la peroxidación lipídica.

(4) Reiniciación: Una de las vías más comunes para iniciar la peroxidación

lipídica es por medio de la rotura catalizada por metales de los peróxidos ya presentes en el sistema. Los metales de transición, tanto los oxidados como los reducidos, tales como el hierro y el cobre, pueden catalizar la descomposición de peróxidos para formar radicales alcoxilo (LO·), alquilo (L·) o peroxilo (LOO·). Todas estas especies pueden iniciar el proceso peroxidativo como se describió en (1). En estas circunstancias, cualquier compuesto o proceso que disminuya la concentración de hierro o cobre libres en los sistemas biológicos actuará inhibiendo la reiniciación. Por ejemplo, proteínas que se unen a metales, ferredoxina y ceruloplasmina.

(5) Eliminación del producto: Las reacciones de reiniciación pueden

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también prevenirse si se elimina el peróxido (LOOH), el producto de las primeras tres etapas de la peroxidación lipídica. Como ya se mencionó anteriormente, este proceso implica el uso de las peroxidasas seleno dependientes, que catalizan la reducción del peróxido al correspondiente alcohol (LOH). Aunque la glutation peroxidasa se ha considerado que era el primer enzima encargado de este proceso, se ha caracterizado una seleno peroxidasa, glutation peroxidasa fosfolípido hidroperóxido, que puede reaccionar directamente con los fosfolípidos hidroperóxidos de las membranas.

Figura 10. Etapas de la peroxidación lipídica

(6) Terminación: Los compuestos que reaccionan con la cadena que propaga los radicales libres, tales como los radicales peroxilos o los alcoxilos, y dan por resultado la formación de especies que no son capaces de sustraer hidrógeno de otras moléculas, son considerados antioxidantes que rompen la cadena. Una variedad de compuestos, como fenoles, aminas aromáticas y polienos conjugados, pueden funcionar rompiendo la cadena de lipoperoxidación. El α-tocoferol, se ha propuesto como el más importante agente liposoluble antioxidante que actúa rompiendo la cadena lipoperoxidativa en plasma humano. Otros compuestos, como los carotenoides, ubiquinol y

Capítulo 3

108

bilirubina poseen también esta propiedad. Se ha sugerido que el ubiquinol 10 protege las lipoproteínas de baja densidad humanas con más efectividad que el α-tocoferol.

6. Causas del envejecimiento

Una célula típica de rata, como el hepatocito, puede sufrir en su DNA unas

105 agresiones por día con las especies reactivas de oxígeno. La presencia de los productos resultantes de las interacciones de estas especies reactivas con las macromoléculas celulares ha llevado al convencimiento de que las defensas antioxidantes no son totalmente eficientes, que las células se encuentran sometidas a situaciones crónicas de estrés oxidativo y que el envejecimiento es una consecuencia de la acumulación del daño oxidativo. De todo lo anterior se deduce que la hipótesis oxidativa del envejecimiento se basa en el progresivo e irreversible incremento de la lesión oxidativa molecular.

La velocidad de generación de especies reactivas de oxígeno in vivo, se

evalúa mediante técnicas de citometría de flujo. Con estos medios experimentales se ha observado en hígado de ratas, que el estado de los pares redox tienden hacia valores más oxidados a medida que transcurre la edad, así como los niveles de peroxidación de lípidos y de oxidación de proteínas. El estrés oxidativo se detecta por el incremento exponencial de la carbonilación de las proteínas, pérdida de sus grupos SH, pérdida del glutation, elevación de la concentración de productos que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico y por la pérdida de la actividad catalítica de determinados enzimas. La concentración de 8-hidroxiguanosina, un indicador del daño oxidativo al DNA, experimenta un progresivo incremento durante el envejecimiento. De tales estudios se deduce que el daño oxidativo molecular es ubicuo, sustancial y se eleva exponencialmente con la edad.

7. Perspectivas y Conclusiones Es evidente que una serie de factores genéticos y ambientales determinan

el envejecimiento y la longevidad. La manipulación de estos factores puede alterar la expectativa de vida y el fenotipo senescente. Existen amplias evidencias que demuestran que una mayor resistencia al estrés oxidativo conduce a una mayor longevidad. La modificaciones de los factores ambientales adversos, tales como evitar la exposición a carcinógenos exógenos (radiaciones UV o ionizantes, agentes químicos, etc), la restricción dietética

Capítulo 3

109

y/o la ingesta de alimentos con alto contenido de antioxidantes, pueden elevar la longevidad al disminuir situaciones de estrés oxidativo. Además la identificación y modulación de la actividad de genes de longevidad y de aquellos implicados en la reparación del DNA puede ayudar a elevar la expectativa de vida en los humanos. Es posible que algunas enfermedades relacionadas con el envejecimiento, debidas a la pérdida de la capacidad proliferativa celular, pudieran ser prevenidas por restauración de la actividad telomerasa. Finalmente, la activación de la capacidad reparadora del DNA ha de proporcionar otra estrategia, que unida a las otras, proporcione un medio de prevenir las enfermedades degenerativas asociadas a la edad.

8. Abreviaturas CAT, catalasa; DFO, desferroxamina; G6P, glucosa-6-fosfato; G6PDH,

glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; GPX, glutation peroxidasa; GRED, glutation reductasa; GSH, glutation reducido; GSSG, glutation oxidado; GST, glutation transferasa; H2O2, peróxido de hidrógeno; L·, radical alquilo LO·, radical alcoxilo; LOO·, radical peroxilo; NAC, N-acetil cisteína; NADP+, nicotinamida adenin dinucleótido fosfato (oxidado); NADPH, nicotinamida adenin dinucleótido fosfato (reducido); O2

.-, radical superóxido; ·OH, radical hidroxilo; 6PG, 6-fosfogluconato; Q, ubiquinona; QH2, ubiquinol; ROS, especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxygen Species); SOD, superóxido dismutasa; SQH, semiubiquinol·.

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Capítulo 3

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Capítulo 4. TELÓMEROS Y TELOMERASA

1. Introducción. 2. Estructura de los telómeros. 3. Mecanismos de alargamiento de los telómeros 4. Senescencia replicativa y acortamiento de telómeros. 5. Telomerasa y cáncer. 6. Senescencia y cáncer 7. Regulación epigenética de telómeros de mamíferos 8. Recientes aportes al rejuvenecimiento. 9. Acortamiento de telómeros y patologías relacionadas 10. Conclusiones. 11. Abreviaturas 12. Bibliografía

1. Introducción El acortamiento de los telómeros y las alteraciones en el equilibrio redox

se han relacionado con los procesos que conducen al envejecimiento y al cáncer. El daño oxidativo, como factor medioambiental se eleva exponencialmente con la edad contribuyendo a la patogénesis de enfermedades tales como el cáncer, hipertensión, diabetes, aterosclerosis etc. Por otro lado, el envejecimiento es también un fenómeno programado genéticamente, ya que la longevidad máxima es una característica de cada especie. En este aspecto, se posee suficiente evidencia que demuestra que la pérdida de la integridad de los telómeros es un importante factor en el declinar de las funciones fisiológicas asociadas al envejecimiento y también que telómeros y telomerasa se encuentran implicados en los mecanismos que conducen al cáncer.

Los telómeros son complejos especializados de DNA-proteína que se

encuentran en los extremos de los cromosomas lineales y los protege de la degradación y pérdida de genes esenciales. Los telómeros consisten en repeticiones de nucleótidos en número variable, unidas a un complejo multiproteico denominado shelterina/telosoma. La replicación de los telómeros presenta un dilema especial denominado “problema de la replicación terminal”. En el proceso de la división celular, los telómeros de las células somáticas normales no pueden replicarse en su totalidad por el complejo convencional DNA polimerasa y esto se debe a la diferencia en la replicación de las dos cadenas del DNA. Para solucionar este problema la

Capítulo 4

115

mayoría de las células eucariotas utilizan la telomerasa, una ribonucleoproteína retrotranscriptasa, que actúa alargando los extremos de los cromosomas con una secuencia telomérica específica, utilizando como molde una porción de su propio componente integral RNA.

En la mayoría de las células somáticas derivadas de tejidos normales, la

pérdida de la capacidad replicativa, que conlleva a la senescencia celular, se debe al acortamiento de los telómeros asociado con la ausencia de actividad telomerasa. Los telómeros y la telomerasa presentan un gran interés a la hora de encontrar explicación, no sólo a los cambios relacionados con el envejecimiento, sino también a los relativos a la tumorigénesis. Son numerosas las alteraciones en la expresión genética que afectan la diferente capacidad de las células para dividirse y que se encuentran implicadas en los mecanismos que conducen, tanto al envejecimiento como al cáncer. A nivel celular, la senescencia se ha utilizado como modelo de envejecimiento, por tanto, el conocimiento de la senescencia celular tiene importantes implicaciones en la salud. Observaciones iniciales sugirieron que la senescencia celular era el resultado del acortamiento de los telómeros, pero hallazgos más recientes apuntan que la senescencia celular está desencadenada por lesión al DNA. De hecho, tanto el acortamiento de los telómeros como la lesión al DNA comparten un mecanismo común y es la vía de respuesta al daño al DNA.

Las repeticiones teloméricas se generan por una transcriptasa inversa

denominada telomerasa o TERT (telomerase reverse transcriptase). TERT reconoce el terminal 3′-OH en el extremo de los cromosomas y añade repeticiones TTAGGG de novo utilizando una molécula de RNA como molde (template) o TERC (telomerase RNA component). Mientras que los eucariotas unicelulares tienen cantidades ilimitadas de telomerasa y mantienen los telómeros en una longitud constante, la mayoría de los organismos multicelulares poseen cantidades limitadas telomerasa y el acortamiento de los telómeros se verifica acoplado a la división celular, debido a la incapacidad de las DNA polimerasas normales a copiar los extremos terminales de los cromosomas. El acortamiento de los telómeros puede acelerarse por acción de nucleasas y ciertos agentes que lesionan al DNA. El acortamiento de los telómeros se observa en todos los tejidos humanos a medida que transcurre la edad. Esto refleja el acumulo de divisiones celulares que se asocia a la renovación tisular. El acortamiento de los telómeros, además, es uno de los mecanismos mejor conocidos, que impone un límite al crecimiento de células normales en cultivo, fenómeno

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que se denomina senescencia replicativa. Una serie de patologías relacionadas con el envejecimiento y con síndromes de envejecimiento prematuro se caracterizan por un acortamiento rápido de los telómeros, lo que sugiere que dicho acortamiento de los telómeros es la causa del envejecimiento del organismo. Resultados obtenidos a partir del modelo de ratón deficiente en Terc, demuestran un acortamiento telomérico acelerado y una expectativa de vida más corta, que se agrava en sucesivas generaciones hasta que la infertilidad de los machos no permite más generaciones.

Por una parte, el acortamiento de los telómeros puede promover el

envejecimiento al inducir la apoptosis y la parada del ciclo celular in vivo, lo que conlleva a la pérdida celular, a la disfunción tisular y a la alteración de la capacidad regenerativa de las células madre.

El interés por los telómeros, relativo a los procesos de senescencia e

inmortalidad, se basa en que el envejecimiento supone la pérdida de la capacidad replicativa celular, mientras que la inmortalidad supone la ganancia de un potencial replicativo ilimitado. La importancia de la relación entre envejecimiento e inmortalidad se encuentra reforzada por el hecho que una elevada proporción de células tumorales expresan actividad telomerasa, mientras que la mayor parte de células somáticas normales muestran una ausencia casi total de esta actividad. El que la actividad telomerasa se considere una de las características de las células tumorales, hace de este enzima un potencial objetivo terapéutico y de diagnóstico.

2. Estructura de los telómeros Los telómeros de eucariotas son secuencias hexaméricas repetidas de

DNA, potencialmente expansionables y no codificables. Aparecen en el extremo de los cromosomas lineales y son esenciales para el mantenimiento de la estabilidad cromosómica, que van unidos a un complejo multiproteico especializado conocido con el nombre shelterina/telosoma que ejerce un papel fundamental en la regulación de la longitud telomérica y en su protección. Consisten los telómeros en secuencias repetitivas ricas en guanina (G) que se desarrollan en dirección 5´ 3´, en el extremo de los cromosomas, con la cadena complementaria, rica en citidina (C). Las secuencias teloméricas pueden variar entre las especies, pero cada organismo posee la misma secuencia repetitiva en todos sus telómeros. En humanos y en ratón dicha secuencia es TTAGGG. En el momento del nacimiento, los telómeros de las células somáticas humanas contienen unas 15 kb del

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fragmento TTAGGG y los ratones tienen de 25 a 40 kb. En cada división celular se pierden de 25 a 200 bases de los extremos teloméricos. Cuando este acortamiento ocurre entre 80 a 100 veces, la célula deja de dividirse y envejece.

Los telómeros humanos poseen longitud variable según las diferentes

células. Por ejemplo, la de las células germinales fluctúa entre 10 y 15 kb, mientras que la de los leucocitos de sangre periférica fluctúa entre 5 y 12 kb. El mantenimiento de la longitud de los telómeros supone un problema en el mecanismo de replicación celular, porque la síntesis de la cadena conductora de la célula hija llega hasta el final del extremo 5´ de la cadena del DNA de la célula madre, mientras que la síntesis de la cadena rezagada, al ser discontinua, no puede replicarse hasta el final. El problema de la replicación terminal, descubierto por Watson en 1972, se debe a que el mecanismo de replicación del DNA en los cromosomas lineales es diferente para cada una de las dos cadenas y es esto lo que ocasiona el acortamiento telomérico.

Los telómeros de los vertebrados terminan en una cadena 3′ que

sobresale, rica en guanina que se genera por el proceso post replicativo de la cadena rica en citosina y que es el sustrato para la elongación telomérica mediada por la telomerasa (Figura 1). La cadena G sobresaliente puede doblarse e invadir la región de doble cadena del telómero y generar una estructura de bucle conocida como bucle-T (T-loop), que esconde el extremo 3′ de la telomerasa y de las actividades de reparación y degradación del DNA. Los bucles T representan un mecanismo primitivo para protección del telómero. Además, el hecho de que parezcan intermediarios de recombinación homóloga sugiere que pueden ser regulados por actividades implicadas en esta vía de reparación del DNA.

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Figura 1. Estructura de los telómeros. Los telómeros de mamíferos consisten en

repeticiones de la secuencia de nucleótidos TTAGGG que está unida al complejo proteíco shelterina/telosoma. Adyacentes a los telómeros están las regions subteloméricas, que son también ricas en DNA repetitivo (Blasco 2007, modificado).

Las repeticiones teloméricas están unidas al complejo multiproteico

shelterina/telosoma (Figura 1) que contiene factores que se unen directamente a la cadena G sencilla que sobresale, como el heterodímero de protección de los telómeros Pot1/TTP, y a la región telomérica de doble cadena, como los factores de unión a las repeticiones teloméricas TRF1 y TRF2 y sus proteínas que interaccionan Rap1 (proteína represora activadora 1) y Tin2 (proteína 2 nuclear que interacciona con TRF1). El TRF1 también reune en los telómeros las poli(ADP) ribosilasas TANK1 y TANK2 o tanquirasas. Se ha propuesto que las TRF1 y las proteínas que interaccionan con TRF1 regulan la longitud telomérica mediante el control del acceso de la telomerasa al telómero. TRF2 y Pot1 son también importantes para la regulación de la longitud del telómero y tienen papeles adicionales en la protección del telómero, por prevenir las fusiones entre los extremos cromosómicos. El papel del TRF2 en la protección del telómero puede relacionarse con la señalización del daño al DNA y factores de reparación.

El TRF2 puede interaccionar con componentes del complejo Mre11, que

es importante en la unión de terminaciones no homólogas (NHEJ) y en la recombinación homóloga. También se ha demostrado que TRF2 interacciona con la nucleasa XPF-ERCC1 de la reparación por escisión de nucleótidos, la

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nucleasa Apolo y el factor de señalización del DNA. Además el TRF2 se ha propuesto que se une a ATM y cancela la respuesta desencadenada por ATP a la lesión al DNA, lo que sugiere que TRF2 tiene un papel que previene una respuesta al daño al DNA en los telómeros. Un papel similar ha sido propuesto para Pot1 basado en el hecho de que ratones deficientes en Pot1 muestran una elevada señalización al daño al DNA en los telómeros. Componentes del NHEJ (Ku80 y DNA-PKC) y de la recombinación homóloga (vías Rad51D, Rad54, XRCC3) se ha demostrado que también tienen papeles en la regulación de la longitud telomérica

Figura 2. Además de la shelterina, los telómeros de mamíferos contienen también

nucleosomas que muestran modificaciones en las histonas que son características de los dominios de heterocromatina. Además el DNA subtelomérico está fuertemente metilado. Estas modificaciones en la cromatina en los telómeros y subtelómeros regulan negativamente la longitud telomérica y la recombinación de los telómeros. TriM, trimetil; Dnamt, DNA metiltransferasas. ( Blasco 2007, modificado)

Además del complejo shelterina, los telómeros y subtelómeros están

unidos a nucleosomas que están enriquecidos en modificaciones de histonas, características de dominios constitutivos de heterocromatina (Figura 2). Las modificaciones de las histonas incluyen la trimetilación de H3K9 H4K20 por las histona metiltransferasas supresoras de la variegación de los homólogos 3-9 (Suv3-9h1 y h2) y supresoras de la variegación de homólogos 4-20 (Suv4-20h1 y h2), respectivamente. Además, las proteínas heterocromatínicas HP1β, HP1γ y HP1α se unen también a los dominios teloméricos y subteloméricos mediante su afinidad por residuos trimetilados H3K9 (Figura 2). Estas marcas epigenéticas son características de dominios de heterocromatina compacta y transcripcionalmente silente, tales como las

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encontradas en la heterocromatina pericéntrica. Además, las regiones teloméricas y subteloméricas muestran poca abundancia de H3 y H4 acetiladas (AcH3 y AcH4) y regiones de hipermetilación de DNA subtelomérico, las cuales demuestran que los telómeros son dominios de cromatina silenciados. La formación y mantenimiento de estos dominios silenciados de cromatina en los telómeros se ha propuesto que actúan como reguladores negativos de la elongación de los telómeros. En particular, la alteración en la trimetilación de las histonas o la metilación del DNA da lugar a telómeros anormalmente alargados como también a una elevada recombinación entre las secuencias teloméricas.

3. Mecanismos de alargamiento de los telómeros El principal mecanismo encargado de la elongación de los telómeros en

mamíferos es la telomerasa (Figura 3). La telomerasa contiene dos subunidades, la retrotranscriptasa (TERT) y la molécula de RNA asociada (TERC), y también una molécula de disquerina, proteína que estabiliza el complejo telomerasa. La pérdida de DNA telomérico durante el envejecimiento es probable que sea el resultado de cantidades limitantes de actividad telomerasa en el organismo adulto, que no pueden compensar el progresivo acortamiento de los telómeros que ocurre durante la regeneración tisular. Esta pérdida progresiva de telómeros contribuye al envejecimiento del organismo. Por otro lado, la gran mayoría de los tumores y líneas celulares inmortales poseen elevados niveles de telomerasa, la cual sostiene su crecimiento previniendo el acortamiento de telómeros y evadiendo la senescencia y la apoptosis.

Figura 3. La telomerasa es el mecanismo principal de elongación de los telómeros. La telomerasa consiste en dos moléculas de la subunidad Tert y dos moléculas de la subunidad Terc que contiene el molde AAUCCC y se asocia a una molécula de disquerina (Dkc1), proteína que estabiliza el complejo. La telomerasa reconoce el terminal 3´ de la cadena telomérica rica en G y añade repeticiones teloméricas de novo (Blasco 2007, modificado)

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Algunas líneas celulares inmortales y tumores que carecen de actividad telomerasa son capaces de mantener o alargar sus telómeros mediante mecanismos que se conocen como alargamiento alternativo de los telómeros (ALT). En levadura y en mamíferos, se ha demostrado que ALT implica eventos de recombinación homóloga entre secuencias teloméricas (Figura 4). Las células ALT-positivas se caracterizan por telómeros heterogéneos, muy cortos o muy largos al mismo tiempo, y por la co-localización de los telómeros con un cuerpo del tipo de leucemia promielocítica (PML), denominados cuerpos PML asociados a ALT (APB).

Figura 4. Las células deficientes en telomerasa pueden también mantener sus telómeros

mediante recombinación homóloga entre los telómeros, un mecanismo conocido como alargamiento alternativo de los lelómeros (ALT) (Blasco 2007, modificado).

Los mecanismos ALT están también activados en ratones deficientes en

Terc, en fibroblastos embrionarios y en células madre embrionarias, y durante la formación del centro germinal, lo que indica que los mecanismos ALT pueden ser seleccionados también en ambientes no tumorales. Sin embargo, mientras que ALT puede rescatar la viabilidad de cepas de levadura deficientes en telomerasa, no puede rescatar la viabilidad de ratones deficientes en Terc, lo cual muestra que los mecanismos ALT no operan para rescatar la supervivencia de organismos multicelulares. El hecho de que ALT está en su mayor parte restringido en ratones deficientes en Terc, como también en líneas celulares inmortales y en tumores, indica la existencia de mecanismos que reprimen activamente a ALT en células normales. Datos recientes indican que componentes del complejo shelterina, tales como Pot1

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y TRF2, o proteínas que interaccionan con TRF2, tales como WRN, pueden influenciar la recombinación telomérica y son reguladores potenciales de ALT. De igual manera, la metilación del DNA subtelomérico y la metilación de las histonas de los telómeros, son represores potentes de la recombinación telomérica y de la activación de ALT. Sin embargo, una relación causal entre la activación de ALT en tumores y defectos en estos reguladores de la longitud telomérica está todavía pendiente de aclarar

4. Senescencia replicativa y acortamiento de telómeros Hayflick y Moorhead, en los años sesenta, observaron en cultivo de

fibroblastos humanos normales una capacidad limitada de dividirse. Las células después de un número definido de divisiones dejaban de proliferar y entraban en un estado que él denominó, de senescencia replicativa. Al momento final de la vida proliferativa lo denominaron "límite Hayflick", y fijaron entre 50 y 100 la capacidad de duplicacion que una célula somática podía sufrir. La senescencia replicativa o senescencia celular, en el límite Hayflick se caracteriza por una inestabilidad cromosómica y salida del ciclo celular, además de diversos cambios bioquímicos y morfológicos. Las células senescentes post-mitóticas, una vez que atraviesan el límite Hayflick, pueden permanecer activas, y mantener su viabilidad por períodos amplios de tiempo, siempre que se mantengan las condiciones apropiadas de cultivo. La senescencia replicativa se ha demostrado también in vivo en células de donantes de diferentes edades, lo que refleja la existencia de un reloj mitótico que actúa contabilizando el número de divisiones celulares.

El proceso del envejecimiento se relaciona con el acumulo de

alteraciones en el DNA, debido a agentes que lesionan la propia molécula o a errores en su síntesis. Entre las diferentes alteraciones típicas del envejecimiento, que conducen a la inestabilidad genética, el acortamiento de los telómeros representa uno de los cambios estructurales más importantes. Se ha detectado una disminución en la longitud de los telómeros en células de donantes de edad elevada y de cultivos celulares senescentes, lo que indica que el acortamiento telomérico se considera un marcador del envejecimiento.

La senescencia replicativa puede ser retrasada o eludida, permitiendo así

a la célula entrar en la inmortalidad. Se ha propuesto un modelo de dos fases para controlar el ciclo celular. Al llegar al límite de Hayflick o límite de mortalidad 1 (M1), las células salen del estado proliferativo y entran en el

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estado senescente. En presencia de oncogenes víricos las células se transforman por inhibición de los genes supresores de tumores, p53 y Rb, escapan de la senescencia y adquieren una ampliación de su periodo replicativo en el que siguen perdiendo telómeros (Figura 5). Esa ampliación no es ilimitada y finaliza en el estado de crisis o estado de mortalidad 2 (M2), que se asocia con inestabilidad cromosómica y muerte celular. Algunas células emergen de la crisis, y al activarse en ellas la telomerasa, adquieren la inmortalidad. Por tanto, el estado M1 es el primero de los dos mecanismos independientes, responsable de la senescencia replicativa, estado en el que aún quedan repeticiones teloméricas suficientes. Si M1 se sobrepasa, se evade la entrada en senescencia, pero el acortamiento telomérico prosigue y conduce a las células al estado de mortalidad 2 o estado de crisis, donde los cromosomas han perdido ya la función protectora de los telómeros, se vuelven inestables y es cuando la célula ha de morir. La reactivación de la actividad telomerasa estabiliza el acortamiento de los telómeros, la célula escapa de M2 y entra en la inmortalidad celular y de ahí al Cáncer.

Figura 5. Telómeros y telomerasa: senescencia e inmortalidad celular que conduce al

cáncer. La telomerasa es activa en células germinales, pero se encuentra reprimida en la mayor parte de las células somáticas normales. En ausencia de telomerasa, los telómeros se acortan en cada división. El estado de mortalidad 1 (M1) o límite Hayflick, se inicia cuando aún permanecen varias kilobases de repeticiones teloméricas y las células entran en senescencia replicativa por parada del crecimiento. El estímulo que induce la parada del crecimiento son las señales de lesión del DNA que se emiten como respuesta a la pérdida telomérica. En estas condiciones, si se inactivan las proteínas p53 y Rb, las células pueden continuar dividiéndose y acortando sus telomeros hasta llegar a un estado de crisis o estado de mortalidad 2 (M2) que conlleva a la muerte celular. Si en este momento se activa la telomerasa la célula puede evadirse del estado M2, mantener sus telómeros, seguir proliferando y convertirse en inmortal.

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El progresivo acortamiento de telómeros provoca la pérdida de parte de los de los 92 telómeros que se encuentran en una célula diploide humana. Aunque aún permanezca una proporción de varias kilobases en cada uno de los telómeros, como las repeticiones teloméricas tienen la misión de proteger los extremos de los cromosomas, la pérdida de esas repeticiones es motivo suficiente para que la célula se sienta desprotegida y emita señales de lesión del DNA que actúen previniendo la proliferación. Se ha observado que la pérdida de un simple telómero en una célula de S. cerevisiae causa la parada del ciclo celular. Se considera que dos proteínas por lo menos, la p53 y la p21 se encuentran implicadas en el momento en el que la lesión del DNA controla la progresión del ciclo celular. La expresión de p53 se induce inmediatamente cuando se lesiona el DNA, ya que el acortamiento telomérico puede hacer sentir a la célula la lesión del DNA en su doble cadena, lo que le hace activar la expresión de la proteína p53. Esta proteína induce a su vez la expresión de la proteína p21, que posee capacidad para unirse al antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), e inhibir directamente al complejo de replicación del DNA y la actividad de las quinasas dependientes de ciclina. Además, la fosforilación de factores, como la proteína Rb, por las mencionadas quinasas, es uno de los requerimientos para la progresión del ciclo celular. Contando con todo ello, se postula una triple hipótesis para explicar la inducción del fenotipo senescente o estado de senescencia replicativa M1:

(1) Un cromosoma que ha perdido secuencias teloméricas se asemeja a

un DNA con rotura en sus dos cadenas, y desencadena la emisión de señales de lesión del DNA; esta señal induce la expresión de las proteínas p53 y p21; p21 inhibe la actividad de las quinasas dependientes de ciclina; estas quinasas al estar inhibidas no pueden fosforilar la proteína Rb; y la no fosforilación de Rb unida a otras acciones de p21 y p53, ocasiona la parada del ciclo celular.

(2) Los telómeros pueden unirse o secuestrar factores de transcripción

que activan o reprimen una serie de genes. Así como los telómeros se van acortando, los factores de transcripción quedan en libertad y pueden ser capaces de unirse a sitios intragenómicos importantes donde pueden actuar reprimiendo o activando genes implicados en la progresión del ciclo celular o en la diferenciación. Existe un precedente en levadura que apoya esta idea, donde la proteína Rap1 asociada a los telómeros, secuestra factores silenciadores que pueden actuar en sitios no teloméricos cuando quedan liberados.

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(3) Un tercer modelo indica que la estructura heterocromatínica del DNA cerca de la región telomérica, puede reprimir genes reguladores (por ejemplo, factores de transcripción), que frenan el crecimiento y alteran la diferenciación celular. En tanto en cuanto los telómeros se acortan, la heterocromatina disminuye, con lo cual desaparece la represión de los reguladores. También aquí tenemos un precedente en la levadura que silencia el lugar cerca de los telómeros. Una hipótesis relacionada explica que la pérdida de genes silenciadores o cambios en la estructura de la cromatina pueden, independientemente de los telómeros, inducir el fenotipo senescente.

De todo lo anteriormente expuesto se deduce que las células normales

sufren un número finito de divisiones celulares y al final ingresan en un estado no proliferativo denominado senescencia celular o replicativa y se ha propuesto que el acortamiento de los telómeros es el reloj biológico que desencadena la senescencia. Para comprobar esta hipótesis Bodmar et al. han investigado en líneas celulares humanas telomerasa-negativas transfectadas con vectores que codifican la subunidad catalítica de la telomerasa humana y han observado que los clones control telomerasa negativos exhibían acortamiento de telómeros, mientras que los clones transfectados, que expresaban la telomerasa, alargaban sus telómeros, se dividían vigorosamente, mostraban menor actividad β-galactosidada (biomarcador de la senescencia) y habían sobrepasado su expectativa de vida en 20 divisiones más. Con estos hallazgos se ha establecido una relación causal entre el acortamiento de los telómeros y la senescencia celular in vitro. La capacidad de mantener las células normales humanas en un estado fenotípico joven puede aportar numerosas aplicaciones a la medicina.

Se ha considerado anteriormente que la replicación incompleta de los

extremos de los cromosomas, podía ser la causa de la pérdida gradual del potencial proliferativo en la senescencia replicativa. Sin embargo, la primera evidencia acerca de que la pérdida de los telómeros ocurría durante el envejecimiento celular fue obtenida por Harley et al., analizando fibroblastos humanos en cultivo, en los cuales la longitud media de los fragmentos terminales de restricción decrecía de una manera dependiente de la replicación. Esta disminución se relacionaba también con la senescencia in vivo, ya que, tanto en fibroblastos como en linfocitos de sangre periférica, la longitud de estos fragmentos en donantes viejos era más corta que en los donantes más jóvenes. Por el contrario, la longitud de los telómeros no decrecía en células inmortalizadas in vitro, en células tumorales o en células germinales, que expresaban la telomerasa. Tales resultados han llevado a

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proponer que durante las sucesivas rondas de replicación del DNA, la progresiva pérdida de las secuencias teloméricas ocurre en células normales somáticas hasta que un acortamiento crítico en la longitud de los telómeros llega a percibirse como lesión en el DNA y obliga a las células a salir del ciclo celular. Las células inmortales necesitan un mecanismo que estabilice los extremos de los cromosomas y para ello se necesita la expresión de la telomerasa. Esta hipótesis del envejecimiento relacionada con la longitud de los telómeros es atractiva porque proporciona el mecanismo molecular que contabiliza el número de divisiones celulares en las células somáticas normales. Sin embargo, estudios recientes han revelado una panorámica más compleja. Se han identificado líneas celulares inmortales telomerasa-negativas y también se ha detectado que el tratamiento de líneas humanas de linfocitos B y T inmortales con inhibidores de la transcriptasa inversa, reduce la actividad de la telomerasa con ningún efecto sobre el fenotipo inmortal. Por otro lado, algunas células somáticas normales poseen actividad telomerasa, aunque sus telómeros continúan acortándose con cada ronda de replicación. La actividad telomerasa en varias células somáticas híbridas no se relaciona con su capacidad para sufrir la senescencia o continuar proliferando, lo que demuestra que algunos híbridos senescentes continúan expresando telomerasa. Estos datos sugieren que la actividad telomerasa por sí misma, no mantiene la longitud de los telómeros, e indican la existencia de mecanismos alternativos que alargan los telómeros (ALT) estabilizadores de los extremos de los cromosomas, independientes de la telomerasa. Existen observaciones adicionales no reconciliadas con la hipótesis de los telómeros, debido a que se ha comprobado que dos células hijas pueden poseer potencial proliferativo muy diferente, hasta en 30 duplicaciones, y también se ha detectado, que con una serie de manipulaciones experimentales se puede incrementar significativamente el período vital de fibroblastos humanos

5. Telomerasa y cáncer Para que una célula adquiera la malignidad se necesita que ocurran en

ella alteraciones genéticas múltiples y que una vez inmortal prolifere y origine crecimiento tumoral y metástasis. Como resultado la célula requiere mecanismos para mantener la funcionalidad de los telómeros. A estas conclusiones se ha llegado al detectarse actividad telomerasa en muestras tumorales y no en los tejidos adyacentes y ha hecho suponer que las células cancerosas deben reactivar la telomerasa antes de que se establezca una malignidad agresiva. La actividad telomerasa se convierte así en un marcador excelente de la malignidad y proporciona un medio valioso para el

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diagnóstico de tumores. También se ha sugerido que la telomerasa puede ser un indicador útil para la progresión de un cáncer, frente a un tratamiento de quimioterapia en un determinado paciente. Además de todo esto, la capacidad de la telomerasa para mantener el crecimiento tumoral puede ser interesante, ya que la inhibición de su actividad o de su expresión génica puede originar la reversión del tumor. Sin embargo, el que la telomerasa sea requerida para la inmortalidad celular o para el crecimiento tumoral es un hecho discutible, pues algunos tumores y líneas celulares inmortales no contienen telomerasa detectable. Por tanto, es probable que la telomerasa no siempre sea necesaria para la inmortalidad celular o para el crecimiento tumoral, a pesar de que más de un 85% de los cánceres humanos estudiados expresen este enzima.

La telomerasa, al igual que otras polimerasas, depende de las

interacciones entre sus componentes proteicos y el DNA. Estas interacciones estabilizan el complejo antes de la iniciación de la polimerización y ayudan a traslocar el telómero recién ampliado para que comience otra ronda de síntesis. Se ha descubierto la existencia de una desviación clave en el control del envejecimiento celular. En la mayor parte de los tejidos los telómeros se acortan cada vez que la célula se divide hasta que los cromosomas se encuentran tan desprotegidos (deshilachados), que la célula se torna senescente. Pero en las células embrionarias, en aquellas que generan los óvulos y espermatozoides (germinales), y en las cancerosas, la telomerasa reconstruye los telómeros después de cada división manteniendo intacta la longitud telomérica. Investigadores de la Universidad Rockefeller en Nueva York (De Lange et al.), han descubierto en células humanas, la primera proteína enzimática de enlace al DNA específica de los telómeros, que controla la actividad de la telomerasa. Este enzima, que ellos han denominado tanquirasa, facilita la acción de la telomerasa porque elimina la proteína que bloquea el acceso de la telomerasa a los extremos de los cromosomas. Si este enzima juega realmente este papel, se ha abierto un interesante camino para desarrollar compuestos que aprovechen la actividad de la tanquirasa para controlar el período vital proliferativo. Los compuestos que la activen podrán poner en marcha la actividad telomerasa en células utilizadas en terapias génicas con el objeto de retrasar la entrada en senescencia. Por el contrario, agentes anticáncer podrán trabajar inhibiendo la tanquirasa y con ello impidiendo el acceso de la telomerasa al telómero y así devolver la senescencia y la mortalidad a células cancerosas inmortalizadas.

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La estructura de la tanquirasa proporciona algunos indicios clave de como debe actuar. Posee 24 repeticiones anquirina, que en otras proteínas se encuentran implicadas en las interacciones proteína-proteína. Otra sección de la tanquirasa se parece catalíticamente a la región activa de otro enzima denominado poli (ADP) polimerasa, (PADPP). La PADPP interviene activamente en la reparación del DNA, modificando por ADP-ribosilación, a proteínas del complejo molecular que genera el DNA nuevo y a si misma. La actividad PADPP se basa en sustraer ADP-ribosa de un nucleótido, el NAD+, y adicionarlo a proteínas específicas. Para ver si la tanquirasa muestra un comportamiento catalítico semejante, se puso en contacto en el tubo de ensayo los tres componentes: NAD+, TRF-1 (factor de enlace a las repeticiones teloméricas), y la tanquirasa y se encontró que este enzima añadía residuos de ADP-ribosa a sí misma y al TRF-1. Normalmente el TRF-1 se encuentra unido al DNA, pero cuando la tanquirasa es activa puede ADP ribosilar al TRF-1. Es durante, o quizás después, de la replicación del DNA, cuando la tanquirasa modifica el TRF-1 de tal forma que éste abandona los telómeros y permite el acceso a la telomerasa, para que ésta actúe reemplazando los telómeros perdidos durante la replicación.

6. Senescencia y cáncer La capacidad limitada de las células a dividirse más allá de un número

definido de duplicaciones celulares (potencial de crecimiento definido), conlleva a la senescencia replicativa o estado de parada irreversible del crecimiento que depende de la edad o de las duplicaciones de una célula. Por ello, la senescencia celular supone la pérdida de la capacidad replicativa. Por inmortalización celular se conoce aquella capacidad celular de proliferación indefinida. En organismos multicelulares de vida larga, la inmortalidad celular o potencial de crecimiento ilimitado, puede ser considerada como una evasión anormal de la senescencia celular. La inmortalidad celular supone, por tanto, la ganancia de la capacidad replicativa indefinida.

Hasta hace muy poco se ha considerado que cáncer y envejecimiento

eran dos campos completamente separados, con una sola conexión y es que la incidencia del cáncer crece a medida que transcurre la edad. Sin embargo, esta idea está experimentando cambios y hoy se puede decir que envejecimiento y cáncer son dos caras de una misma moneda. En una reciente revisión de Serrano y Blasco se discuten los mecanismos convergentes y divergentes que gobiernan el envejecimiento y el cáncer. El

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envejecimiento es un fenómeno complejo, regulado a nivel genético, en el que se encuentran implicados un gran número de procesos moleculares y fisiológicos. El cáncer es también un proceso complejo y, al igual que el envejecimiento, no es posible encontrar un mecanismo simple que explique todos los cambios bioquímicos que ocurren durante su desarrollo. El mayor logro ha sido la hipótesis unificada del origen genético de la mayoría de cánceres, ya que hoy no se duda que la mayoría de ellos surge por mutaciones en múltiples genes que afectan al crecimiento normal de una célula. Envejecimiento y el cáncer están desencadenados por acumulación de daño celular de manera que aquellos mecanismos que protegen a la célula de sufrir ese daño, proporcionan protección contra el cáncer y contra el envejecimiento. A la vez, cáncer y longevidad, requieren un potencial proliferativo celular. Sin embargo, aquellos mecanismos que limitan la proliferación proporcionan protección frente al cáncer, pero favorecen el envejecimiento.

Al enfrentar los conceptos senescencia y cáncer surge la siguiente

pregunta: ¿Puede la senescencia proteger contra el cáncer? El cáncer es una enfermedad cuya principal característica es la proliferación celular incontrolada y cualquier mecanismo que pueda frenar este proceso puede, potencialmente, interrumpir su progresión. La inducción natural de la senescencia, mediada por el acortamiento de los telómeros, puede ser un mecanismo ideado a lo largo de la evolución para prevenir el cáncer en especies de larga vida. Sin embargo, el cáncer surge por evasión de los controles senescentes mediante la acumulación de mutaciones que afectan a los genes supresores, que son los controladores clave del crecimiento.

Existe un consenso general que el acumulo de lesión celular es el

acontecimiento inicial de envejecimiento y cáncer. El cáncer se desarrolla por acumulo de daños genéticos y epigenéticos. De igual manera, el envejecimiento ocurre debido al acumulo de lesión a las macromoléculas, que va a conducir a una alteración en la regeneración tisular. Así que, aquellos mecanismos que protegen las células de sufrir lesión protegen del cáncer y del envejecimiento. Otros mecanismos tienen efectos opuestos sobre cáncer y envejecimiento, protegiendo del cáncer, pero promoviendo el envejecimiento. Entre estos mecanismos están el acortamiento telomérico y la desrrepresión del locus INK4a/ARF, cuyo propósito es prevenir la excesiva proliferación celular, lo cual produce efectos contrarios en cáncer y en envejecimiento. Mientras la protección frente al cáncer produce un efecto beneficioso para el organismo, la longevidad y la regeneración resultan

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limitadas. Estos mecanismos divergentes están diseñados para prevenir del cáncer no para promover el envejecimiento.

La formación de un tumor requiere múltiples cambios genéticos

independientes, seguidos de la expansión clonal. Si se considera que la frecuencia de mutaciones espontáneas es aproximadamente de una entre un millón, se necesita al menos un millón de células para que ocurra, con probabilidad razonable, una mutación. Estas mutaciones han de acumularse en la misma célula y por tanto han de tener lugar una serie de expansiones clonales. Como se requiere que la célula se duplique 20 veces para generar un millón de células, cada mutación deberá ir acompañada por 20 divisiones. Asumiendo que sean necesarias 5 mutaciones en una misma célula para que surja el cáncer, dicha célula ha de dividirse 100 veces para llegar a la malignidad. La pérdida de células por apoptosis o la inhibición de la proliferación por senescencia ponen límite, en gran manera, al número de células en el tumor. Teniendo en cuenta que la mayoría de las células humanas solo se divide 50 - 70 veces, la senescencia celular actuará a modo de freno efectivo sobre la proliferación de células que han acumulado algunas mutaciones (Figura 6).

Se ha propuesto que la senescencia celular se controla por una familia de

genes que se activan al final de la vida proliferativa y conducen a la célula al estado senescente. La inmortalidad sólo ocurre cuando los genes senescentes acumulan defectos y pierden su operatividad, lo cual permitirá a la célula escapar del programa de la senescencia. La telomerasa se re-expresa en la mayoría de los tumores y líneas celulares inmortalizadas, mientras que en la mayoría de células normales somáticas no posee actividad porque existe un mecanismo genético represor de la actividad telomerasa. Las células tumorales y las inmortales han perdido o inactivado el gen represor putativo (Figura 7). En apoyo de estas hipótesis, Oshimura y Barret, han conseguido experimentalmente la restauración de la senescencia celular en células de carcinoma renal (RCC23) mediante la introducción de un cromosoma 3 normal.

La repercusión fisiológica de la senescencia celular es muy interesante ya

que supone un mecanismo supresor de tumores al prevenir a la célula de la adquisición de mutaciones múltiples que la llevarían a la transformación maligna. Muchos tumores poseen células con un potencial indefinido de división de modo que el proceso tumorigénico selecciona a aquellas células que pueden total o parcialmente evadir la senescencia. Ciertos oncogenes

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131

(celulares o víricos) actúan ampliando el período de vida proliferativo. Por ello las mutaciones oncogénicas y las estrategias de los virus oncogénicos acarrean la activación de mecanismos que pueden evadir el estado senescente. Entre los genes necesarios para establecer y mantener la senescencia están p53 y Rb, genes supresores de tumores, que son los que se pierden más fácilmente en la mayoría de tumores humanos. La supresión tumoral es el valor adaptable de la senescencia ya que, cualquier proceso limitante del crecimiento puede suprimir la tumorigénesis.

Figura 6. La formación de un tumor requiere muchos cambios genéticos independientes

y expansión clonal.

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132

La senescencia celular o replicativa es una parada irreversible de la proliferación celular unida a una alteración en la función celular, que se encuentra controlada por múltiples genes y no depende del tiempo sino del número de divisiones celulares. Las células senescentes adquieren tres características:

(1) frenan su crecimiento cuando se encuentran en la fase G1 del ciclo

celular por perdida de la capacidad de entrar en la fase S (síntesis del DNA) en respuesta a mitógenos, y poseen un contenido diploide de DNA. Las células senescentes permanecen activas desde el punto de vista metabólico y aunque muchos genes se mantienen todavía inducibles, existen represiones en genes reguladores clave del crecimiento o superexpresiones en genes tales como los inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina (CDI);

(2) las células senescentes por su estado no proliferativo irreversible, se

asemejan a las células diferenciadas terminales y (3) las células senescentes adquieren resistencia a la apoptosis y son

bastante estables (Figura 7). La conexión entre la senescencia replicativa, la inmortalización y el

acortamiento de telómeros se encuentra en la actualidad sometida a una intensa investigación. No está claro el mecanismo que utiliza la célula para frenar la proliferación, una vez que la longitud de los telómeros ha alcanzado el estado de mortalidad 1 o límite Hayfick, como tampoco lo está cuando se activa la telomerasa en el momento crítico del estado de mortalidad 2, para que las células inmortales mantengan su longitud telomérica. La posibilidad de que la manipulación de la longitud de los telómeros pudiera alterar la entrada en el estado senescente y afectar las enfermedades degenerativas del envejecimiento, presenta un escenario atractivo en el que se necesita encontrar explicación al papel todavía misterioso de este fascinante elemento de los cromosomas.

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Figura 7. Vías múltiples hacia la senescencia celular. (A) En las células normales la

actividad telomerasa está reprimida por el gen represor de la telomerasa, aunque otros genes funcionan normalmente conduciendo a la senescencia. (B) Algunas vías están alteradas (genes A, B y C), pero las células aún envejecen porque la actividad telomerasa se encuentra reprimida. (C) La alteración del gen represor de la telomerasa activa la telomerasa, sin embargo, como el gen B de senescencia funciona normalmente la célula envejece. (D) Si todos los genes se encuentran alterados y se desreprime el gen de la telomerasa se evade la senescencia, lo cual conduce a la inmortalidad celular

7. Regulación epigenética de telómeros de mamíferos Trabajos recientes de Blasco, estudian la regulación epigenética de los

telómeros. Ya se ha comentado con anterioridad que los telómeros están formados por repeticiones de TTAGGG unidas a un complejo multiproteico

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especializado, conocido como shelterina/telosoma, que actúa sobre la regulación de la longitud telomérica y en su protección. Las regiones subteloméricas, localizadas en la región adyacente a la telomérica están compuestas también por DNA repetitivo y contienen genes de baja densidad.

El funcionamiento de los telómeros requiere una longitud mínima de

repeticiones TTAGGG y la integridad del complejo shelterina/telosoma. La longitud telomérica se mantiene por la telomerasa, transcriptasa inversa que añade repeticiones teloméricas de novo, después de cada división, para contrarrestar el problema de la replicación terminal en aquellos tipos celulares en los que se expresa la telomerasa. También se ha comentado, que existen vías alternativas para mantener la longitud telomérica, descrita como ALT, que depende de la combinación homóloga entre secuencias teloméricas.

La mayoría de las células adultas, incluyendo las células madre, pierden

los telómeros progresivamente durante la división celular y se ha propuesto que este acortamiento telomérico es un factor limitante en la vida humana y contribuye al desarrollo de patologías relacionadas con el envejecimiento. La evidencia firme que se posee procede de estudios de la deficencia en la telomerasa en modelos experimentales en ratón y de algún caso de disqueratosis congénita (fallo en la médula ósea caracterizado por inestabilidad genética y elevado riesgo de cáncer), y anemia aplásica, que muestra pérdida prematura de renovación de tejido asociada con menos actividad telomerasa y telómeros cortos. Por el contrario, la gran mayoría de cánceres humanos tienen elevada actividad telomerasa aberrante o tienen activados los mecanismos ALT, lo cual les permite mantener los telómeros y dividirse indefinidamente.

Un aspecto importante de la regulación y funcionamiento de los

telómeros y de regiones subteloméricas es su estructura cromatínica. Los telómeros de mamíferos como los de la mosca Drosophila, tienen características de la heterocromatina, como indica el hecho de que pueden silenciar genes cercanos. La cromatina telomérica en humanos contiene nucleosomas que muestran un espacio débilmente alterado comparado con la cromatina no telomérica. No obstante, los detalles moleculares de la estructura de la heterocromatina telomérica humana permanece desconocida. Recientes estudios han demostrado que la cromatina telomérica y subtelomérica del ratón contiene modificaciones en las histonas que son comunes en la heterocromatina y que el DNA subtelomérico puede metilarse.

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135

Además, evidencias cada vez más firmes indican la existencia de conexiones funcionales entre estas marcas epigenéticas y la homeostasis de la longitud de los telómeros. Alteraciones en las modificaciones de las histonas en la cromatina telomérica o en la metilación del DNA en regiones subteloméricas, se relacionan con la alteración en la longitud de los telómeros, lo que apunta a una estructura de mayor órden en los telómeros, que está regulada epigenéticamente y que es importante para el control de la longitud telomérica.

La cromatina de los telómeros tiene varias características similares a la

de la heterocromatina de las regiones pericentroméricas, tal como la capacidad de silenciar genes cercanos. Este fenómeno se conoce como efecto de posición telomérica (TPE). El TPE en células humanas está influenciado por la longitud telomérica e implica la hipoacetilación de las histonas y puede alterarse por tratamiento con inhibidores de la desacetilasa SIRT. Los telómeros y subtelómeros de mamíferos también tienen similitudes con regiones pericentroméricas en términos de composición de la secuencia y contenido en genes; ambos están caracterizados por un elevado contenido en repeticiones de DNA y aunque los telómeros no contienen genes, los subtelómeros como las regiones pericentroméricas son pobres en genes, al igual que el TPE en células humanas. Sin embargo, al contrario que en levadura, donde sólo las repeticiones subteloméricas contienen nucleosomas, en humanos, los telómeros y subtelómeros contienen nucleosomas.

Como consecuencia de las observaciones del TPE en humanos, muchas

marcas que generalmente se encuentran en la heterocromatina, pueden encontrarse en telómeros de mamíferos. En particular, al igual que en las regiones pericentroméricas de mamíferos, la trimetilación de H3K9 (trimetilación en la lisina 9 de la histona 3) y de H4K20 (trimetilación en la lisina 20 de la histona 4) se han identificado en los dominios teloméricos y subteloméricos de mamíferos. Estas modificaciones se llevan a cabo por las histonas metiltransferasas. En el caso de H3K9 los enzimas responsables de la trimetilación son los SUV3-9H1 y SUV3-9H2, mientras que la trimetilación de la H4K20 se realiza por los SUV4-20H1 y SUV4-20H2. Proteínas de la familia del retinoblastoma supresora de tumores Rb 107 y 130 interaccionan con SUV4-20H1 y SUV4-20H2 para mantener la trimetilación de H4K20 en la cromatina telomérica y pericéntromérica. Los telómeros humanos y murinos se encuentran también enriquecidos en HP1 (isoformas de proteínas de la heterocromatina). Además, las repeticiones teloméricas y subteloméricas de mamíferos se caracterizan por bajos niveles

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de H3 y H4 acetiladas. Las observaciones que la TPE humana se revierte cuando TRF1 se sobreexpresa y aumenta cuando los telómeros se alargan, sugieren que los componentes de la shelterina/telosoma pueden afectar el status epigenético de los telómeros por su capacidad de regular su longitud.

Las alteraciones en la metilación del DNA y en la modificación de las

histonas son comunes en cáncer humano. Dado que la estructura de la cromatina afecta la regulación de los telómeros, estos cambios epigenéticos pueden ser una importante conexión entre la alteración de los telómeros y el desarrollo del cáncer. En particular, tumores que muestran hipometilación en el DNA o menor trimetilación en has histonas H3K9 y H4K20, en regiones teloméricas puede pronosticarse que favorecen la activación de los mecanismos de elongación de telómeros (telomerasa o ALT), lo cual, a su vez, puede sostener el crecimiento tumoral en ausencia de telomerasa. Defectos en la metilación del DNA se han asociado a otras enfermedades.

El hallazgo de que los cambios epigenéticos en la cromatina telomérica y

subtelomérica se asocian con telómeros muy cortos, sugiere que el acortamiento telomérico en las patologías relacionadas con la edad, puede ser el resultado de defectos epigenéticos en los telómeros. Esto puede favorecer el desarrollo del cáncer por activación del mantenimiento de los telómeros por mecanismos tales como telomerasa o ALT. Finalmente, un número de factores ambientales (tabaco, obesidad, estrés), acelera la tasa de acortamiento de los telómeros y puede ejercer impactos en la modificación de la cromatina en los telómeros y en la expresión de genes subteloméricos.

8. Recientes aportes al rejuvenecimiento. La relación entre telómeros y envejecimiento se conoce desde 1990 a

raíz de las investigaciones de Harley y Carol Greiden. Esta última junto con Elizabeth Blackburn, fueron en 1984, las descubridoras de la telomerasa, enzima que alarga los telómeros, cuya ausencia es causa de una parte importante de los efectos adversos del envejecimiento. Estudios previos también habían observado que elevando la cantidad de esta enzima se corría mayor riesgo de cáncer

El aumento combinado de la telomerasa y de ciertos supresores

tumorales ha dado como resultado un ratón transgénico que es más resistente al cáncer y envejece mucho más tarde. María Blasco y sus colaboradores han desarrollado un superratón en el que se han conseguido dos cualidades:

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aumentar la longevidad y potenciar la resistencia al cáncer. La fórmula de este complejo hallazgo se ha basado en elevar la telomerasa en ratones resistentes al cáncer. Estos científicos han creado, por un lado, un ratón resistente al cáncer y, por otro, un ratón con mayor cantidad de Tert, gen que codifica la proteína responsable de la regeneración de los telómeros. Se ha creado un ratón en el que conjugan el aumento de la longevidad y la resistencia al cáncer, en base al incremento de la expresión de Tert, que es uno de los dos genes que forman la telomerasa, en combinación con un aumento en la expresión de los supresores tumorales p53, p16INK y p19ARF.

El resultado del cruce de ratones modificados genéticamente ha dado

lugar a un superratón de laboratorio, que envejece más tarde, vive más y es resistente al cáncer. Este superratón presenta una buena coordinación neuromuscular a edades avanzadas, además de una mayor y mejor tolerancia a la glucosa, lo que supone menor riesgo de diabetes. Además, los tejidos de la piel y del tracto digestivo se mantienen como en ratones jóvenes durante más tiempo. Es la primera vez que se desvela que la telomerasa puede frenar el envejecimiento. Estos autores han encontrado que el envejecimiento es un proceso muy robusto, ajustado de manera estricta a lo largo de la evolución, que para modularlo de manera efectiva en un mamífero no basta con manipular solo gen, sino que hay que hacer combinaciones de genes. El nuevo paso dado por el equipo de los investigadores antes citados, ayuda a desvelar los genes que son importantes para determinar y/o ajustar la esperanza de vida de las especies sin aumentar con ello el riesgo de cáncer. Según palabras de María Blasco: “aumentar a la vez la resistencia al cáncer y los genes de longevidad es una manera efectiva de alargar la vida de manera significativa”.

Sobre las futuras implicaciones clínicas, Blasco matiza que, aunque no

podemos conseguir humanos transgénicos, la función de los genes se puede mimetizar con fármacos. Ya hay algunos que aumentan la cantidad de p53 y también de telomerasa. Actualmente están en fase clínica para el cáncer (p53) y para enfermedades de envejecimiento precoz debido a acortamiento prematuro de los telómeros (Tert).

Los ratones diseñados con más cantidad de TERT/p53 y

p16INK/p19ARF, son los que han dado lugar al superratón antes mencionado, cuyo organismo envejece más tarde y vive más. De hecho, se comportan como ratones jóvenes a edades avanzadas y tienden a vivir un

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promedio de un 40% más que los normales, lo que trasladado a los humanos equivaldría a alcanzar los 120 años. María Blasco también aclara la duda razonable de si existe algún riesgo real del incremento de los telómeros en el ser humano y se muestra contundente al opinar que el aumento de los telómeros en humanos no sería un riesgo, sino un beneficio, siempre que fuera acompañado de un aumento de los genes supresores, para evitar el riesgo del cáncer

9. Acortamiento de telómeros y patologías relacionadas Uno de los eventos celulares intrínsecos mejor conocidos asociados con

el envejecimiento es el acortamiento progresivo de los telómeros. La velocidad a la que se acortan los telómeros varía entre hombre y mujer y puede ser influenciada por factores que aceleran el envejecimiento y que son un riesgo de muerte prematura, tales como estrés, tabaco y obesidad. El acortamiento de los telómeros se acelera también en varias enfermedades asociadas con el envejecimiento: enfermedad cardiovascular e infecciones entre otras. También, la longitud de los telómeros parece ser predictiva de demencia y de alteraciones cognitivas.

Algunos síndromes humanos se caracterizan por mutaciones en los genes

de la telomerasa, los cuales dan lugar a ritmos acelerados de acortamiento telomérico con la edad. Estos incluyen algunos casos de disqueratosis congénita, anemia aplásica y fibrosis idiopática pulmonar. Los pacientes con disqueratosis congénita acarrean mutaciones en componentes del complejo telomerasa que dan lugar a una disminución de la estabilidad de la telomerasa y a telómeros más cortos. Estas mutaciones afectan a uno u otro de los genes Tert y Terc (pacientes con la variante de disqueratosis congénita dominante autosómica) o la disqueratosis congénita de un gen DKC1 (pacientes con la forma de enfermedad asociada a X), que codifica una proteína que interacciona con la telomerasa implicada en la estabilidad de Terc y en el procesamiento de RNA pequeño nucleolar. Ambas mutaciones originan menor actividad telomerasa y telómeros cortos. Los pacientes con disqueratosis congénita desarrollan muchas de las patologías demostradas en el modelo experimental de ratón con deficiencia en Tert, tales como corta estatura, hipogonadismo e infertilidad, defectos en la piel y del sistema hematopoyético, fallos en la médula ósea y muerte prematura. Además, al igual que los ratones deficientes en Tert, los pacientes con disqueratosis congenita muestran también una elevada inestabilidad cromosómica a medida que envejecen, lo cual está de acuerdo con una pérdida telomérica

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más rápida. Finalmente, estos enfermos y los ratones deficientes en Tert muestran afectada la progenia lo que hace pensar que los telómeros cortos contribuyen a la presentación de la enfermedad. Una diferencia importante existe entre los pacientes de esta enfermedad y los ratones deficientes en Tert y es que los enfermos muestran elevada incidencia en cáncer espontáneo, mientras que a los ratones deficientes en Tert les ocurre lo contrario, excepto aquellos con deficiencia en p53 y sobreexpresión de TRF2. Por tanto, los ratones deficientes en Tert muestran un parecido muy cercano, pero no total, con la patología de disqueratosis congenita humana. Una razón que puede explicar esta diferencia es que, en contraste con los ratones deficientes en Tert, los pacientes con esta patología, retienen todavía genes de la telomerasa, que pueden ser activados durante la tumorigénesis.

Un número de pacientes diagnosticados con anemia aplásica muestran

también mutaciones en los genes de la telomerasa Tert y Terc, lo que ocasiona un acortamiento acelerado de los telómeros y muerte prematura. Más recientemente se han encontrado mutaciones en los componentes de la telomerasa en algunos casos de fibrosis idiopática pulmonar, que es una enfermedad letal de aparición en adultos caracterizada por fibrosis pulmonar y fallo respiratorio, cuya patología se debe a deficiencias en la regeneración celular asociada al acortamiento de los telómeros.

Además de las enfermedades citadas en el párrafo anterior, que coinciden

en actividad telomarasa defectuosa y telómeros cortos, se han caracterizado otras enfermedades de síndromes asociados al envejecimiento, producidas por mutaciones en las proteínas de reparación del DNA, tales como, el síndrome de rotura Nijmegen (Nbs1), la enfermedad similar a la ataxia telangiectasia (Mre11), el síndrome de Werner (WRN), el síndrome de Bloom (BLM), la ataxia telangiectasia (ATM) y la anemia de Fanconi (proteínas codificadas por genes FANC), muchas de las cuales interaccionan con la proteína de unión a los telómeros TRF2. Los síndromes de Werner, Bloom y ATM asociados al envejecimiento humano, han sido reproducidos en ratón solo en combinación con deficiencia en telomerasa y cortos telómeros, en el contexto de modelo de ratón deficiente en Tert.

De manera análoga, la deficiencia de telomerasa en ratón origina

disminuciones en la expectativa de vida y en la longevidad máxima en la primera generación de ratones, lo que indica que la telomerasa es un factor limitante para el envejecimiento en ratón y sugiere que los telómeros cortos

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140

contribuyen a la patología de estas enfermedades del envejecimiento prematuro en humanos.

En los últimos años, el papel específico de la telomerasa en diferentes

compartimentos de células madre ha empezado a ser estudiado, en particular en subtipos bien caracterizados de células madre, tales como las células madre hematopoyéticas (HSC), las células madre epidérmicas (ESC) y células madre neurales (NSC). Las HSC derivadas de humanos y de ratón pierden el DNA telomérico con la edad, a pesar de poseer actividad telomerasa detectable. Este progresivo acortamiento telomérico actúa como una barrera del desarrollo para las HSC, las cuales pueden limitar la regeneración hematopoyética. En apoyo de esta idea, las HSC obtenidas a partir de ratones deficientes en Terc con telómeros cortos, muestran una capacidad reducida para repoblar ratones irradiados.

10. Conclusiones El acortamiento de los telómeros es un hecho que ocurre en tanto en

cuanto el organismo envejece y se acelera en enfermedades humanas asociadas con mutaciones en la telomerasa (disqueratosis congenita, fibrosis idiopática pulmonar y anemia aplásica). Los individuos con estas enfermedades y los ratones deficientes en Terc, muestran una menor expectativa de vida que coincide con una pérdida prematura de renovación de tejidos, lo que sugiere que la telomerasa es un factor limitante de la homeostasis tisular y la supervivencia del organismo. Estos hallazgos han ganado especial relevancia ya que sugieren que la actividad telomerasa y la longitud de los telómeros pueden afectar directamente la capacidad de las células madre para regenerar tejidos. De ser esto cierto, la disfunción de las células madre provocada por el acortamiento de telómeros puede ser uno de los mecanismos responsables del envejecimiento del organismo tanto en ratones como en humanos.

El hecho de que sea necesario un largo período de espera antes de que

pueda observarse un freno en la proliferación celular, hace pensar que los inhibidores de la telomerasa no han de ser convenientes como primer tratamiento para el cáncer. Parece razonable pensar que los inhibidores de la telomerasa habrán de ser administrados, bien como agentes quimiopreventivos o bien después de la eliminación de la masa tumoral por cirugía o por una ronda de quimioterapia. Existe también el peligro que los inhibidores de la telomerasa, originen efectos colaterales no deseables frente

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141

a células normales proliferativas, como las células germinales y algunas células somáticas progenitoras.

La discusión de las aplicaciones de los inhibidores de la telomerasa como

terapia del cáncer, ha sido casi completamente confinada a su uso en la quimioprevención y quimioterapia. En teoría, los inhibidores de la telomerasa presentan la posibilidad de un uso amplio. Las repeticiones teloméricas se han caracterizado en diversos organismos parásitos y la actividad telomerasa se ha detectado en el Plamodium falciparum. Estas observaciones sugieren que puede ser posible obtener ventajas de las diferencias entre parásito y hospedador o enzimas fúngicos para diseñar selectivamente fármacos tóxicos. A pesar de las posibles aplicaciones de los inhibidores de la telomerasa a la terapia del cáncer, estos inhibidores en otros organismos no afectarían la telomerasa en células progenitoras del hopedador reduciéndose así el riesgo de efectos colaterales indeseables. Nuestro conocimiento de la biología básica del mantenimiento de la longitud telomérica sugiere que el descubrimiento de nuevos fármacos anti-telomerasa representaría una nueva clase de agentes terapéuticos actuando sobre un mecanismo diferente.

11. Abreviaturas ALT, alargamiento alternativo de los telómeros; CDI, inhibidor de las

CDK; CDK, quinasas dependientes de ciclina; DNMT, DNA metil transferasa; DMSO, dimetil sulfóxido; H3 y H4, histonas; H3K9, histona 3 trimetilada en la lisina 9; H4K20, histona 4 trimetilada en la lisina 20; Histonas, proteínas fuertemente básicas que forman parte de los nucleosomas; HP1, proteína de la heterocromatina; Ku80, proteína componente de NHEJ; MRE11, recombinación meiótica; TPE, efecto de la posición del telómero; NAD, nicotinamido adenin dinucleótido; NHEJ, unión de terminaciones no homólogas; NMR, resonancia magnética nuclear; Nucleosoma, unidad fundamental de la cromatina; p53, proteína supresora de tumores; PADPP, poli (ADP) polimerasa; PCNA, antígeno nuclear de proliferación celular; Pot/TTP heterodímero protector de los telómeros; Rb, proteína del retinoblastona supresora de tumores; RCC23, células de carcinoma renal; SUV3-9H1 y SUV3-9H2, enzimas que trimetilan a H3 en la lisina 9; SUV4-20H1 y SUV4-20H2, enzimas que trimetilan la H4 en la lisina 20; TEBP, proteína de enlace al extremo sobresaliente 3´del DNA telomérico; TEP, proteína asociada al telómero; TRF1y TRF2, factores de enlace a las repeticiones teloméricas; Terc, segmento RNA componente de la

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telomerasa humana; Tert, subunidad catalítica de la telomerasa humana; TTAGGG, repetición seis de nucleótidos (rica en guanina), que forman los telómeros; TRAP, protocolo de amplificación de las repeticiones teloméricas; TRF, fragmentos de restricción terminal

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more than an anticancer mechanism? Trends Cell Biol 5, 293-297.

Capítulo 4

145

Capítulo 5. SUPRESORES DE TUMORES Y ENVEJECIMIENTO

1. Introducción 2. Mecanismos supresores de tumores 3. Supresión tumoral y longevidad 4. Mantenimiento del genoma y garantía de longevidad 5. Mecanismos supresores de tumores y envejecimiento 5.1. Apoptosis y supresión tumoral 5.2. Senescencia y supresión tumoral 6. Vías supresoras de tumores, p53 y Rb 7. Conservación evolutiva de estas vías 8. Evolución del fenotipo senescente 8.1. Apoptosis y envejecimiento 8.2. Senescencia celular y envejecimiento 9. Conexiones moleculares 10. Genes supresores y telomerasa. Últimas aportaciones 11. Conclusiones 12. Abreviaturas 13. Bibliografía 1. Introducción Los genes supresores de tumores, como su nombre indica, son genes que

suprimen la formación de tumores y a su vez aseguran la longevidad. Los genes se definen como supresores de tumores cuando sus mutaciones predisponen al cáncer, definición basada en el fenotipo. Las proteínas que codifican estos genes supresores de tumores inhiben la mitosis, y cuando sufren mutaciones, el alelo mutante se comporta como recesivo, lo que quiere decir que, en tanto en que la célula contenga un alelo normal, la supresión tumoral continúa. Los oncogenes, por el contrario, se comportan como dominantes, es decir un alelo mutante o demasiado activo predispone a la formación tumoral. Los genes supresores de tumores se identificaron al principio consiguiendo híbridos entre células normales y tumorales y detectando en algunas ocasiones que un cromosoma de las células normales revertía el fenotipo transformado.

Las mutaciones que conducen a la progresión descontrolada del ciclo

celular se requieren para el desarrollo de un tumor, pero los programas proliferativos de las células de mamíferos poseen una variedad de

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mecanismos supresores, que desencadenan la apoptosis o la senescencia, con el objeto de evitar que la proliferación celular se convierta en aberrante. Estos procesos eventuales dependen de una serie de sensores y transductores de señales que actúan en redes coordinadas para dirigir la maquinaria responsable de la apoptosis o de la parada del ciclo celular en diferentes puntos. Aunque las mutaciones oncogénicas que alteran tales redes pueden tener efectos profundos y variados sobre la evolución del tumor, pueden dejar intacto el potencial latente supresor que puede ser aprovechado en terapéutica.

2. Mecanismos supresores de tumores El cáncer es un problema que afecta a los organismos con tejidos

renovables; éstos han desarrollado mecanismos supresores de tumores para suprimir el riesgo del cáncer. Los genes supresores de tumores actúan para prevenir o reparar el daño genómico o para inhibir la propagación de células potencialmente cancerosas, mediante una permanente parada de su crecimiento (senescencia celular) o por inducción de la muerte celular (apoptosis). Los primeros se denominan genes supresores vigilantes o policías, y los segundos genes supresores guardianes. El mecanismo de algunos genes supresores vigilantes parece que retrasa el fenotipo senescente, asegurando la longevidad, mientras que los mecanismos de los genes supresores guardianes pueden promover el fenotipo senescente. La apoptosis y la senescencia celular están controladas por las vías p53 y Rb supresoras de tumores, cuyos componentes están evolutivamente conservados entre los organismos multicelulares. La hipótesis evolucionista de la pleiotropía antagónica predice que algún proceso que beneficia a los organismos jóvenes (supresión del cáncer) puede tener efector deletéreos en la vejez y contribuir al envejecimiento. Ambas apoptosis y senescencia celular pueden ser pleiotrópicas antagonistas, ya que promueven el envejecimiento al impedir la renovación tisular por agotamiento de las células madre o progenitoras. Además, las células senescentes secretan factores que pueden alterar la integridad y función de los tejidos e incluso promover la progresión del cáncer en la vejez. Estudios recientes con p53 proporcionan las bases moleculares de cómo la supresión tumoral y el envejecimiento pueden ser manipulados.

Los organismos con tejidos renovables utilizan una red de vías genéticas

y respuestas celulares para prevenir el cáncer. Las vías principales supresoras de tumores en mamíferos surgieron de mecanismos ancestrales que actúan

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para regular la embriogénesis o proteger las líneas germinales en organismos post-mitóticos simples o para el mantenimiento somático en los organismos complejos. El cambio desde el desarrollo y el mantenimiento de la línea germinal en organismos simples, al mantenimiento somático en organismos complejos, ha debido surgir con un elevado coste. Recientes evidencias indican que algunos mecanismos supresores de tumores en mamíferos contribuyen al envejecimiento. ¿Cómo puede haber ocurrido esto y cuáles son sus implicaciones en nuestra capacidad de controlar cáncer y envejecimiento?

Por organismos complejos se entiende aquellos organismos

multicelulares complejos que están compuestos por células somáticas mitóticas (renovables) y postmitóticas (no renovables), mientras que los organismos multicelulares simples son aquellos compuestos totalmente por células somáticas post-mitóticas. El cáncer aflige casi inevitablemente a los organismos complejos, tales como ratones y humanos a medida que nos acercamos a la vejez. Este no es el caso de todos los organismos, por ejemplo, los organismos invertebrados simples Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster, no sufren cáncer. Así que, ¿cuál es la prevalencia del cáncer entre los animales y qué es lo que distingue un organismo que sufre cáncer de aquel que no? El que los organismos multicelulares estén sometidos a padecer cáncer depende en algún grado de su complejidad. Una importante diferencia entre organismos simples y complejos es que estos últimos poseen tejidos renovables que son esenciales para la vida y esto explica su susceptibilidad al cáncer. Los tejidos renovables permiten a los organismos adultos reemplazar las células que se han perdido por lesión catastrófica o patológica o a través de la diferenciación. Sin embargo, la proliferación celular que se verifica en la renovación de los tejidos pone al genoma en gran riesgo de adquirir y propagar mutaciones que pueden conferir características malignas a las células.

Así, parece que en tanto en cuanto el organismo complejo es renovable,

en tanto en cuanto está en riesgo de padecer cáncer. Los organismos complejos han desarrollado estrategias, mecanismos supresores de tumores, para suprimir el desarrollo del cáncer, al menos durante el período de madurez sexual y reproducción (adulto joven). Estos mecanismos se han estudiado extensamente, principalmente en ratones y humanos. Está claro que han surgido al menos dos estrategias para suprimir el cáncer: una es la que usa supresores de tumores vigilantes (caretaker) para proteger el genoma de adquirir mutaciones oncogénicas y la otra usa supresores de tumores

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guardianes (gatekeeper) para eliminar o prevenir el crecimiento de células cancerosas potenciales (Figura 1). Ambos mecanismos proceden de vías genéticas ancestrales, muchos de cuyos elementos están todavía presentes en los organismos simples que no sufren cáncer. Una distinción importante entre supresores de tumores vigilantes y guardianes es que los primeros operan generalmente dentro del contexto celular, mientras que los segundos operan en el contexto tisular. Esto es, los vigilantes o policías actúan para preservar la integridad de la célula, mientras los guardianes promueven la muerte celular o pérdida del crecimiento, por el bien del organismo. El origen de muchos de estos supresores de tumores hay que buscarlo en genes que están presentes en organismos simples unicelulares. Así que muchos genes vigilantes codifican proteínas evolutivamente conservadas, que participan en funciones de mantenimiento genómico, tales como las que intervienen en las vías de reparación del DNA. Estas incluyen helicasas RECQ, componentes de la vía de reparación por escisión de nucleótidos y las proteínas del mantenimiento de los telomeros. Por el contrario, muchos supresores de tumores guardianes, no existen en organismos unicelulares, pero aparecen con la evolución, en los multicelulares. Ejemplos de estos genes son los que codifican las proteínas p53 y Rb, que controlan las respuestas celulares de la apoptosis y la senescencia celular.

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Figura 1. Mecanismos supresores de tumores. El daño oncogénico es detectado por los

supresores de tumores que evitan el desarrollo del tumor. El daño oncogénico recurre a cualquier evento intra o extracelular que pueda conducir al fenotipo maligno. Agentes químicos, radiaciones y otros, pueden originar mutaciones y lesiones que alteran el comportamiento celular. Los supresores de tumores vigilantes o policias (caretaker), reparan el daño oncogénico, mientras que los supresores tumorales guardianes (gatekeeper) promueven respuestas celulares, apoptosis o parada del ciclo celular, que puede ser transitoria o permanente (senescencia celular). Se supone que los guardianes funcionan cuando el daño oncogénico no pudo ser reparado. La muerte celular o la parada del crecimiento previene la supervivencia y propagación de células con comportamiento anormal (Campisi 2003 modificado)

3. Supresión tumoral y longevidad Los genes supresores de tumores previenen la muerte prematura por

cáncer, así que esta es la razón por la que se los clasifica como genes que aseguran la longevidad, genes que retrasan el envejecimiento y promueven la salud y la supervivencia del organismo adulto. Este es probablemente el caso de los supresores tumorales vigilantes o policías, pero recientes hallazgos han propuesto que otros supresores de tumores, los guardianes, puedan contribuir al desarrollo del fenotipo senescente en organismos complejos.

Es necesario conocer qué relación existe entre los genes supresores de

tumores y los genes que aseguran la longevidad, y cómo pueden los supresores de tumores tener efectos beneficiosos, que se traducen en la prevención del cáncer, y perjudiciales, que promueven el envejecimiento.

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Sin tener en cuenta si los supresores tumorales son vigilantes o guardianes, las mutaciones inactivadoras de unos y otros, incrementan el riesgo de cáncer. Por tanto, todos los supresores tumorales promueven directamente la longevidad de los organismos complejos multicelulares al evitar el desarrollo de tumores malignos, mientras que la pérdida de la función supresora tumoral acorta el promedio de expectativa de vida al elevar la incidencia del cáncer. Numerosas líneas de evidencia, obtenidas de modelos murinos y genética humana, apoyan esta relación directa entre mecanismos supresores tumorales y longevidad. Sin embargo, recientes estudios indican que existe una relación más compleja, pues los mecanismos supresores de tumores pueden influenciar el envejecimiento, limitando la longevidad. Las conexiones entre supresión tumoral y envejecimiento son dos:

Primera, algunos mecanismos supresores de tumores no solo evitan el

cáncer, sino que retrasan la aparición del fenotipo senescente. Recientes experimentos demuestran que los defectos en ciertas vías reparadoras del DNA, incrementan tanto la incidencia del cáncer como el ritmo al cual se desarrolla el fenotipo senescente. Estos hallazgos apoyan la idea que la lesión al DNA y la pérdida de la integridad genómica en células somáticas pueden contribuir al fenotipo senescente más que al cáncer. Así que, algunos supresores tumorales del tipo vigilante o policía, pueden actuar como genes aseguradores de la longevidad independientemente de su papel en la supresión tumoral.

Segunda, por el contrario, esta segunda conexión se basa en recientes

evidencias que indican que otros mecanismos supresores de tumores, particularmente los mecanismos del tipo guardián, implicados en la apoptosis y la senescencia celular, suprimen el desarrollo del cáncer y promueven el desarrollo del fenotipo senescente. Estos hallazgos hacen posible que algunos genes supresores de tumores muestren pleiotropía antagonica, y por tanto contribuyan al envejecimiento. Por pleiotropía antagónica se entiende que los genes o procesos seleccionados para beneficiar la salud de organismos jóvenes, pueden tener efectos deletéreos no seleccionados que se manifiestan en organismos viejos.

Cuando fallan los mecanismos del tipo vigilante, el fenotipo senescente

que se desarrolla puede derivar, no solo de la pérdida de la integridad genómica, sino también de la apoptosis y senescencia celular que ocurren en respuesta al daño acumulado. Así que, los mecanismos implicados en los dos

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tipos de supresión tumoral, pueden interaccionar. No es necesario decir que esta nueva apreciación tiene implicaciones importantes para nuestra prospectiva de prevenir y tratar el cáncer, como también otras patologías asociadas con el envejecimiento.

4. Mantenimiento del genoma y garantía de longevidad Muchos supresores tumorales tipo vigilante frenan la aparición del

cáncer al prevenir o reparar el daño genómico, suprimiendo directamente la adquisición de mutaciones oncogénicas. En muchos casos estos genes supresores proceden de vías genéticas que existen en todos los organismos, desde las bacterias a los humanos, y en principio pueden codificar proteínas que son importantes en la reparación del DNA dañado o en el mantenimiento de la integridad genómica.

Un ejemplo interesante de un supresor tumoral vigilante ancestral es la

helicasa RECQ, identificada en Escherichia coli, donde es importante para resolver ciertos tipos de daño al DNA por recombinación. Los genes tipo RECQ se han encontrado también en eucariotas. Las levaduras de fusión y gemación contienen ese gen, y en ambos casos (SGS1 en Saccharomyces cerevisiae y RQH1 en Schizosaccharomyces pombe), la proteína tipo RECQ parece especialmente importante para reparar el daño que ocurre durante la replicación del DNA. Los eucariotas complejos poseen varias helicasas tipo RECQ, lo que indica que estas proteínas tomaron diferentes funciones así como iba surgiendo la complejidad del organismo. En todos los organismos estudiados, se detectaron helicasas tipo RECQ defectuosas, que dieron lugar a mutaciones genéticas (aberraciones cromosómicas) e inestabilidad.

Los humanos tienen cinco helicasas tipo RECQ: RECQ1, BLM, WRN,

RTS y RECQ5 (Figura 2). Tres de ellas, BLM, WRN y RTS, cuando son defectuosas dan lugar a los síndromes hereditarios Bloom, Werner y Rothmund–Thomson, respectivamente. Las helicasas tipo RECQ, BLM, WRN y RTS participan en las vías de reparación del DNA, particularmente en las roturas de la doble cadena, y su pérdida resulta en deleciones, translocaciones y otras aberraciones cromosómicas que son causa y reconocimiento del cáncer. Además, los síndromes de Bloom, Werner y Rothmund–Thomson se caracterizan por una elevada incidencia de cáncer, lo que indica que los respectivos genes son supresores de tumores tipo vigilante. Sin embargo, cada síndrome se caracteriza por patologías adicionales, algunas de las cuales son comunes a más de un síndrome (tal

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como diabetes tipo II en los síndromes de Bloom y Werner), mientras que otras patologías son específicas del síndrome (tal como la enfermedad cardiovascular en el de Werner y anormalidades del esqueleto en el de Rothmund–Thomson).

Figura 2. Genes vigilantes del tipo DNA helicasa RECQ frenan la aparición del cáncer

al prevenir o reparar el daño genómico suprimiendo directamente la adquisición de mutaciones oncogénicas. Se muestran las cinco helicasas humanas RECQ1, BML, WRN, RTS y RECQ5. Los genes vigilantes suprimen también el desarrollo de los fenotipos del envejecimiento.

El síndrome de Werner es único, entre las enfermedades de helicasas tipo

RECQ y además entre todas las enfermedades hereditarias humanas es el ejemplo más claro de un síndrome de envejecimiento prematuro en adultos. Individuos con síndrome de Werner son asintomáticos en el primer decenio de sus vidas. Más tarde, desarrollan, a un ritmo acelerado, muchos fenotipos benignos y patológicos asociados con el envejecimiento. Estos incluyen delgadez y color gris del pelo, arrugas de la piel, cataratas bilaterales, diabetes tipo II, osteoporosis, enfermedad cardiovascular y cáncer. Estos individuos mueren generalmente hacia los cincuenta años, de cáncer o enfermedad cardiovascular. Sus células muestran inestabilidad genética y elevada frecuencia de deleciones y translocaciones cromosómicas. Las

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células de pacientes con fenotipo del síndrome de Werner son propensas a mutaciones y el fenotipo de los individuos con síndrome Werner es propenso al cáncer. Todas estas características muestran que WRN es un gen supresor de tumores tipo vigilante, sin embargo, WRN parece suprimir también el desarrollo del fenotipo senescente que no se relaciona con el cáncer. La pérdida de la integridad genómica puede, por tanto, conducir a patologías asociadas con la edad que no sean el cáncer. Además algunos supresores de tumores vigilantes, tales como WRN, son genes que aseguran la longevidad, independientemente de sus funciones supresoras de tumores. Las mutaciones que se acumulan en individuos con síndrome de Werner pueden ser responsables de los fenotipos senescente y canceroso. Alternativamente, los fenotipos senescentes en el síndrome de Werner pueden resultar como consecuencia de las respuestas celulares de apoptosis o senescencia, al daño no reparado, que puede acumularse en las células.

Muchos otros sistemas reparadores del DNA que mantienen el genoma

corrigiendo el daño al DNA, existen en mamíferos, y entran dentro de los supresores tumorales vigilantes o policías. Una variedad de vías de reparación por escisión restringidas a una cadena sencilla de DNA, incluyen la reparación por escisión de bases (BER), la reparación por escisión de nucleótidos (NER) y la reparación de errores de apareamiento (MMR). De éstas, BER es prominente para la reparación de lesiones al DNA inducidas por especies reactivas de oxígeno (ROS), NER es importante para reparar lesiones inducidas por luz ultravioleta y MMR es crítica para reparar lesiones al DNA asociadas a la replicación. Además, existen vías importantes para reparar la rotura de la doble cadena (DSB), una lesión del DNA particularmente citotóxica, que incluye la recombinación homóloga (HR) y la unión de terminales no homólogos (NHEJ). HR es una vía libre de errores que utiliza la cromátida hermana como molde durante la fase S/G2, mientras que NHEJ, une los terminales sin un molde. NHEJ es la vía que domina en G1-G0, pero puede funcionar también durante la fase S. Ambas vías reparadoras se utilizan con frecuencia en células de mamíferos y la alteración de cada una de ellas conduce a grandes reordenamientos cromosómicos (GCR).

Alguno de estos sistemas se ha conservado a lo largo de la evolución. En

organismos complejos, los defectos en los componentes clave de estos sistemas causan síndromes de propensión al cáncer, lo que indica que son supresores de tumores. Hay que destacar, que un subgrupo de tales defectos también acelera el envejecimiento. Por ejemplo, la disrupción dirigida de

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Ku80, un componente clave del sistema NHEJ en ratón, acelera la aparición de nódulos preneoplásicos y también acelera el desarrollo de osteoporosis, atrofia de la piel y otros signos de envejecimiento. Otro ejemplo interesante es un defecto específico en el sistema reparador por escisión de nucleótidos. Defectos en cualquiera de las siete proteínas (XPA–XPG), que participan en este sistema reparador del DNA causa Xeroderma pigmentosum en humanos, sin embargo, una mutación específica en XPD causa un síndrome diferente, tricotiodistrofia (TTD) o síndrome de pelo quebradizo, que se presenta con varias características de envejecimiento prematuro. En humanos y en un ratón genéticamente modificado, TTD no da lugar a predisposición al cáncer, más bien TTD se presenta con varias características de envejecimiento prematuro. Los individuos con TTD, no solo tienen defectuosa la reparación por escisión de nucleótidos, sino que también tienen alterada la transcripción que puede causar apoptosis. Así que, el prematuro envejecimiento de individuos con TTD puede deberse a deterioro genómico, excesiva apoptosis o ambos. Igualmente, ratones que acarrean una truncación en el gen Brca1, que se cree es importante en la reparación del DNA durante la replicación, son propensos al cáncer de ovario y mama, pero también mostraron signos de envejecimiento prematuro. Las células de estos ratones son propensas a sufrir senescencia celular. Estos ratones probablemente desarrollan cáncer porque adquieren mutaciones como consecuencia de reparación subóptima durante la replicación del DNA. Por otra parte, su prematuro envejecimiento puede ser debido a la pérdida excesiva de integridad genómica, a la senescencia celular o a ambas. En estos casos, parece que los supresores de tumores tipo vigilante realizan dos funciones en organismos complejos, ambas promueven la longevidad: suprimen el desarrollo del cáncer y suprimen el desarrollo de fenotipos asociados con el envejecimiento.

5. Mecanismos supresores de tumores y envejecimiento. El DNA está sometido a una variedad de agresiones que causan un

espectro de lesiones de resultado fenotípico. Estas agresiones pueden resultar de la exposición a agentes exógenos y endógenos. Entre los exógenos, el más común son las ROS, que son subproductos del metabolismo del oxígeno y son producidos por la mitocondria y los peroxisomas. Las ROS son importantes para múltiples procesos biológicos que incluyen la señalización celular. Sin embargo, son también altamente reactivos y pueden reaccionar con macromoléculas celulares incluyendo al DNA. Estas reacciones pueden causar un amplio espectro de daño genético: lesión de las bases y rotura de la cadena sencilla del DNA (SSB), pero también rotura de la doble cadena

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(DSB). Existen muchos otros agentes exógenos que pueden lesionar al DNA, que se encuentran en el aire, el agua y el suelo. Entre los agentes endógenos que lesionan al DNA están los errores de replicación, la desaminación espontánea de la citosina, la pérdida de telómeros y deficiencias en los intermediarios de la reparación del DNA. Las vías del mantenimiento de la homeostasis celular que responden al daño al DNA son cruciales para la supresión de tumores y como se comentó anteriormente, estos supresores de tumores se clasifican en vigilantes o policías y guardianes. Todos estos sistemas reparadores del DNA entran en la categoría de vigilantes.

En contraste a los supresores de tumores vigilantes, los guardianes están

en los puntos de chequeo del daño al DNA y responden a muchas formas de daño, para facilitar la reparación de la lesión o su eliminación. La maquinarias de chequeo de puntos de control monitorizan el genoma para buscar problemas que surgen durante la replicación del DNA o mitosis y detienen la progresión del ciclo celular cuando se detectan problemas, pera permitir un lapso de tiempo para que el daño sea reparado. Estos daños al DNA incluyen daño genómico, cambios epigenéticos que alteran la expresión génica o disrupciones en el microambiente celular que alteran el comportamiento celular. Los supresores de tumores guardianes regulan las respuestas celulares a eventos potencialmente oncogénicos Si el daño al DNA no ha podido ser reparado por los vigilantes, entonces los guardianes participan en la apoptosis o en la parada de la proliferación celular. Esta parada puede ser transitoria (para permitir la reparación) o permanente. La parada proliferativa permanente se conoce como senescencia celular (Figura 3).

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Figura 3. Características e inductores del fenotipo senescente. El fenotipo senescente se

caracteriza por un detenimiento irreversible de la proliferación celular, resistencia a estímulos apoptóticos y cambios en las funciones diferenciadas. Un fenotipo senescente puede ser inducido por una variedad de estímulos, tales como: expresión de oncogenes o señales mitogénicas, cambios en la estructura de la cromatina, acortamiento de telómeros, ciertos tipos de daño al DNA y sobreexpresión de ciertos genes supresores de tumores (Itahana et al., 2001, modificado).

5.1. Apoptosis y supresión tumoral. La apoptosis conduce a las células a morir de manera rápida y regulada,

haciendo que el contenido celular se entrecruce sistemáticamente y se elimine por células fagocíticas. La apoptosis asegura que las células mueran sin liberar al medio enzimas degradativos destructores y compuestos intracelulares que desencadenan reacciones inflamatorias. En los eucariotas multicelulares, la apoptosis funciona durante el desarrollo embrionario para eliminar el exceso de células o células que no han conseguido hacer conexiones intercelulares apropiadas. También se eliminan células dañadas de la línea germinal. La apoptosis es esencial para el desarrollo embrionario y el mantenimiento de la línea germinal en organismos eucariotas simples y complejos. Además, existe una secuencia y homología funcional entre los reguladores y los efectores de la apoptosis, desde los simples organismos, tales como el C. elegans, hasta los más complejos, como los humanos. Aunque ciertas características de la apoptosis han sido descritas en levadura envejecida, estas solo se asemejan superficialmente a las de las células apoptóticas de los organismos multicelulares, ya que no está claro por qué la muerte celular programada ha evolucionado en un organismo unicelular. En

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organismos complejos, la apoptosis es también esencial para el mantenimiento homeostático de tejidos renovables en adultos. En tales tejidos, una de las funciones más importantes de la apoptosis es eliminar células disfuncionales o dañadas y por tanto, potencialmente oncogénicas. No existe duda que la apoptosis es una importante defensa frente al cáncer. Las células cancerosas, casi invariablemente, adquieren mutaciones que les permite evadir las señales normales y los mecanismos que causan la muerte celular apoptótica. Además, ratones manipulados genéticamente que acarrean mutaciones letales no embrionarias, que comprometen la capacidad de las células para morir por apoptosis, son generalmente propensos al cáncer.

5.2. Senescencia celular y supresión tumoral. La senescencia celular o la respuesta senescente, elimina de manera

irreversible la capacidad proliferativa de las células en respuesta a estímulos que les pondría en riesgo de transformación maligna. La senescencia celular se identificó como senescencia replicativa, el proceso que limita la vida replicativa de las células, que está causada por el acortamiento y disfunción de los telómeros en células humanas. Algunos otros estímulos se ha demostrado que detienen las células en un fenotipo senescente de manera rápida y sin división celular. Estos estímulos se dice que inducen “senescencia prematura” e incluyen daño al DNA, la expresión de ciertos oncogenes y alteraciones en la estructura de la cromatina. En contraste a la apoptosis, la senescencia celular no elimina las células dañadas disfuncionales, simplemente establece una parada en su crecimiento (Figura 3).

La senescencia celular va acompañada por muchos cambios en la

expresión genética, alguno de los cuales causan la permanente parada del crecimiento. Por ejemplo, se inducen los inhibidores del ciclo celular INK4A y WAF1, y se reprimen los estimuladores del ciclo celular c-FOS, y las ciclinas A y B, como también varias enzimas necesarias para la replicación del DNA. Otros cambios en la expresión génica causan las alteraciones características en la función y morfología celular. Estos cambios tienden a ser específicos del tipo celular en fibroblastos humanos, se incrementa la expresión de las metaloproteinasas de la matriz, citoquinas inflamatorias, tales como interleuquina 1, factores del crecimiento epidérmico, tal como heregulina, y disminuyen la expresión de las moléculas del estroma de la matriz (colágeno y elastina).

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Además, algunas células adquieren resistencia a la muerte apoptótica después de la senescencia. La parada del crecimiento unida a la resistencia a la apoptosis y cambios en las funciones celulares, definen el fenotipo senescente. La senescencia celular puede ser también un proceso evolutivo conservado. Las células de una variedad de mamíferos, pájaros y reptiles se ha demostrado que detienen su crecimiento en diferentes condiciones con un fenotipo senescente. Además, células madre del ovario de la D. melanogaster detienen de manera estable su crecimiento después de varias divisiones y así pueden sufrir la senescencia celular. Incluso organismos unicelulares, como la levadura S. cerevisiae, sufre la senescencia replicativa. Como el acortamiento de telómeros no ocurre en levadura o en células madre del ovario de la Drosophila, la senescencia en estas células puede ser debida a estímulos no teloméricos, tales como daño acumulado o cambios en la organización de la cromatina. Cualquiera que sea el caso, estos ejemplos indican que la respuesta senescente está conservada entre los vertebrados y deriva posiblemente de respuestas celulares que ocurren en algunos invertebrados u organismos unicelulares. Al contrario que la apoptosis, poco se sabe de hasta qué punto la senescencia celular es importante en organismos simples. Entre los organismos complejos, sin embargo, existen numerosas pruebas que demuestran que la respuesta senescente es importante por suprimir el desarrollo del cáncer. Esta evidencia incluye el hecho que las células cancerosas casi invariablemente adquieren mutaciones que previenen la respuesta senescente, y los ratones que acarrean tales mutaciones son propensos al cáncer. Estas mutaciones tienden a ser aquellas que inactivan las vías p53 y Rb y así, los efectos in vivo sobre la apoptosis no pueden ser descartados, pero la actividad de p53, Rb o sus reguladores positivos se elevan en células senescentes. Además, la inhibición experimental de estas actividades hace que las células ignoren las señales inductoras de la senescencia y su estimulación experimental hace que las células detengan su crecimiento con un fenotipo senescente. Como se conoce menos de las moléculas que ejecutan el fenotipo senescente, que de aquellas que ejecutan la apoptosis, no ha sido posible prevenir específicamente la senescencia celular sin afectar otras funciones de las vías p53 y Rb. No obstante, la preponderancia de circunstancias evidentes indica que la respuesta senescente es un mecanismo crucial supresor tumoral.

6. Vías supresoras de tumores p53 y Rb Las proteínas p53 y Rb son el centro de las dos vías principales

supresoras de tumores que controlan las respuestas celulares a potenciales

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estímulos oncogénicos (Figura 4). Cada una de estas vías consiste en una serie de reguladores efectores anteriores y posteriores. Para simplificar se muestran en la figura sólo cuatro componentes en cada una de ellas. También ambas vías interaccionan en varios puntos.

En la vía p53, se emiten señales, tales como daño al DNA que inducen la

expresión de la proteína ARF (conocida también como p14 en humanos y p19 en ratón), producto del locus CDKN2A. ARF incrementa los niveles de p53 al secuestrar la oncoproteína MDM2, la cual facilita la degradación e inactivación de p53. p53 como factor de transcripción tiene actividad transactivadora y transrrepresora y de esa forma controla la transcripción de muchos genes. Entre los genes objetivo de p53 están WAF, un inhibidor de las quinasas dependientes de ciclina (CDK) que, entre otras actividades causa la parada del ciclo celular, y BAX, que promueve la muerte celular por apoptosis.

En la vía Rb, señales oncogénicas inducen p16INK4a, el otro producto

del locus CDKN2A. INK4a inhibe CDK que fosforila e inactiva a Rb durante la fase G1 del ciclo celular. El también controla la expresión de muchos genes, aunque lo hace reclutando factores de transcripción y proteínas remodeladoras de cromatina. Una consecuencia posterior de la actividad Rb es la inhibición de la actividad de E2F, que es muy importante para la transcripción de varios genes que se requieren para la progresión a través de las fases G1 y S del ciclo celular. Rb regula también la actividad de p53 mediante la formación de un complejo trimérico p53–MDM2–Rb.

Aunque el destino de las células es muy diferente dependiendo de si

sufren apoptosis o senescencia celular, sorprendentemente ellas se comprometen con la misma maquinaria reguladora, en tanto cuanto estas respuestas celulares sean reguladas, directa o indirectamente, por las vías p53 y Rb. p53 y RB definen los dos supresores de tumores principales que operan en organismos complejos. Ambas vías comprenden muchos reguladores anteriores y muchos efectores posteriores, alguno de los cuales son ellos mismos supresores de tumores (por ejemplo, p16INK4a y p19ARF, que son los productos del locus CDKN2A) u oncogenes (por ejemplo MDM2). Las vías p53 y Rb interaccionan en varios puntos y se regulan una a otra (Figura 4). La proteína p53 es un factor de transcripción que regula la apoptosis y la senescencia celular al inducir la expresión de genes específicos. La vía Rb regula directamente el ciclo celular y de aquí la senescencia celular, pero es también importante en la apoptosis, probablemente por interaccionar con

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p53, en respuesta a estímulos específicos. Ambas respuestas son probablemente influenciadas por muchos factores, incluyendo el tipo y fuerza del estímulo, el tipo celular y el contexto tisular.

Figura 4. Señales oncogénicas y vías supresoras de tumores (Campisi 2003 modificado) 7. Conservación evolutiva de estas vías ¿Cómo han evolucionado las funciones de estos supresores de tumores

p53 y Rb? Homólogos de p53 y Rb no parece que estén presentes en organismos unicelulares, tales como la levadura. Esto indica que p53 y Rb evolucionaron para controlar las respuestas celulares que se requieren específicamente en organismos o tejidos multicelulares. En el caso de p53, se ha discutido que su evolución haya proporcionado un nuevo módulo regulador a la respuesta al daño al DNA, proporcionando a las células la elección de proliferar, parar el crecimiento o morir, dependiendo del tejido o tipo celular. p53 y Rb, como también varios componentes de las vías que controlan en mamíferos, están, sin embargo, presentes en organismos simples que no desarrollan cáncer. En algunos eucariotas simples, los genes que codifican p53 y Rb no sólo están estructuralmente relacionados con aquellos presentes en organismos complejos, sino que interaccionan con las mismas proteínas y tienen las mismas funciones bioquímicas. Por ejemplo, el homologo del p53 en C. elegans, CEP-1, y el homólogo de Drosophila, dp53, pueden transactivar un promotor que contiene sitios de unión del

Capítulo 5

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consenso p53 humano. En Drosophila, el homólogo Rb, el RBF, interacciona con homólogos E2F de la mosca. Sin embargo, como ni C. elegans ni Drosophila padecen cáncer, ¿cuáles son las funciones de p53 y RB en estos organismos?

En ambos casos, los homólogos de p53 funcionan para inducir la

apoptosis en respuesta al daño al DNA en el embrión o en la línea germinal. En Drosophila, y probablemente en C. elegans, los homólogos Rb, controlan negativamente la proliferación celular durante el desarrollo embrionario. Así, los procesos celulares que son controlados por p53 y Rb son similares en organismos simples y complejos, la apoptosis y la parada del ciclo celular, respectivamente. Sin embargo, en organismos simples, estos procesos celulares no son supresores de tumores, más bien, actúan para eliminar embriones defectuosos y precursores defectuosos de las células germinales, o para sostener el desarrollo embrionario. Hay que destacar, que p53 puede también ayudar a proteger a los adultos de estos organismos simples, de los efectos deletéreos del estrés, aunque no está claro cómo confiere p53 la resistencia al estrés, ni lo que hace induciendo la apoptosis en células somáticas adultas. Cualquiera que sea el caso, parece que en los organismos simples, p53 y Rb y los procesos celulares que controlan, ejercen funciones sobre el embrión y la línea germinal, pero han adquirido funciones somáticas adicionales, tales como la supresión tumoral en los organismos complejos. Sin embargo, parece que estas funciones somáticas pueden haber evolucionado a un coste y pueden no ser completamente beneficiosas, en tanto en cuanto los organismos complejos envejecen. Para explicar como esto puede ocurrir, es importante revisar algunas ideas sobre ¿por qué envejecen los organismos?

8. Evolución del fenotipo senescente La teoría evolutiva propone que los organismos no están programados

para envejecer, que es la evolución la que selecciona por aptitud, la supervivencia y la reproducción. Entonces ¿por qué los organismos envejecen (se deterioran) y mueren? Los organismos evolucionan en ambientes donde, incluso si el envejecimiento no existiera, la muerte ocurriría debido a peligros extrínsecos, como accidentes, depredadores, infecciones y hambre (Figura 3). Así como un organismo envejece la posibilidad de que muera por peligros ambientales se eleva, lo cual hace que los organismos viejos sean escasos en la población. Por tanto, la fuerza de la

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selección natural decrece progresivamente con la edad. Este declinar puede tener dos resultados:

(1) que las mutaciones en la línea germinal, que no comprometen la

aptitud en la juventud, pero si la comprometen más tarde en la vejez, no puedan ser eliminadas porque los organismos viejos en los cuales actúan son escasos o no existentes. Esta teoría de la acumulación de mutaciones en la línea germinal es distinta de la hipótesis de la acumulación de lesiones que indica que el metabolismo oxidativo lesiona las células somáticas, lo que conduce al fenotipo senescente.

(2) que debido a que la fuerza de la selección natural declina con la edad,

los rasgos que benefician a los organismos en la juventud, son retenidos, incluso los que tienen efectos perjudiciales, en la vejez. En ambientes naturales adversos, estos efectos perjudiciales son raros o no existen, debido a que pocos individuos son lo suficientemente viejos para manifestar que sobreviven. Así que los efectos perjudiciales no pueden ser eliminados porque hay muy pocos supervivientes sobre los cuales la selección natural puede actuar.

Esta es la esencia de la teoría evolutiva de la pleiotropía antagónica: los

procesos biológicos que son cruciales para el desarrollo óptimo y la aptitud en la juventud pueden, en la vejez, reducir la aptitud por causar fenotipos deletéreos (senescentes). ¿Qué ocurre cuando los peligros ambientales se reducen o eliminan súbitamente (en tiempo evolutivo)? Esto es lo que ocurre exactamente en la humanidad en los últimos siglos (y en los ratones de laboratorio en las últimas décadas). En el ambiente menos peligroso o más protegido, muchos organismos sobreviven más allá la supervivencia esperada en el ambiente en el que ellos evolucionaron. Por consiguiente, ellos muestran los fenotipos deletéreos que han escapado a la selección natural. Por tanto, ¿son los mecanismos supresores de tumores, apoptosis o senescencia celular, que ocurren en células somáticas adultas, antagonistas pleiotrópicos? Estos mecanismos protegen a los organismos del cáncer en la juventud, pero contribuyen a los fenotipos senescentes y a las patologías dependientes de la edad en la vejez.

8.1. Apoptosis y envejecimiento ¿Cómo puede la apoptosis contribuir al envejecimiento? En los tejidos

somáticos de organismos complejos adultos, la apoptosis es importante para

Capítulo 5

164

el mantenimiento de la homeostasis tisular. Defectos en la apoptosis (poca o mucha) se asocian con una serie de enfermedades. En algunos casos la apoptosis ocurre como consecuencia de diferenciación normal, mientras que en otros casos la apoptosis elimina células dañadas de los tejidos. El daño endógeno, especialmente por reacciones oxidativas endógenas es dominante en todas las células. El daño puede causar pérdida de función en células post-mitóticas y es beneficioso y conveniente eliminar tales células. Por ejemplo, la eliminación de neuronas disfuncionales, facilita la conexión sináptica a las neuronas vecinas. La pérdida de neuronas irreemplazables o poco reemplazables puede tener pocas consecuencias en organismos jóvenes en los cuales la plasticidad sináptica puede compensar la pérdida ocasional de células. En organismos viejos, sin embargo, la pérdida de neuronas por apoptosis puede dejar atrás los mecanismos compensatorios.

Alternativa o adicionalmente, la apoptosis neuronal puede a veces

eliminar las reservas de células madre o progenitoras, que pudieran ser capaces de reemplazar a las neuronas en algunas regiones del cerebro o del sistema nervioso periférico. En tejidos compuestos por células mitóticas, la apoptosis es doblemente importante porque el daño posee el peligro adicional de la transformación maligna. Los tejidos mitóticos tienen también el riesgo de agotar su abastecimiento de células madre o progenitoras. De hecho, las células madre por sí mismas, pueden sufrir la apoptosis como consecuencia de lesiones. Otra vez, durante la juventud, la eliminación de células dañadas por apoptosis tiene un efecto positivo neto. Eventualmente, sin embargo, la depleción de las células madre, puede causar, en tejidos con un elevado recambio celular, la pérdida de células y función. Esto es, de hecho, lo que se observa en muchos tejidos de organismos viejos, en los que se ha de considerar la pérdida de células tolerada antes de que su función decline.

8.2. Senescencia celular y envejecimiento La senescencia celular, al igual que la apoptosis, contribuye al

envejecimiento, aunque ambas lo hacen por dos mecanismos diferentes. El primero se debe a que las células senescentes no pueden proliferar y, de la misma manera que la apoptosis, puede disminuir gradualmente la capacidad renovadora de los tejidos, al agotar el suministro de células madre o progenitoras (Figura 5). El segundo, porque el fenotipo senescente da lugar frecuentemente a la secreción de enzimas degradadores, citoquinas y factores de crecimiento. Además, las células senescentes pueden acumularse con la edad y estos acúmulos se han detectado en sitios de patologías relacionadas

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con la edad, lo cual indica que las células senescentes también contribuyen al envejecimiento al alterar activamente la integridad, la función o la homeostasis de los tejidos a medida que se acumulan. Se ha descrito que los fibroblastos senescentes pueden estimular, in vivo e in vitro, el crecimiento y la transformación tumorigénica de células epiteliales premalignas. Por tanto, existe la posibilidad que si la senescencia celular protege a los organismos del cáncer en la juventud, puede promover la progresión al cáncer en la vejez. Como se discutió anteriormente, ambas mutaciones y microambiente permisivo, son necesarios para que se desarrolle el cáncer. Así, la elevación exponencial en cáncer que ocurre con la edad, es el resultado de dos procesos sinérgicos: la adquisición de mutaciones oncogénicas que inactiva los mecanismos supresores de tumores y el control relajado por el microambiente tisular debido a la presencia de células senescentes.

Figura 5. Las células senescentes promueven el cáncer. (A) Tejido epitelial joven

compuesto por células epiteliales en contacto con la membrana basal que se mantiene sobre el estroma que contiene fibroblastos residentes. Mutaciones oncogénicas en las células jóvenes dan lugar a células “neoplásicas”, pero el ambiente del tejido joven suprime la expresión del fenotipo neoplásico. (B) Tejido epitelial viejo. Con el envejecimiento aparecen células senescentes que secretan factores (enzimas degradativos, citoquinas inflamatorias y factores de crecimiento), que alteran la estructura tisular, lo cual permite a las células iniciadas expresar el fenotipo neoplásico (Campisi 2003 modificado).

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166

9. Conexiones moleculares ¿Cuáles son los genes responsables de la pleiotropía antagónica de la

apoptosis y la senescencia celular? Las respuestas a esta pregunta están empezando a enfocarse en el p53. Tres grupos de ratones han sido manipulados genéticamente para que la expresión o actividad de p53 fuera superior a la normal. Estos ratones no existen en la naturaleza, pero han proporcionado un valioso medio para investigar los efectos de p53, que en algunos casos no podrían haber sido estudiados en ratones silvestres o knockouts p53–/–. Considerando el papel de p53 como supresor tumoral, las tres líneas de ratones transgénicos mostraron menor incidencia al cáncer. Al igual que en humanos, el cáncer es una causa significativa de muerte en ratones, pero sorprendentemente, estos ratones no alargaron su vida. En dos de las tres líneas, la vida de los ratones resultó más corta. En la línea mejor caracterizada, un acontecimiento de recombinación espontánea dio lugar a la pérdida de seis exones en la región anterior de uno de los alelos que codifican p53. La proteína p53 mutada (p53m) con la región amino terminal truncada, parece que formó complejo con el tipo silvestre p53 producido por el otro alelo y así intensificó su actividad. Los ratones p53m/+ sufrían menos cáncer, sin embargo, acortaron su vida en un 20 – 30%. Además, estos animales mostraron varios signos de envejecimiento prematuro, incluyendo atrofia tisular (piel, músculo esquelético, hígado y órganos linfoides), osteoporosis, poca cicatrización de las heridas y sensibilidad incrementada al estrés. Una tercera línea de ratón acarreaba un gran inserto genómico que contenía el gen normal Trp53 y las regiones que controlan su expresión. Estos ratones con un alelo transgénico p53-tg fueron también resistentes al cáncer, pero ellos no mostraron signos de envejecimiento prematuro. De manera alternativa, sin embargo, a pesar de presentar menor incidencia de cáncer, estos ratones no vivieron más que los silvestres ¿A qué se deben las diferencias entre los ratones p53m/+ y los p53-tg? Se especula que la diferencia radica en que el exceso de actividad p53 está de alguna manera regulada. Los ratones p53m/+ expresan constitutivamente la proteína mutante p53 y de esta manera la actividad p53 se eleva en estos animales. Por el contrario, los ratones p53-tg regulan normalmente la copia extra Trp53 y así la actividad p53 se eleva anormalmente solo cuando es inducida por daño u otros estímulos. La resistencia al cáncer de los ratones p53-tg puede ser debida a la mayor respuesta de p53 al daño. Sin embargo, también puede ser debida al hecho que los ratones p53-tg adquieren un cambio genético adicional para inactivar la copia extra de Trp53. Ambas, la resistencia al cáncer y el envejecimiento prematuro mostrados por los ratones p53m/+

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pueden ser debidos a una excesiva apoptosis dependiente de p53 que puede eliminar células cancerosas potenciales, pero que también priva a los tejidos renovables de su reserva de células madre. Por otro lado, el fenotipo senescente p53m/+ puede ser debido a una excesiva senescencia celular, y la subsiguiente pérdida de la integridad y función del tejido. En este caso, la senescencia celular puede fracasar al promover cáncer en la vejez porque los efectos promotores del cáncer están limitados a las células premalignas, las cuales pueden ser eficientemente eliminadas o detenidas en ratones p53m/+.

El estudio de las relaciones entre supresión tumoral y longevidad

presenta implicaciones interesantes e importantes para establecer límites a las promesas de intervenciones que intentan prevenir o retrasar el cáncer y el envejecimiento. Uno de los lados del espectro, los fenotipos de los organismos que son defectuosos en ciertos genes reparadores del DNA, indica que algunos mecanismos supresores de tumores, aquellos que están implicados en el mantenimiento del genoma, también promueven la longevidad. De esta manera, las estrategias que previenen el daño al DNA (elevación de las defensas antioxidantes) o mejoran los mecanismos de reparación del DNA, suprimen tanto el fenotipo canceroso como el senescente. ¿Será posible mejorar los sistemas de mantenimiento genómico, dada su complejidad y las numerosas interacciones con la transcripción y replicación celular y la maquinaria del ciclo celular? Esto, por supuesto permanece aún sin esclarecer. Por otra parte, la pleiotropía antagonista predice que es difícil, si no imposible, mejorar los mecanismos supresores de tumores sin acelerar el envejecimiento y viceversa. Para mitigar este terrible punto de vista están los ratones p53-tg. Es todavía posible que, en posteriores caracterizaciones, estos ratones muestren algunos signos de envejecimiento prematuro, como era de esperar, ya que ellos tienen un mayor promedio de expectativa de vida, como resultado de su muy disminuida susceptibilidad al cáncer. No obstante, el fenotipo de estos ratones indica que la actividad intensificada, pero regulada de p53 puede ofrecer una mejora en la supresión tumoral sin acelerar el envejecimiento. No es necesario decir, que se necesita investigar mucho más, antes de que conozcamos si el grado de estas posibilidades es realmente viable. No obstante, como las investigaciones modernas de cáncer y envejecimiento convergen, es conveniente tener a la vez optimismo y precaución.

Capítulo 5

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10. Genes supresores y telomerasa. Últimas aportaciones. En referencia a todo lo anteriormente comentado, sobre los mecanismos

implicados en la supresión tumoral en el envejecimiento y en el cáncer, son muchos los grupos científicos que están tratando de desentrañar las complejas vías implicadas con el objeto de encontrar medios para intervenir a nivel farmacológico, nutricional y genético. Experimentos muy recientes del grupo de Blasco han aportado interesantes hallazgos que han demostrado, en ratones manipulados genéticamente en genes supresores y en la telomerasa, que puede conseguirse alargar la vida sin peligro de desarrollar cáncer. Otra vez envejecimiento y cáncer se enfrentan en un organismo tal como el ratón y esto presenta un enorme interés por sus grandes repercusiones de aplicación a la especie humana. Estos autores han conseguido crear ratones resistentes al cáncer con un 40% de mayor esperanza de vida. En estos experimentos la telomerasa ha jugado un importante papel, pues está demostrado que una célula puede llegar a la inmortalidad si se aumenta su actividad telomerasa (ver capítulo Telómeros, en este volumen). Sin embargo, estos mismos investigadores nunca lograron aumentar la vida de un organismo completo (gusanos o moscas), solo mediante la activación de la telomerasa. Además, la activación de la telomerasa no está exenta de riesgos: en palabras de María Blasco, "La telomerasa per se no es perjudicial para la célula, pero las células tumorales también la necesitan, y al incrementar su expresión y su actividad se eleva el riesgo de desarrollar un tumor".

Para lograr la ecuación perfecta, el equipo de estos investigadores tuvo la

idea de modificar genéticamente los ratones en una doble dirección: aumentando la actividad telomerasa para que no envejeciesen e incrementando a la vez la presencia de varios genes supresores tumorales de los anteriormente mencionados en este capítulo, p53, p16INK y p19ARF, para protegerles del cáncer. Sobre este ratón inmune al cáncer se aumentó la expresión de la proteína TERT, responsable de la regeneración de los telómeros. Los ratones así modificados presentaron buen estado neuromuscular a edades avanzadas, mayor tolerancia a la glucosa y tejidos más sanos capaces de mantenerse jóvenes durante más tiempo.

Sus conclusiones, podrían tener aplicaciones inmediatas en humanos, ya

que existen compuestos que funcionan aumentando el nivel de los supresores tumorales y también hay moléculas diseñadas para aumentar la telomerasa. Unos y otras están siendo usadas para el tratamiento de enfermedades

Capítulo 5

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relacionadas con el envejecimiento precoz y el acortamiento de los telómeros, como la disqueratosis congénita (un raro síndrome de envejecimiento prematuro), algunas anemias aplásicas, la fibrosis pulmonar idiopática e incluso el sida, puesto que los pacientes con VIH también tienen los telómeros más cortos a causa del estado de su sistema inmune".

11. Conclusiones Cáncer y envejecimiento son padecimientos que aquejan a organismos

con tejidos renovables, por eso han surgido genes supresores de tumores que suprimen el desarrollo del cáncer y limitan la longevidad. Los supresores de tumores que actúan previniendo el daño genético son los genes supresores “vigilantes o policías”, mientras que los que inhiben la propagación de las células cancerosas potenciales se denominan genes supresores “guardianes”. La acción de estos genes supresores está siendo estudiada por diferentes grupos de investigadores, que tratan de conseguir, mediante la manipulación genética, cómo alargar la vida sin tener el riesgo de contraer cáncer. Los avances conseguidos hasta la facha son de tal magnitud, que hoy casi ningún científico duda que en un día no muy lejano, se podrán curar muchas de las enfermedades asociadas al envejecimiento, que a su vez, son la mayor causa de la morbilidad y mortalidad en nuestra sociedad. Es inevitable pensar que si esto se consigue también llegaremos a vivir muchos años en buenas condiciones de salud. La naturaleza ha generado especies más longevas que la nuestra, como algunas tortugas o loros, así que solo se trataría de averiguar qué fórmula han utilizado. De hecho hoy se puede potenciar la función de los genes con fármacos, con estrategias nutricionales y con manipulación genética. Solo entendiendo las bases moleculares del envejecimiento y del cáncer, se podrán desarrollar herramientas para retrasar la aparición de enfermedades asociadas al envejecimiento y que además la mayoría de ellas están íntimamente conectadas con el cáncer.

12. Abreviaturas BAX, promotor de la muerte celular por apoptosis; CDK, quinasas

dependientes de ciclina; CDKN2A, locus que incluye los genes INK4a y ARF; E2F, factor de transcripción; Ku80, componente clave del sistema de reparación de NHEJ; MDM2, oncoproteína que facilita la degradación de p53; NHEJ, uniones terminales no homólogas; p16INK proteína supresora de tumores inhibidora de las CDK; p19ARF, proteína supresora de tumores; p53, proteína supresora de tumores; p53-tg, p53 con alelo transgénico; Rb,

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proteína del retinoblastoma, supresora de tumores; RECQ, helicasas; TERT, fragmentos terminales de restricción; Trp53, p53, proteína relacionada con la transformación; TTD, tricotiodistrofia; WAF, proteína supresora de tumores inhibidora de las CDK; WRN, gen supresor tipo vigilante que codifica una helicasa.

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Capítulo 6. INMUNOSENESCENCIA

1. Introducción 2. Generalidades del sistema inmune 3. ¿Qué es inmunosenescencia? 4. Envejecimiento y células madre hematopoyéticas (HSC) 5. El impacto de la edad sobre la inmunidad innata 6. Alteraciones del desarrollo de las células B 7. Timo, desarrollo de las células T y envejecimiento 8. Deficiencias en las células T periféricas 9. ¿Puede ser revertida la inmunosenescencia? 10. Conclusiones 11. Abreviaturas 12. Bibliografía

1. Introducción

Es un hecho reconocido que el sistema inmune sufre alteraciones asociadas

a la edad, que se acumulan y producen un deterioro progresivo en la capacidad de responder a infecciones y a desarrollar inmunidad después de la vacunación. Ambos fenómenos están asociados con la mayor mortalidad en los ancianos. La inmunosenescencia, definida como aquellos cambios que tienen lugar en el sistema inmune a medida que el organismo envejece, presenta cada vez un mayor interés a nivel experimental y clínico. Para discutir los mecanismos que contribuyen a la inmunosenescencia hay que dar énfasis a los factores extrínsecos, con una atención particular enfocada a la involución del timo. Un sistema inmune funcional, que día a día se enfrente a los agentes extraños y patógenos, se considera vital para la supervivencia del organismo. En humanos y en muchas otras especies, se reconoce que el sistema inmune declina con la edad, lo cual conduce a una mayor incidencia de infecciones, neoplasia y enfermedades autoinmunes.

El impacto de los cambios asociados a la edad en el sistema inmune no era

un asunto claro cuando el promedio de la vida humana era de 40 años. Sin embargo, los avances en las ciencias médicas y nutricionales en los últimos 150 años, han dado como resultado un espectacular incremento en la expectativa de vida, llegando hoy en día a alcanzar los 80 años. En nuestra sociedad actual el 18% de la población tiene más de 65 años y se espera que este valor suba hasta un 25% en los próximos 20 años. Así que, en ausencia de cualquier otra presión

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evolutiva, un sistema inmune que fue diseñado para funcionar 40 años, tiene ahora que continuar por otros 40 años más. Por tanto, no tiene que sorprender que la mayor susceptibilidad al cáncer y a las infecciones de todo tipo, en individuos de edad avanzada, sea debida a deficiencias severas en el sistema inmune.

Una de las características de todas las células somáticas es su expectativa de vida definida. Las células pueden proliferar hasta alcanzar un punto, a partir del cual, aunque permanezcan metabólicamente activas, pierden su capacidad de dividirse y generar células hijas. Esta observación es importante en relación con la hipótesis del agotamiento clonal, mecanismo citado con frecuencia para explicar la disfunción inmune asociada al envejecimiento. En esta hipótesis, la repetida división de los linfocitos, condena irremediablemente a un límite replicativo, después del cual las células entran en senescencia, pero permanecen en la reserva de células T.

2. Generalidades del sistema inmune

El sistema defensivo para combatir los agentes infecciosos en mamíferos

se compone de dos sistemas, el sistema inmune innato y el sistema inmune adquirido o adaptativo. Las células fagocíticas: monocitos y polimorfonucleares (neutrófilos) circulantes y los macrófagos (células Kupffer en hígado y microglias en cerebro) en los tejidos, junto con las células naturales asesinas (NK), son los componentes más importantes del sistema inmune innato. A su vez, los linfocitos, que se dividen en dos grupos principales, las células T y las células B, y cada uno de ellos está compuesto por un innumerable número de clones, son los componentes más importantes del sistema inmune adaptativo. Cada clon es pequeño en número después del nacimiento, pero se eleva rápidamente por exposición a microorganismos del ambiente. Esta expansión clonal de los linfocitos está inducida por estímulos antigénicos del ambiente externo, lo cual es muy importante para la eficiente ejecución de la función inmune frente a los agentes infecciosos. El estímulo antigénico del ambiente externo se verifica a través de los monocitos y macrófagos del sistema inmune innato, los cuales mediante el estallido respiratorio y las proteasas destruyen y digieren los agentes patógenos y los presentan a los linfocitos.

De esta manera, los receptores de los linfocitos reconociendo los epítopos antigénicos juegan el papel más importante en el desarrollo y operación de la función inmune. A través de los receptores, el estímulo antigénico puede ser transducido en la señalización intracelular, lo cual conduce a la proliferación

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174

celular o a la producción de citoquinas. El mecanismo de señalización intracelular comprende una serie de reacciones encadenadas en la que intervienen una multitud de moléculas. Cualquier alteración en cualquier molécula puede dar lugar a un desequilibrio en las funciones de las células T, tales como la proliferación celular o la producción de citoquinas.

El sistema inmune es una red compleja de células y órganos que trabajan juntos para defender el cuerpo contra ataques de invasores “foráneos” que no pertenecen al organismo. Esta red es una de las principales defensas contra las enfermedades e infecciones. El sistema inmune lucha contra la enfermedad, incluso el cáncer, en formas diversas. Por ejemplo, el sistema inmune puede reconocer la diferencia entre las células sanas y las células dañadas o cancerosas y trabaja para eliminarlas. Pero el sistema inmune no siempre reconoce las células dañadas o cancerosas como “foráneas”. Además, el cáncer se puede iniciar cuando el sistema inmune deja de funcionar o cuando no funciona adecuadamente. Las terapias biológicas están diseñadas para reparar, estimular o mejorar las respuestas inmunes.

El desencadenamiento de una enfermedad no se debe únicamente a la

invasión de un agente patógeno, sino que el estado inmune del individuo es decisivo. La inmunidad innata es la primera respuesta frente a un microorganismo extraño, mediante la cual se intenta eliminar la infección o contenerla hasta la aparición de una respuesta inmune más específica y eficaz, la inmunidad adaptativa.

Los principales componentes de la inmunidad innata son las barreras físicas, químicas y biológicas, las células fagocitarias, las células asesinas naturales o NK (Natural Killer) y factores solubles, que incluyen los componentes del complemento y las citoquinas que median la fagocitosis y la inflamación. La respuesta inmune innata es inespecífica, es decir carece de memoria inmunológica y se desarrolla por mecanismos incapaces de distinguir las diferencias antigénicas de los diferentes tipos de microorganismos. Además de los procesos inflamatorios de forma localizada, existe una respuesta general para proteger el organismo en su conjunto, la “respuesta de fase aguda”, coordinada por las citoquinas secretadas por macrófagos, con la que se crean las condiciones orgánicas más adecuadas para luchar contra los distintos patógenos. Pero, además de esta respuesta generalizada frente a diferentes agentes extraños, va a producirse una respuesta innata característica frente a cada tipo de patógeno (bacterias y sus productos, hongos, virus, y parásitos).

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Al sistema inmune innato pertenecen los fagocitos. Los fagocitos son leucocitos que pueden fagocitar y digerir partículas y microorganismos en un proceso conocido como fagocitosis. Hay varios tipos de fagocitos, los monocitos y los polimorfonucleares (neutrófilos), que circulan por la sangre, y los macrófagos, que se encuentran en tejidos de todo el organismo. Las células asesinas naturales (células NK) producen citoquinas poderosas y proteínas que forman poros que se adhieren a cualquier invasor foráneo, célula infectada o célula de tumor y lo destruyen. A diferencia de las células T citotóxicas, las células NK están listas para atacar de manera rápida al encontrarse con sus objetivos.

Al sistema inmune adquirido pertenecen los linfocitos. Los linfocitos son un tipo de leucocitos que se encuentran en la sangre y en muchas otras partes del cuerpo. Las células B, las células T y las células asesinas naturales son tipos de linfocitos. Las células B (linfocitos B) maduran hasta convertirse en células plasmáticas que segregan proteínas llamadas anticuerpos (inmunoglobulinas). Los anticuerpos reconocen y se adhieren a las sustancias foráneas conocidas como antígenos, encajando perfectamente así como una llave encaja en el ojo de una cerradura. Cada tipo de célula B produce un anticuerpo específico, el cual reconoce un antígeno específico. La función primaria de las células T (linfocitos T) es producir las proteínas llamadas citoquinas (linfoquinas, interferones, interleuquinas y factores estimuladores de las colonias), para que las células se comuniquen entre sí. Algunas células T, llamadas células T citotóxicas, segregan proteínas que forman poros y que atacan directamente las células infectadas, foráneas o cancerosas. Otras células T, llamadas células T cooperadoras, regulan la respuesta inmune al segregar citoquinas y enviar señales a los otros elementos del sistema inmune. Por tanto, las células T participan en los dos tipos de respuestas inmunológicas: la humoral (anticuerpos) y la celular. Existen subpoblaciones de células T que tienen las siguientes funciones: 1. Células T citotóxicas (CD8+), que expresan el marcador CD8 y pueden destruir células que contienen patógenos en su citosol. 2. Células T cooperadoras (Th), que expresan moléculas CD4 y pertenecen a dos grupos, células Th1 inflamatorias implicadas en la eliminación de patógenos que se ubican intracelularmente en compartimentos vesiculares y células Th2 necesarias para la producción de anticuerpos por parte de las células B (Figura 1)

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Figura 1. Células sanguíneas que derivan de la médula ósea. Las células madre

hematopoyéticas (HSC) se diferencian en el linaje mieloide y en el linaje linfoide. NK, células naturales asesinas; Th1 y Th2, linfocitos T auxiliares; CTL, linfocito T citotóxico.

3. Qué es inmunosenescencia?

Por inmunosenescencia se conoce el deterioro del sistema inmune debido al envejecimiento. Este deterioro contribuye a la morbilidad y mortalidad de la población anciana, que se deben a la mayor incidencia de infección, de fenómenos autoinmunes y de cáncer. La alteración de cualquiera de las células implicadas en la función inmune juega un papel importante en estos procesos.

Este deterioro del sistema inmune es de gran relevancia clínica habiéndose descrito que la incidencia y severidad de las enfermedades infecciosas se elevan progresivamente con la edad. Así, es mucho mayor la incidencia de neumonías, meningitis, sepsis, infecciones del tracto urinario, etc. También, los índices de mortalidad asociados a enfermedades infecciosas se multiplican por dos en el paciente de edad cuando se compara con el paciente joven. Se ha demostrado que la primera causa de muerte por encima de los 80 años son las enfermedades

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infecciosas, por tanto, la inmunosenescencia tiene un papel importante en la defensa de los agentes patógenos.

Los factores que contribuyen a la inmunosenescencia son, en su mayor parte, los siguientes:

a) defectos en las células madre hematopoyéticas b) impacto sobre la inmunidad innata c) alteraciones en el desarrollo y función de las células B d) alteraciones en el timo y en el desarrollo de los linfocitos T e) deficiencias en los linfocitos T periféricos.

Entre los factores anteriormente mencionados y que, hasta la fecha se

conoce que intervienen en la función inmune, se observa que los linfocitos T son los que se encuentran más afectados ante cualquier alteración en la red compleja de citoquinas. La respuesta de los linfocitos ante el antígeno es generar estímulos para desencadenar la proliferación celular y a medida que avanza la edad es mayor el número de células T que no son capaces de proliferar frente a aquel estímulo que induce la respuesta proliferativa de las células T, en indivíduos más jóvenes. Esta hipótesis parece lógica y razonable y se encuentra apoyada por datos obtenidos de humanos y ratones, con la demostración que el envejecimiento trae consigo un acumulo de células senescentes en ambas especies. La inmunosenescencia parece estar más estrechamente ligada a la expectativa de vida del animal que a del linfocito.

La disminución de la respuesta inmune en el envejecimiento, se considera, por tanto, causada principalmente por el declinar de la función de las células T, y este declinar parece que se debe a una combinación de factores que se citan a continuación:

1. la disminución de la producción de células T vírgenes, por involución del timo,

2. la activación sucesiva, inducida por los antígenos presentados por las APC (antigen presenting cells), que conduce irreversiblemente a la senescencia replicativa y al agotamiento clonal de ciertas células T, y

3. al envejecimiento post-mitótico de las células T en reposo, fenómeno también observado en otras células no en división, como las neuronas y células musculares.

La importancia relativa de estos procesos en la respuesta defectuosa de las

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células T observada en animales y humanos envejecidos, permanece aún sin establecer, aunque es muy probable que todos ellos participen en la inmunosenescencia. Los cambios en la función de las células T a lo largo de la edad se perciben como reflejo de un deterioro del sistema inmune. Los cambios en el sistema inmune relacionados con el envejecimiento se manifiestan principalmente en la funcionalidad de las células T. El estado inmunosenescente, se detecta en organismos de vida larga o corta, como función de su edad respecto a la expectativa de vida. Aunque la inmunososenescencia se considera como perniciosa para el individuo, en algunos aspectos puede contribuir a aminorar alguna patología. Esto ocurre en los casos de rechazo en transplantes de córnea, riñón e hígado en humanos y en modelos murinos de lupus eritematosus.

4. Envejecimiento y células madre hematopoyéticas (HSC)

Las células madre hematopoyéticas (HSC) poseen la capacidad de diferenciarse en los diferentes tipos de células sanguíneas (Figura 2), acoplada con la capacidad de autorrenovación, para prevenir el agotamiento clonal. Considerando que todas las células hematopoyéticas derivan de las HSC, el declinar en la inmunidad dependiente de la edad, ha de ser atribuida a la actividad funcional de las HSC en el organismo anciano. Los primeros estudios dirigidos al efecto del envejecimiento sobre la función de las HSC no fueron convincentes, lo que se atribuyó a las diferentes técnicas utilizadas, tales como trasplante de médula ósea (BMT), trasplante seriado de médula ósea, o actividad de unidades formadoras de colonias del bazo. Sin embargo, evidencia reciente sugiere que las HSC muestran una disminución en su función que se detecta a medida que transcurre la edad.

Ahora se conoce que existen componentes genéticos que regulan el

envejecimiento de las células madre. Por ejemplo, estudios en ratones C57BL/6 han revelado un incremento en el número de HSC en ratones viejos, por el contrario, el número de HSC en ratones DBA disminuye notablemente con la edad. En experimentos competitivos de repoblación, comparando el trasplante de médula ósea de ratones jóvenes y de ratones viejos en el mismo receptor, se detectó que las HSC de ratones viejos tenían menor capacidad para repoblar y generar progenitores hematopoyéticos. Esto se debe a la incapacidad de las HSC viejas de adherirse al ambiente del estroma de la médula ósea, lo que lleva a proponer que el potencial de estas HSC de animales viejos está reducido. Resultados más recientes del perfil de expresión génica han demostrado que las HSC viejas reflejan una capacidad reducida en diferenciarse en linaje linfoide

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mientras que exhiben una capacidad incrementada de diferenciarse en el linaje mieloide. Además, la expresión del inhibidor del ciclo celular p16INK4a apareció elevada con la edad en las HSC y la evidencia sugiere que este incremento contribuye al potencial reducido de repoblación de las viejas HSC. Todos estos estudios muestran que el efecto del envejecimiento sobre las HSC es un efecto intrínseco que da lugar a que estas células exhiban una menor capacidad de repoblación junto con una alteración en la programación de la diferenciación hematopoyética.

Figura 2. Efecto de la edad sobre los diferentes componentes del sistema inmune innato y

adaptativo. Las células madre hematopoyéticas de la médula ósea (HSC), dan lugar a los progenitores hematopoyéticos en respuesta a diferentes señales. Los defectos asociados al envejecimiento se muestran en los diferentes estados del desarrollo hematopoyético. CLP, precursor linfoide común; CMP, progenitor linfoide común; DN, doble negativo; ETP, precursor tímico temprano; HSC, célula madre hematopoyética; Ig, inmunoglobulina; IFNγ, interferón gamma; NK, células naturales asesinas; RAG, gen activador de la recombinación; ROS, especies reactivas de oxígeno; SP, positivo sencillo, TCR, receptor de células T. (Aw et al, 2008, modificado)

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5. El impacto de la edad sobre la inmunidad innata

Aunque los cambios durante el envejecimiento en el sistema inmune adaptativo están bien documentados, el análisis detallado del impacto de la edad sobre el sistema inmune innato permanece aún sin resolver. Las características clínicas de la inmunosenescencia indican claramente una disfunción en la inmunidad innata y en los últimos años varios estudios han intentado ocuparse de este tema. Estas investigaciones han demostrado que el envejecimiento va asociado con una elevada producción de citoquinas por los macrófagos (Figura 3). Elevados niveles de estos mediadores parece que son los responsables de la mayor parte de las enfermedades relacionadas con la edad, tales como diabetes, osteoporosis y aterosclerosis, porque todas ellas comparten una patogénesis inflamatoria, que como resultado de la continua producción de mediadores inflamatorios, puede desencadenar enfermedades inflamatorias asociadas. Además, datos más recientes sugieren que el balance entre las citoquinas pro- y anti-inflamatorias puede ser usado para evaluar la fragilidad y mortalidad de pacientes ancianos.

Figura 3. El proceso de inmunosenescencia se acompaña de cambios en el fenotipo y

función de las células, tanto del sistema inmune innato como del adaptativo, como consecuencia de un complejo proceso de remodelado. Aunque el deterioro de los componentes de la respuesta adaptativa es más aparente, también la función de los componentes de la respuesta innata se encuentra afectada por la edad. La producción incrementada de citoquinas por los macrófagos es, en gran parte, responsable de muchas enfermedades inflamatorias relacionadas con la edad. IL, interleuquina; NK, Célula natural asesina; M, macrófagos; Tc, linfocito T citotóxico; Th, linfocito auxiliar; GM-CSF, factor de crecimiento de colonias de granulocitos y macrófagos; IFNγ, interferon gamma (Solana-Lara 2004).

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Una serie de estudios han sugerido también que existe menor capacidad fagocítica y menor producción de anión superóxido por los macrófagos, por efecto de la edad, y también que otra de las características de estos fagocitos incluye la expresión de receptores Toll-like. De igual manera, la activación de los neutrófilos por formil-metionil-leucil-fenilalanina (FMLP) está alterada en individuos viejos y asociada a una reducción en la movilización intracelular del Ca2+. Debido a tales deficiencias, se sugiere que es el medio ambiente, con hormonas y citoquinas, el que juega un papel clave, sobre la actividad funcional de estas células. Además, Butcher y Lord han propuesto que el elevado ritmo de infecciones después de la fractura de cadera en individuos de edad avanzada, es el resultado de la disfunción de los neutrófilos, lo cual se atribuye a los elevados niveles de cortisol circulante presente en estos individuos. La hormona adrenal el sulfato de dihidroepiandrosterona (DHEAS), que intensifica la función inmune, tiene un efecto opuesto al cortisol. Incluso en traumas de pacientes jóvenes el incremento de cortisol se controla por la producción de DHEAS. Sin embargo, la producción de DHEAS está notablemente reducida con la edad y de esta manera, el efecto inmunosupresor del cortisol no puede ser contrarrestado en ancianos después de la lesión.

Dado el papel esencial que juegan las células naturales asesinas (NK) en la

inmunidad, no es razonable asumir que las manifestaciones clínicas atribuidas a la inmunosenescencia, puedan también ser el resultado de alteraciones dependientes de la edad en el número y función de las células NK. Se ha demostrado que el número de estas células se eleva de manera significativa con la edad, pero los cambios en su función estan menos claros. En algunos casos existen descripciones discrepantes y conflictivas, pero recientes y contrastados estudios indican que en individuos de edad avanzada está deprimida la función de las células NK. Tales informes han demostrado alterada citotoxicidad y reducida producción de citoquinas y quimioquinas por las células NK activas. Esto puede ser atribuido a la expansión de diferentes subgrupos de células NK porque se ha descrito que en individuos de edad avanzada existe una proporción incrementada del subgrupo de células NK CD56–, las cuales exhiben actividad citolítica más baja y tienen una capacidad reducida para secretar citoquinas en comparación con el subgrupo CD56+, de células NK

6. Alteraciones del desarrollo de las células B

Es esencial que las HSC en la médula ósea generen células B tempranas a

través de precursores linfocíticos comunes. Estos precursores se convierten en

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células Pro-B en la médula ósea por reordenamiento genético de la cadena pesada de la inmunoglobulina y posteriormente se diferencian en células Pre-B (Figura 1), las cuales entonces migran a la periferia. La transición a los estados Pro-B y Pre-B dependen de la actividad de los genes activadores de la recombinación RAG1 y RAG2. La inmunidad humoral en pacientes ancianos está severamente comprometida como resultado de dos mecanismos:

1. producción disminuida de linfocitos B productores de

inmunoglubulinas a largo plazo, debido a deficiencias intrínsecas y medioambientales y

2. pérdida de la diversidad y afinidad de la inmunoglobulina, como resultado de la alteración en la formación del centro germinal.

La disminución en la producción de las células Pre-B ha sido bien

establecida, aunque durante cierto tiempo se ha presumido que era consecuencia de la capacidad disminuida que tenían las células B para diferenciarse. Sin embargo, esto no puede ser la única razón, porque Miller y Allman han descrito una disminución en la frecuencia y número absoluto de células Pro-B en los reservorios para el linaje de células B, con reducciones marcadas observadas en ratones de solo 7 meses de edad. Más recientemente, Min et al. han demostrado que la producción, tanto de células Pro-B como de Pre-B está severamente alterada en ratones viejos, que se recuperan del tratamiento inducido con 5-fluorouracilo y tales deficiencias asociadas a la edad en las células Pro-B, pueden ayudar a explicar una reducción en el número de células Pre-B. Algunos estudios han subrayado también la pérdida del RAG mRNA en preparaciones totales de médula ósea obtenidas de ratones viejos. Otros estudios utilizando quimeras recíprocas de médula ósea han llevado a Labrie et al. a emitir la hipótesis que la expresión de RAG (gen activador de la recombinación) en células Pro-B está controlada por el mismo microambiente, más bien que ser una deficiencia intrínseca de los progenitores senescentes de las células B. La evidencia que apoya esta hipótesis, procede de cultivos de células del estroma, porque los cultivos de células de animales viejos son menos eficientes en el mantenimiento de la proliferación celular, que los de células de animales jóvenes. No obstante, otros estudios han sugerido la existencia de deficiencias en factores de transcripción en los precursores senescentes de las células B. Los factores E2A y Pax-5 son cruciales para la linfopoyesis B, porque ellos acompañan la diferenciación, proliferación y supervivencia de células B tempranas después de la interacción del receptor de la interleuquina 7 (IL-7). La expresión reducida de los productos de E2A (E47 y E12) y Pax-5 (proteína activadora específica de células B; BSAP) se ha demostrado en células B

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periféricas de ratones viejos.

El impacto del envejecimiento sobre las células B periféricas presenta

muchas facetas porque el número de células B exportadas desde la médula ósea es ya reducido, exacerbándose los defectos a medida que transcurre la edad. A pesar de la disminución cuatro o cinco veces en la producción de células B en el ratón viejo, el número de células B periféricas permanece relativamente constante. Una razón puede ser que el reservorio de células B periféricas esté ya saturado de manera similar a lo que ocurre en la homeostasis de las células T. Sin embargo, otra explicación posible es, que a pesar de que se refleje una disminución en la generación de células B esto vaya acompañado de un incremento en la longevidad de las células B periféricas. Además, de las expansiones oligoclonales de las células B asociadas con la expresión de CD5, la producción de la inmunoglobulina independiente de las células T y la producción de autoanticuerpos de baja afinidad, se sabe que ocurre en individuos viejos para ocupar nichos, los cuales entonces no pueden ser ocupados por otras células B. Muchos otros defectos intrínsecos de las células B se han descrito también en ratones y humanos viejos, incluyendo la reducción de moléculas coestimuladoras, deficiencias en el receptor señalizador de las células B y baja afinidad de las inmunoglobulinas. Además las interacciones célula T/célula B se sabe que está alterada en ratones y en humanos viejos. Tales defectos en la función de las células T auxiliares, asociados al envejecimiento, afecta de manera significativa la inmunidad humoral porque se requieren para la formación del centro germinal y producción de factores solubles.

7. Timo, desarrollo de las células T y envejecimiento

De todos los cambios asociados al envejecimiento en el sistema inmune, la

regresión del timo es el más dramático, ubicuo y reconocible. La reducción del tamaño del timo durante el envejecimiento fue documentado incluso antes de que se estableciera la función del timo. Paradójicamente, la reducción del tamaño del timo observada en individuos viejos y en aquellos que habían muerto de enfermedad fatal, fue considerada normal, mientras que las muertes súbitas sobre la mesa de operaciones fueron atribuidas comúnmente al gran timo que impedía el respirar. La atrofia crónica del timo se acepta ahora como un proceso ancestral evolutivamente conservado y el impacto sobre la inmunosenescencia, junto con la caracterización de los estados y mecanismos implicados, se encuentran bajo un intenso escrutinio.

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El timo es el lugar primario del desarrollo de las células T, capaz de generar células auto tolerantes, auto restringidas en el complejo principal de histocompatibilidad, e inmunocompetentes. Las células tímicas epiteliales altamente queratinizadas (TEC), constituyen el subcomponente principal del estroma tímico altamente acreditado, porque proporciona el microambiente favorable que estimula el desarrollo de las células T. Mediante una combinación de contacto célula-célula y producción de factores solubles, las TEC crean nichos discretos en el timo para dirigir las múltiples etapas de la timopoyesis, como se refleja por la distribución de los timocitos en desarrollo.

Precursores tímicos tempranos (ETP) procedentes de las HSC en la

médula ósea, entran en el timo mediante unión cortical-medular y migran a la zona cortical más externa. Estos precursores, ya dentro del timo, se diferencian, en otro subgrupo denominado células dobles negativas (DN), que no expresan CD4 o CD8. El subgrupo DN puede dividirse posteriormente según la expresión de CD44 y CD25 con las secuencias de maduración CD44+ CD25– (DN1), CD44+ CD25+ (DN2), CD44– CD25+ (DN3) y CD44– CD25– (DN4), que identifican los estados de expansión que lo compromete al linaje de células T y a la reorganización de los genes del receptor de células T (TCR). La mayoría de los timocitos se encuentran en la corteza después de la activación de CD4 y CD8 para convertirse de timocitos dobles positivos (DP) y sufren rigurosos procesos de selección. A partir de aquí continúan hasta la médula donde se diferencian en células T sencillas positivas SP CD4+ o SP CD8+ y esperan ser exportadas a la periferia (Figura 2).

Con la edad existe una disminución en el espacio epitelial y en la cantidad

de células del timo, lo que se denomina involución tímica. En ratones, la pérdida del espacio tímico epitelial está causada por una gran reducción del tamaño del timo, mientras que en el timo humano existe un incremento en el espacio perivascular, que se reemplaza de manera progresiva con grasa en pacientes de edad avanzada. A pesar de la reducción en el área funcional del timo con la edad, el timo demuestra todavía productividad de células T, aunque a un menor ritmo. La continua persistencia del receptor de células T con círculos positivos de escisión (TREC+), que representan a los recientes emigrantes tímicos (RTE), se encontró en sangre periférica de personas de edad. Los inconvenientes de usar el análisis TREC, incluyendo la inclusión de células vírgenes de larga vida, fue superado mediante un modelo de ratón transgénico con un transgen de proteína fluorescente verde (GFP), bajo la expresión del promotor RAG-2, donde RTE retenía altos niveles de GFP que se desvanecían en unas tres semanas. Los RTE fueron claramente detectables en ratones de dos

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años y controlaron la pérdida del tamaño del timo, siendo el rendimiento relativamente independiente de la edad, ya que se calcula por el número de RTE esplénico por 100 timocitos DP.

Hoy se tiene evidencia contrastada que la involución del timo no se

corresponde con la pubertad, como se asumió previamente. En el timo de ratón se observó una disminución significativa en el número de células a las seis semanas de edad. En humanos la disminución en la densidad celular tímica comienza a los 9 meses de edad y parece que se realiza mediante varias fases de regresión rápida (de los 9 meses a los 10 años y de los 25 a los 40 años) y de atrofia más lenta (entre los 10 y 25 años y por encima de los cuarenta). A pesar de estos datos sobre los acontecimientos de la atrofia del timo, los mecanismos que controlan el proceso permanecen aún sin aclarar. Se ha propuesto un número de candidatos, que se discutirá a continuación:

¿Proceden estos defectos de las HSC de la médula ósea? El impacto de las HSC sobre la involución del timo es un debate

contencioso que hasta el momento solo ha dado datos conflictivos. Originalmente, Tyan describió una disminución en la capacidad de la médula ósea envejecida de reconstituir las poblaciones de células T en animales letalmente irradiados. Aportando credibilidad a estos estudios, las HSC purificadas procedentes de ratones viejos mostraron un potencial de diferenciación disminuida hacia linajes linfoides in vivo e in vitro. Entre las células DN están los progenitores tímicos tempranos (ETP), que disminuyen en frecuencia y número total en ratón viejo. Además, las ETP del ratón viejo no fueron eficientes en la generación de timocitos DP y SP. Sin embargo, una serie de estudios que transfieren la médula ósea de animales jóvenes a animales viejos irradiados letalmente, han mostrado que la repoblación tímica y esplénica y las respuestas mitogénicas fueron mucho más bajas en los receptores viejos. Además, la médula ósea de animales jóvenes, inyectada en animal viejo, no fue capaz de restaurar las anormalidades histológicas del timo. Por tanto, se sugiere que existen también deficiencias asociadas a la edad en las células del estroma.

¿Es responsable la IL-7? La IL-7, producida por las células epiteliales tímicas (TEC), es una

citoquina vital para el desarrollo de los timocitos, ya que controla las fases tempranas de la timopoyesis y se ha demostrado que declina con la edad. Es interesante destacar que el tratamiento de ratones con anticuerpos anti IL-7 dio como resultado un fenotipo similar al de la involución del timo. Por el

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contrario, inyectando a los ratones viejos IL-7 exógena, se consiguió elevar el peso y la densidad celular del timo. Se ha descrito un incremento en células TREC+ CD8+ T en la periferia después de 14 días del tratamiento con IL-7. Existe también la dificultad de distinguir los efectos de la IL-7 sobre la timopoyesis partiendo de las respuestas periféricas, por tanto, las células del estroma del timo preparadas para expresar constitutivamente IL-7 se trasplantaron en ratones y se controló la atrofia tímica. A pesar de la elevación en el número de timocitos CD25+ DN en ratones viejos implantados, no se encontró ningún cambio en el ritmo o grado de involución del timo y el número total de timocitos y el rendimiento tímico fueron similares en los ratones transplantados y en controles. Por consiguiente, la IL-7 puede rescatar la deficiencia temprana en la timopoyesis del ratón viejo, pero fracasa en el caso de regenerar el timo.

¿Un problema hormonal? En asociación con las células T regenerantes, el timo se reconoce como

una glándula endocrina, sensible al control hormonal y capaz de la producción endógena de algunas hormonas con varios receptores expresados en el estroma tímico y en los timocitos. Dada la evidencia circunstancial de que el declinar en los niveles circulantes de hormona del crecimiento (GH) coincide con la presumida iniciación de la atrofia tímica, se ha propuesto que la GH puede estar implicada. Además, se ha demostrado que la GH y su mediador el factor de crecimiento insulínico (IGF-1), estimulan la timopoyesis en animales jóvenes. Células GH3 de adenoma pituitario (que secretan GH), procedentes de un modelo de ratón, cuando se implantaron en ratas de 22 meses, el tamaño del timo aumentó, así como el número de células. En ratones viejos el tamaño y el número de células del timo incrementaron después de la administración de GH; sin embargo, la recuperación estuvo lejos de conseguir los valores del ratón joven, lo que implica que el papel de la GH en la involución del timo es limitada. Por último, estudios con ratones pequeños (con una deficiencia del 90% en GH e IGF-1 en suero), no mostraron cambios en el ritmo de involución.

Por el contrario, los esteroides sexuales son renombrados por tener efectos

perjudiciales sobre los timocitos. En ausencia de hormonas sexuales por castración u ovariectomía, se observó regeneración del timo. Ratones quiméricos con estroma defectivo en el receptor de andrógenos, pero con timocitos del tipo silvestre no sufrieron atrofia del timo, sugiriéndose que el estroma es el objetivo de la regresión inducida por andrógenos. Se ha intentado caracterizar la influencia de los esteroides sexuales en el timo, así que se ha

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observado que el número de ETP, pero no la proporción fue amplificado en ratones castrados de mediana edad, lo que implica que la elevación es a nivel de entrada de las células progenitoras, más que el resultado de su replicación. Además, la arquitectura aberrante tímica se restaura después de la castración. No obstante, existe evidencia suficiente como para sugerir que la testosterona no es el único agente que contribuye a la involución, incluyendo un examen de la atrofia tímica en ratones hipogonadales con producción disminuida de esteroides sexuales, los cuales no presentaron cambios en la cantidad de células o en su distribución al compararlos con animales de tipo silvestre. Se demostró que los efectos de la eliminación de las hormonas sexuales son transitorios en el ratón tipo silvestre con pérdida de efectos positivos después de 20 semanas.

¿Están implicados los cambios en las células epiteliales tímicas (TEC)? Un candidato potencial a tener en cuenta son las células tímicas epiteliales

(TEC). Dado que las TEC constituyen un compartimento integral del estroma tímico y son la fuerza conductora principal de la timopoyesis, es muy importante investigar los cambios asociados a la edad relacionados con las TEC. Si es que existe un declinar en el número de TEC con la edad es algo que tiene que tener una respuesta, y los datos hasta ahora obtenidos in vitro sugieren que el ritmo proliferativo de estas células se reduce en ratones viejos. Un reciente estudio ha demostrado que las células CD45– disminuyen en número con la edad y que la proporción de TEC proliferativas, evaluadas por expresión de Ki67 disminuyen en ratones viejos. Alteraciones en la arquitectura del timo se han observado en ratones y en humanos. Parece que con la edad aparecen en el timo humano acúmulos de fibroblastos y una disminución de las áreas queratina positivas. Esto va acompañado por una distorsión en la unión cortical medular. Además existe en ratones viejos una disminución en los genes de las células TEC, el Foxn1 y en la expresión de la subunidad 8 de la queratina. Estos datos, analizados colectivamente, sugieren que con la edad existe una pérdida cualitativa o cuantitativa de TEC. Además, también se ha encontrado que el grueso de los cambios morfológicos observados, se asocian con alteraciones en la expresión de moléculas críticas tales como el complejo principal de histocompatibilidad clase II y moléculas definidas de las TEC corticales y medulares, que parecen declinar con la edad. Considerando el ritmo exacerbado de atrofia del timo, asociada al envejecimiento, se propone que son muchos y muy diferentes los parámetros que controlan el proceso del envejecimiento, tanto en timo, como en otros órganos y tejidos. Esto está apoyado por análisis de microchips que demuestran que la mayoría de los genes específicos que cambian con el envejecimiento del timo son distintos a los encontrados en otros sistemas. Se sugiere que la

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deficiencia comienza en el mismo timo, ya que, de acuerdo con la teoría del soma desechable, esta deficiencia llega a ser redundante una vez que se ha generado un repertorio significativo de TCR, lo cual ocurre en momentos tempranos de la vida. Estos cambios dan como resultado un desarrollo defectuoso de las células T, el cual, a su vez, tiene un efecto negativo sobre las TEC, debido a que el mantenimiento de la arquitectura tímica, depende de la presencia de timocitos maduros funcionales. Indudablemente, el proceso de la involución del timo es multifactorial y todos los mecanismos discutidos aquí pueden estar implicados con graves repercusiones para las células T periféricas.

8. Deficiencias en células T periféricas Sorprendentemente existen pocos cambios dependientes de la edad en el

número de células T periféricas, especialmente cuando se considera la reducción en el rendimiento del timo con la edad. El tamaño del reservorio de las células T periféricas está estrictamente regulado por diversas variables, incluyendo mecanismos homeostáticos. Tanto las células T vírgenes como las de memoria sufren un control homeostático y en humanos la proliferación constante contribuye de manera significativa al mantenimiento del repertorio del TCR de células T vírgenes. Se ha presumido que los reservorios de células T vírgenes y de memoria eran mantenidos por separado con diferentes requerimientos de supervivencia, que son mucho más estrictos para las células T vírgenes. Un estudio reciente ha revelado que la expansión clonal de las células T CD8+ es la consecuencia de la diversidad de las células T remanentes, particularmente aquellas que comparten el mismo elemento TCR Vβ. Esto tiene un profundo impacto en la diversidad de las TCR. El análisis de la cadena TCR Vβ ha presentado una disminución en el repertorio de reconocimiento de los antígenos, que resultó ser aproximadamente 108 en jóvenes adultos y 106 en adultos viejos, con una contracción drástica en la diversidad de las células TCD4+ en la séptima y octava décadas de la vida. Estudios en ratón han determinado que una disminución de dos a diez veces en la diversidad en estas células es suficiente para poner en peligro la respuesta inmune mediada por una célula T, lo que explica la mayor susceptibilidad de personas de avanzada edad a nuevos patógenos.

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Figura 4. Los linfocitos T periféricos sufren un proceso de senescencia. Mientras que los

linfocitos T vírgenes, con bajo ritmo replicativo son compatibles con un proceso de senescencia post-mitótica independiente de antígeno (Ag), los linfocitos T efectores y de memoria sufren un proceso de senescencia replicativa dependiente de antígeno, que puede llevar al agotamiento clonal (Solana-Lara et al 2004).

Como el mayor requerimiento del reservorio de células T periféricas es la

perpetuación mediante replicación, esto tiene grandes implicaciones para la célula individual. Las células T senescentes, tanto si se trata de senescencia post-mitótica independiente de antígeno (Ag), como de senescencia replicativa dependiente de Ag, puede conducir a una alteración en la producción citoquinas, como también al agotamiento clonal (Figura 4). El examen de la vida media del linfocito muestra variaciones en subgrupos, pero todas son finitas. Las células CD4+ T humanas tienen alrededor de 33 duplicaciones en cultivo, mientras que las células CD8+ T tienen en cultivo solo alrededor de 23. La restricción que dicta la vida media de la célula, se cree que depende de la longitud de los telómeros y el análisis de la longitud de los telómeros, los muestra significativamente más cortos en individuos viejos entre todos los subgrupos de células T. Estas células que han sufrido la senescencia replicativa, acumulan con la edad, particularmente en el subgrupo CD8+ de memoria, muchas alteraciones que son específicas solo a ciertas infecciones persistentes. Un virus que ha atraído especial atención es el citomegalovirus, con gran expansión de clones CMV-específicos CD8+ de células T en el anciano y se ha verificado mediante estudios longitudinales que la seropositividad al CMV identifica aquellos individuos con un fenotipo de riesgo inmune. Los telómeros cortos se relacionan con cambios en el fenotipo, modificaciones en las

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respuestas y resistencia a la apoptosis.

9. ¿Puede ser revertida la inmunosenescencia? Los avances en la investigación de la inmunosenescencia han llevado a

estudiar las terapias potenciales para contrarrestar estas deficiencias en ancianos y pacientes inmunocomprometidos. Como los defectos asociados al envejecimiento parece que derivan parcialmente de las células progenitoras, en teoría algunos de los problemas asociados con la inmunosenescencia pueden ser revertidos al mejorar la cantidad y número de células T vírgenes y de células B productoras de immunoglobulinas. Una terapia de éxito es el trasplante de médula ósea (BMT); sin embargo, la existencia de enfermedad derivada del injerto vs huésped e injerto vs leucemia, hace tropezar a los pacientes receptores del BMT a que permanezca como obstáculo principal, que tiene que ser superado. En ratón, la administración de factores de crecimiento y citoquinas, tal como IGF-I e IL-15, después de trasplante alogeneico de médula ósea se ha comprobado que intensifica la reconstitución inmune, incluyendo a las células NK, NKT y T, asociadas con función activada de las células T y NK, mientras que IGF-I en combinación con IL-7 incrementa enormemente la linfopoyesis de células B. Además, las terapias utilizando factores solubles, tales como la IL-7, pueden ser buenos candidatos para la reconstitución inmune después del BMT, porque Bolotin et al. han descrito la activación de la timopoyesis después de trasplante singeneico de médula ósea al administrar in vivo IL-7, sin agravar la enfermedad injerto vs receptor. Resultados similares se encontraron para las células B y NK después del BMT, en ratones de mediana edad, lo que introduce la esperanza de la resconstitución inmune en la vejez usando después del trasplante citoquinas condicionadoras de monocitos y macrófagos.

Como resultado de un microambiente disfuncional, los perfiles alterados de

citoquinas y deficiencias en la transducción de señales son críticas en el envejecimiento. Numerosos resultados sugieren que la terapia con IL-7, en ratones viejos consiguió rejuvener el timo, aunque nunca hasta el punto de llegar al tamaño y productividad del animal joven. Adicionalmente, los componentes del receptor IL-7 parece que no se expresan en células Pro y Pre-B derivadas de ratón viejo a niveles comparables a los del ratón joven. Así, la terapia con IL-7 puede no ser útil debido a la incapacidad de mantener esta citoquina en el nicho particular y/o a deficiencias señalizadoras en el ratón viejo. De hecho el transductor de señales STAT5 fosforilado por el receptor JAK activado por las IL-7 e IL-2, es probable que sea crucial en la terapia anti-inmunosenescencia, porque su presencia está muy reducida en precursores de

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células B y células T senescentes. Sin embargo, hay que recordar que incluso el evento de reconstitución de la timopoyesis por IL-7/IL-2 y el desarrollo de células B en ratón viejo, no puede ser aplicado en humanos porque la IL-7 no tiene las mismas propiedades en humanos que en ratón. La perspectiva del trasplante del timo, como medio de elevar el número de células T vírgenes parece que es prometedor, tanto en ratones como en humanos que padezcan de disfunción inmune. El trasplante de piezas de tejido tisular tímico, en pacientes pediátricos que sufran del síndrome DiGeorge, parece que también tiene éxito en la restauración de la función inmune hasta 10 años después de la cirugía. Las implicaciones de esta terapia para el tratamiento de la disfunción inmune en el anciano es más compleja, debido a la cantidad limitada de tejido y a la cirugía invasiva que implica el rechazo del tejido. En el ratón, se ha identificado un progenitor multipotente TEC que puede crecer en un timo tridimensional y mantener el desarrollo de células T normales cuando se trasplanta en la cápsula renal de ratones nudos y normales. En humanos, tales células epiteliales progenitoras microambientales no han sido identificadas todavía, pero los intentos para encontrar tales células epiteliales no diferenciadas en el timo postnatal murino, hace que estas investigaciones tengan un altísimo y prometedor interés en la restauración de la función del timo. Existen numerosos estudios que describen la existencia de una relación entre los sistemas inmune y neuroendocrino, colocando el timo como objetivo del control neuroendocrino. Otros resultados parecen apoyar esta hipótesis porque se ha demostrado que la expresión de hormonas neuropeptídicas y tímicas en el timo se encuentran afectadas por la edad y tienen un papel en el desarrollo de las células T a lo largo de la evolución de diferentes especies.

Últimamente ha habido una reemergencia en el interés por el zinc como un

adyuvante terapéutico. Los beneficios del zinc sobre el sistema inmune se han reconocido durante muchos años y también la disminución de la absorción de zinc en individuos de edad avanzada, lo cual ha conducido a proponer el suplemento en la dieta de zinc durante el envejecimiento. Este suplemento ha de ser usado con precaución, ya que mientras que el zinc puede disminuir la apoptosis espontánea en células mononucleares de sangre periférica, produce, sin embargo, un incremento en la apoptosis inducida por estrés oxidativo, que depende de la edad.

Otra terapia interesante está dirigida a los esteroides sexuales, que se sabe

que tienen un efecto notable sobre el tamaño y función del timo durante el envejecimiento y en la modulación de la diferenciación, proliferación y supervivencia de los precursores de las células B. El grupo de Boyd ha

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192

demostrado que la castración de ratones de 9 meses de edad elevó el número de ETP y la proliferación tímica. Aunque esta técnica no tiene aplicaciones en humanos, los análisis de pacientes masculinos que sufren terapia de ablación de esteroides sexuales para al cáncer prostático, han demostrado que esta técnica puede ser útil para elevar las células T vírgenes circulantes en individuos de edad. Además la terapia hormonal puede ser también útil en el tratamiento de disfunciones innatas asociadas a la edad, por ejemplo, suplementos de DHEAS son capaces de elevar la producción de anión superóxido en neutrófilos y puede incrementar la actividad de las células NK. Sin necesidad de cirugía o ablación de esteroides sexuales y sus efectos colaterales intrínsecos, la terapia génica sola o en combinación con otras terapias puede ser más efectiva para restaurar la función inmune en pacientes inmunocomprometidos y en los ancianos. Niños de corta edad con inmunodeficiencia severa asociada al cromosoma X, que recibieron genes retrovíricos dirigidos a la médula ósea, desarrollaron una reconstitución inmune impresionante. Esto muestra que aunque todavía nos encontramos en fases muy tempranas, la terapia génica puede tratar las alteraciones inmunológicas en individuos de edad avanzada e inmunodeficientes.

10. Conclusiones

El declinar de la función inmune por efecto de la edad es un hecho

demostrado en humanos y en animales y se encuentra asociado con una elevada incidencia de enfermedades infecciosas y cáncer. Está demostrado que existen múltiples alteraciones en la función de los linfocitos durante el envejecimiento. Las funciones alteradas más evidentes incluyen la inhibición de la proliferación celular en respuesta a estímulos antigénicos o mitogénicos, la acumulación de células T que carecen de respuesta, la producción alterada de diversas citoquinas, y defectos en la expresión de los receptores de citoquinas y en la transducción de señales. Aunque se han desarrollado diversas teorías para explicar la disminución en la función de las células T por efecto de la edad, apenas se ha relacionado este declinar en la función inmune con la lesión oxidativa mediada por las ROS. La teoría de los radicales libres y el envejecimiento se acepta ampliamente y puede ser crucial para explicar la inmunosenescencia. El estado de estrés oxidativo induce la muerte de linfocitos en cultivo y la tasa de muerte en estas condiciones es mayor en cultivos celulares procedentes de animales viejos. Esto sugiere que un incremento en el estrés oxidativo puede ser el responsable de la disminución de la función de las células T y puede explicar la inmunosenescencia.

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A pesar de que el estudio de la immunosenescencia es algo todavía muy reciente, los avances en estos últimos años han conseguido profundizar en el conocimiento de los mecanismos que se encuentran implicados. El profundo cambio que se ha verificado, desde la fase meramente descriptiva de investigación, hasta encontrar los factores causales está reportando un enorme beneficio a una población en continuo incremento con un promedio de expectativa de vida cada vez mayor. Un mejor conocimiento de las señales que gobiernan y dictan la disfunción inmune y la senescencia, particularmente desde el microambiente, puede ser la clave del éxito de la reconstitución del sistema inmune en el futuro.

11. Abreviaturas

Ag, antígeno; APC, células presentadoras de antígenos; BMT, trasplante

de medula ósea; BSAP, proteína activadora específica de las células B; CLP, precursor común de linfocitos; CMV, citomegalovirus; CTL, linfocito T citotóxico; DHEAS, sulfato de dihidroepiandrosterona; DN, doble negativo; DP, doble positivo; ETP, progenitores tímicos tempranos; FMLP, formil-metionin-leucil-fenilalanina; GM-GSF, factor de crecimiento de colonias de granulocitos y macrófagos; GFP, proteína fluorescente verde; GH, hormona del crecimiento; HSC, células madre hematopoyéticas; Ig, inmunoglobulina; IGF1, factor insulínico1; IL, interleuquina; IFNγ, interferón gamma; NK, células naturales asesinas; RAG, gen activador de la recombinación; ROS, especies reactivas de oxígeno; RTE, emigrantes tímicos recientes; SP, sencillo positivo; STAT, transductor de señales y activador de la transcripción; TCR, receptor de células T; TEC, células tímicas epiteliales, TREC, círculos de escisión del receptor de células T;

12. Bibliografía

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Capítulo 7. ENVEJECIMIENTO Y CÁNCER: DOS CARAS DE LA MISMA MONEDA

1. Introducción 2. Envejecimiento y cáncer. Origen común. 3. Mecanismos protectores del envejecimiento y el cáncer 3.1. Eficiencia metabólica, nutrientes y mitocondria 3.2. Defensas antioxidantes 3.3. Supresores tumorales 3.4. Inestabilidad genómica 3.5. Autofagia 3.6. El metabolismo energético conecta envejecimiento y cáncer 4. Mecanismos opuestos en la protección al envejecimiento y al cáncer 4.1. Papel de los telómeros 4.2. Desrrepresión de genes supresores 5. Conclusiones 6. Abreviaturas 7. Bibliografía 1. Introducción A primera vista el cáncer y el envejecimiento parecen ser las dos caras

de una misma moneda. El origen de esta unión está en la conexión entre la senescencia celular y la tumorigénesis, el papel común de la inestabilidad genómica, el acortamiento telomérico y el papel central de la mitocondria y de la transducción de señales dependiente de energía en ambos procesos. Es un hecho reconocido que ambos, envejecimiento y cáncer tienen su origen en el acumulo de daño celular. Por tanto, aquellos mecanismos que eviten la agresión, proporcionan protección tanto frente al envejecimiento como frente al cáncer. Por otro lado, tanto la longevidad y el cáncer dependen de un potencial proliferativo, lo cual hace que aquellos mecanismos que limitan la proliferación indefinida, protegen del cáncer y protegen también de la longevidad. La protección ante el cáncer supone un beneficio para la supervivencia del organismo, mientras que evitar la longevidad promueve la aparición de los achaques del envejecimiento. El balance entre estos mecanismos es lo que garantiza que la mayoría de los organismos puedan verse libres del cáncer y del envejecimiento, hasta avanzadas sus vidas.

De acuerdo con la teoría evolutiva del soma desechable los mecanismos

que retrasan el envejecimiento y protegen del cáncer han adaptado sus

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199

respectivas fuerzas a la esperanza de vida natural de cada especie y de esta manera, estos mecanismos aseguran que la mayoría de los individuos no envejezcan y no padezcan cáncer, en tanto en cuanto sean útiles para sus especies. Si comparamos los mamíferos de vida corta, como los ratones, con los de larga vida, como los humanos, esta claro que los sistemas implicados en la protección del cáncer y del envejecimiento han de ser más rigurosos y estrictos en los humanos que en los ratones. Es por tanto, importante destacar, que estos mecanismos de protección frente al cáncer y los que promueven una longevidad saludable, han tenido que evolucionar en paralelo, como las dos caras de una misma moneda y se han tenido que ir acomodado a la expectativa de vida natural de cada especie.

2. Envejecimiento y cáncer. Origen común Cada vez es más evidente que envejecimiento y cáncer están

íntimamente conectados mediante la actividad de genes específicos y las respuestas celulares a las posibles agresiones oncogénicas. Sin embargo, envejecimiento y cáncer permanecen completamente separados en lo que se refiere a la investigación y estudio de los mecanismos intrínsecos y extrínsecos de su desarrollo. En los últimos años está surgiendo con fuerza un reconocimiento que el envejecimiento y el cáncer están conectados por una compleja e intrigante interrelación, y en los dos años últimos una serie de publicaciones ha mostrado la complejidad de esta interrelación, la cual no es necesario decir, que en los nuevos hallazgos también se desentrañan nuevas posibilidades y estrategias de intervención.

No obstante, este paralelismo en la evolución de los sistemas implicados

en la protección del cáncer y del envejecimiento, tiene raíces más profundas que la simple adaptación de dos procesos independientes. Recientemente se ha desvelado la existencia de mecanismos convergentes que proporcionan resistencia al cáncer y resistencia al envejecimiento, acoplando así su evolución. Estos mecanismos actúan en causas comunes del cáncer y del envejecimiento, como son la generación y el acumulo de daño celular. Como la lesión o daño celular está en los orígenes, tanto del cáncer como del envejecimiento, aquellos mecanismos que previenen o evitan el daño celular inciden sobre estos dos procesos y les proporcionan protección. Entre éstos están los que mejoran la eficiencia del consumo de energía y disminuyen la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), que son consideradas como la fuente principal de lesión endógena. También, el supresor de tumores p53 es un sensor importante, que en el momento que detecta lesión

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200

en el DNA, desencadena respuestas de reparación y defensa. Está claro, por tanto, que aquellos sistemas, mecanismos o intervenciones que aminoran la concentración de ROS o promueven la actividad de p53, proporcionan protección frente al cáncer y frente al envejecimiento.

Sin embargo, existen otros mecanismos que tienen efectos opuestos ante

el cáncer y ante el envejecimiento, es decir, protegen del cáncer (efecto positivo), pero promueven el envejecimiento (efecto negativo). Estos mecanismos son el acortamiento de los telómeros y la desrrepresión del locus INK4a/ARF (CDKN2A), cuyo propósito es prevenir la proliferación celular excesiva y esto produce efectos conflictivos entre cáncer y envejecimiento: mientras que el efecto ante al cáncer es beneficioso para el individuo, la renovación celular a largo plazo y la longevidad se encuentran comprometidas. Sin embargo, hay que tener en consideración, que estos mecanismos están principalmente diseñados para prevenir el cáncer, pero no para promover el envejecimiento. Muchos de los mecanismos que protegen del cáncer consiguen su efecto eliminando células lesionadas, potencialmente neoplásicas, mediante muerte celular por apoptosis o mediante senescencia celular. Las células senescentes pueden ser eliminadas eficientemente del organismo y por tanto, se asume que los mecanismos inductores de la senescencia son necesariamente pro envejecimiento, y que los mecanismos inductores de la apoptosis pueden ser o no ser deletéreos para el organismo. La eliminación de las células dañadas, bien por senescencia o por apoptosis pueden favorecer o no el envejecimiento, dependiendo de la magnitud de la respuesta y la capacidad de regeneración del tejido lesionado.

3. Mecanismos protectores del envejecimiento y el cáncer El acumulo de lesiones celulares es, sin duda, el evento iniciador del

cáncer y del envejecimiento. La tumorigénesis se desencadena por el acumulo de lesiones genéticas y epigenéticas. De igual manera el envejecimiento surge, al menos en parte, debido al acumulo de lesiones en las macromoléculas celulares, que afecta inicialmente a las proteínas, lípidos y DNA, y eventualmente altera la regeneración tisular. Así que, aquellos mecanismos que protegen las células de la lesión, pueden proteger del cáncer y del envejecimiento de manera simultánea. En este aspecto, es importante considerar que los organismos de larga vida, son en términos generales más resistentes al estrés.

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201

3.1. Eficiencia metabolica, nutrientes y mitocondria La disponibilidad de nutrientes ejerce efectos importantes sobre el

metabolismo celular y sobre la eficacia de la mitocondria. En condiciones de dieta restringida los niveles de ADP se elevan y el influjo de ADP en la mitocondria conduce la eficiente actuación de la cadena de transporte electrónico. Por el contrario, un exceso de nutrientes se traduce en una baja demanda de energía, una actuación de la mitocondria por debajo de lo óptimo y como consecuencia mayor liberación de ROS.

Por otro lado, el mecanismo principal que gobierna el envejecimiento, es

el impacto de la hormona del crecimiento (GH) y del factor insulínico 1 (IGF1), ya que la baja actividad GH/IGF1 promueve una mayor eficiencia en la respiración mitocondrial y menor generación de ROS. Una importante patología cuya mejora se asocia con la baja actividad GH/IGF1 es el “síndrome metabólico” asociado al envejecimiento y a elevados niveles de glucosa y lípidos en sangre. La mayor eficiencia metabólica, la actuación óptima de la mitocondria (menos producción de ROS) y la disminución del síndrome metabólico, son factores importantes que retrasan el envejecimiento. En apoyo a lo anteriormente descrito, se ha demostrado que ratones con deficiente señalización por la insulina, presentan una vida más larga, y también que ratones sometidos a regímenes anti-diabéticos muestran retraso en el envejecimiento y vida más larga. El concepto de mejora en la eficiencia metabólica, que se traduce en menos ROS endógenos y longevidad, se aplica también a las dietas hipocalóricas y a la proteína desacetilasa SIRT1 que retrasa el envejecimiento en todas las especies ensayadas. La desacetilasa dependiente del NAD, SIRT1, se considera un sensor importante de la dieta y un mediador de la mayor longevidad dependiente de la dieta restringida. SIRT1 detecta la disponibilidad de nutrientes por mecanismos que están aún en investigación, pero está demostrado que la abundancia de NAD es necesaria para la actividad enzimática de SIRT1, como también para la activación transcripcional del gen SIRT1 por un complejo formado por forkhead box, FOXO3 y p53.

Frente a la escasez de nutrientes se desencadena un programa

metabólico, mediado en parte, por asociación de SIRT-1 con el coactivador PGC1α. SIRT1 desacetila y activa a PGC1α y una vez activado se traslada el núcleo donde se une a un factor de transcripción y promueve la expresión de genes. El resultado es una mayor eficiencia metabólica, mejor funcionamiento de la mitocondria y reducida generación de ROS. El

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202

resveratrol es una fitoalexina procedente del Polygonus cuspidatum, presente en las uvas, vino, nueces, etc., que puede ser consumido con la dieta y muestra notable actividad frente al envejecimiento, aunque a concentraciones mucho más elevadas que las presentes en el alimento. El resveratrol activa a SIRT1 y con ello alarga la vida de levaduras, gusanos, moscas y peces, y también de ratones incluso alimentados con dietas hipercalóricas.

La sobreexpresión de la proteína secretada KLOTHO se ha descrito que

retrasa el envejecimiento en ratones, al intervenir rebajando la actividad de la vía IGF1–insulina. La familia FOXO de factores de transcripción merece ser mencionada por su posible papel mediador de la longevidad y protección del cáncer. Las proteínas FOXO se activan mediante varios estímulos a través de un mecanismo que implica la vía Jun quinasa, y su asociación y desacetilación por SIRT1. Por el contrario las proteínas FOXO son inactivadas por factores de crecimiento, tales como la insulina, a través de la AKT quinasa. Las proteínas FOXO tienen muchos objetivos transcripcionales, que incluyen enzimas gluconeogémicos y antioxidantes. El homólogo de FOXO en gusanos y moscas es suficiente para proporcionarles un alargamiento de la vida, lo cual explica, al menos en parte, cómo la baja señalización de la insulina media efectos anti-envejecimiento.

Lo anteriormente mencionado lleva a proponer que, diversas

manipulaciones genéticas, tales como las de aminorar las actividades de GH, IGF1 y del receptor de la insulina y de incrementar las de FOXO, SIRT1 y KLOTHO, así como la administración de antidiabéticos, dietas hipocalóricas y resveratrol, comparten en común la capacidad de retrasar el envejecimiento y alargar la longevidad. (Figura 1). El impacto de estas manipulaciones en la resistencia al cáncer está todavía en estudio, pero existe suficiente evidencia que indica que la mejora de la eficacia metabólica proporciona protección al cáncer. En particular, existen pruebas que demuestran la actividad de los antidiabéticos, las dietas hipocalóricas y el resveratrol, en la protección al cáncer, previniendo o retrasando varios tipos de cáncer en ratón. Es de destacar una evidencia preliminar en el caso de antidiabéticos como protectores al cáncer en humanos. Además recientes estudios indican que tres proteínas relacionadas con FOXO, FOXO1, FOXO3 y FOXO4 tienen actividad potente de protección frente al cáncer.

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203

Aunque el panorama actual es todavía incompleto, se sugiere que mejorando la eficacia del metabolismo celular, se consigue menor daño endógeno lo cual proporciona protección frente el envejecimiento y el cáncer (Figura 1).

Figura 1. Envejecimiento y cáncer. Una fuente importante de daño a las células

proviene del metabolismo, mediante la producción de ROS, que causan lesión macromolecular (proteínas, lípidos y DNA). El daño endógeno es causa de ambos envejecimiento y cáncer. Aquellos mecanismos que disminuyen las causas del daño endógeno, disminución de ROS de GH y de señalización IGF1, dieta hipocalórica, estrategias antioxidantes y señalización por p53, protegen las células del envejecimiento y del cáncer (Serrano y Blasco 2007, modificado)

3.2. Defensas antioxidantes. La conexion entre daño oxidativo y envejecimiento ha sido un tópico de

intensa investigación. Las ROS se generan a lo largo de la vida y causan continuo daño a los integrantes macromoleculares de la célula (proteínas, lípidos y DNA). El ritmo de producción de ROS se eleva con el envejecimiento, debido en parte, a diversas alteraciones en la cadena de transporte electrónico mitocondrial asociadas al propio envejecimiento, lo cual, a su vez produce daño en la mitocondria. Esto crea un círculo vicioso,

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cuyo final es un progresivo incremento en las ROS y en la lesión oxidativa derivada de ellas, que se refleja en la propia mitocondria (Figura 1)

A pesar de los intentos para entender la conexión entre el daño oxidativo

y el envejecimiento, hay pocos ejemplos de manipulación genética en ratones que disminuyan directamente el daño oxidativo y alarguen la vida. Los ejemplos más notables son los ratones deficientes en p66Shc y los ratones que sobreexpresan catalasa. p66Shc es una proteína multifuncional que se localiza en el espacio intermembrana de la mitochondria donde actúa como proteína redox, que interacciona con el citocromo c y recibe electrones, que son posteriormente transferidos al oxígeno y se generan ROS. La catalasa, es una enzima cuya misión es eliminar H2O2 (peróxido de hidrógeno, una especie reactiva de oxígeno), y los ratones que sobreexpresan catalasa muestran un retraso en el envejecimiento. También los ratones que expresan tioredoxina humana tienen más larga su expectativa de vida y su longevidad máxima. Por último, debe mencionarse que la administración de antioxidantes en la dieta retrasa el envejecimiento en gusanos y moscas, pero hasta hoy no se ha demostrado en ratón. Estos datos aportan la suficiente evidencia para responsabilizar al daño oxidativo como una de las causas de envejecimiento.

La resistencia al cáncer no se ha relacionado en los ratones

anteriormente mencionados con la longevidad, aunque sus más largas vidas implica que no existe incremento en la susceptibilidad al cáncer. Sin embargo, la administración de antioxidantes en la dieta, particularmente N-acetilcisteína, es una potente intervención anti-cáncer en ratones y se ha demostrado que proporciona protección frente a cánceres inducidos por carcinógenos y frente a linfomas que fueron producidos en ausencia de p53 o de ataxia telangiectasia mutada (ATM) quinasa. Finalmente, debe destacarse que los efectos del resveratrol sobre la protección al cáncer y al envejecimiento pueden ser mediados a través de su conocida actividad antioxidante. En resumen, la evidencia disponible sugiere que los antioxidantes puede retrasar tanto el cáncer como el envejecimiento (Figura 1).

3.3. Supresores tumorales La proteína p53 es la quintaesencia de los supresores de tumores, cuya

actividad se ha perdido en muchos cánceres humanos. Su misión es la de maestro integrador del estrés celular con la capacidad de orquestar un amplio

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espectro de respuestas defensivas. La proteína p53 es normalmente inactiva, debido a su rápida degradación por la específica ubiquitina ligasa MDM2. Una multitud de situaciones de estrés convergen en p53 a través de una compleja vía de señalización, solo parcialmente conocida, que estabiliza y modifica p53. El supresor tumoral p19ARF es también relevante en este aspecto, está codificado por el locus INK4a/ARF, se une e inhibe a MDM2, y estabiliza p53. Después de ser activada por estrés, p53 gana completa competencia transcripcional y activa un amplio espectro de genes objetivo. Los objetivos transcripcionales de p53 son los que van a poner en práctica la respuesta celular: reparación del DNA, parada proliferativa transitoria, senescencia o apoptosis, etc., que dependerá del tipo e intensidad del estrés y de su efecto sobre la célula. Poniendo el ejemplo de objetivos antioxidantes y pro-oxidantes: el estímulo por estrés oxidativo de baja intensidad que no compromete la viabilidad celular, es suficiente para que p53 active objetivos antioxidantes. En caso de estimulo de alta intensidad, p53 activa objetivos pro-oxidantes que participan en el desencadenamiento de la muerte celular. La tumorigenesis ha de ser considerada como un proceso gradual mediante el cual las células adquieren la capacidad de sobrevivir y proliferar en condiciones de estrés. Situaciones de estrés incluyen estrés oxidativo, carencia de nutrientes y oxígeno, ataque por células inmunes, carencia de inserción propia a otras células o a la matriz extracelular, daño al DNA, señales oncogénicas, metabolismo aberrante etc. La proteína p53 reacciona ante todas estas situaciones; primero, mediante programas transcripcionales que intentan reestablecer la homeostasis, y después, si el estrés persiste, previniendo la propagación de las células dañadas por apoptosis o senescencia.

Un tópico emergente de relevancia potencial para la protección frente al

envejecimiento es el programa transcripcional mantenido por la proteína p53 basal (basal se refiere a la actividad de p53 frente a una situación endógena de estrés normal). Esta actividad basal de p53 incluye un grupo de genes (SCO2, SENS1 y SENS2, AIF, TIGAR, ALDH4 y otros), cuyo efecto final combinado es mejorar la eficiencia de la respiración mitocondrial y disminuir la generación de ROS. Así, p53 no solo proporciona protección al estrés aberrante, tal como durante la tumorigénesis, sino también en el daño endógeno que ocurre en cada momento de la vida. Dado el papel central que juega p53, no sorprende que su manipulación en modelos de ratón esté proporcionando un cuadro complejo de datos. Los modelos de ratón disponibles con elevada actividad p53 se pueden agrupar en dos categorías. Primera, son aquellos en los que p53 retiene sus controles reguladores

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normales, lo que significa que depende todavía de la presencia de señales de estrés para conseguir su completa actividad, que incluye la capacidad de desencadenar la apoptosis y senescencia. Segunda, son aquellos modelos en los que la secuencia de aminoácidos de p53 ha sido modificada con la eliminación de su región N-terminal, que se requiere para interaccionar con MDM2, lo que indica que la actividad p53 es parcialmente independiente de las señales de estrés. Ambos grupos de modelos de ratón comparten el fenotipo de ser más resistentes al cáncer, pero tienen fenotipos diferentes de envejecimiento. En el caso del ratón con elevados niveles de p53 normalmente regulada, el envejecimiento no está acelerado, mientras que en el caso de ratones con actividad p53 alterada, el envejecimiento si lo está.

Aquí queremos dedicarnos a aquellos modelos de ratón modificado, pero

cuyos niveles no han sido afectados en su regulación. El grupo de Serrano y Blasco han demostrado que los ratones con una copia extra del gen p53 normalmente regulado envejecen normalmente. Pero análisis detallados de sus tejidos envejecidos en un marco deficiente en telomerasa indicó que estos ratones podían eliminar las células dañadas por los telómeros más eficientemente. En una continuación de estos estudios se combinaron una copia extra del gen p53 y una copia extra del ARF en la misma cepa de ratón. El ratón así obtenido se denominó super ratón ARF/p53. Los análisis de la expectativa de vida indicaron que, aparte del beneficio de una menor incidencia en cáncer, estos super ratones ARF/p53, mostraron una expectativa de vida más larga. Además, estos ratones mostraron menores achaques asociados al envejecimiento, probablemente debido a elevados niveles de objetivos transcripcionales anti-oxidantes.

De hecho, si el envejecimiento es una consecuencia del acumulo de

lesiones y p53 es la principal defensa frente a la lesión, entonces no sorprende que p53 junto con p19ARF, pueda tener actividad anti envejecimiento. Un hallazgo interesante ha sido realizado en Caenorhabditis elegans, en el cual se ha observado que varias mutaciones de longevidad, incluyendo menor actividad insulina/IGF1, menor respiración mitocondrial o dieta hipocalórica, proporcionan también protección frente a tumores debido a elevada actividad de p53. Las dos observaciones siguientes, que p53 puede proporcionar actividad anti-envejecimiento, y que mutaciones de longevidad pueden proporcionar protección frente al cáncer dependiente de p53, sugieren que longevidad y resistencia al cáncer están íntimamente conectadas y parcialmente coordinadas por p53. Finalmente, hemos de mencionar que aquellos sistemas que mantienen la estabilidad genómica

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pueden también ser considerados mecanismos convergentes en el sentido que disminuyen el daño al DNA y por tanto, previenen ambos cáncer y envejecimiento. Existen múltiples ejemplos de ratones con inestabilidad del DNA que son propensos al cáncer y tienen un envejecimiento acelerado.

3.4. Inestabilidad genómica El mantenimiento de la integridad del DNA representa un reto

fundamental y continuo para cada célula de nuestro organismo. Existen múltiples vías para detectar y reparar el DNA dañado, dependiendo de la naturaleza de la lesión y de la fase del ciclo celular en la cual se ha producido la lesión. Como la inestabilidad del DNA es un signo característico de la mayor parte de los cánceres, no sorprende que muchos de los factores que se han implicado en detectar y responder al daño al DNA se encuentren alterados en tumores humanos. Menos estudiado es el hecho que la inestabilidad genómica sea también una característica del envejecimiento. Se conoce desde hace muchos años que existe un incremento en la inestabilidad cromosómica dependiente de la edad y datos recientes indican que la acumulación de mutaciones somáticas por efecto de la edad, puede variar entre los diferentes tejidos del mismo organismo y que estas alteraciones genéticas contribuyen a la variación estocástica en la expresión genética que se observa a menudo en el envejecimiento de mamíferos

Los análisis moleculares de los síndromes humanos de cáncer

hereditario, tal como el síndrome de Li-Fraumeni, la ataxia telangiectasia (AT) y las formas comunes de cáncer familiar de ovario y mama, refuerzan las conexiones existentes entre el mantenimiento de la integridad del genoma y la susceptibilidad al cáncer. Estas patologías pueden ser causadas por mutaciones en la línea germinal en los genes que codifican la proteína p53, la quinasa ataxia telangiectasia mutada (ATM) o la del cáncer de mama (BRCA1), tres proteínas que son esenciales para la vigilancia del daño al DNA, las cuales se han asociado al envejecimiento de células o del organismo. En el caso de p53, se ha observado que ratones manipulados genéticamente para expresar isoformas alteradas de p53 con actividad incrementada, son resistentes al cáncer pero envejecen prematuramente. La proteína p53 normal presenta un impacto beneficioso sobre la longevidad al eliminar el daño al DNA por reparación o eliminando las células dañadas por apoptosis. Apoyan esta idea los experimentos en ratones que sobreexpresan p53 y p19ARF los cuales muestran un retraso en el envejecimiento. También en ratones con deleciones dirigidas o humanos con deficiencias hereditarias

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208

en varios factores que se encuentran implicados en detectar y reparar DNA dañado, tienen reforzada la correlación entre el daño al DNA y la tasa de envejecimiento. Por ejemplo, reduciendo el nivel de varios genes de puntos de control mitóticos, se origina inestabilidad cromosómica, aumento de la aneuploidia y la aparición del fenotipo de ratones progeroides. Estas observaciones indican que deficiencias severas en las proteínas implicadas en la detección del daño y reparación al DNA, pueden acelerar el envejecimiento, mientras que deficiencias menos severas en las mismas vías pueden predisponer al cáncer. El mecanismo para el envejecimiento en ausencia de una fiel reparación del DNA, no está del todo claro, pero puede ser secundario a la inducción de la senescencia o apoptosis de células madre y progenitoras. Alternativamente, la ausencia de reparación del DNA puede causar tanto daño directo a las células diferenciadas terminales, como para desequilibrar la homeostasis, por el contrario, mutaciones débiles en el mismo grupo de genes pueden permitir a las células sobrevivir y proliferar, pero con una alteración soterrada en la fidelidad del DNA, que posteriormente predispondrá al cáncer. Esto nos puede ayudar a comprender por qué tantos modelos de ratón con deleciones de genes asociados a la reparación o detección del daño al DNA pueden exhibir a la vez, susceptibilidad al cáncer y características progeroides.

3.5. Autofagia La última disposición de los desechos celulares, otro de los aspectos en

el que se encuentran cáncer y envejecimiento, es la que se conoce como autofagia. Este concepto, descrito por primera vez en levadura, la macroautofagia, es el proceso en el que proteínas u orgánulos viejos y dañados, incluidas las mitocondrias, son secuestrados dentro de estructuras de doble membrana conocidas como autofagosomas, los cuales se fusionan con los lisosomas en células de mamíferos, o con vacuolas en levadura, para posteriormente degradar el cargamento usado y devolverlo como reutilizables bloques de construcción. En levadura se han identificado más de 16 genes conservados requeridos para la autofagia. Un activador universal de la autofagia es la disminución en la disponibilidad de nutrientes y este estímulo ocurre, en parte, por inhibición de la señalización de TOR (objetivo de la rapamicina).

Aunque el acumulo de proteínas y orgánulos dañados es un signo de

envejecimiento y enfermedades asociadas el envejecimiento, la conexión entre estos procesos y el cáncer ha sido hasta recientemente poco claro. La

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primera conexión entre autofagia y cáncer surgió de la observación de que el producto del gen beclin 1 (becn1), un homólogo del gen de la autofagia de levadura VPS30, se une al oncogen humano BCL2 (B cell/lymphoma 2), e inhibe la autofagia. Esto indica que en los tumores caracterizados por una mayor expresión de BCL2, cuya misión, al menos en parte, fue inhibir la autofagia. En ratones haploinsuficientes, que habían perdido una copia del gen Becn1, desarrollaron tumores, lo que indica que la autofagia actúa como un importante supresor de tumores in vivo. En otros estudios se observó que en tumores malignos humanos el locus BECN1 está comúnmente delecionado y por evidencia experimental, se conoce que varios supresores de tumores, incluyendo la fosfatasa y homólogo de la tensina PTEN y p53, estimulan la autofagia. En efecto, aunque la evidencia indica que los oncogenes inhiben la autofagia y que los supresores de tumores la estimulan, la conexión mecanística entre cáncer y autofagia permanece sin aclarar (Figura 2).

Figura 2. Papel de la autofagia en cáncer y envejecimiento. La autofagia es un proceso

regulado para la eliminación de proteínas y orgánulos dañados. Tiene lugar en condiciones basales y se estimula por factores ambientales tales como la privación de alimento. Las proteínas conectadas a la tumorigénesis pueden regular el ritmo de la autofagia, con productos de oncogenes que la bloquean y supresores tumorales que la estimulan. La eliminación de componentes celulares dañados, especialmente las mitocondrias, disminuye la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que a su vez, reduce la inestabilidad genómica y la senescencia celular. Tales mecanismos pueden permitir incrementos moderados en la autofagia para reducir la incidencia del cáncer y retrasar el envejecimiento (Finkel et al 2008 modificado).

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210

3.6. El metabolismo energético conecta envejecimiento y cáncer En organismos relativamente simples como el C. elegans, las

mutaciones que prolongan su vida están a menudo conectadas con la capacidad del organismo a superar el estrés, en particular el estrés oxidativo y el metabólico. Esta resistencia al estrés puede ser importante para una célula de un tumor de rápido crecimiento donde el suministro y la disponibilidad de nutrientes y oxígeno son, a menudo, precarios. Esta coincidencia estratégico metabólica se ha hecho más concreta por observaciones de genes específicos que conectan la triada de envejecimiento, cáncer y energía. Uno de tales genes es Trp53 que codifica la proteína p53. Este supresor de tumores es uno de los que sufren mutación más frecuentemente en cánceres humanos y su actividad incrementada acelera el envejecimiento. No obstante, existe una conexión entre p53 y el metabolismo celular, reforzada por recientes informaciones que p53 regula la transcripción de dos proteínas que tienen papeles clave en la utilización de glucosa y la respiración mitocondrial. Otra vía que permite a las células y los organismos adaptarse a cambios en la disponibilidad de nutrientes es la red señalizadora TOR, la cual se activa en presencia de abundantes nutrientes y se inactiva en situaciones de ayuno. Un número de reguladores de TOR, PTEN, esclerosis tuberosa 2 (TSc2), v-akt, homólogo 1 del oncogen vírico del timoma murino (AKT1) y serina/treonina quinasa 11 (STK11), están frecuentemente alterados en tumores humanos. De la misma manera, el uso del inhibidor de TOR, la rapamicina, es frecuentemente requerida como tratamiento de los tumores malignos. La vía TOR ha recibido un nuevo interés por su papel en el envejecimiento, ya que en muchos organismos la disminución de la señalización TOR se asocia con el alargamiento de la vida. En células de mamíferos mTOR parece ser un importante regulador del metabolismo mitocondrial.

La familia de los factores de transcripción forkhead, representa otra vía

en la cual interseccionan cáncer y envejecimiento. Los miembros de esta familia en mamíferos regulan numerosos aspectos del destino celular. El ortólogo de mamíferos más cercano al daf 16 del C. elegans, es FOXO3, que controla la expresión de múltiples genes implicados en la resistencia al estrés y metabolismo. La familia forkhead en mamíferos actúa como supresores de tumores y reguladores de la longevidad de las células madre (Figura 3).

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211

Figura 3. Existe una red complicada de interacciones para proteínas implicadas en la coordinación del estado energético con el destino último de la célula. Entre éstas se encuentran las proteínas cuyas actividades están influenciadas por reservas energéticas incluyendo AKT, AMPK y SIRT1. Por otro lado, estos sensores regulan la actividad de efectores tales como el objetivo de la rapamicina TOR (serina treonina quinasa), FOXO (factor de transcripción) y el supresor tumoral p53. Regulación positiva (flechas rojas), negativa (líneas negras), cambios sutiles líneas verdes). La expectativa de vida parece estar influenciada por muchos de estos sensores y efectores, lo que indica que existe una conexión íntima entre la energía y la longevidad. AKT, v-akt homólogo 1 del oncogén vírico del timima muruni; APMK, proteína quinasa dependiente de AMP, SIRT1, desacetilasa dependiente del NAD ( Filkel, Serrano y Blasco 2008).

4. Mecanismos opuestos en la protección al envejecimiento y al

cáncer Hemos descrito aquellos mecanismos que disminuyen el daño celular

actuando sobre una causa común de cáncer y envejecimiento, y proporcionan protección a ambos procesos. Sin embargo, existen mecanismos que protegen del cáncer limitando el potencial proliferativo de las células, y presentan efectos pro-envejecimiento. Las células han desarrollado mecanismos que guardan una “memoria” de su historia proliferativa, que previene la proliferación celular más allá de un cierto punto. Estos son los potentes mecanismos de supresión tumoral, que pueden contribuir al envejecimiento. Las células de individuos viejos (en particular células madre

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y progenitoras) han acumulado una larga historia de proliferación y pueden sucumbir al mismo mecanismo que previene la proliferación indefinida de las células cancerosas. Por tanto, aquellos mecanismos que previenen la proliferación indefinida, presentan efectos opuestos sobre el cáncer y sobre el envejecimiento.

4.1 Papel de los telómeros. Los telómeros son estructuras especializadas situadas en el extremo de

los cromosomas, que sirven para distinguir y proteger las terminaciones naturales de dichos cromosomas. Los telómeros impiden que estas terminaciones naturales sufran la fusión con los extremos de otros cromosomas por lo cual son esenciales para su estabilidad. El acortamiento progresivo de los telómeros, del que se tiene experiencia en la mayoría de las células somáticas, entre las que se incluye a las células madre y las progenitoras, constituye el mecanismo mejor conocido por el cual las células mantienen una memoria proliferativa. Los telómeros son estructuras nucleoproteínicas cuya misión es la de proteger los extremos de los cromosomas. En los vertebrados los telómeros consisten en repeticiones de 5′-TTAGGG-3′ que están unidos a complejos multiproteicos especializados denominados shelterina. La propia regulación de los telómeros requiere una longitud minima de repeticiones de 5′-TTAGGG-3′, la integridad del complejo shelterina y la presencia de heterocromatina constitutiva. En ausencia de mecanismos compensadores, los telómeros se pierden en cada ciclo de división celular debido a la incapacidad de la maquinaria replicativa de copiar las secuencias terminales de los moldes (template) lineales, problema que se agrava por las actividades degradativas del DNA que pueden operar en los telómeros. La pérdida de los telómeros se compensa por la telomerasa, una retrotranscriptasa, que añade repeticiones teloméricas de novo después de cada división celular. Sin embargo, las células somáticas de adultos, entre las que se incluyen las células madre, no tienen suficiente actividad telomerasa para contrarrestar el acortamiento telomérico que va apareciendo con el envejecimiento y por tanto los organismos viejos acumulan daños cromosómicos derivados de los telómeros

En la mayoría de los casos, los tumores tienen los telómeros más cortos

que el tejido que los rodea, lo cual está de acuerdo con la idea que los telómeros se acortan durante la extensa proliferación que precede la formación de un cáncer. Además, la activación del gen de la telomerasa, que es silente en células normales, ocurre en la mayoría de cánceres y, de esta

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manera, la mayoría de las células cancerosas son capaces de mantener sus cortos telómeros o incluso alargarlos. Manipulaciones genéticas han demostrado que la expresión de la telomerasa en la vida postnatal, por medio de transgénesis, incrementa la incidencia de cáncer, probablemente al hiperactivar las células madre. Esta evidencia favorece un escenario en el cual el acortamiento de telómeros impone una potente barrera a la proliferación de las células tumorales. Así que, solo aquellas células que superan esta barrera, generalmente por activación del gen silente de la telomerasa, aunque también por recombinación telomérica, son capaces de generar un tumor maligno. Pruebas genéticas de este modelo han sido obtenidas en ratones en los cuales la barrera de acortamiento de telómeros es más difícil de superar debido a la ausencia genética de telomerasa. Estos ratones deficientes en telomerasa muestran una mayor protección frente al cáncer. Hay que mencionar dos excepciones relevantes que ocurren cuando la deficiencia de telomerasa se combina con ausencia de p53 o con sobreexpresión del componente de la shelterina el TRF2, que recluta la nucleasa XPF e induce la degradación de los telómeros. La ausencia de p53 o la sobreexpresión de TRF2 ocasionan una inestabilidad genética galopante en células deficientes en telomerasa que promueve el desarrollo de cáncer. Dejando aparte estas dos excepciones (deficiencia de p53 y sobreexpresión de TRF2), el acortamiento de los telómeros, mediante la activación de p53, previene la proliferación indefinida de las células cancerosas y constituye uno de los mecanismos supresores de tumores más importantes (Figura 2).

Como los telómeros son esenciales para la estabilidad cromosómica, la

pérdida de los telómeros a una edad avanzada puede ser la causa del envejecimiento del organismo. Además, la longitud de los telómeros es un pronóstico de patologías relacionadas con la edad y la longevidad en humanos. En ratones, incluso la primera generación que carece de telomerasa tiene una menor expectativa de vida. Además, el examen de la longitud de los telómeros en ratones silvestres ha demostrado que los telomeros se acortan significativamente en la edad avanzada, tanto en Mus spretus como en el ratón de laboratorio Mus musculus. Finalmente, los ratones que sobreexpresan la telomerasa y no sucumben al cáncer, muestran un modesto incremento en su longevidad. Por tanto, está demostrado que existe una conexión entre el acortamiento de telómeros y el envejecimiento tanto en humanos como en ratones. Observando el mecanismo del envejecimiento y los telómeros, los ratones deficientes en telomerasa envejecen prematuramente debido a múltiples defectos en los órganos, que son causados por alteración en la regeneración de los tejidos asociada a la

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funcionalidad reducida de varios compartimentos de células madre. Esto sugiere que los telomeros cortos provocan envejecimiento a través de sus efectos deletéreos sobre la funcionalidad de las células madre. Por ejemplo, se ha demostrado que los telómeros cortos alteran la capacidad de las células madre epidérmicas de salir de su estado quiescente y regenerar tejidos, anticipando sus efectos pro-envejecimiento. La menor longevidad y los defectos regenerativos de los ratones deficientes en telomerasa son reminiscentes de los pacientes humanos con síndrome de disqueratosis congénita, como también de ciertos pacientes con anemia aplásica. Resultados recientes indican que el envejecimiento conducido por telómeros está mediado por el objetivo transcripcional de p53, p21Cip1 en un proceso que también implica a la proteína de reparación de errores de apareamiento PMS2. En resumen, la evidencia acumulada indica que el acortamiento de telómeros es un componente relevante del envejecimiento fisiológico, que es probable que esté mediado por el impacto de la longitud telomérica sobre las células madre. Creemos que la ausencia del mantenimiento de los telómeros después del desarrollo embrionario está diseñada en primer lugar como un mecanismo supresor de tumores, y no como un mecanismo activo pro-envejecimiento. Esto está de acuerdo con la idea del soma desechable por el cual la selección natural, en vez de seleccionar los genes que promueven activamente el envejecimiento, abandona la protección a individuos que han sobrepasado su utilidad para la especie. En ambientes artificiales protegidos, sin embargo, los individuos tienen una longevidad más larga que en ambientes silvestres y esta larga expectativa de vida no natural, da la oportunidad para acontecimientos de acortamientos de telómeros críticos y de envejecimiento conducido por telómeros. De esta manera, está claro, que el mismo mecanismo que nos protege del cáncer puede también contribuir a nuestro envejecimiento.

4.2. Desrrepresión de genes supresores. El locus, INK4a/ARF también conocido como locus CDKN2a, está

situado en el cromosoma 9 y es uno de los lugares mutados más frecuentemente en cáncer humano. Comprende estructuras que se solapan y codifican dos proteínas, la p16INK4a y la p19ARF, que juegan un papel importante en la regulación del crecimiento celular, la supervivencia y la senescencia. Estas dos proteínas son supresoras de tumores no relacionados, la p16INK4a, regula la actividad de Rb1 por inhibición directa de las quinasas dependientes de ciclina (CDK) y la p19ARF regula la función de p53. La inactivación de este locus por completa eliminación o por mutilación

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aberrante del promotor, es muy común en casi todos los tipos de tumores malignos. Una completa incidencia de inactivación del 30% hace de este locus una de las defensas más importantes frente al cáncer en los mamíferos. El mecanismo de acción del locus INK4a/ARF es bien conocido. La proteína p19ARF estabiliza p53 por unirse e inhibir a la proteína oncogénica MDM2. En el caso de p16INK4a, su actividad supresora de tumores se basa en su capacidad de unirse e inhibir las quinasas dependientes de ciclina-D CDK4 y CDK6. Esta particular clase de quinasas, como también las ciclinas del tipo D se sabe que tienen potencial oncogénico y fosforilan a la familia del retinoblastoma de supresores de tumores (Rb, p107 y p130), que a su vez son los principales reguladores negativos del ciclo celular.

Una característica clave del locus INK4a/ARF reside en el hecho que es

transcripcionalmente silente durante el desarrollo embrionario y durante la mayor parte de la vida postnatal hasta el estado adulto, pero se activa por estímulos mitogénicos excesivos, por ejemplo, por señalización oncogénica en tumores, como también en organismos viejos. La expresión de ciertos oncogenes acelera la desrrepresión del locus INK4a/ARF, un fenómeno que se ha denominado “senescencia inducida por oncogenes”. Una amplia cantidad de resultados ha propuesto un modelo en el cual las células “memorizan” el estímulo mitogénico excesivo y las divisiones celulares, en parte mediante la desrrepresión de este locus. Por tanto, la desrrepresión del locus INK4a/ARF durante el envejecimiento es de notable magnitud y puede bien estar entre los cambios más dramáticos en la expresión génica que se asocian al envejecimiento. El locus INK4a/ARF se mantiene silente en células normales, no estresadas por mecanismos epigenéticos que parecen depender de represores transcripcionales complejos Polycomb. Durante el envejecimiento o sometiendo a estrés cultivos celulares, los niveles de los componentes de Polycomb BMI1 y EZH2 decrecen y esto puede explicar la dependencia del envejecimiento de la desrrepresión del locus INK4a/ARF (Figura 4). Sin embargo, a pesar de Polycomb, muchos otros reguladores transcripcionales inciden en la actividad del locus INK4a/ARF. La identificación de los factores relevantes que son responsables de la desrrepresión de este locus durante el cáncer y el envejecimiento permanece como un desafío para el futuro próximo.

A pesar de la evidencia correlativa entre la desrrepresión del locus

INK4a/ARF y el envejecimiento, todavía no se tienen datos genéticos. Ratones que contienen una copia extra del locus intacto en la forma de un gran transgen genómico, no muestran prematuro envejecimiento, mientras

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que están más fuertemente protegidos frente al cáncer. Estos datos sugieren que el locus INK4a/ARF es un potente supresor tumoral, pero tiene un impacto menor sobre el envejecimiento fisiológico. Sin embargo, en ratones que carecen o sobreexpresan p16INK4a, se ha demostrado que está limitado el potencial regenerativo de las células madre. La actividad pro-envejecimiento de p16INK4a es interesante, aunque tiene que ser demostrada directamente. En este aspecto, un factor complicado deriva de la posibilidad que los inhibidores del ciclo celular puedan mantener la proliferación de las células madre a un ritmo bajo y esto pueda ser beneficioso para prevenir el prematuro agotamiento de las reservas de células madre, como ha sido demostrado para p21Cip1.

Figura 4. Mecanismos que previenen del cáncer y promueven el envejecimiento. Las

células poseen dos sistemas autónomos principales para limitar su potencial proliferativo: el acortamiento de telómeros y la regulación del inhibidor INK4a de las quinasas dependientes de ciclina. Ambos sistemas ejercen impacto sobre el potencial proliferativo de las células madre, particularmente en la vejez y sobre la proliferación aberrante estimulada por señalización oncogénica. Estos límites son beneficiosos para prevenir el desarrollo del cáncer, pero son perjudiciales para la regeneración de los tejidos en edades avanzadas (Serrano y Blasco 2007 modificado).

Se puede resumir que el locus INK4a/ARF sufre una notable

desrrepresión durante el envejecimiento, quizás como una manifestación del excesivo o prolongado estimulo mitogénico que se acumula en las células madre. Por el contrario, la desrrepresión del locus INK4a/ARF durante la

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tumorigenesis proporciona protección poderosa frente al cáncer, como se ha evidenciado por la fuerte presión selectiva para eliminar el locus en el cáncer. Como se comentó anteriormente, para el acortamiento de los telómeros y de acuerdo con la teoría del “soma desechable” se cree que el propósito principal del locus INK4a/ARF es proporcionar protección frente al cáncer y no hacer cumplir activamente el envejecimiento en una forma programada genéticamente. Esto no excluye que la notable desrrepresión del locus en las edades avanzadas contribuya al proceso del envejecimiento.

La relevancia de la senescencia para la protección del cáncer, puede ser

razonada si se considera la senescencia como una barrera inducida por estrés que limita el potencial proliferativo de las células lesionadas. De acuerdo con esta idea, se ha demostrado que existen abundantes células senescentes en los tumores, moviendo así estas observaciones desde el reino del cultivo in vitro a la arena de la biología real del cáncer (Figura 5). Esta senescencia intra-tumoral se cree que se desencadena por señales oncogénicas que pueden funcionar desrreprimiendo el locus INK4a/ARF. Otro mediador importante de la senescencia inducida por oncogenes, parece ser la activación de la vía de respuesta al daño al DNA (DDR), posiblemente por la hiperreplicación característica de las células cancerosas. Otra sorpresa reciente ha sido la rápida eliminación in vivo de células tumorales que han sufrido la senescencia desencadenada por p53, Al menos en un sistema, esta eliminación parece que ocurre mediante la activación del sistema inmune innato, lo cual es relevante porque la quimioterapia y la radioterapia convencionales funcionan induciendo la senescencia en el interior de la masa tumoral. Además, otra evidencia indica que el reconocimiento de las células tumorales por el sistema inmune requiere la activación continua de la vía DDR. Tales observaciones necesitan ser colocadas en el sitio apropiado, ya que está claro que la mayoría de los tumores malignos, se desarrollan en presencia de un sistema inmune funcional. De igual manera, los tejidos que sufren envejecimiento normal pueden acumular cantidades significativas de células senescentes sin provocar una respuesta inmunológica potente.

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Figura 5. Interacción de las células madre, estrés, envejecimiento y cáncer.

Durante el envejecimiento normal, las células madre acumulan lesiones y cambios dependientes del estrés (desrrepresión del locus INK4a/ARF o acortamiento de telómeros). Esto conduce a un incremento de células senescentes (células grandes azules) en el interior de tejidos diferenciados. Tumores incipientes surgen directamente de las células madre o a partir de células más comprometidas, y sufren proliferación rápida (células pequeñas rojas). Estas células premalignas acumulan rápidamente alteraciones, debido a la presencia de oncogenes, lo que conduce a una elevada proporción de células tumorales que se vuelven senescentes (células pequeñas azules). La progresión tumoral hacia la malignidad se favorece cuando las células tumorales adquieren mutaciones que alteran el programa de senescencia. (Finkel, Serrano y Blasco 2008, modificado).

5. Conclusiones Se han descrito dos tipos de mecanismos que juegan entre cáncer y

envejecimiento: mecanismos convergentes que al disminuir el daño celular, evitan el cáncer y protegen la longevidad, y mecanismos opuestos que parecen diseñados para prevenir la excesiva proliferación con lo cual previenen del cáncer, pero limitan la longevidad. El equilibrio entre ambos mecanismos ha de asegurar una vida saludable, libre de cáncer y de los achaques de la vejez, para la mayoría de los individuos durante la juventud y la vida adulta.

El reto para el futuro será manipular estos mecanismos para conseguir

una vida larga y saludable. En el caso de los mecanismos convergentes, su intensificación mediante tratamientos quimiopreventivos debe, en teoría,

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proporcionar beneficios frente al cáncer y el envejecimiento. Esto no es especulativo, estudios preliminares han demostrado que fármacos antidiabéticos tienen efectos protectores del cáncer en humanos y también elevan la longevidad en ratones. En el caso de mecanismos opuestos en la protección, tales como el acortamiento de telómeros y la desrrepresión del locus INK4a/ARF, cualquier tratamiento dirigido a elevar sus efectos protectores del cáncer, han de ser transitorios y tomados en consideración por sus posibles efectos pro envejecimiento.

Por último hay que considerar que la vida es muy difícil modificarla,

porque todos los elementos del organismo han sido ajustados enormemente a lo largo de la evolución. Envejecimiento y cáncer deben ir de la mano si se quiere “manipular” la longevidad. No tiene sentido alargar la vida si se desarrolla un cáncer, y viceversa; no interesa estar protegidos del cáncer, si se adelanta el envejecimiento. Hay que tener presente que el cáncer es una enfermedad degenerativa y en la mayoría de los casos una consecuencia del envejecimiento celular. Con los años, los organismos van perdiendo su capacidad de reparación y las lesiones se acumulan, esos daños, a su vez, van a ser capaces de producir mutaciones, que con el paso del tiempo van a favorecer la proliferación celular aberrante.

6. Abreviaturas AKT, v-akt, homólogo 1 del oncogén vírico del timoma murino; ATM,

quinasa ataxia telangiectasia mutada; DDR, vía de respuesta al daño al DNA; BCL2, proteína codificada por el oncogén BCL2 del linfoma de células B; BMI1, componente del Polycomb; CDK4 y CDK6, quinasas dependientes de ciclina 4 y 6; EZH2, componente del polycomb; FOXO, factor de transcripción de la familia forkhead; AMPK, proteína quinasa dependiente del AMP; DDR, respuesta al daño al DNA; GH, hormona del crecimiento; IGF1, factor de crecimiento insulínico; MDM2, proteína oncogénica que inactiva a p53; NAD, nicotinamida adenina dinucleótido; p16INK, proteína supresora de tumores inhibidora de las CDK; p19ARF, proteína supresora de tumores que estabiliza a p53 por unión a MDM2; p66Shc, proteína redox multifuncional en el espacio intermembrana de la mitocondria; PGC1a, coactivador; PTEN, proteína fosfatasa homólogo de la tensina; ROS, especies reactivas de oxígeno; SIRT1, desacetilasa dependiente de NAD; STKII, serina treonina quinasa II; TRF, fragmentos terminales de restricción.

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Capítulo 7

223

Capítulo 8. MANIPULACIÓN DE LA ESPERANZA DE VIDA.

1 Introducción 2. ¿Puede manipularse la vida? 3 Complejidad de las diferentes especies estudiadas 4. De qué manera pueden extrapolarse estos avances a la especie humana 5 Consideraciones evolutivas del envejecimiento 6 Fenotipo senescente y su relación con la enfermedad 7 Bases del envejecimiento intrínseco 8. Otras consideraciones 9. Perspectivas futuras 10. Abreviaturas 11. Bibliografía 1. Introducción Recientes descubrimientos en la ciencia del envejecimiento indican que

la vida puede ser alterada por manipulación genética, nutricional o farmacológica en organismos tales como levaduras, gusanos, moscas y ratón. El estudio de los mecanismos básicos del envejecimiento ha experimentado un gran avance en las dos últimas décadas y ha hecho difícil ignorar el tema de si las intervenciones biomédicas para posponer sustancialmente el envejecimiento son científicamente posibles. El tema es abundante en afirmaciones opuestas, tales como que la vida no puede alargarse por encima de un límite (120 – 125 para la especie humana), pero las predicciones en 1990 afirmaban que la disminución en el ritmo de muerte no alcanzaría los niveles requeridos para que la esperanza de vida en el nacimiento excediera los 85 años. Sin embargo, las mujeres japonesas han sobrepasado ya ese límite y la esperanza de vida en los países desarrollados propone que superaremos los 85 años en 2050. ¿Podrá la ciencia liberarnos de las ataduras que parecen establecer límites a la vida humana?

2. ¿Puede manipularse la vida? Con el descubrimiento en los 1980 que las mutaciones en determinados

genes pueden ampliar la vida en el nematodo Caenorhabditis elegans, el envejecimiento empezó a ser visto como maleable por métodos usados para entender y manipular el desarrollo y la enfermedad. Hoy en día, cientos de

Capítulo 8

225

genes mutantes pueden incrementar la longevidad en organismos que van desde la levadura (Saccharomyces cerevisiae), nematodos (Caenorhabditis elegans), la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) hasta el ratón (Mus musculus). La mayoría de estos genes actúan sobre vías evolutivamente conservadas que regulan el crecimiento, el metabolismo energético, la alimentación y la reproducción. Entre estos se incluyen genes que codifican componentes de la vía señalizadora insulina/factor de crecimiento insulínico (IGF-I), la vía objetivo de la rapamicina (TOR) y la cadena de transporte electrónico mitocondrial (Figura 1). En la mayoría de los casos, la ampliación de la expectativa de vida ocurre cuando la actividad de estos componentes disminuye, lo que reduce el daño somático e incrementa el mantenimiento y reparación.

La mayoría de mutaciones que promueven la longevidad se han

descubierto con mutágenos o RNA de interferencia, que principalmente descubren funciones genéticas inactivadas o disminuidas, de manera que puedan ser descubiertas posteriores mutaciones resultantes de la función activada de los genes. Muchas mutaciones que promueven la longevidad simulan la restricción dietética (dieta hipocalórica sin malnutrición), que se ha demostrado que alarga la vida en roedores. La restricción de la dieta incrementa la longevidad en muchas especies, levaduras, nematodos, arañas y perros. Aunque los fenotipos de dieta restringida a menudo se solapan con aquellos otorgados por amortiguación de las vías pro-envejecimiento, en algunos casos la restricción dietética ejerce efectos sinérgicos con las mutaciones que promueven la longevidad, indicando que la dieta restrictiva puede actuar independientemente. La apreciación que la esperanza de vida es flexible o moldeable y se encuentra bajo la influencia de genes que favorecen el crecimiento y la procreación, despierta las esperanzas de encontrar moléculas que se dirijan a las vías afectadas por la restricción dietética o las mutaciones que promueven el envejecimiento. Se han identificado compuestos prometedores en este sentido, aunque ninguno ha mostrado todavía efectos importantes sobre la esperanza de de vida en los humanos sanos. La mayoría, sin embargo, se encuentra en pruebas clínicas para tratar enfermedades relacionadas con la edad, como diabetes y cáncer. Es digno de considerar que hace solo dos décadas era una fantasía especular sobre la posibilidad de alargar la vida humana, mientras que hoy se está considerando como una realidad. El que las mutaciones en las vías evolutivamente conservadas puedan alargar la vida en organismos experimentales, es un paso de mucha trascendencia con una directa aplicación sobre los efectos indeseables que trae consigo la edad avanzada.

Capítulo 8

226

3. Complejidad de las diferentes especies estudiadas Es un hecho evidente que una gran parte de la biología básica es similar

entre especies tan divergentes como levadura y humanos. Es también cierto que los estudios en levaduras, nematodos y moscas han sido de una enorme utilidad para avanzar en nuestro conocimiento sobre las bases evolutivas y mecanísticas del envejecimiento humano. La respuesta de los organismos más simples a determinadas intervenciones, puede no ser predictiva cuando la complejidad se eleva o cuando la fisiología se desvía de los humanos de manera significativa. El impacto de la complejidad se muestra en la vía señalizadora de la insulina. Los invertebrados tienen un solo receptor que une ligandos tipo insulina o IGF-1. Las mutaciones que mitigan parcialmente esta señalización alargan la vida de nematodos y moscas. Sin embargo, los mamíferos tienen receptores diferentes para la insulina y el IGF-1, con funciones que se solapan. El factor insulínico IGF-I controla principalmente el crecimiento, mientras que la insulina regula el metabolismo. En mamíferos, la señalización defectuosa de la insulina causa resistencia a la insulina y diabetes. La señalización defectuosa del IGF-I causa rotura proteica y degeneración muscular, y la sobreexpresión de IGF-I reduce la disfunción cardiaca asociada a la edad y mejora la regeneración muscular. No obstante, la señalización reducida de insulina, específicamente en tejido adiposo, o señalización reducida de IGF-I en todo el animal, alarga la expectativa de vida en ratones. Por tanto, la modulación de vías señalizadoras, específicas del tejido, puede retrasar el envejecimiento en humanos (Figura 1).

El impacto de la complejidad se demuestra por interacciones de dos

familias de proteínas que modulan la longevidad: los factores de transcripción forkhead (FOXO) y el regulador silenciador de la información (SIR) proteínas desacetilasas (sirtuinas). Las proteínas FOXO (DAF-16 en nematodos), se requieren para la ampliación de la vida conferida por mutación de la vía señalizadora de la insulina, y la sobreexpresión de SIR2 se sabe que incrementa la vida en levaduras y nematodos. Los mamíferos poseen muchas proteínas FOXO y SIR, algunas proteínas FOXO inician la muerte celular inducida por estrés (apoptosis), que elimina células dañadas o disfuncionales. Las proteínas FOXO activan también la defensa antioxidante y los genes que facilitan la reparación del DNA. FOXO es desacetilada por el ortólogo de SIR2, SIRT2, la sirtuína humana, la cual incrementa la resistencia al estrés oxidativo y la parada del ciclo celular, dependiente de FOXO, pero inhibe la apoptosis también dependiente de FOXO. SIRT1

Capítulo 8

227

también desacetila la proteína p53 supresora de tumores, atenuando su actividad transcripcional y suprimiendo la apoptosis inducida por estrés y la senescencia celular (parada proliferativa irreversible). (Figura 1).

Figura 1. Vías pro-envejecimiento potencialmente conservadas, interconexiones y

posibles objetivos de intervención. Se muestran tres vías principales IIS, TOR y mitocondria. Las actividades pro-envejecimiento de estas vías están conservadas entre las especies, con sensores de energía, tales como AMPK, como eje potencialmente importante en las redes complejas que las integran. Sin embargo, es importante percibir diferencias potenciales entre las especies. La mayoría de las deficiencias en la cadena respiratoria son letales o causan enfermedades en humanos, pero pueden alargar la vida en los nematodos o en la levadura. En mamíferos, la mitocondria juega un papel importante en la señalización de la apoptosis, lo cual puede acelerar o retardar el envejecimiento, dependiendo del tipo celular. Muchas señales de longevidad convergen en miembros de las familias FOXO y sirtuínas, los cuales pueden interaccionar. Las proteínas SIR pueden activar o reprimir a FOXO. También, los efectos de FOXO y SIR2 en las células pueden ser beneficiosos (elevando las defensas antioxidantes) o perjudiciales (apoptosis), y pueden promover o no la supervivencia del organismo. En mamíferos, SIRT1 amortigua la apoptosis por reprimir a FOXO y por prevenir la oligomerización de BAX en la membrana externa de la mitocondria, la cual desencadena la permeabilización de la membrana y la salida al citosol de los factores apoptogénicos solubles, tales como el citocromo c. La apoptosis puede ser beneficiosa en el aspecto que elimina las células dañadas y previene el cáncer, o puede ser perjudicial al eliminar de manera indiscriminada células irreemplazables como las neuronas (Vijg y Campisi 2008, con modificaciones).

Capítulo 8

228

Es difícil pronosticar, a priori, si el incremento de FOXO o la actividad de las sirtuínas elevan o disminuyen la longevidad en mamíferos. Los mamíferos dependen de la apoptosis y la senescencia para suprimir el cáncer, enfermedad importante relacionada con la edad y gran desafío para la longevidad de los mamíferos. Este no es el caso de la levadura, moscas o nematodos, los cuales nunca o muy raramente desarrollan cáncer y como adultos contienen muchas células somáticas post mitóticas.

La magnitud de la ampliación de la longevidad es un factor digno de ser

tenido en cuenta. Así, el amortiguamiento genético de la vía de señalización de la insulina duplica la vida en los nematodos, y la incrementa en diez veces en caso de una mutación en esta vía. En moscas, sin embargo, las mutaciones en un solo gen de la vía señalizadora de la insulina u otra vía promotora del envejecimiento, alarga la vida solo en un 25 – 30%. En ratones, las mutaciones inactivadoras en los genes Pou1f1, Prop1, o del receptor de la hormona del crecimiento (que reduce las señales IGF-I) incrementa la vida un 40%, mientras que las mutaciones que afectan directamente a la vía señalizadora de la insulina la amplían solo un 20% o menos.

Así, la reducción de la vía señalizadora insulina/IGF, puede incrementar

de manera sustancial la vida en los nematodos, pero en grado mucho menor lo hace en modelos experimentales más complejos como moscas o ratones. Se conoce poco acerca de los mecanismos responsables de estas diferencias entre las especies, pero si se sabe que dentro de las especies cuenta mucho el origen genético, el medio ambiente, el sexo, etc. Por ejemplo, la ampliación de la vida en la mosca “chico” depende de la concentración de alimento. En moscas transgénicas, la sobreexpresión de la superoxido dismutasa humana en las neuronas motoras, produjo efectos beneficiosos en la longevidad, que variaron considerablemente entre los diez genotipos silvestres ensayados, como también por el sexo. Aunque es posible que no se hayan definido aún las condiciones óptimas para la regulación de las vías conservadas del envejecimiento en organismos más complejos que el nematodo, otras características hacen que los nematodos tengan que ser considerados aparte, debido a las circunstancias siguientes:

1. muchas de las mutaciones iniciales de longevidad identificadas en

estos gusanos afectan un estado de desarrollo alternativo denominado “dauer” que suspende la reproducción y altera el metabolismo. La hibernación, estado que suspende temporalmente el

Capítulo 8

229

metabolismo y reproducción de los mamíferos, nunca dura más que la expectativa de vida, en contraste con el estado dauer de los nematodos.

2. la respiración aeróbica es menos crítica para los nematodos que para las moscas o los mamíferos. Esto puede explicar por qué el RNA de interferencia explora el incremento de vida en los nematodos identificando múltiple genes que codifican subunidades de la cadena de transporte electrónico mitocondrial. La regulación de estos genes puede incrementar la esperanza de vida al reducir la función mitocondrial y sus subproductos tóxicos. En mamíferos una regulación similar produciría efectos letales.

4. De qué manera pueden extrapolarse estos avances a la

especie humana Aunque el conocimiento de las vías pro-envejecimiento que se han

identificado en organismos experimentales, supone un punto importante de comienzo lógico para tratar de aplicarlo a la vida humana, hay que profundizar aún en muchos aspectos y determinar primero si es posible que estas vías puedan modular el envejecimiento en nuestra propia especie. Una propuesta inicial es identificar asociaciones entre los polimorfismos en genes conservados y la longevidad humana. La longevidad humana extrema está controlada genéticamente por la elevada oportunidad que muestran los humanos centenarios para vivir más de 100 años y los grupos familiares moderados de longevidad extrema. Hasta aquí, sin embargo, los estudios no han llevado a ninguna conclusión debido a que no fueron conseguidos en su totalidad o debido a una mezcla en la población control. Los intentos realizados para asociar los genes candidatos con la longevidad humana extrema, han identificado variantes en genes del metabolismo de las lipoproteínas que aparecen sobreexpresados en centenarios. También se ha detectado la existencia de variantes en genes segregados que codifican FOXO1 y FOXO3 y se asocian con supervivencia de 85 años o más, y en mujeres se han encontrado variantes en genes que reducen la señalización insulina/IGF1, asociadas con supervivencia larga. Recientemente, se ha observado en centenarios la sobreexpresión de mutaciones heterozigóticas en el gen IGF-1R, que reducían de manera notable la actividad del IGF-1R.

Aunque estos resultados son, sin duda, muy prometedores en el estudio

del envejecimiento humano, se necesita investigar con mayor profundidad para confirmar que los humanos y los organismos utilizados como modelos

Capítulo 8

230

experimentales, utilizan vías similares moduladoras de la longevidad. Incluso si estas vías están conservadas en el Homo sapiens, su variación natural no actúa sobre la ampliación de la vida tanto como lo hacen las mutaciones generadas en modelos como los nematodos. Es posible que la complejidad del organismo ejerza alguna influencia y limite de alguna manera todo lo que puede alargarse la vida por manipulación de las vías metabólicas o también que debamos esperar a tener otros estratos de control, que tienen que ser descubiertos en animales más complejos. En la predicción del alargamiento de la vida en humanos, es importante recordar que las respuestas son aún desconocidas. El alargamiento de la vida en los modelos experimentales estudiados supone, en cierto grado, datos obtenidos con la utilización de un artefacto, pues ninguno de los animales de laboratorio considerados de tipo silvestre tiene la diversidad genética de verdaderas cepas silvestres, pues el laboratorio no es su hábitat natural. Por ejemplo, se ha demostrado que la restricción dietética no eleva la longevidad de manera sustancial en algunos ratones silvestres. Por tanto, la crianza de animales de laboratorio ha de ser seleccionada para conseguir una respuesta resistente a la restricción dietética. Dos estudios longitudinales de restricción dietética en mono rhesus se iniciaron en los últimos 1980 y los resultados obtenidos sugieren que la restricción dietética mejora la salud, detectándose en estos monos menor grasa corporal, mayor sensibilidad a la insulina y lípidos circulantes favorables, pero no ha habido aún evidencia alguna que demuestre que la restricción dietética alarga la vida como sucede en los roedores de laboratorio. Además, en monos y por extensión en humanos, alguno de los beneficios obtenidos con la restricción de la dieta, tal como los bajos niveles de IGF-I, pueden disminuir el riesgo de cáncer, aunque también pueden incrementar el riesgo de fracturas osteoporóticas. Por tanto, es necesario reducir la señalización IGF-I al principio del estado adulto para prevenir del cáncer, pero incrementarla en edades posteriores para prevenir enfermedades no cancerosas. ¿Podemos esperar intervenciones que se dirijan a la vía señalizadora insulina/IGF1, incluso con regulación espacio/temporal, para alargar la vida en el mismo grado que ocurre en modelos simples? Entre los efectos pro-longevidad del amortiguamiento de la señalización insulina/IGF1, está la activación de la resistencia al estrés. La respuesta al estrés es superior en células de especies de larga vida que en las de vida más corta. En estas últimas, existen suficientes oportunidades para intensificar los mecanismos protectores, sin embargo en las especies de vida larga, existen menos. Además, es obvio que la fisiología humana difiere de la de la levadura y los nematodos, aunque quizás menos obvias son las diferencias entre ratón y humano. Hay que tener presente que muchas terapias anti-

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231

cáncer tienen éxito en ratones, pero no en humanos. Además, los efectos colaterales de los fármacos, que afectan vías fisiológicas complejas, son ya un problema. Por ejemplo, la transferencia de los inhibidores de proteínas por ésteres del colesterol, desarrolla un incremento en lipoproteínas de alta densidad, lo cual eleva el riesgo de enfermedad cardiovascular. Antes de que podamos evaluar el impacto potencial de intervenciones para incrementar la vida humana sustancialmente, necesitamos comprender las causas primarias del envejecimiento, que conducen a la pregunta ¿por qué envejecemos?

5. Aspectos evolutivos del envejecimiento De acuerdo con Dobzhansky, ‘‘nada en biología tiene sentido excepto

cuando se considera a la luz de la evolución’’; por tanto, lo mismo ocurre con el envejecimiento. La mayor parte de los científicos aceptan que el envejecimiento es el resultado del mayor peso de la selección natural sobre la supervivencia y la reproducción en edades tempranas, que sobre el vigor en edades tardías. Este declinar relacionado con la edad en la fuerza de la selección natural, articulado por Medawar, se debe a la elevada mortalidad causada por peligros externos. Cuando estos peligros hacen que sea rara la supervivencia en individuos de avanzada edad, la selección natural favorece variantes genéticas que promueven el crecimiento y reproducción tempranos. En ambientes menos peligrosos, la supervivencia se eleva y las variantes genéticas que promueven el mantenimiento somático se pueden propagar. Por lo tanto, la expectativa de vida específica de las especies está determinada por la compensación entre mantenimiento somático, crecimiento y reproducción tempranas (Figura 2). Por ejemplo, los genes que aseguran una respuesta inmune poderosa a la infección, promueven la supervivencia temprana, pero más tarde contribuyen a la inflamación, un fenotipo relacionado con la edad y riesgo de desarrollar muchas enfermedades.

Es un hecho reconocido que las grandes diferencias en la longevidad

surgen como resultado de la evolución. Consideremos la diferencia en longevidad entre nematodos (semanas) y mamíferos (años), o incluso entre ratones (3 años) y humanos (100 años). ¿Cómo se consiguieron estas diferencias? ¿Desechando las vías pro-envejecimiento o creando nuevas vías que aseguraran la longevidad?

Capítulo 8

232

Figura 2. El equilibrio entre el mantenimiento somático, el crecimiento y la

reproducción es lo que determina la expectativa de vida. De acuerdo con la teoría del soma desechable, los organismos han de comprometerse entre la asignación de la energía para crecimiento y reproducción o para el mantenimiento somático y la reparación (Vijg y Campisi 2008).

La notable conservación entre las vías conocidas que modulan la

longevidad y la similitud entre los organismos, tales como ratones y humanos en la estructura y organización genómica, argumenta frente a esta posibilidad. Por supuesto que algunas vías no conservadas y únicas pueden aún no estar descubiertas, pero es más probable que la longevidad fuese conseguida por cambios sutiles en muchos genes en el curso de la evolución, no por mutaciones únicas con grandes efectos, los cuales a menudo elevan la esperanza de vida a costa de la reproducción o la supervivencia en condiciones de estrés. Si es así, las intervenciones que se dirigen a un único gen o incluso a una única vía no pueden alargar la longevidad hasta el grado conseguido por selección natural. Esto no debe disuadir la búsqueda de intervenciones farmacológicas, pero más bien recalca como la superficialidad de nuestro conocimiento acerca de la comparación de mecanismos evolutivos puede obstaculizar severamente los esfuerzos en esta área. A pesar de un consenso general respecto a las bases evolutivas de por qué envejecemos, todavía conocemos apenas las causas primarias del

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envejecimiento y su relación con la enfermedad, la cual es generalmente la causa de la muerte.

6. El fenotipo senescente y su relación con la enfermedad El énfasis que dedicamos a la expectativa de vida puede distraernos del

propio envejecimiento. En nematodos y moscas, se conoce mucho de genes que determinan la vida media, pero poco acerca de cómo mueren estos animales. Esto se debe a la complejidad de los fenotipos senescentes y a nuestra limitada capacidad para definir el fenotipo en contraste con la relativa facilidad con que se define el genotipo. Existen notables similitudes entre las especies, pero también marcadas diferencias. Por ejemplo, las placas amiloides en el cerebro y las placas ateroscleróticas en los vasos sanguíneos son características de envejecimiento humano, pero son virtualmente carentes en ratón. Incluso en el examen de fenotipos compartidos se pueden descubrir diferencias. Por ejemplo, la cifosis (curvatura espinal) está causada por osteoporosis en humanos, pero puede deberse a otras causas en ratón. Incluso los fenotipos senescentes, desde el pelo gris hasta la susceptibilidad al cáncer, varían entre individuos humanos, y entre razas de ratones. Un fenotipo prominente relacionado con la edad en humanos y ratones, ausente en nematodos y moscas, es el cáncer. El cáncer surge en tejidos renovables, de los cuales carecen los invertebrados. El cáncer se considera, a veces, como opuesto a la vejez porque conlleva crecimiento más vigoroso. Además la senescencia celular, el cese irreversible del crecimiento, se ha considerado como un modelo de envejecimiento in vivo, pero ahora se conoce como una respuesta supresora tumoral al estrés. Las células senescentes aumentan con la edad en ratón, en primates no humanos y en humanos, pero comprenden solo una fracción de células en los tejidos renovables. La senescencia celular puede ser otra estrategia evolutiva, así como suprime el cáncer en fases tempranas, puede promover el envejecimiento al agotar las células madre o alterar sus nichos. Las células senescentes secretan citoquinas inflamatorias y otras moléculas que alteran el microambiente tisular y pueden estimular el crecimiento de células y proteger las mutaciones preneoplásicas. Por otra parte el incremento en la senescencia celular y la disminución del potencial proliferativo, puede también explicar la disminución en la incidencia del cáncer a edades muy avanzadas (más de 80 años). Así que, la senescencia celular puede actuar como carcinógeno o como anti-carcinógeno.

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Poco se sabe de los fenotipos senescentes y las causas de muerte en el C. elegans. El sistema nervioso está notablemente preservado, pero los nematodos viejos muestran movimientos más lentos, ritmo más lento de bombeo faríngeo (debido al deterioro del músculo, similar a la sarcopenia humana) y un incremento en lipofucsina. Es digno de destacar que existe una amplia variabilidad en la degeneración relacionada con la edad entre animales genéticamente idénticos y células del mismo tipo en un individuo. Esto refuerza el papel potencialmente importante de eventos estocásticos en el envejecimiento. También en Drosophila se sabe poco acerca de la edad y las causas de muerte. A pesar de ello, este organismo está emergiendo como un poderoso modelo de enfermedades humanas relacionadas con la edad, tal como la enfermedad de Parkinson. Las moscas viejas también padecen sarcopenia y acumulan lipofucsina, de manera que estos rasgos pueden ser fenotipos senescentes universales. Las moscas sufren también síntomas de disfunción cognitiva, síntoma que comparten con ratones y humanos.

¿Podemos distinguir entre envejecimiento y enfermedad? La respuesta

es difícil, depende de la enfermedad y cómo su mecanismo se relaciona con el envejecimiento intrínseco, que son los cambios relacionados con la edad, no determinados por factores externos o predisposición genética. Enfermedades como la anemia falciforme causada por una mutación hereditaria en el gen de la β-globina, aparece en edades jóvenes en constricción vascular y mayor riesgo de infección, pero es también común en ancianos. Debido a que estos fenotipos se manifiestan dentro del campo de la selección natural, la anemia falciforme no es una enfermedad relacionada con el envejecimiento, ya que sus causas tienen poco que ver con la edad. Tal distinción mecanística es mucho más difícil para enfermedades de desarrollo tardío. Muchos distinguirían una degeneración vascular fatal de una benigna aparición de pelo gris, sin embargo, ambos fenotipos tienen la misma causa: el envejecimiento intrínseco. Por otra parte, mecanismos diferentes pueden producir el mismo fenotipo relacionado con la enfermedad en edades avanzadas. Por ejemplo, el envejecimiento intrínseco de las células endoteliales puede contribuir a la aterosclerosis, como hacen las mutaciones o los polimorfismos en genes que codifican el receptor de la lipoproteína de baja densidad o ApoB. Las estatinas pueden rebajar el colesterol y suprimir la aterosclerosis en individuos con elevado riesgo, con receptor de lipoproteínas de baja densidad o alelos ApoB, pero no puede prevenir el envejecimiento intrínseco de las células endoteliales.

Capítulo 8

235

Las enfermedades son la causa principal de muerte entre los humanos de edad avanzada. Arteriosclerosis, diabetes, demencia, osteoporosis, osteoartritis y cáncer son patologías prominentes y responsables de la mortalidad de individuos de edad. Entre los ancianos que escapan a estas enfermedades, la causa de muerte es a menudo desconocida. Sin embargo, como las interacciones entre los fenotipos senescentes son complejos, la muerte natural puede ser considerada como enfermedad oculta. Por ejemplo, atrofias sutiles de los tejidos, neuropatías o derrames microvasculares pueden ocultar la muerte de ancianos sometidos a estrés. No está claro si una intervención con éxito en una enfermedad manifiesta mejorará el envejecimiento intrínseco ampliando así la vida media de manera significativa.

El envejecimiento está influenciado por factores genéticos y ambientales

que pueden estar relacionados o no con el envejecimiento intrínseco. Independiente de los mecanismos posibles del envejecimiento intrínseco, los alelos que promueven el envejecimiento penetran la línea germinal en tanto en cuanto sus efectos adversos se manifiesten lo suficientemente tarde como para crear una diversidad de factores de riesgo genéticos. Incluso entre organismos endogámicos, por ejemplo, en gemelos humanos monocigóticos, la diversidad genética ocurre en células somáticas por mutación y epimutación en edades muy tempranas. De igual manera, el medioambiente o el estilo de vida (luz solar, tabaco), pueden acelerar el envejecimiento intrínseco en tejidos específicos. Es posible que los individuos de longevidad extrema, 100 o más años, sean aquellos que consiguen escapar a los riesgos genéticos y ambientales. Esta posibilidad está apoyada por el ritmo desacelerado en la mortalidad vista en edades avanzadas en poblaciones de invertebrados y humanos, lo que indica la supervivencia de muy pocos individuos frágiles. Una cuestión permanece: ¿cómo estos supervivientes que escapan a los riesgos genéticos y ambientales, que eliminan individuos mediante enfermedad, sucumben al envejecimiento intrínseco? A la pregunta si existe realmente un mecanismo de envejecimiento intrínseco que afecte a cada célula o a cada tejido, tendremos que investigar cuáles son sus bases.

7. Bases del envejecimiento intrínseco El envejecimiento implica numerosos cambios funcionales y

estructurales, de los cuales muchos afectan la supervivencia. Un proceso universal de envejecimiento intrínseco puede explicar los fenotipos senescentes comunes entre los animales. Una de las características

Capítulo 8

236

compartidas por todas las especies estudiadas hasta la fecha es el acumulo de lesiones somáticas no reparadas. Así, en el acumulo durante la vida de varios tipos de lesión, junto con errores aleatorios en procesos de información, se sustenta el envejecimiento intrínseco (Figura 3). La atenuación de tal daño puede explicar la longevidad conferida por mutaciones que amortiguan los procesos metabólicos normales. Además, los sistemas de defensa que mantienen el daño bajo control pueden diferir en eficacia entre las especies, dictando su vida media. Causas prominentes de daño somático incluyen las especies reactivas de oxígeno (ROS) y los azúcares reductores. Las ROS, los subproductos de la respiración y otros procesos metabólicos pueden lesionar y entrecruzar DNA, proteínas y lípidos. Los azúcares reductores reaccionan con otros carbohidratos y con grupos amino de las proteínas, dando lugar a la formación de productos terminales de glicosilación avanzada (AGE), muy difíciles de degradar.

Los AGE se acumulan en estructuras proteicas de larga vida, tales como

el colágeno y la elastina. Los AGE incrementan la rigidez de los vasos sanguíneos y las articulaciones y alteran la función del riñón, corazón, retina y otros órganos. Las intervenciones que eliminan el daño pueden contrarrestar los efectos adversos de las ROS y los AGE, y posponer el envejecimiento indefinidamente. Sin embargo, el daño a las macromoleculas se manifiesta de muchas formas y muchas de ellas no han sido aún identificadas. Además, no sabemos sus contribuciones relativas al envejecimiento intrínseco o cómo pueden interaccionar varios componentes del espectro de lesiones. Parece más eficaz eliminar las moléculas dañinas en vez del daño mismo. Sin embargo, algunas moléculas dañinas son cruciales para la función normal de la célula. Dos ejemplos son la glucosa, que no puede ser eliminada totalmente, y las ROS, que son moléculas señalizadoras.

El intento de decidir entre los efectos beneficiosos o perjudiciales de

algunas moléculas ha de complicar las estrategias dirigidas al alargamiento de la longevidad, neutralizándolas. Un intento similar pueden ser los procesos celulares que nos defienden contra el cáncer. La regeneración de los tejidos eleva el riesgo de cáncer al elevar la posibilidad de adquirir mutaciones o epimutaciones en el DNA, las cuales ocurren frecuentemente en cada organismo como consecuencia de errores durante la replicación o reparación de un DNA lesionado. Los mecanismos supresores de tumores eliminan células que adquieren un determinado grado de lesión (apoptosis) o previenen permanentemente su proliferación (senescencia). Estas respuestas, sin embargo, pueden gradualmente causar atrofia tisular y por tanto, pérdida

Capítulo 8

237

de la función y capacidad regenerativa del órgano (Figura 3). En principio, el trasplante de células madre puede contrarrestar los efectos adversos de estas respuestas a la lesión.

Figura 3. Aunque estocásticas en naturaleza, las causas del envejecimiento y del cáncer

implican mecanismos programados y al azar Cuando el nivel de lesión no es lo suficiente elevado para producir una

respuesta apoptótica o de senescencia, aparece una situación difícil de establecer: el acumulo gradual de cambios aleatorios en el DNA o en proteínas que convierten el tejido en un mosaico celular. Tales cambios estocásticos pueden reajustar genes reguladores y de manera aleatoria alterar los perfiles de expresión genética en una célula. Estos cambios pueden comprometer la función tisular sin producir respuestas celulares inmediatas (Figura 3). La desviación de la regulación genética sería difícil de corregir y podría incluso ocurrir en células madre in vivo o ex vivo durante la expansión para terapia de trasplante. Además, las vías de desarrollo que son esenciales para la buena disposición en la vida durante la infancia o la reproducción pueden ser deletéreas en tejidos adultos. Por ejemplo, vías que conducen la morfogénesis ductal en la glandula mamaria en el desarrollo o

Capítulo 8

238

en la preñez pueden gradualmente promover hiperplasia ductal en la glándula mamaria madura, predisponiendo al cáncer.

8. Otras consideraciones Cada vez hay más certeza acerca de la manipulación de la longevidad

por medios farmacológicos, aunque no está claro aún el mecanismo por el cual tales intervenciones actúan. Pequeños compuestos polifenólicos, como el resveratrol incrementan in vitro la actividad NAD desacetilasa de SIR2, e incrementan la vida media de la levadura, C. elegans y Drosophila, en una forma que depende de Sir2. También el resveratrol es un potente antioxidante y suprime el daño oxidativo. El resveratrol incrementa la sensibilidad a la insulina y la supervivencia en ratones alimentados con dietas altas en calorías. La rapamicina un antibiótico antifúngico inhibe la vía pro-envejecimiento TOR en células de levadura y humanas. No se sabe si la inhibición de TOR amplia la esperanza de vida en mamíferos, pero el solapamiento mecanístico con la metformina, un fármaco antidiabético, sugiere que puede ser. La metformina incrementa la sensibilidad a la insulina y reduce la glucosa plasmática y puede alargar la vida al activar la AMPK, y por tanto, inhibiendo la vía TOR y la señalización IGF1. El metabolismo de la glucosa es uno de los objetivos principales para intervenciones pro-longevidad, sobre la base de la evidencia que inhibe vías energéticas que simulan la restricción dietética o inhiben la vía señalizadora insulina/IGF1. Un ejemplo es la 2-desoxi-D-glucosa (2DG), que produce efectos beneficiosos similares a los de la dieta restringida. No se sabe si la 2DG alarga la vida, pero se encuentra ya en fase I de pruebas clínicas para tratar tumores sólidos, que dependen de la glucolisis para su supervivencia y son sensibles a la 2DG.

Los antioxidantes naturales, como las vitaminas C y E y el beta caroteno,

han sido repetidamente probados por su capacidad potencial de ampliar la supervivencia en ratones, pero con resultados poco significativos. En humanos, la elevada ingesta de antioxidantes se relaciona con riesgo disminuido de enfermedades, pero las pruebas clínicas con suplementos en la dieta de vitamina E y beta caroteno fracasaron en la mejora de enfermedades. Agentes sintéticos atrapadores de ROS han sido probados en C.elegans y ratones con resultados conflictivos. Los radicales libres atrapadores de electrones, como la fenil tert-butil-nitrona (PBN), bloquean o revierten la lesión asociada con una variedad de enfermedades en modelos animales, sin embargo, un derivado de PBN no ha podido ampliar la

Capítulo 8

239

longevidad en ratones. Por otro lado, ciertos entrecruzamientos de los AGE pueden ser rotos con agentes químicos, por ejemplo el haluro de tiazolio y el alagebrium son solo parcialmente efectivos porque rompen un pequeño subgrupo de estructuras entrecruzadas. Sin embargo, el alagebrium alivió la rigidez cardiovascular en monos y está hoy en pruebas clínicas para trastornos cardiovasculares y diabetes que se asocian con enfermedad renal.

Los rápidos avances en células madre hacen que la terapia de reemplazo

sea un prometedor tratamiento, para regenerar tejidos funcionalmente en declive de envejecimiento intrínseco. Como los células madre endógenas muestran declive funcional con el envejecimiento, una opción lógica es diferenciar células pluripotentes, obtenidas de embriones o generadas por reprogramación de células somáticas, en células especializadas ex vivo. Antes de que estas ideas lleguen a ser una opción real, tenemos que comprender mucho más sobre cómo las células madre adultas contribuyen al mantenimiento del tejido durante el envejecimiento, cómo el envejecimiento altera el microambiente de las células madre o nicho y cómo se mantiene la capacidad regeneradora funcional de las células madre durante la diferenciación y expansión del tejido.

9. Perspectivas futuras Es un hecho reconocido que la mortalidad declina y la esperanza de vida

incrementa en tanto en cuanto el mundo se desarrolla. Antes de 1970, esto era debido a mejoras en la alimentación y en la sanidad (avances en la medicina, vacunas y antibióticos). Después de 1979, la mortalidad declina debido probablemente a la medicina preventiva, estilo de vida, uso rutinario de medicamentos contra la hipertensión y otros fármacos. Es imposible pronosticar, en este momento, si el incremento de intervenciones sofisticadas conseguirá disminuir el fenotipo senescente. Sin embargo, existen razones para tener precaución.

Primero, la intervención farmacológica sobre la base de vías

identificadas en modelos experimentales puede ser una ilusión porque las ganancias en longevidad conseguidas en los organismos experimentales, parece que declinan cuando se trata de organismos más complejos o dependen de la fisiología idiosincrática.

Segundo, la expectativa de vida en unos organismos puede ser menos

manipulable que en otros. Además el cáncer supone un desafío a la

Capítulo 8

240

longevidad, que es distinto a partir de la degeneración relacionada con la edad y puede ser suprimida por mecanismos que son también pro-envejecimiento.

Tercero, existen todavía enormes lagunas en nuestro conocimiento sobre

cómo las vías metabólicas operan e interaccionan, y cómo serios efectos colaterales pueden restringir la efectividad de intervenciones farmacológicas.

La reparación del daño a macromoléculas puede ser más prometedora

especialmente al unísono con mejores terapias anticáncer. Sin embargo, no está tampoco claro que todas las lesiones tóxicas hayan sido identificadas, o si existen estrategias prácticas para eliminarlas. Por ejemplo, sería imposible contrarrestar el cambio (epi) genómico por medios farmacológicos, ya que las células y órganos trasplantados están también sujetos a perder la integridad genómica. Además, no sabemos si el daño macromolecular es la única causa del envejecimiento. Incluso en organismos simples no está claro que las vías moduladoras de la longevidad supongan interacciones exquisitamente compensadas, reguladas por numerosos elementos genéticos.

El gran número de transacciones genómicas genera errores inevitables,

muchos de ellos irreversibles. Además, existe evidencia que el envejecimiento supone un cambio gradual hacia perfiles más fortuitos, que puede causar fallos en órganos y tejidos que no pueden ser eliminados por intervenciones farmacológicas o biológicas. En teoría las intervenciones pueden ser diseñadas para alterar las redes orquestadas de interacción célula-célula para incrementar la vida. Esto es lo esencial que la evolución ha hecho para producir especies de vida larga. La cuestión es, ¿podemos simular el proceso evolutivo de forma que la senescencia llegue a ser casi insignificante? La respuesta debe ser que no lo sabemos. Aunque no hay razón científica para no esforzarse en curar el envejecimiento, lo mismo que se hace con el cáncer y otras enfermedades, nuestro conocimiento hoy hace imposible afirmar que un aplazamiento indefinido sea factible. Necesitamos el momento presente para intensificar las investigaciones dirigidas a resolver las principales dudas que impiden un conocimiento más completo de los mecanismos básicos del envejecimiento y su relación con la enfermedad. Solo estas consideraciones nos permitirán diseñar estrategias para conseguir aumentar la salud y la expectativa de vida humanas.

Capítulo 8

241

10. Abreviaturas AGE, productos terminales de glicosilación avanzada; AKT, serina

treonina quinasa, proteína quinasa B; AMPK, quinasa activada por AMP; BAX, factor apoptogénico; 2DG, 2-desoxi-D-glucosa; FOXO, factor de transcripción de la familia forkhead; IGF1, factor de crecimiento insulínico; IIS, vía señalizadora insulina/IGF1; IGF1R, receptor de IGF1; PI3K fosfoinositol 3 quinasa; PBN, fenil tert-butil nitrona; PTEN fosfatasa y homólogo de la tensina; SIR, regulador silente de la información, NAD desacetilasa; ROS, especies reactivas de oxígeno; TOR, objetivo de la rapamicina.

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243

Weindruch R (2006) Will dietary restriction work in primates? Biogerontology 7, 169–171

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244

Capítulo 9. CÉLULAS MADRE 1. Introducción 2. Células madre adultas 3. Células madre en órgano normal 4. Deterioro oxidativo celular dependiente de la edad 5. Envejecimiento y células madre 6. Envejecimiento del nicho de las células madre 7. Telomerasa en las células madre. 8. Replicación del DNA 9. Cáncer, envejecimiento y regulación de las células madre 10. Terapia Regenerativa 11. Conclusiones 12. Abreviaturas 13. Bibliografía 1. Introducción El envejecimiento es un proceso complejo que afecta a cada célula y

cada órgano y conlleva el deterioro de las funciones. A medida que transcurre la edad la piel pierde su elasticidad y las heridas curan más lentamente. Lo mismo ocurre con los huesos que se fracturan con más facilidad y necesitan más tiempo para reparar la fractura. El tejido pulmonar también pierde elasticidad. Los vasos sanguíneos acumulan depósitos grasos y se vuelven menos flexibles con riesgo de arterioesclerosis. La menor capacidad de regeneración de los tejidos u órganos lesionados y la mayor propensión a infecciones y al cáncer son las características más prominentes de la senectud. Aunque la vulnerabilidad a las enfermedades infecciosas y al cáncer está causada por un decaimiento de la función del sistema inmune, éste es a su vez, producto de interacciones entre las células madre hematopoyéticas y el microambiente en la médula ósea y el timo, como también de la mucosa que tapiza los bronquios y los sistemas digestivos. Por tanto, todos los cambios que tienen lugar en el envejecimiento, deterioro tisular, cáncer y propensión a las infecciones, pueden ser interpretados como signos de la edad a nivel de las células madre somáticas. Como los procesos regenerativos de un organismo vivo están determinados por la capacidad potencial de sus células madre para reemplazar el tejido dañado, un organismo vivo es, por tanto, tan viejo como sus células madre.

Capítulo 9

245

Los mamíferos y especialmente los humanos han pagado un alto precio por subir en la escala evolutiva y han perdido gran parte del poder regenerador que poseen otros animales. Así, mientras los humanos poseen muy limitada capacidad de regenerar sus tejidos, otros organismos muestran capacidades regeneradoras extraordinarias. Ante la decapitación, la planaria regenera una nueva cabeza en cinco días. La hidra, un pequeño animal tubular acuático que trepa por las rocas, es capaz de producir dos nuevos organismos en 7–10 días cuando su cuerpo se divide por la mitad. Las lagartijas recobran su cola o pata perdidas por acción de un predador, en materia de unos días. Estos animales con capacidad regeneradora tan elevada, poseen una abundancia de células madre o desdiferencian las células de tejidos diferenciados, en células madre. Se ha calculado que un 20 % de algunos gusanos consisten en células madre y la hidra es una clase de embrión permanente. Las lagartijas usan un mecanismo diferente y cuando tienen necesidad urgente de un nuevo miembro, convierten células diferenciadas adultas en células indiferenciadas embrionarias. Estas células migran al lugar de la lesión donde regeneran la parte perdida.

Hasta un cierto punto los mamíferos pueden regenerar algunos tejidos,

tales como la piel y la médula ósea, pero no en el grado que lo hacen la hidra o la lagartijas. La capacidad de regeneración de los humanos declina con la edad. Se conoce poco acerca del impacto del tiempo y la edad sobre las unidades básicas de la vida, las células madre adultas específicas de los tejidos. Así que, un mayor conocimiento a nivel celular y molecular de los procesos que capacitan a las células madre para iniciar la autorrenovación y para dividirse, proliferar y diferenciarse en células funcionales de tejidos lesionados, ha de ser la clave de la terapia regeneradora y una cura eventual para muchas enfermedades.

2. Células madre adultas Las células madre adultas o somáticas, proporcionan el medio de

regenerar los tejidos envejecidos o deteriorados. La doble capacidad de estas células de autorrenovarse y diferenciarse en linajes múltiples, se encuentra controlada por interacción directa con un microambiente específico, denominado “nicho”. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC) residen en la médula ósea y es tema de debate si ellas poseen una verdadera autorrenovación o sufren la senescencia replicativa como cualquier otra célula somática. No se sabe en qué grado los cambios dependientes de la edad en estas células madre se deben a factores intrínsecos o a estímulos

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246

externos. Se ha demostrado que el nicho juega el papel más importante en el envejecimiento de las células madre adultas. El nicho mantiene las HSC en estado quiescente que reduce el daño al DNA, las protege de radicales y compuestos tóxicos, regula las cascadas señalizadoras intrínsecas y modula la expresión genética y las modificaciones epigenéticas. Por tanto, está claro que existe una interrelación entre estas células madre y su nicho que controla la función de las HSC, incluyendo los procesos del envejecimiento en la hematopoyesis.

El envejecimiento es un proceso complejo que afecta a cada célula y

cada órgano y que conduce al deterioro de muchas de las funciones del organismo en el transcurrir de la vida de un individuo. La menor capacidad de regenerar los tejidos lesionados y la mayor propensión a infecciones y cáncer, son las características más prominentes de la senectud. Las células madre adultas aseguran a lo largo de la vida la regeneración de los tejidos adultos. Si el efecto rejuvenecedor de las células madre fuera perfecto, las células senescentes serían reemplazadas indefinidamente. La investigación sobre células madre y sus cambios asociados a la edad, tiene interés por dos razones:

1. las células madre suponen un buen modelo para estudiar el

envejecimiento, ya que ellas proporcionan la base de la regeneración de los tejidos envejecidos, y

2. encontrar el medio de reactivar las células madre y controlar su

destino, puede crear magníficas oportunidades para el tratamiento de las enfermedades degenerativas del envejecimiento

Por tanto, todos los fenómenos de la senectud se pueden interpretar a

nivel de las células madre somáticas, y se considera que un organismo es tan viejo como lo son sus células madre.

Todas las células somáticas normales cultivadas in vitro, dejan de

proliferar después de un cierto número de divisiones antes de entrar en un estado denominado senescente, en el cual las células son viables y metabólicamente activas, pero han perdido la capacidad de proliferar. No hay que confundir el estado senescente con el estado reversible de quiescencia, en el que las células se encuentran en reposo proliferativo o fase G0 del ciclo celular. Desde la primera descripción de senescencia replicativa se ha especulado mucho sobre cuál es el proceso que gobierna el

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envejecimiento de todo el organismo, en base a dos aspectos fundamentales: ¿Es el envejecimiento resultado de un programa genético o es provocado por acontecimientos accidentales o fortuitos?

El progresivo acortamiento de los telómeros o la modificación de las

estructuras teloméricas se considera que es el desencadenante principal de la senescencia replicativa. La casi indetectable actividad telomerasa en células normales, es lo que conduce a la sucesiva pérdida de los telómeros en cada división celular. Por el contrario, las células germinales, las células madre embrionarias y las adultas, mantienen su telómeros mediante la telomerasa activa y esto evita la senescencia replicativa.

Sin embargo, este mecanismo no es solo la causa del envejecimiento. La

senescencia implica también lesión al DNA y estrés oxidativo. Por tanto, la senescencia es un proceso muy complejo, y la secuencia de los acontecimientos moleculares que la producen esta muy lejos de ser conocida en su totalidad.

En general, las células madre adultas tienen un recambio bajo y residen

en nichos especializados, protegidas del medio ambiente y activadas en determinados momentos. La mayoría de ellas permanecen en la fase G0 (estado quiescente), en contraste con las células progenitoras amplificadoras transitorias (TA). El nicho es el que gobierna la división celular asimétrica que ha de proporcionar la autorrenovación y la diferenciación y juega también un papel importante en la regulación del envejecimiento.

3. Células madre en órgano normal Aunque el concepto de células madre fue introducido hace un siglo por

Alexander Maximox (1909), la moderna investigación comenzó en 1963 cuando Siminovitch, Culloch y Till, y consiguieron detectar las células madre hematopoyéticas (HSC, hematopoietic stem cells). Primero demostraron que las células de la médula ósea podían reconstituir la hematopoyesis y rescatar animales irradiados con dosis letales. Segundo, usando trasplantes seriados establecieron la capacidad autorrenovadora de las células originales de la médula ósea. Cuando células de colonias del bazo, obtenidas de los primeros receptores de trasplantes de médula ósea, fueron posteriormente trasplantadas en animales que habían recibido dosis letales de irradiación, se encontraron colonias de leucocitos y eritrocitos en los segundos receptores. En base a estos experimentos se definieron las

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248

HSC como células que poseían la “capacidad de autorrenovación no restringida y diferenciación en linaje múltiple”. Este descubrimiento marcó el comienzo de los días de la investigación de las células madre. Solo recientemente se han identificado otras células madre somáticas en tejidos con capacidad regenerativa más limitada.

La funcionalidad regenerativa en cualquier órgano o tejido se

desencadena por activación de células madre quiescentes que se localizan en nichos muy específicos. Esta activación está normalmente mediada por señales recibidas a través de vías de señalización tales como Wnt, Hedgehog o Notch. Lo que sigue es una secuencia de eventos estrictamente regulados a niveles genéticos y epigenéticos y por el microambiente circundante. El resultado neto de este proceso de activación es el establecimiento de una jerarquía bien definida que comienza a partir de la célula madre poco proliferativa (quiescente) y da lugar a la amplificación transitoria (TA) de precursores tempranos y tardíos que poseen capacidad proliferativa elevada. Estos precursores generan progenitores comprometidos en el linaje y finalmente células diferenciadas terminales no proliferativas, con funcionalidad especializada necesaria para el funcionamiento del órgano (Figura 1). La homeostasis se consigue entre el número de células diferenciadas terminales y una nueva activación de la célula madre, de manera que se asegure el relativo recambio celular para el mantenimiento del equilibrio funcional dentro del órgano.

La mayoría de los tejidos que se autorrenuevan caen dentro de esta

categoría. Cada vez que una célula madre se divide genera dos células hijas; una de ellas es una nueva célula madre y la otra es una célula comprometida con asimetría conseguida sobre una población base, como también a nivel de divisiones celulares individuales. La asimetría de la población facilita la respuesta a las necesidades fisiológicas variables, por ejemplo, durante la cicatrización de las heridas. Las células en cada nivel de jerarquía responden de manera diferente a señales extrínsecas: específicamente cada tipo celular requiere diferentes señales para progresar al nivel siguiente. Esto demuestra la importancia del microambiente en la regulación de la supervivencia de la célula madre y en la protección de su composición genética, mientras que imparte la diversidad funcional de las células diferenciadas en el órgano.

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Figura 1. Jerarquía de las células madre en la regeneración de un tejido normal. Una

célula madre adulta quiescente, que se localiza en nichos específicos dentro del órgano, recibe una señal de activación y se divide por división asimétrica, generando una nueva célula madre y una célula amplificadora transitoria (TA), con descendencia de células TA tempranas y células TA tardías. En respuesta a una señal microambiental en base al compromiso del linaje, se generan células progenitoras específicas del tejido cuya descendencia serán las células diferenciadas terminales sin capacidad proliferativa (Bapat 2007).

En el sistema hematopoyético, así como en otros tejidos normales, las

células madre tienen la capacidad de autorrenovación, son pluripotentes y generalmente quiescentes, manteniéndose la mayor parte de su tiempo en G0. Así como las células madre pueden reparar su DNA, al autorrenovarse pueden también acumular mutaciones adquiridas tras su exposición a agentes carcinógenos. Si los tumores surgen a partir de las células madre, la acumulación de estas mutaciones debe ser lo que se ha reconocido como el proceso multiescalonado de la carcinogenesis. Así, cabe preguntarse ¿surgen las células madre cancerosas de células madre normales o surgen de células diferenciadas que adquieren capacidad de autorrenovarse? ¿Contribuye la

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resistencia innata de las células madre normales a la radiación y a las toxinas, al fracaso de algunas terapias del cáncer? ¿Cómo se puede aprovechar el conocimiento de las células madre para seleccionarlas específicamente y mejorar la terapia?

Figura 2. Procesos biológicos que afectan a las células madre. La biología de las

células madre implica muchos procesos celulares diferentes necesarios para mantener el reservorio de HSC y su funcionalidad durante las condiciones ambientales variables a lo largo de la vida. La dotación de células madre se mantiene cuidadosamente mediante el estricto equilibrio entre proliferación vs quiescencia y autorrenovación vs diferenciación y la relación dinámica entre la extravasación en sangre y linfa (movilización) vs el mantenimiento en un nicho de la médula ósea (homing). Defectos en cualquiera de estos procesos supone una situación de estrés que las conducirá a la senescencia o a la apoptosis. La disminución del número de células en el reservorio de las células madre y de sus funciones dará lugar al envejecimiento, lo que implica pérdida del potencial normal del reservorio, y afecta la longevidad. Las flechas verdes indican los procesos celulares que favorecen el mantenimiento de la población de HSC, mientras que las flechas marrones indican aquellos factores que las comprometen a su destrucción HSC: células madre hematopoyéticas. HPC: células hematopoyéticas progenitoras (Liang y Zant 2008, modificado).

Las células madre normales en el organismo adulto son las responsables

de la renovación y reparación del tejido dañado o envejecido. Una característica inherente a las células madre es su capacidad de autorrenovación sin pérdida de su capacidad proliferativa. Las células madre son inmortales y resistentes a la acción de fármacos. Son capaces de diferenciarse y formar tipos específicos de tejidos debido a la influencia del microambiente que las rodea y a otros factores.

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La biología de las células madre implica muchos procesos celulares diferentes necesarios para mantener el reservorio de las HSC y su funcionalidad durante las condiciones ambientales variables a lo largo de la vida. La dotación de células madre se mantiene cuidadosamente mediante el estricto equilibrio proliferación vs quiescencia, autorrenovación vs diferenciación y la relación dinámica entre la extravasación en sangre y linfa (movilización) vs el mantenimiento en un nicho de la médula ósea (homing). Defectos en cualquiera de estos procesos supone una situación de estrés que las conducirá a la senescencia o a la apoptosis. La disminución del número de células en el reservorio de las células madre y de sus funciones dará lugar al envejecimiento lo que implica pérdida del potencial normal del reservorio, y afecta la longevidad (Figura 2).

4. Deterioro oxidativo celular dependiente de la edad Una teoría basada en el deterioro oxidativo celular dependiente de la

edad fue propuesta por Harman en 1956 y todavía tiene absoluta vigencia. Este deterioro tiene dos componentes principales: daño oxidativo y daño replicativo celular. El metabolismo normal produce especies reactivas de oxígeno (ROS), que pueden oxidar y lesionar las membranas celulares proteínas y ácidos nucleicos. Un ejemplo del efecto de la toxicidad de las ROS sobre proceso del envejecimiento se encuentra en estudios en los cuales fueron sobreexpresados los enzimas que limitan la exposición de los componentes celulares a las ROS, tales como catalasa y superóxido dismutasa (SOD1). Niveles de actividad de estos enzimas superiores a lo normal causaron un incremento en la esperanza de vida del 20–30% en Drosophila. Si esta sobreexpresión se dirigió a las células neuronales, las moscas vivieron incluso más, lo que indica que el sistema nervioso es susceptible de lesión por las ROS y que tal lesión afecta la longevidad. En mamíferos, la conexión entre los ROS y el envejecimiento es todavía incompleta, debido a no existe evidencia de prematuro envejecimiento en ratones que acarrean mutaciones de pérdida de función en enzimas que eliminan las ROS. Además, el daño ocasionado por las ROS en el genoma mitocondrial producido por mutaciones debidas al envejecimiento, causa defectos en la cadena de transporte electrónico, lo que afecta a la producción de energía y produce todavía más cantidad de ROS. Este declinar de la función mitocondrial por efecto del envejecimiento se ha detectado en muchas especies, y se ha llegado a la conclusión que el envejecimiento está directamente relacionado con el metabolismo celular y la disminución de la función mitocondrial. Además de la mitocondria otros orgánulos

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subcelulares, tales como los lisosomas, se lesionan debido a modificaciones ocasionadas por las ROS. La lipofuscina, pigmento típico de la ancianidad, se compone de material intralisosómico polimérico que no puede ser degradado por las hidrolasas lisosómicas. Existe una correlación inversa entre el acumulo de lipofuscina, la función lisosómica y la expectativa de vida de la célula. La presencia de lipofuscina en las células madre se ha visto que interfiere con las funciones celulares y promueve patologías relacionadas con la edad, tales como enfermedades neurodegenerativas, fallo cardiaco y degeneración macular.

Muchos mecanismos pueden estar implicados en el riesgo debido a la

oxidación y agregación de proteínas en células senescentes. El estrés oxidativo y las ROS representan los mayores contribuyentes. El acumulo de ROS durante el envejecimiento biológico, conduce en sus últimas causas a una extensa oxidación de las macromoléculas, DNA, proteínas y lípidos, las cuales una vez modificadas por oxidación, se vuelven inestables y propensas a alteración estructural, promoviendo así la formación de agregados proteicos. Otro mecanismo implica el acumulo de mutaciones en el DNA y una disminución de los sistemas de reparación. Cuando mutaciones no sinónimas ocurren en las secuencias modificadoras, pueden ser sustituidos aminoácidos inapropiados lo que desestabiliza el plegamiento de la estructura nativa de las proteínas y favorece la formación de proteínas mal plegadas. Cuando las mutaciones ocurren en sitios promotores de genes asociados con el envejecimiento y la enfermedad, pueden incrementar la transcripción y la concentración de proteínas y péptidos con propensión a la agregación. Estos agregados interfieren con las funciones normales de la célula en multitud de vías, lo que conduce a la senescencia o a la muerte celular. Por tanto, el estrés oxidativo, las mutaciones al DNA y otros mecanismos anteriormente citados, pueden estar implicados en el declinar en el número y función de las células madre por efecto del envejecimiento.

5. Envejecimiento y células madre Un número de factores interfieren con la potencia completa de la

población de células madre durante el envejecimiento. Si el envejecimiento se mira como el acumulo en un organismo de células de usar y tirar, el ritmo y grado del envejecimiento de dicho organismo son un reflejo de cómo éste contrarresta los deletéreos efectos del ambiente. Se han propuesto dos teorías principales respecto al envejecimiento: una basada en la evolución y otra basada en el daño. Muchos biólogos evolucionistas sugieren que los genes

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que favorecen la reproducción de las especies tienen efectos negativos en la última fase de la vida, limitando la longevidad. Este fenómeno se ha denominado pleiotropía negativa. De acuerdo con esta teoría los organismos se mantienen mientras permanece su competencia reproductora. Después de la fase reproductora, los genes seleccionados por sus efectos beneficiosos sobre la reproducción no se expresan. Un ejemplo de la pleiotropía antagonista es el papel de los andrógenos en los machos. Los andrógenos, las hormonas responsables del crecimiento y función de la próstata en los jóvenes, que juegan un papel importante en la generación del esperma para la reproducción, son las mismas hormonas que en la vejez contribuyen al cáncer de próstata.

Figura 3. Modelo de proliferación de células madre y envejecimiento. (A) Células

madre jóvenes, representadas aquí como células madre hematopoyéticas, sufren la autorrenovación, que les permite el mantenimiento del reservorio de células madre y la producción de todas las células efectoras diferenciadas requeridas (neutrófilos, linfocitos, eritrocitos, plaquetas, etc). (B) La acumulación de mutaciones en el DNA con el envejecimiento conduce a una pérdida de células madre y a una menor capacidad para autorrenovarse con un neto descenso en el número de células madre. Además, las células madre remanentes pierden su capacidad para diferenciarse en el linaje hematopoyético. El incremento en la pérdida de células ocurre por apoptosis o senescencia cuando las células acumulan mutaciones en el DNA a un nivel crítico. Las células mutadas que escapan de la apoptosis o senescencia son un riesgo de transformación maligna (Bellantuomo y Keith 2007)

La teoría de la senescencia replicativa fue introducida en 1961 por

Hayflick, como proceso que limita el número de divisiones que una célula específica puede sufrir a lo largo de la vida y que posteriormente se ha

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asociado a la pérdida del DNA telomérico. La senescencia replicativa o parada del crecimiento se postuló al detectar que existía una conexión directa entre las rondas de replicación y la pérdida de los telómeros situados en los extremos de los cromosomas. Durante cada división se pierde DNA telomérico, porque la mayoría de las células somáticas no expresan telomerasa, la enzima responsable de reconstituir los telómeros. Se ha demostrado que la longevidad puede prolongarse en gusanos que sobreexpresan HRP-1, una proteína que se une a los telómeros e incrementa su longitud. Sin embargo, los mecanismos implicados en tal proceso no están del todo claros. Posteriores estudios han demostrado que las células afectadas sufren senescencia antes de adquirir telómeros cortos críticos, para evitar la inestabilidad genómica que puede conducir al cáncer. Por tanto, la senescencia replicativa/parada del crecimiento no depende exclusivamente de la erosión telomérica, depende también de otros mecanismos.

A pesar de la capacidad de autorrenovación de las células madre adultas,

recientemente ha surgido en estas células la noción del envejecimiento. Datos obtenidos sugieren que con la edad el proceso de autorrenovación y diferenciación resulta afectado, mostrando una menor generación de progenia diferenciada o dirigida hacia un linaje particular. La división celular asimétrica se ha observado en un número muy limitado de tipos celulares y la evidencia experimental es débil. Por el contrario evidencia más convincente sugiere que existe un acumulo de cambios en el DNA de las células madre a medida que transcurre el tiempo, que puede afectar su funcionalidad. Si los cambios en el DNA alcanzan un cierto umbral, las células madre pueden sufrir apoptosis o senescencia, lo cual incrementa la pérdida celular y disminuye el número de células. Alternativamente, las células madre pueden escapar de la senescencia y tener un riesgo de sufrir cambios clonales que pueden conducir a la formación de un tumor (Figura 3). Aunque alguno de estos procesos está bien comprobado, otros permanecen hipotéticos. Además, no está claro si estos cambios ocurren en células madre, como parte de un proceso fisiológico o solo en circunstancias de estrés extremo, y si es el resultado de un programa intrínseco de las células madre o de cambios en el microambiente en el cual ellas residen. También es materia de debate si hay alguna vía relacionada o causal para el envejecimiento de los tejidos y la pérdida de su función o existe alguna alternativa que puede predisponer al desarrollo de tumores malignos

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6. Envejecimiento del nicho de células madre Las células madre adultas proporcionan las bases para la regeneración de

tejidos viejos, debido a su capacidad dual de autorrenovación y diferenciación en muchos linajes. Estas dos características están controladas por interacción directa con un microambiente específico denominado “nicho”. Las células madre hematopoyéticas (HSC) residen en la médula ósea. Todavía no está claro, si las HSC pueden rejuvenecer indefinidamente o si no poseen una “verdadera” capacidad autorrenovadora y sufren la senescencia replicativa como otras células somáticas. Por otro lado, la cuestión que surge es la siguiente ¿hasta qué punto los cambios relacionados con la edad en las HSC son debidos a factores intrínsicos o son regulados por estímulos externos? Existe cada vez más convencimiento que el nicho de las células madre es de la mayor importancia para la regulación del envejecimiento celular en las células madre adultas. Es este nicho el que realiza las funciones siguientes:

• mantiene las HSC como también la senescencia replicativa, • protege a las células madre de los radicales y compuestos tóxicos, • regula las cascadas señalizadoras celulares, y • modula la expresión génica y las modificaciones epigenéticas en las

HSC. De esta manera, la interacción de las HSC con su nicho controla la

función de estas células madre, incluyendo el proceso de envejecimiento de la hematopoyesis.

Varios programas intrínsecos y vías señalizadoras facilitan las

características únicas de las células madre. Estos programas regulan el mantenimiento, proliferación y diferenciación, pero tienen que estar estrictamente controlados por el microambiente de acuerdo con las necesidades fisiológicas del organismo. En 1978 Schofield propuso una hipótesis en la cual las células madre se encuentran asociadas con otras células que determinan su comportamiento y son las que forman el “nicho”. Se han identificado para las HSC dos tipos de nicho en la médula ósea, el nicho endosteal y el vascular. Las HSC más primitivas se localizan cerca del endosteum del hueso próximas a las células del estroma y de los osteoblastos. Esta comunicación y adhesión recíprocas es lo que ha de regular la función de las HSC. Las HSC se encuentran también en la vecindad de las células endoteliales sinusoidales. Se cree que el nicho

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vascular forma un medioambiente que promueve la proliferación y diferenciación y la transmigración endotelial de las HSC, mientras que el nicho endosteal promueve la quiescencia y la autorrenovación. El mecanismo preciso de esta interacción entre las HSC y el microambiente local no se conoce, sin embargo, es cierto que la composición de los tipos celulares y los componentes de la matriz extracelular están en continua variación a lo largo de la vida. Estos cambios se reflejan en una menor formación de hueso y pérdida de masa ósea y son más pronunciados en pacientes con osteoporosis, y van acompañados por una mayor adipogenesis y menor osteoblastogenesis. También, la composición de las células hematopoyéticas maduras cambia a lo largo de la vida.

El sistema inmune se afecta de manera especial en el envejecimiento,

detectándose muy reducido el potencial de diferenciación linfoide en la médula ósea de donantes viejos. Experimentos de trasplantes han indicado que esta desviación del potencial de diferenciación mieloide con la edad es probablemente debido a cambos intrínsecos en las HSC más viejas. Además recientes estudios indican que el envejecimiento no está asociado solo con las alteraciones funcionales de las HSC, sino también con alteraciones en el microambiente que se requiere para la diferenciación hematopoyética. Las HSC de ratones jóvenes al ser trasplantadas en ratones viejos, tienen un potencial de diferenciación reducido hacia el fenotipo linfocito, lo cual no ocurre en caso de receptores jóvenes. Por otra parte, las HSC de ratones viejos también tienen un menor potencial de diferenciación linfoide debido a los cambios en el microambiente. De todo esto se deduce que el nicho de las células madre sufre grandes cambios durante la vida del organismo y éstos pueden jugar un papel importante en el control externo del envejecimiento de las células madre.

Cuestiones centrales en la función de las células madre adultas en el

contexto del envejecimiento han sido ya desentrañadas: en teoría, las HSC pueden tener un ilimitado poder de autorrenovación, incluido el rejuvenecimiento o pueden sufrir el envejecimiento celular al igual que otras células somáticas. Además, la cuestión que surge es, hasta qué grado los cambios relacionados con la edad en estas células son debidas a un factor intrínseco o son regulados por estímulos del microambiente, el nicho de las células madre. Cuatro situaciones posibles se describen en los párrafos siguientes y la realidad más probable es algo entre ellas (Figura 4).

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Figura 4. Mecanismos implicados en el envejecimiento de las HSC. (A) La

autorrenovación de las HSC puede estar asociada con el rejuvenecimiento, para evitar de este modo el envejecimiento celular en células madre adultas. (B) Alternativamente las HSC pueden están ligadas a la senescencia replicativa con un número limitado de divisiones tal como cualquier célula somática, (C) El envejecimiento de las HSC puede estar también controlado por estímulos externos del microambiente que regulan el rejuvenecimiento de las HSC. (D) El anclaje de las HSC a nichos específicos en la medula ósea parece mantenerlas en un estado quiescente y por tanto, la interacción con el microambiente puede contrarrestar la senescencia replicativa de las HSC (Wagner et al., 2008, modificado).

Las HSC pueden rejuvenecer indefinidamente. La autorrenovación

verdadera de las células madre indica que la célula hija posee las mismas características que la célula madre y esto debe incluir también el rejuvenecimiento. Esto las capacitará para mantener de manera indefinida el reservorio de células madre. Si es este el caso, las células madre adultas pueden proporcionar infinitas bases para la regeneración tisular. En este aspecto, la pérdida continua de potencial regenerativo de los tejidos viejos, ha de ser atribuida a la reducción en el número de las primitivas células madre. La prueba de esta tesis no es posible por la medida funcional de las HSC, que necesitaría poder discriminar entre células madre verdaderas y células progenitoras. Además, la demostración que las células hijas comparten las mismas características de sus madres no es posible debido al hecho que la madre ya no existe después de la división celular. Así, la teoría del infinito rejuvenecimiento de las HSC, como se observa en las células

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madre de la línea germinal o en las células madre embrionarias (ESC), no puede apenas ser verificada.

Las HSC sufren el envejecimiento celular. En contraposición con la tesis

anteriormente mencionada, las HSC pueden sufrir la senescencia replicativa tal como todas las células de mamíferos. En este caso, no hay autorrenovación “verdadera” ya que las células hijas pueden tener el mismo potencial de diferenciación multilinaje, pero después de un número limitado de ciclos celulares la célula hija entrará en estado senescente y saldrá del ciclo proliferativo. Además de las limitaciones anteriormente mencionadas, los análisis de senescencia replicativa de las HSC son difíciles por la ausencia de protocolos fidedignos de expansión in vitro para las primitivas HSC. Para las células madre mesenquimatosas (MSC) los protocolos de expansión en cultivo están establecidos y se ha demostrado que la senescencia replicativa en estas células es un proceso continuo y organizado. Sin embargo, las MSC son poco definidas a nivel molecular y la verificación de su función de célula madre no está del todo demostrada. El agotamiento del reservorio de las HSC no suele ocurrir durante la vida del organismo. Experimentos de trasplante en modelos murinos han demostrado que la menor capacidad de repoblación y el agotamiento de las HSC puede prolongarse más de cinco rondas de trasplante. A pesar de una notable capacidad proliferativa, estos resultados demuestran el envejecimiento celular de las HSC. Modelos matemáticos de la diferenciación de las HSC demuestran que la hipótesis de Hayflick es compatible con la larga vida de la hematopoyesis. Además la senescencia replicativa en las HSC está apoyada indirectamente por el hecho de que la mayoría de estas células permanecen en un estado quiescente en la médula ósea. Se ha demostrado que en la cinética de la división celular asimétrica, una célula hija permanece quiescente o se divide muy lentamente, mientras que la otra se multiplica exponencialmente y genera progenitores comprometidos y colonias de linaje específico. Si las dos células hijas de lento crecimiento se separan por micromanipulación y se analizan individualmente, una de ellas hereda la capacidad de la célula madre, mientras que la otra se vuelve más específica. Analizando las diferencias cinéticas de división para separar las células CD34+/CD38 en una fracción de división lenta (SDF) y una fracción comprometida de rápida división (FDF), se ha detectado que varios marcadores moleculares asociados con la función primitiva de las células madre están más expresados en SDF que en FDF, lo que explica que la quiescencia o la lenta división son mecanismos protectores durante la replicación del DNA, y la razón de división rápida, de quiescencia o de

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división lenta, se debe a la protección de mutaciones durante la replicación del DNA o a la prevención del agotamiento replicativo de las células madre. El envejecimiento celular, por tanto, se regula por el microambiente.

El envejecimiento celular está regulado por el microambiente. Una serie

de estudios han demostrado que la hematopoyesis resulta afectada por el microambiente hematopoyético. Las HSC tienen menor capacidad de hospedarse en sus nichos después de ser trasplantadas en receptores viejos vs receptores jóvenes. Además la interacción de adherencia de las HSC con su nicho se modula por alteraciones relacionadas con la edad, ya que los ratones viejos muestran una mayor movilización de las HSC en respuesta al factor de crecimiento estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF). Se ha demostrado que la disfunción de los telómeros también ejerce efectos sobre el microambiente hematopoyético. En ratones knockout en telomerasa la B-linfopoyesis se alterada mientras que la mielopoyesis se eleva. Además, la disfunción de los telómeros y el envejecimiento limita el enraizamiento de las HSC de tipo silvestre trasplantadas. Estos datos proporcionan evidencia de que la función de soporte o el tamaño del nicho sufren modificaciones durante el envejecimiento.

El microambiente mantiene las HSC en estado quiescente para prevenir

la senescencia replicativa. Las HSC en condiciones normales, se mantienen en estado quiescente y tienen que ser activadas para elevar la hematopoyesis, de acuerdo con las necesidades fisiológicas del organismo. Esto ocurre especialmente después de la quimioterapia. La división celular, la autorrenovación y la diferenciación están estrictamente controladas por el nicho de las células madre. Manteniendo las células madre en un estado quiescente se reduce el número de mutaciones que puede, en sus últimas consecuencias, conducir al desarrollo de la leucemia. Por otra parte, esto puede retrasar el agotamiento de las primitivas HSC por senescencia replicativa. Si las HSC sufren la senescencia replicativa, entonces el envejecimiento se modula indirectamente por estímulo externo del nicho que regula su proliferación.

Como se mencionó con anterioridad, existen datos que demuestran que

el microambiente ejerce influencia sobre el envejecimiento de las HSC, aunque los mecanismos moleculares precisos se desconocen. Varios efectores del envejecimiento se han descrito recientemente y alguno de estos puede estar sometido a control externo por el nicho. En la Figura 5 se muestran diversos cambios de la hematopoyesis relacionados con la edad,

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que son el resultado de las alteraciones intrínsecas en las mismas HSC, como también del microambiente hematopoyético que regula y mantiene su función. Entre estos cabe citar, las especies reactivas de oxígeno y compuestos tóxicos, la regulación de la expresión génica y del miRNA, modificaciones epigenéticas, la regulación de la proliferación por reposo proliferativo (quiescencia), la regulación de cascadas señalizadoras que implican la expresión de genes supresores de tumores (p53, p16INK4a y p19ARF) y también la adhesión de las HSC al tamaño limitado del nicho.

Figura 5. Mecanismos potenciales para la regulación del envejecimiento por el nicho de

las células madre. La autorrenovación y diferenciación de las células madre está estrechamente controlada por el nicho de las células madre en la médula ósea. Esta figura resume los mecanismos por los cuales esta interacción puede también regular el envejecimiento en las HSC (Wagner et al., 2008).

7. Telomerasa en las células madre Las células madre son la fuente regeneradora de los distintos tejidos del

organismo. Se ponen en acción cuando se produce un daño tisular y emigran desde sus nichos hasta el lugar que tienen que reparar. Sin embargo, si se multiplican en exceso, o demasiado poco, pueden ser origen de cáncer o de enfermedades relacionadas con el envejecimiento, respectivamente (Figura 6).

Recientemente, se ha descubierto que el comportamiento de las células

madre está determinado por sus telómeros y la cantidad de telomerasa que contienen. Los telómeros y la telomerasa son determinantes importantes de la mortalidad e inmortalidad celular y uno de los mecanismos mejor

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conocidos que controlan el cáncer y el envejecimiento. Mantener los extremos de los cromosomas o telómeros en buen estado permite que las células madre funcionen eficazmente. Las células madre epiteliales que tienen telómeros muy cortos no abandonan sus nichos ni regeneran la piel y el pelo adecuadamente, por lo que provocan el envejecimiento prematuro de la piel. Por el contrario, cuando la proteína encargada de alargar los telómeros, la telomerasa, se encuentra en exceso en las células, lo que ocurre en más del 90% de los tumores, las células madre epiteliales abandonan en exceso sus nichos para regenerar los tejidos demasiado eficientemente, con lo que la piel y el pelo crecen más de lo que es normal, y hay una mayor susceptibilidad de formar tumores epiteliales (Figura 6). Estos descubrimientos indican que la longitud telomérica y la cantidad de telomerasa determinan el comportamiento de las células madre. Los defectos en el comportamiento de las células madre preceden en el tiempo a la aparición de los primeros síntomas visibles de envejecimiento prematuro o del cáncer, por lo que la medida de la longitud telomérica o de actividad de la telomerasa en células madre puede considerarse como uno de los parámetros utilizables en el pronóstico. Las terapias que permitiesen controlar estas variables en las células madre podrían ser beneficiosas en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el envejecimiento, incluyendo el cáncer. Además, desvelar los parámetros que determinan el comportamiento de las células madre es esencial para el uso de éstas en terapias celulares sin causar efectos secundarios indeseables. Tales defectos se muestran a continuación: el acumulo de errores en la maquinaria de replicación, cambios en la fluidez de la membrana, daños por la acción de los radicales libres, aumento de los productos de glicosilación avanzada, resistencia a la insulina, reducción de la longitud de los telómeros, autoinmunidad y apoptosis.

Uno de los eventos intrínsecos más conocidos de la célula, que mejor

describe el mecanismo implicado en el envejecimiento celular, es el acortamiento de los telómeros en cada ronda de división celular. El ritmo al cual los telómeros se acortan con la edad es muy variable y puede ser influenciado por factores que se aceleran por la edad y son un riesgo de muerte prematura (tabaco, obesidad, etc). El acortamiento de los telómeros se acelera también en varias enfermedades humanas asociadas con la edad, tales como la enfermedad cardiovascular y la infección entre otras. Existe una correlación entre la longitud de los telómeros y el riesgo de muerte por enfermedad cardiaca. También la longitud de los telómeros es un marcador predictivo de demencia o alteraciones cognitivas.

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Los telómeros se alargan por la acción catalítica de la telomerasa, pero en ausencia de este enzima tiene lugar un persistente acortamiento de los telómeros y finalmente la pérdida de la función de dichos telómeros, la cual se asocia con senescencia replicativa y apoptosis. Las células madre normalmente expresan la telomerasa en contraste con la mayoría de las células somáticas. Sin embargo, en las HSC, la actividad es baja, aunque suficiente como para mantener el acortamiento de los telómeros durante el envejecimiento limitando su vida proliferativa. Por otro lado, en un modelo de trasplante seriado en ratón con sobreexpresión de telomerasa, las HSC de animales transgenicos y no transgénicos no pudieron ser trasplantados más de cuatro veces, lo que indica que otros mecanismos, que no son la telomerasa, limitan la función de las células madre también. Además, la disfunción de los telómeros altera también el nicho de las células madre. Utilizando ratones knockout en telomerasa (Terc-/-), se ha demostrado que la disfunción de la telomerasa induce alteraciones en el microambiente de la médula ósea por disminuir el compartimento de las células del estroma y reducir la capacidad de estas células de la medula ósea en su actividad de soporte de la hematopoyesis. La actividad de soporte hematopoyético depende de la edad y se relaciona con el progresivo acortamiento de telómeros en estas células estromales. Además, la disfunción de los telómeros altera la expresión de varias citoquinas en plasma de los ratones viejos Terc-/-, antes citados. Estos datos proporcionan evidencia clara, que el acortamiento de los telómeros no es el único mecanismo intrínseco implicado en el envejecimiento celular de las HSC, aunque la pérdida de telómeros induce alteraciones asociadas a la edad en el ambiente de las células madre, que pueden alterar la función y el enraizamiento de las HSC.

Algunos síndromes humanos se caracterizan por mutaciones en los

genes de la telomerasa, que ocasionan ritmos acelerados de acortamiento de los telómeros. Estas enfermedades son, algunos casos de disqueratosis congénita, anemia aplásica, y fibrosis pulmonar idiopática. En particular los pacientes con disqueratosis congénita acarrean mutaciones en componentes del complejo de la telomerasa que producen una estabilidad disminuída de la telomerasa y telómeros más cortos. Estas mutaciones afectan a los genes Terc y Tert (en pacientes con disqueratosis dominante congénita) o al gen de la disqueratosis congenita 1 (DKC1), en pacientes con la forma ligada a X de la enfermedad), los cuales codifican una telomerasa que interacciona con proteínas implicadas en la estabilidad de Terc y en el procesamiento del RNA nuclear pequeño. Ambas mutaciones dan como resultado una actividad telomerasa muy disminuida y telómeros muy cortos. Sorprendentemente, los

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pacientes con disqueratosis congénita desarrollan muchas de las patologías demostradas para el modelo de ratones deficiente en Terc-/-, tales como corta estatura, hipogonadismo e infertilidad, defectos en la piel y en el sistema hematopoyético, fallo en la médula ósea y muerte prematura. Al igual que en ratones deficientes en Terc, los pacientes con disqueratosis congénita también muestran inestabilidad cromosómica con el envejecimiento, lo cual está de acuerdo con una velocidad mayor de pérdida de los telómeros.

Figura 6. Papel de la telomerasa en el funcionamiento de las células madre, que

conduce al envejecimiento o al cáncer. El acortamiento de los telómeros (en células sin telomerasa) conduce a una menor capacidad de las células madre a abandonar el nicho y regenerar los tejidos con lo cual el tejido se deteriora y envejece. Los mecanismos que intervienen en esta menor movilización no están claros, pero es probable que se deban a la senescencia y apoptosis en respuesta a los telómeros cortos. Por el contrario, la sobreexpresión de telomerasa conduce a una aberrante movilización de las células madre fuera del nicho, la cual, en combinación con mutaciones oncogénicas, puede contribuir a la formación de tumor. (Blasco 2008, con modificaciones).

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8. Replicación del DNA La replicación del DNA es el tendón de Aquiles en el mantenimiento del

genoma. Según la segunda ley de la termodinámica, la tendencia de los sistemas ordenados para caer en desorden general, puede aplicarse a todas las moléculas, incluyendo al DNA. El proceso de replicación del DNA requiere varios grupos de genes de reparación y continuo chequeo de los puntos de control, que son esenciales para salvaguardar el genoma a niveles múltiples, durante el estado precario de la replicación. La inestabilidad de la horquilla de replicación, es un evento relativamente común en el curso de la replicación normal del DNA. Por ejemplo, la fosforilación de H2AX, una variante de histona en respuesta a la rotura de la doble cadena, se estimula una vez que el DNA entra en replicación en células en cultivo.

Otras proteínas que responden a la rotura de la doble cadena, tales como

Rad51 y BRCA1, son también reclutadas hacia la cromatina durante la fase S, como índice de daño al DNA. Además, se sabe que el intercambio de las cromátidas hermanas, un marcador de la recombinación homóloga, ocurre a un ritmo de 10 intercambios cada fase S en células en cultivo. Debido a la naturaleza multivariable de los intermediarios de la resolución de la recombinación, los 10 intercambios por fase S, proporcionan un límite más bajo que el ritmo de recombinación actual durante la síntesis del DNA. Estos eventos de intercambio son un índice del colapso de la horquilla de replicación en escenarios de reiniciación. Finalmente es importante destacar que son esenciales un gran número de genes para el desarrollo embrionario y la proliferación a largo plazo en cultivo, lo que indica la importancia de daño exógeno al DNA. La pérdida de la integridad genómica durante la síntesis del DNA puede afectar la capacidad regenerativa del tejido al iniciar prolongadas respuestas en los puntos de control del ciclo celular, que causan la pérdida funcional de las células madre y progenitoras.

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Figura 7. El daño no reparado al DNA en el curso de la replicación, inicia respuestas

en los puntos de control que conducen a la senescencia o muerte celulares. La proliferación y diferenciación de las células madre y progenitoras actúan como un medio de reconstituir tejidos afectados, después de la eliminación y muerte de estas células mutantes. Sin embargo, el daño replicativo al DNA, tanto en células madre como en células que forman el nicho, altera las propiedades multipotentes de estas células o causa su pérdida a partir del reservorio proliferativo. Estos deterioros cíclicos proporcionan, con el tiempo, una causa potencial que produce el declinar regenerativo del envejecimiento (Ruzankina et al, 2008).

9. Cáncer, envejecimiento y regulación de las células madre Muchas de las situaciones fisiopatológicas que afligen al anciano,

anemia, sarcopenia, osteoporosis, etc, derivan de una alteración entre la pérdida y la renovación celular. El hecho de que el mantenimiento homeostático y el potencial regenerativo de los tejidos decaigan a medida que transcurre la vida, ha implicado el declinar de las células madre como hecho crucial en el complejo proceso del envejecimiento. Es un hecho reconocido que la edad avanzada va acompañada por mayor riesgo de cáncer. Como el cáncer surge después de la adquisición de múltiples eventos mutagénicos, las células de larga vida son las están más capacitadas para servir como reservorio de dichas mutaciones. Así, las células madre son los objetivos ideales para el acumulo de daño precanceroso, ya que las propiedades que caracterizan a estas células, autorrenovación y diferenciación, las capacita para mantener y propagar las mutaciones adquiridas en el transcurso del tiempo, tanto en la progenia autorrenovable como en los progenitores más diferenciados, durante la vida del organismo.

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El peligro del acumulo de mutaciones en las células madre tiene su contrapartida en la acción de las proteínas supresoras de tumores, que suprimen los clones malignos mediante la apoptosis o parada del crecimiento. Sin embargo, como las demandas homeostáticas de los tejidos requieren la actividad de las células madre y de las células progenitoras, los supresores pueden, sin advertirlo, conducir al descenso de actividad de las células madre, contribuyendo así al envejecimiento.

El cáncer es la causa conductora de muerte en individuos menores de 85

años, y a pesar de la plétora de nuevas terapias anticáncer en los últimos diez años, la muerte ha descendido solo un 1,5% por año. Como la multiplicidad de eventos moleculares que se corresponden con el envejecimiento ocurren también en tumores, los estudios para elucidar las aberraciones moleculares en células madre y progenitoras durante el envejecimiento, puede proporcionar la forma de aumentar el conocimiento en la formación del cáncer y dirigirlo hacia el diseño de nuevas terapias. Muchos cánceres, incluyendo el de colon, mama, cerebro, cabeza y cuello del útero, pancreático y hematopoyéticos, contienen poblaciones pequeñas de células iniciadoras de tumores o células madre cancerosas (CSC). Las CSC comparten muchas de sus propiedades funcionales con las células madre normales, incluyendo el potencial ilimitado de autorrenovación. Al igual que las células madre normales, las CSC tienen el potencial de hacer surgir la mayoría de los tipos celulares tumorales y son, en sus últimas causas, las responsables del mantenimiento continuo del tumor. Además las CSC, como las células madre normales, expresan elevados niveles de proteínas transportadoras de multirresistencia a fármacos, ABC/MDR que median el eflujo de los fármacos, una propiedad que las capacita a evadir el efecto de la quimioterapia, y contribuye a la recaída. De hecho, la causa conductora de la muerte en pacientes con cáncer continúa siendo la resistencia, intrínseca o la adquirida, de las células tumorales a la terapia. El grado en el cual las CSC derivan directamente de las células madre normales o transformadas, o son el resultado de eventos transformantes que imparten propiedades de células madre a progenitores comprometidos, es probable que sea variable entre los diferentes cánceres, aunque están implicadas las aberraciones en los mecanismos que gobiernan la autorrenovación y la supervivencia y las decisiones del destino celular, ya que estos son procesos normales estrictamente regulados.

Una de las enfermedades más estudiadas que demuestra la correlación

entre el envejecimiento de las células madre y la adquisición de mutaciones

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requeridas para la transformación maligna es la leucemia mieloide crónica (CML), la cual es, en general, enfermedad de los ancianos. La CML fue el primer tumor maligno asociado con anormalidad cromosómica y su tirosina quinasa constitutivamente activa, es el producto de la fusión BCR/ABL. La CML fue también el primer cáncer que se demostró que derivaba de una célula madre y que fue tratado terapéuticamente con un fármaco diseñado para inhibir la expresión de la oncoproteína BCR/ABL. Los mecanismos moleculares que conducen a la progresión de la CML humana, desde su fase crónica hasta la crisis mieloide blástica, han sido ya muy estudiados, pero solo recientemente ha sido evaluado el papel de las células madre y las progenitoras. En la fase crónica se ha demostrado que el transcrito de fusión BCR/ABL, estaba presente e elevados niveles en HSC fenotípicas, mientras que en el estado de crisis blástica fue caracterizado por la expresión amplificada de BCR/ABL en progenitores de granulocitos/macrófagos comprometidos (GMP). Después de la transición de la crisis blástica se encontró que los GMP habían ganado la capacidad de autorrenovación y de transferir la crisis blástica a ratones inmunodeficientes, en parte, como consecuencia de la adquisición de la autorrenovación que fue conseguida a través de la vía de señalización de la Wnt/βcatenina, lo cual demuestra la formación de células madre leucémicas (LSC).

10. Terapia regenerativa La consideración de la terapia regenerativa en su aplicación a las

enfermedades relacionadas con la edad, ha atraído la atención hacia dos categorías de células madre: las células madre somáticas adultas, específicas de tejidos y las células madre embrionarias. El establecimiento de las células madre embrionarias (ESC) en 1998, ha promovido, desde entonces, el entusiasmo de los investigadores relacionados con este campo, hacia el estudio de las células madre. Existen diferencias entre estos dos tipos celulares con respecto a su potencial terapéutico: las ESC tienen un potencial ilimitado para el crecimiento y diferenciación, mientras que las células madre adultas están dirigidas hacia la especialización. Así, las células madre adultas tienen la capacidad de regenerar los tejidos en los cuales ellas se encuentran durante la vida de un individuo, mientras que las ESC tienen el potencial de formar la mayoría de los tipos celulares del organismo adulto por un casi ilimitado período de tiempo. Sobre la base de modelos animales, varios estudios han afirmado que las células madre adultas pueden también desarrollar un potencial comparable al de las ESC. Estudios más recientes, sin embargo, han cuestionado la interpretación de los resultados iniciales que

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sugieren la plasticidad o transdiferenciación de las células madre adultas. Mientras que alguno de los experimentos que demostraban la versatilidad de las células madre adultas, no fueron reproducibles, otros estudios detectaron, tanto in vitro como in vivo, fusiones espontáneas de células y núcleos entre células madre adultas y células diferenciadas del organismo.

La fusión celular puede, por tanto, ser tenida en cuenta para explicar el

fenómeno que se ha interpretado como evidencia de transdiferenciación. Otros estudios han demostrado que la transdiferenciación se verifica sin fusión celular, especialmente en condiciones fisiológicas del feto en desarrollo, aunque a frecuencia muy baja. Además, al contrario a las ESC, que pueden derivar de líneas celulares establecidas desde los 4 a los 7 días del embrión, las células madre somáticas son evasivas. Para tratar la leucemia, son necesarios ensayos in vitro para identificar si los progenitores hematopoyéticos humanos se incrementan con el advenimiento del trasplante de tejido hematopoyético. Cualquier ensayo para evaluar células madre ha de comparar las propiedades de las células analizadas in vitro con aquellas de unidades de repoblación probadas in vivo después de una dosis letal de irradiación. Este modelo experimental no es posible en humanos. Para poner a prueba las células madre adultas, se han desarrollado ensayos de colonias, incluyendo los de células iniciadas a largo plazo (LTC-IC) y ensayos de células iniciadas mieloides-linfoides, que pueden servir como marcadores para la repoblación potencial de las células madre en una población dada. Además, se ha demostrado que los marcadores de superficie tales como CD34, CD133, Thy-1 y HLA-DR, se asocian con la cualidad de células madre de las preparaciones celulares. A pesar de todos los esfuerzos realizados durante los últimos años, ningún ensayo se considera adecuado para identificar las HSC. Así que, no existe sustituto apropiado para ensayos de repoblación en un modelo de trasplante de ratón, después de una dosis letal de irradiación. Un modelo de ratón inmunocomprometido, tal como el modelo SCID, o modelos de trasplante in utero de oveja, usando animales tolerantes a las HSC humanas, han sido propuestos para estimar los potenciales de repoblación de las HCS humanas. El impacto del tiempo y la edad en la cantidad y calidad de las HSC de ratón han sido recientemente estudiados, pero la información sobre la senescencia en HSC humanas es escasa. Este estudio es de gran importancia porque estas células mantienen su función durante más tiempo que el promedio de la vida humana. La mayor parte del conocimiento que se ha conseguido acerca de la senescencia de las células madre ha sido a través de estudios en ratones, ya que estos animales comparten más del 90% de su genoma con el humano y tienen 30

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veces la vida más corta, por lo que se espera que las observaciones en el comportamiento de las células madre en ratón, puedan ser extrapoladas a las HSC de humano. Varios estudios han indicado que incluso pensando en concentraciones similares de HSC, que se encuentran en médula ósea joven y vieja, la capacidad funcional por célula en el modelo de repoblación es lo que muestra una reducción significativa dependiente de la edad del donante. La senescencia de las HSC se regula por varios elementos genéticos ubicados en cromosomas específicos. Estos elementos pueden diferir entre las especies, razas e incluso en individuos en el modelo de ratón. En humanos, la senescencia de las HSC y sus efectos patológicos relacionados pueden no ser tan obvios como en el modelo de ratón porque los clones de HSC primitivos pueden producir progenia que soporte la producción de células sanguíneas maduras a lo largo de la vida, lo cual es obvio después del trasplante de médula ósea o de HSC. El potencial terapéutico de los tratamientos basados en células madre fue demostrado por primera vez en los últimos 1960, cuando se utilizó el trasplante de médula ósea para tratar pacientes con inmunodeficiencia hereditaria o con leucemia aguda. Sin los beneficios del conocimiento actual de inmunología y los cuidados que los soportan, las tasas de morbilidad y mortalidad serian altas. Sin embargo, los resultados fueron estimulantes comparados con aquellos obtenidos a partir de opciones de tratamiento convencional. El trasplante de médula ósea ha llegado a ser mucho más eficiente y se ha comprobado que es la única posibilidad de cura para algunos pacientes con enfermedades hereditarias y malignas. Aunque inicialmente identificadas en la médula, las HSC fueron posteriormente encontradas en sangre periférica después de estimulación durante la fase de recuperación de terapia mielosupresora o de la administración de citoquinas. Estas HSC de sangre periférica han sido trasplantadas con éxito en lugar de la médula ósea para reconstituir las funciones hematopoyéticas e inmunes en los receptores.

Encontrar medios para reactivar las células madre y controlar el objetivo

de su destino ha de crear oportunidades impredecibles para la curación de enfermedades degenerativas. Las células madre son enormemente prometedoras para terapias de reemplazo celular o reparación de tejidos en muchas enfermedades degenerativas del envejecimiento, ictus, enfermedad cardiaca, diabetes y enfermedad de Parkinson. Considerando el tiempo y la edad, la investigación con células madre es importante por dos razones: primera, porque supone un buen modelo para estudiar el envejecimiento y segunda, porque los cambios asociados con la senescencia de células derivadas de la médula ósea, puede proporcionar pistas pertinentes para

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270

descifrar el proceso de envejecimiento celular. Por otra parte, encontrar caminos para reactivar las células madre y controlar sus destinos puede crear oportunidades imprevistas para curar enfermedades.

Todas las células del organismo poseen un repertorio de unos 30.000 a

40.000 genes de los cuales en cualquier momento solo una cuarta parte se expresa. Las bases fundamentales de las diferencias en los diferentes tipos de células (corazón, cerebro, hígado, piel, etc), que comprenden el organismo, se encuentran en la decisión celular de qué genes expresa o reprime. Durante el desarrollo fetal, las células madre embrionarias con completo acceso al genoma van a dar lugar a la multitud de tipos celulares requeridos para un individuo completo, generando progenies con acceso al genoma cada vez más restringido, las cuales se van comprometiendo a ciertos destinos celulares.

Hoy se sabe que el organismo adulto contiene reservorios de células

madre residuales, que se parecen a las células primitivas del embrión y que tienen la capacidad de ser instruidas para producir una panoplia de tipos celulares que puedan ser utilizados para beneficio terapéutico. Se están desarrollando con gran rapidez, nuevas tecnologías que permitirán que las células maduras diferenciadas readquieran su capacidad de acceso completo al genoma, y puede pronosticarse un día, en el futuro cercano, en el que casi cualquier célula podrá reprogramarse para producir células con propiedades de células madre.

La necesidad de progresar en las terapias de reemplazo de células y

órganos es acuciante, en tanto en cuanto la sociedad tiende hacia una población cada vez más envejecida. Está claro, que son muchas las enfermedades que no pueden ser curadas por los fármacos en uso, tales como la diabetes tipo I, enfermedad de Parkinson, fallo hepático y deterioro de los cartílagos. Para estas enfermedades, la clave del progreso son las terapias basadas en la introducción de células de remplazo. La meta del programa “Biología y Regeneración de Células Madre”, es promover la regeneración de los tejidos en casos de enfermedad y de envejecimiento normal. Los progresos en esta área de la “Terapia Regenerativa” dependerán de los progresos en la biología de las células madre y requerirán el desarrollo de tecnologías y destreza en el aislamiento, cultivo y manipulación de células con capacidad de diferenciarse en varios tipos celulares. Las recientes investigaciones sugieren que una sola o unas pocas clases de células madre residen en muchos tejidos adultos y que las señales ambientales determinan

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271

cómo estas células se diferencian. Será importante determinar cuáles son esas señales. En este aspecto, ya se posee una larga tradición en estudios de biología del desarrollo y diferenciación de células madre embrionarias de ratón.

Se ha demostrado recientemente que células de medula ósea de ratón

están constantemente migrando al cerebro para producir nuevas células nerviosas. Aunque esto ocurre con muy pocas células, esta observación sugiere la existencia de una vía natural de regeneración del sistema nervioso y puede predecirse un día no lejano, en el que se desarrollen fármacos que estimulen la producción endógena de nuevas células nerviosas a partir de células de la médula ósea. Se ha identificado también un gen regulador (factor de transcripción) que opera como un interruptor maestro en las células madre, conduciéndolas para convertirse en neuronas. Estudios en células madre del músculo han proporcionado un modelote ratón para probar terapias de reemplazo celular en distrofias musculares. Terapias de ingeniería de reemplazo celular para la restauración de células productoras de insulina en pacientes con diabetes tipo I es otro de los retos en la actualidad

11. Conclusiones El envejecimiento celular y la senescencia no representan

necesariamente un destino inevitable de las células, porque la senescencia celular no se ha observado en organismos primitivos como esponjas o corales, como tampoco en nuestras células germinales. El envejecimiento en diferentes especies se relaciona con el tiempo de generación y parece proporcionar una ventaja evolutiva para el total de las especies. Es interesante destacar que este proceso está restringido a organismos superiores con un mesodermo y nichos de células madre altamente especializados.

No es una única célula madre la que puede reunir una ventaja de

crecimiento que conduzca a formación tumoral. Datos recientes sugieren que envejecemos, en parte, porque nuestras células madres autorrenovables envejecen como resultado de acontecimientos intrínsecos. El control extrínseco del nicho juega un papel importantísimo en la regulación del envejecimiento de las células madre y por tanto, para la regeneración tisular en el organismo viejo. Varios mecanismos moleculares diferentes pueden

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272

estar implicados en este control del nicho y futuras investigaciones han de profundizar en este tema de tanta repercusión fisiológica.

La pérdida de la autorrenovación y la adquisición de defectos en la

diferenciación de las células madre son responsables del fenotipo típico del envejecimiento. Los mecanismos moleculares que contribuyen al envejecimiento de las células madre son aquellos implicados en la eliminación por apoptosis o senescencia de las células con daño genético, el cual puede suponer un riesgo para la integridad del organismo. Ambas HSC y MSC están siendo usadas en clínica. Por tanto, el conocimiento del envejecimiento de estos compartimentos de células madre es importante, no solo desde la perspectiva de la prevención o mejora de las disfunciones asociadas a la edad, sino también para tenerlas en consideración frente a donantes de células madre selectivas para ser utilizadas en terapias celulares. Las HSC son las células madre mejor caracterizadas y se posee un razonable conocimiento del efecto de la edad sobre su capacidad proliferativa y funcional. Esto ha conducido al uso en clínica de las HSC de neonatos, específicamente la sangre del cordón umbilical. Estudios en MSC sugieren que tanto HSC como MSC sufren un declinar en su capacidad de diferenciación y expansión a medida que transcurre la edad del organismo. Sin embargo, el grado de este declinar no está claro debido a la falta de consenso entre las características fenotípicas, condiciones de crecimiento, y dependencia de los estudios in vitro que llevan consigo extensas comparaciones.

12. Abreviaturas ABC, ATP binding cassette, BRC/ABL, gen de fusión del cromosoma

Filadelfia; CML, leucemia mieloide crónica; CSC, células madre cancerosas; ESC, células madre embrionarias; FDF, fracción que se divide rapidamente; G-CSF, factor de crecimiento de colonias de granulocitos; HSC, células madre hematopoyéticas; LSC, células madre leucémicas; MDR, multirresistencia a fármacos; MSC, células madre mesenquimatosas; ROS, especies reactivas de oxígeno; SDF, fracción que se divide lentamente; SOD1, superóxido dismutasa 1; TA, amplificación transitoria;

13. Bibliografía Bapat SA (2007) Evolution of cancer stem cells. Seminars in Cancer Biol 17,

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Capítulo 9

276

Capítulo 10. RESTRICCIÓN CALÓRICA Y ENVEJECIMIENTO

1. Introducción 2. Dieta hipocalórica 3. Envejecimiento y genes de longevidad 4. Sirtuínas y restricción calórica 5. Dieta hipocalórica y NAD 6. Restricción calórica y expectativa de vida 7. Restricción calórica y estabilidad genómica 8. Conexión sirtuínas, restricción calórica y mitocondria 9. Homeostasis de la insulina y la glucosa 10. Resveratrol 11. Conclusiones 12 Abreviaturas 13. Bibliografía 1. Introducción Una característica común de la vida en los organismos multicelulares es

el progresivo declinar en la eficiencia de una serie de procesos fisiológicos, una vez finalizada la fase reproductora de dicho organismo. Para estudiar la naturaleza de la multitud de mecanismos que intervienen y se asocian en el envejecimiento, se han utilizado muchos modelos y estrategias con el objeto de encontrar respuesta a las siguientes preguntas: ¿Por qué el organismo sufre un deterioro fisiológico irreversible en la última parte de la vida?, ¿A qué se debe que la expectativa de vida sea variable entre las especies? y ¿Por qué la restricción calórica retrasa la aparición de los cambios asociados a la vejez y aumenta la expectativa de vida?

El envejecimiento es un proceso complejo que se detecta, tanto en

células aisladas como en órgano entero, en el que se encuentran implicados factores genéticos y ambientales. Las teorías sobre el envejecimiento tienen su origen en el estudio de los cambios que se suceden o de los cambios que se acumulan a lo largo de la vida. La teoría que ha alcanzado más popularidad por haber sido ampliamente comprobada, fue propuesta por Harman en 1956 y es la que responsabiliza a los radicales libres de oxígeno de las alteraciones oxidativas típicas de la edad avanzada. Esta teoría se

Capítulo 10

277

dirigió, posteriormente, hacia la generación de especies reactivas de oxígeno por la mitocondria.

La teoría programada del envejecimiento propone que el progresivo

declinar de la función de los tejidos, debida a la edad, está causado por cambios homeostáticos en los procesos biológicos que ocurren en ausencia de enfermedad. Los modelos extrínsecos proponen que el envejecimiento es el resultado de continuas agresiones ambientales, que conducen a una gradual disminución de las funciones tisulares. Se ha propuesto también, que las características biológicas de la edad se deben a cambios en procesos básicos endógenos que se aceleran por estas agresiones ambientales, lo cual afecta a la estructura y función de las proteínas que regulan familias de genes de respuesta al estrés.

El envejecimiento en los seres vivos se caracteriza por un progresivo

descenso en la funcionalidad de órganos y tejidos, que va acompañado por daño oxidativo a las macromoléculas, disfunción mitocondrial, alteraciones endocrinas e inestabilidad genómica. La capacidad regenerativa tisular también declina con la edad y en algunos tejidos, músculo, sangre, hígado y cerebro, este declinar se ha atribuido a una menor respuesta de las células madre y progenitoras específicas de cada tejido.

Evadir el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad

avanzada ha sido uno de los sueños de la humanidad desde sus tiempos más remotos. Sin embargo, a pesar de los importantes avances científicos en los campos de la biología, la bioquímica y la fisiología, nuestro conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en el envejecimiento es hoy en día muy limitado.

La dieta hipocalórica al aminorar la generación de especies reactivas de

oxígeno por la mitocondria, se presenta como uno de los medios más efectivos para asegurar una buena salud en la vejez e incluso prolongar la vida. Existen evidencias que demuestran el efecto beneficioso de la dieta restrictiva sobre animales de experimentación, en los que se ha observado una progresión más lenta del propio envejecimiento y un aumento de su esperanza de vida.

2. Dieta hipocalórica A pesar de las importantes consecuencias que el envejecimiento aporta

Capítulo 10

278

al organismo y a la sociedad, solo recientemente se ha mostrado un interes real por profundizar en el conocimiento científico de este importante proceso vital. Es un hecho reconocido el papel que juega la nutrición en la serie de eventos moleculares que conducen a la vejez y también que la restricción calórica de la dieta aumenta la expectativa de vida, retrasa el declinar de la función inmune y reduce la incidencia del cancer y la mortalidad en diferentes especies animales. Sin embargo, se conoce poco aún sobre los mecanismos celulares y moleculares que producen estos efectos positivos. El término restricción calórica se refiere a una reducción del contenido calórico de la dieta sin que ello comprometa a los nutrientes esenciales. La teoría, ampliamente aceptada, de los radicales libres y el envejecimiento, antes citada, hace responsables a las especies reactivas de oxígeno, al estrés oxidativo y a la modificación oxidativa de las macromoléculas, del declinar de las funciones fisiológicas en la senectud. Los efectos beneficiosos que aporta el menor contenido calórico de la dieta sobre las alteraciones típicas del estado senescente, se basan en la menor generación de especies activas de oxígeno y de las lesiones oxidativas del DNA, con la consiguiente disminución de los defectos a nivel transcripcional, traduccional y post-transduccional.

Se ha observado que la restricción calórica reduce la incidencia del

cáncer. La lesión oxidativa del DNA parece encontrarse implicada, tanto en el envejecimiento como en el cáncer, jugando la lesión del DNA mitocondrial el papel más importante en el caso de la vejez, mientras que la lesión del DNA nuclear se encuentra más implicada en el desarrollo tumoral. La serie de acontecimientos moleculares que conducen a la vejez y/o al cancer puede ser modificada por el menor contenido calórico de la dieta. Como muchos de estos acontecimientos son consecuencia de la capacidad del organismo para superar la acción de agentes estresantes ambientales, es posible establecer una relación entre el contenido calórico de la dieta y el tiempo requerido para la formación de un tumor o la expectativa de vida. Por ello, se ha establecido que a mayor contenido calórico de la dieta, mayor peso corporal, mayor incidencia de tumores espontáneos y menor expectativa de vida.

La senectud se caracteriza por un incremento exponencial de proteínas

alteradas por oxidación, lo cual conlleva la activación transcripcional de genes de respuesta al estrés, que procesan la eliminación de proteínas lesionadas o mal plegadas. Se ha observado que las dietas restringidas en calorías previenen esta inducción, lo cual ha hecho pensar que la

Capítulo 10

279

modificación proteica por oxidación o glicación juega un papel decisivo en el envejecimiento. Las dietas hipocalóricas actúan disminuyendo la velocidad metabólica y como consecuencia la producción de subproductos tóxicos del metabolismo. La disminución de la transcripción de genes que se inducen en respuesta al estrés, implicados en la destoxificación, reparación del DNA y de respuesta al estrés oxidativo, inducida por la restricción calórica, se debe a la menor disponibilidad de los sustratos para estos sistemas. Los perfiles transcripcionales encontrados en animales alimentados con dietas bajas en calorías, sin deficiencias en nutrientes esenciales, muestran una desviación dirigida hacia un mayor recambio proteico y a una menor lesión macromolecular. Este cambio puede detectarse a nivel hormonal, por ejemplo, sobre las vías señalizadoras de la insulina mediante el incremento de la expresión de los genes que median la sensibilidad a esta hormona.

Quedan muchos puntos oscuros en el estudio de los factores que

conducen a la multitud de cambios asociados a la senectud, y en por qué estos cambios se retrasan o detienen mediante un menor contenido calórico de la dieta. La restricción dietética moderada o dieta hipocalórica es hasta la fecha uno de los métodos más efectivos para elevar la expectativa de vida y prevenir o retrasar las enfermedades relativas a la edad. La restricción dietética modula muchos procesos fisiológicos fundamentales, generación de ROS, reparación del DNA, metabolismo de fármacos, función inmune, regulación hormonal, etc.

3. Envejecimiento y genes de longevidad Durante mucho tiempo se ha considerado que el envejecimiento de un

organismo era un proceso genéticamente programado como continuación activa del desarrollo, de manera que una vez que un individuo alcanzaba la madurez, los genes del envejecimiento (aging genes) comenzaban a expresarse y a dirigir el progreso hacia la muerte. Esta idea se ha descartado y hoy se considera que el envejecimiento es un desgaste, que depende del tiempo, debido a que disminuyen los sistemas de reparación para el mantenimiento normal de las funciones. La selección natural evolutiva no encuentra razón para mantener estos sistemas reparadores una vez que el organismo ha superado su máxima capacidad reproductora.

Diversos grupos de investigadores han encontrado una familia de genes

implicados en la capacidad de la célula para superar situaciones adversas

Capítulo 10

280

(elevada temperatura, falta de alimento, etc.), que mantienen las defensas y actividades reparadoras naturales a lo largo de toda la vida. Si se logra que el funcionamiento del organismo esté en buenas condiciones, estos genes proporcionarán oportunidades para superar el estrés, mantener la salud y conseguir la longevidad. En contraposición a los genes de envejecimiento, antes aludidos, éstos se denominan genes de longevidad.

La evolución ha favorecido un sistema universal regulador que coordina

la respuesta al medio ambiente. La identificación de genes que dirigen los mecanismos implicados en las defensas naturales de respuesta al medio adverso y controlan la longevidad, ha de proporcionar un medio de evitar las enfermedades y achaques propios del envejecimiento. Muchos genes de reciente descubrimiento, como daf-2, pit-1, amp-1, clk-1 y p66Shc, intervienen en la resistencia al estrés y en la longevidad en animales de laboratorio y forman parte de un mecanismo fundamental de supervivencia frente a la adversidad. Sinclair y Guarente han estudiado un gen denominado SIR2, cuyas variantes se encuentran en diversos organismos, desde la levadura hasta los humanos, y han observado que copias extra de este gen elevan la longevidad en seres vivos tan diversos como Sacharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster y ratones.

4. Sirtuínas y restricción calórica En el año 2000, Leonard Guarante del Instituto de Tecnología de

Massachusetts, en Cambridge (Massachusetts), descubrió que la restricción calórica o una dieta baja en calorías produce la activación de la transcripción de un gen denominado SIR2, con capacidad para retrasar el envejecimiento. Este gen, que codifica la proteína SIR2, denominada sirtuína, se encontraba en mayor concentración en la mosca Drosophila cuando ésta se sometía a un menor aporte calórico en su dieta, demostrándose con esto que la proteína Sir2 desempeñaba un papel central en el ciclo metabólico celular. A partir de este hallazgo, estos autores crearon una mosca mutante que sobreexpresaba la sirtuína, y descubrieron que dichas moscas podían vivir hasta un 60% más que las normales. Asimismo, demostraron que el gen Sir2 se relaciona con mayor esperanza de vida también en la levadura y el nematodo C. elegans.

Las sirtuínas son unas proteínas enzimáticas, desacetilasas dependientes

de NAD que conectan el metabolismo con la longevidad. Como se ha comentado anteriormente, su presencia y mecanismo de acción se ha detectado en levadura, gusanos y moscas. Los mamíferos contienen siete

Capítulo 10

281

homólogos de la SIR2 de levadura, SIRT1 – 7. Se ha demostrado el papel que juegan estas sirtuínas como reguladores del envejecimiento, lo cual las convierte en objetivos farmacológicos potenciales para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la edad

Las proteínas SIR (silent, information regulador), regulan la longevidad

en muchos organismos. En levadura, una copia extra del gen SIR2 aumenta la expectativa de vida, mientras que la eliminación de dicho gen la acorta. La proteína SIR silencia la cromatina, aumenta la capacidad la reparación del DNA y se encuentra implicada en la fidelidad cromosómica durante la meiosis. SIR promueve la longevidad al suprimir la formación de círculos extracromosómicos de rDNA (ERC) en levadura. El ortologo del C.elegans SIR2.1 amplia también la expectativa de vida del nematodo, pero por un mecanismo distinto. La proteína SIR2.1 requiere de la proteína DAF-16 para producir la mayor longevidad en estos gusanos

Las sirtuinas son una clase de proteínas evolutivamente conservadas que

regulan una variedad de funciones celulares tales como el mantenimiento del genoma, la longevidad y el metabolismo. En humanos los siete homólogos de las sirtuínas (SIRT1–7), contienen un dominio catalítico con 275 aminoácidos. Las proteínas SIRT1 - 7 difieren en su localización subcelular y en las secuencias proteicas amino y carboxilo terminales que flanquean el núcleo catalítico central altamente conservado, identificado por primera vez en la proteína SIR2 de levadura, que parece poseer motivos de interacción con otras proteínas y señales de localización celular. La mayoría de estas sirtuínas catalizan la desacetilación dependiente de NAD+ de residuos de lisina amino acetilados de sustratos proteicos (Figura 1). SIRT4 y SIRT6 median la ADP-ribosilación de sustratos proteicos utilizando NAD+ como donador. Las sirtuínas de mamíferos tienen múltiples sustratos y afectan a un amplio espectro de funciones celulares (Tabla 1). Tres sirtuínas de mamíferos (SIRT1, SIRT6 y SIRT7) se localizan en el núcleo. La más estudiada es la SIRT1, que actúa sobre más de una docena de sustratos conocidos y ejerce un papel protector frente al estrés oxidativo y al daño al DNA. Además, SIRT1 juega un papel prominente en tejidos metabólicos, como páncreas, hígado y tejido adiposo. SIRT6 y SIRT7 son reguladores importantes del metabolismo y daño al DNA.

Capítulo 10

282

Tabla 1. Diversidad de las sirtuínas de mamíferos (Haigis y Guarente 2006) Sirtuina Actividad Localización Interacciones Biología

SIRT1 Desacetilasa Núcleo FOXO, PGC-1α Supervivencia celular/metabolismo SIRT2 Desacetilasa Citosol Tubulina, H4 Ciclo celular SIRT3 Deacetilasa Mitocondria AceCS2 Termogenesis/metabolismo SIRT4 ADP-ribosil-transferasa Mitocondria GDH Secreción de insulina/metabolismo SIRT5 Desacetilasa Mitocondria ? ? SIRT6 ADP-ribosil-transferasa Núcleo DNA Polβ Reparación del DNA SIRT7 ? Nucleolo Pol I rDNA transcription

Figura 1. Las sirtuínas catalizan las reacciones de desacetilación o de ADP ribosilación

de un sustrato proteico. Ambas reacciones rompen la molécula de NAD y liberan nicotinamida (Haigis y Guarente 2006 con modificaciones).

No se ha determinado aún, un papel de las sirtuínas de mamíferos en la

regulación de la longevidad máxima, aunque evidencias obtenidas hacen pensar que SIRT1, regula muchos procesos fisiológicos afectados por la

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edad, que están alterados por dieta hipocalórica (Figura 2). SIRT1 desacetila un gran número de sustratos: p53, Ku70, NF-κB, y las proteínas forkhead FOXO, lo cual se relaciona con la resistencia al estrés que confiere la restricción dietética. SIRT1 también regula las actividades de los receptores nucleares PPARγ y del coactivador PGC-1α para influenciar la diferenciación de las células musculares, adipogénesis, almacenamiento de grasa en tejido adiposo blanco y metabolismo hepático, sugiriendo una conexión entre esta sirtuína y las dietas que promueven el adelgazamiento y la longevidad.

Figura 2. Regulación de procesos fisiológicos. SIRT1 regula la supervivencia de

neuronas, la gluconeogenesis, la lipólisis, la supervivencia de las células β y la secreción de insulina (Haigis y Guarente, 2006 modificado)

La homeostasis de la glucosa está mantenida por el hígado y las células

β pancreáticas, en respuesta al cambio de nutrientes. Durante el ayuno los hepatocitos inducen la gluconeogenesis para suministrar glucosa a los tejidos. Se ha revelado que esta respuesta se encuentra bajo un control estricto de la actividad SIRT1, lo que proporciona otra conexión entre SIRT1 y el metabolismo intermediario. En hepatocitos en cultivo, SIRT1 interacciona y desacetila a FOXO1, promoviendo la trancripción, dependiente de FOXO1, de los genes hepáticos gluconeogénicos. En el hígado, el coactivador transcriptional PGC-1α conduce también la expresión de vías gluconeogénicas. SIRT1 desacetila y activa PGC-1α para coordinar, durante el ayuno, el incremento en la expresión de genes gluconeogénicos con la represión de los glucolíticos. Sin embargo, en una línea celular

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neuronal, la sobreexpresión de SIRT1 disminuyó la actividad de PGC1α y la función mitocondrial lo que sugiere que la relación entre SIRT1 y PGC-1α debe ser compleja.

Estudios sobre el envejecimiento en S. cerevisiae, D. melanogaster, y C.

elegans han considerado a las sirtuínas como productos de genes de longevidad conservados, que modulan la respuesta de un organismo al envejecimiento y estado nutricional. El gen SIR2 expresa la proteína SIR2, cuya misión como NAD desacetilasa hace que las células de la levadura se dividan más allá de su expectativa de vida normal. Guarente al seleccionar colonias de levadura que mostraban larga vida encontró una mutación en un gen denominado SIR4, que codifica parte de un complejo de proteínas que contenía la proteína SIR2. La mutación en el gen SIR4 hizo que la proteína SIR2 se uniese a la región más repetitiva del genoma de la levadura, un tramo que contiene los genes que codifican los ribosomas, que se conoce como DNA ribosómico (rDNA). Más de 100 de estas repeticiones de rDNA existen en el genoma de la levadura, y son difíciles de mantener en un estado estable. Estas secuencias repetitivas tienen la capacidad de recombinarse entre ellas, proceso que extrapolado en humanos puede ocasionar numerosas enfermedades, tales como cáncer o enfermedad de Huntington. Los datos obtenidos por este grupo de investigadores les llevaron a sugerir que el envejecimiento en la levadura era causado por la inestabilidad del rDNA que se consiguió atenuar por acción de las proteínas SIR.

Estudiando esta inestabilidad del rDNA, se observó que al dividirse la

célula madre de la levadura se generaban más copias del rDNA que salían del genoma a modo de anillos extracromosómicos y se replicaban con los cromosomas, permaneciendo en el núcleo de la célula. A medida que se acumulaban los anillos de rDNA, la célula necesitaba más energía para su replicación, lo que llegaba a incapacitarla para replicar su propio genoma. En estas condiciones si se añadía una copia extra del gen SIR a la célula madre, se conseguía reprimir la formación de anillos de rDNA en las células hijas, y con ello se producía una ampliación del 30% en la expectativa de vida de la célula. Estos autores descubrieron también este fenómeno en el nematodo C. elegans, a pesar de que el gusano adulto no contiene células en división, y que el mecanismo replicativo de envejecimiento encontrado en levadura no podía aplicarse a los gusanos.

El gen SIR2 codifica una proteína que posee actividad histona

desacetilasa dependiente de NAD, eliminaba grupos acetilo de las histonas y

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así conseguía empaquetar al DNA de tal manera que lo hacía inaccesible a los enzimas responsables de sacar los anillos rDNA fuera del cromosoma. La forma del DNA con histonas desacetiladas es silente debido a que cualquier gen que se encuentre en estas regiones del genoma es inaccesible a la activación. Por tanto, las proteínas SIR, se encuentran implicadas en la silenciación de genes, y de ahí su nombre SIR. La actividad desacetilasa de SIR depende de NAD, y esta asociación SIR2 – NAD establece conexión entre SIR y el metabolismo glucolítico y entre dieta y envejecimiento.

Con el descubrimiento de las proteínas SIR se ha demostrado la

existencia de una nueva misión para el NAD en la regulación transcripcional. Las proteínas SIR2 dependen del NAD para su actividad desacetilasa, que regula una serie de procesos biológicos, respuesta al estrés, diferenciación, metabolismo y envejecimiento. Por tanto, el mantenimiento de los niveles de NAD en la célula es un requisito importante para la expresión y actividad de las sirtuínas. La biosíntesis del NAD está mediada por la nicotinamida fosforibosil transferasa (NAMPT), actividad limitante en la biosíntesis del NAD, ya que a mayor actividad NAMPT mayor concentración celular de NAD, que actúa intensificando la actividad reguladora transcripcional del dominio catalítico de SIR2. El perfil de la expresión genética ha demostrado también que existe una correlación entre la expresión de NAMPT y la de SIR2 en las células. SIRT1/SIR2 juega un importante papel en diversos procesos biológicos, como respuestas al estrés y a citoquinas, diferenciación y metabolismo, mediante la desacetilación de reguladores transcripcionales. Las proteínas SIR2 poseen la capacidad única de acoplar la rotura del NAD y la desacetilación de las proteínas por formación de nicotinamida y O-acetil-ADP ribosa. El requerimiento de NAD implica que SIR2 funciona como sensor de energía o sensor redox que conecta el metabolismo energético con la regulación transcripcional.

5. Dieta hipocalórica y NAD La dieta hipocalórica, así como la dieta intermitente, producen un retraso

en la aparición de los achaques propios del envejecimiento. Aunque los mecanismos implicados no están completamente esclarecidos, es probable que tanto la restricción dietética como la alimentación intermitente promuevan efectos similares sobre la frecuencia de la glucolisis. Así, en condiciones de alimentación ad libitum la glucolisis es continua (hay un exceso de glucosa), mientras que en casos de dieta hipocalórica, la glucolisis es discontínua operando solo postprandialmente. Durante los periodos de

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ayuno, inducido por restricción calórica, el cociente NAD/NADH ha de ser diferente del que prevalece en caso de ad libitum donde la situación de ayuno no es probable. En el caso de alimentación ad libitum la glucolisis continua tiende a provocar menor disponibilidad de NAD y acumulo de NADH, mientras que en el caso de ayuno inducido por restricción calorica disminuye la demanda glucolítica de NAD y aumenta la oxidación del NADH. En la Figura 4 se muestra como la vía glucolítica requiere del NAD para oxidar la glucosa, con la producción de NADH, por tanto los niveles citoplasmáticos de NAD son bajos. En caso de dieta hipocalórica, al haber menor fuente carbonada (glucosa) que se transfiere a la glucolisis, se gasta menos NAD y como resultado “sobra” el suficiente como para activar a SIR2, que desacetila proteínas histónas y no histonas y como consecuencia favorece la longevidad.

Figura 3. SIRT1 como mediador clave en la respuesta a la restricción calórica. Los

activadores químicos de SIRT1 y la biosíntesis de NAD por NAMPT (nicotinamido fosforibosil transferasa) median estos cambios fisiológicos a través de la activación de SIRT1 (Imai 2007, con modificaciones)

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Figura 4. SIR2 requiere NAD para su actividad y este acoplamiento se produce en la

restricción calórica cuando se reduce la fuente carbonada que se transfiere hacia la glucolisis y como resultado "sobra" NAD citoplásmico. SIR2 actúa como sensor de los niveles del NAD. En condiciones de dieta hipocalórica los niveles del NAD son altos, se activa SIR2, el silenciamiento de genes y la longevidad.

Por otro lado, existe otra vía para mantener elevados los niveles de

NAD. Cuando las células se someten a restricción calórica (nutrientes pero no calorías), se inicia un proceso en cascada: a través de la membrana celular. Una señal activa a un gen llamado NAMPT, y la enzima resultante se acumula dentro de la célula. La acumulación de NAMPT, nicotinamida fosforibosil transferasa, hace que también se acumule NAD. Volviendo a las mitocondrias, la acumulación de NAD en el interior de las mitocondrias tiene un efecto posterior y es el de aumentar la actividad de otras dos proteínas mitocondriales producidas por los genes SIRT3 y SIRT4.

El efecto combinado de todo esto hace que las mitocondrias se

robustezcan, aumente la producción de energía y el proceso de envejecimiento celular se hace más lento. Resumiendo, la dieta baja en calorías hace que aumenten las concentraciones de NAMPT, NAD, SIRT3 y SIRT4, y todo junto hace que la célula vida más y con más energía.

6. Restricción calórica y expectativa de vida Hace más de 70 años que McCay y sus colaboradores demostraron que

una reducción en la ingesta total de alimentos alargaba la expectativa de vida en ratas. Durante estos años muchos laboratorios han repetido con éxito los experimentos de McCay utilizando ratas y ratones, peces, moscas y gusanos.

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Así, la restricción dietética se ha establecido como un medio experimental poderoso para estudiar el envejecimiento, llegando a ser una de las áreas más activas de investigación en el campo de la biogerontología. El alargamiento de la supervivencia por la restricción de alimentos parece que se debe a alteraciones en el proceso de envejecimiento, pero los mecanismos implicados mediante los cuales esta restricción ejerce sus efectos beneficiosos permanecen aún sin aclarar. La identificación de objetivos antienvejecimiento y anticáncer de la restricción de la dieta y la de los mecanismos moleculares que interviene en estos efectos podría proporcionar medios para intervención en humanos. Estudios de los laboratorios de Masoro han demostrado que la mayor supervivencia de roedores por restricción de alimento se debe a la menor ingesta de calorías (dieta hipocalórica). Es interesante destacar, que esta mayor supervivencia va acompañada con el retraso en enfermedades tales como el cáncer, lo cual hace a menudo proponer que la dieta hipocalórica aumenta la supervivencia simplemente porque retrasa los procesos patológicos dependientes de la edad, más que por ejercer efecto sobre el envejecimiento o la senectud. Aunque la distinción entre senescencia y enfermedad es a veces difícil de interpretar, se ha demostrado que la dieta hipocalórica retrasa los cambios que ocurren con la edad en la mayoría de los procesos fisiológicos y que estos cambios preceden generalmente a cualquier alteración observada en situaciones patológicas y de enfermedad. Algunos laboratorios han demostrado que la restricción de metionina de la dieta eleva la expectativa de vida y el período vital máximo de ratas, otros describen que la restricción de metionina no es la clave del alargamiento de la vida por restricción calórica. Hasta la fecha la restricción calórica es la estrategia experimental conocida que alarga la supervivencia retrasando el envejecimiento. Varias hipótesis se han emitido para explicar las bases de los mecanismos mediante los cuales la restricción calórica prolonga la vida. Originalmente se propuso que se alargaba la supervivencia porque se retrasaba el crecimiento y el desarrollo. Más tarde, se propuso que era la reducción en el contenido en grasa corporal la base fisiológica del alargamiento de la supervivencia. Recientes investigaciones se dirigen hacia el impacto de la dieta restringida sobre la respuesta al estrés y los mecanismos de señalización. Hoy en día, las hipótesis principales para explicar el efecto de la restricción calórica son:

1. atenuación del daño oxidativo, 2. alteración del sistema glucosa/insulina, 3. alteración de la hormona del crecimiento/IGF-1, y 4. hormesis

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La atenuación del daño oxidativo por efecto de la dieta hipocalórica se ha detectado en las macromoléculas, DNA, proteínas y lípidos. Esta reducción se debe a la menor generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), a la mayor generación de mecanismos protectores, a la mayor capacidad reparadora o a una combinación de todas ellas. La premisa glucosa/insulina es que la dieta hipocalórica reduce la concentración de glucosa plasmática e insulina, con la consiguiente reducción de la señalización por insulina. Últimamente, se propone un incremento en la efectividad de la glucosa y en la respuesta a la insulina o ambas. Esta hipótesis se ha emitido a la luz de los datos que muestran que la pérdida de los sistemas señalizadores de la insulina originan un alargamiento de la vida en muchos organismos (nematodos, moscas de la fruta etc.). Además, la restricción calórica reduce la señalización por el IGF-1, observada en modelos de mamíferos con un alargamiento de la supervivencia. La hormesis propone un beneficio a la salud a partir de agentes estresantes de baja intensidad. La restricción calórica puede funcionar a través de hormesis, ya que puede actuar como un estresante suave que produce una respuesta adaptativa tal como un elevado mantenimiento de los sistemas de reparación. La dieta hipocalórica, como parte del efecto hormético eleva la expresión de genes de respuesta al estrés. En línea con la restricción calórica como agente estresante de baja intensidad, es relevante sugerir que enzimas particulares implicadas en las vías de reparación del DNA, pueden funcionar como genes de respuesta al estrés cuando se exponen a una dieta hipocalórica.

Los mecanismos mediante los cuales la dieta hipocalórica ejerce sus

efectos beneficiosos son en el momento actual un desafío tentador para los investigadores en base al desarrollo de fármacos que pudieran reproducir estos efectos saludables. El fenómeno, atribuido en un principio a un metabolismo celular más lento y a una reducción de los subproductos tóxicos en respuesta a la menor cantidad de alimento, es demasiado simple y las recientes investigaciones demuestran que no es del todo correcto. La restricción de la dieta no retrasa el metabolismo, más bien como estresante biológico (escasez de alimento), induce una respuesta defensiva, y es esa respuesta la que estimula las posibilidades de supervivencia del organismo. En mamíferos su efecto incluye cambios en los mecanismos celulares de reparación, producción de energía y activación de la apoptosis.

El régimen dietético hipocalórico implica la reducción del 30 al 40% del

consumo de alimento ad libitum. En animales (ratas, perros y primates) sometidos a esta dieta restrictiva, se ha demostrado que no solo viven más,

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sino que se mantienen más sanos durante la prolongación de sus vida. Esto indica que este régimen, además de aumentar la supervivencia, evita o retrasa la mayoría de enfermedades asociadas a la senectud, como cáncer, diabetes y enfermedades neurodegenerativas.

La disponibilidad de nutrientes ejerce importantes efectos sobre el

metabolismo celular y el funcionamiento mitocondrial. En condiciones de escasez de alimento la concentración de ADP se eleva y es el influjo de ADP en la mitocondria lo que gobierna la eficacia de la cadena de transporte electrónico. Por el contrario, un exceso de nutrientes produce una elevada concentración de ATP, lo que se traduce en una baja demanda energética (bajos niveles de ADP) que causa un subóptimo funcionamiento mitocondrial, que va unido a una elevada generación de ROS.

7. Restricción calórica y estabilidad genómica La protección del DNA es un elemento clave en la prevención del cáncer

y en la prevención o retraso del fenotipo senescente. Cuando la lesión persiste en el genoma, mediante procesos replicativos y de mutagenesis asociada a la transcripción, se hace permanente en forma de mutaciones y rotura cromosómica e inestabilidad. La inestabilidad genomica promueve el cáncer y el envejecimiento.

Peguntas que se hacen muchos son las siguientes: ¿Puede ser manipulada la capacidad de reparación del DNA?, ¿Provienen los enzimas clave de las vías de reparación del DNA de

genes de respuesta al estrés? ¿Pueden estos enzimas ser activados en respuesta a estímulos

ambientales? y ¿Hay factores ambientales que juegan un papel en la efectividad de estas

vías críticas? En apoyo de un papel para el medioambiente en la modulación de la

eficiencia en la capacidad de reparación del DNA, se ha emitido otra pregunta: ¿mejora la restricción calórica la estabilidad genómica aumentando la expresión/actividad de enzimas reparadores del DNA? En otras palabras, es razonable proponer que el declinar relacionado con la edad en la capacidad de una célula u organismo para mantener la integridad de su genoma, es un mecanismo fundamental inherente al proceso del

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envejecimiento, estando la restricción calórica en el centro del retraso de la vejez y del alargamiento de la vida mediante el mantenimiento de la integridad genómica. Esta hipótesis es atractiva ya que la integridad del genoma es muy importante para una célula u organismo, porque el DNA está constantemente expuesto a agresiones exógenas y endógenas y porque el daño al DNA se ha asociado en sus últimas causas biológicas a mutaciones, cáncer y otras enfermedades asociadas a la vejez. Además, la integridad del DNA, mantenida por una serie de sistemas reparadores, es esencial para la supervivencia de las células y de los organismos. El acumulo de daño al DNA en células somáticas fue propuesto al principio como un mecanismo básico en el proceso del envejecimiento, emitiéndose la hipótesis que el acumulo de daño al DNA ocasionaba la inactivación de genes y la muerte celular. Esta hipótesis se extendió proponiéndose que el acumulo de DNA no reparado y las subsiguientes mutaciones en las células altera la replicación y transcripción del DNA que llevan al fenotipo senescente. Por consiguiente, si la expresión de proteínas esenciales se reduce o inhibe mediante alteraciones en el genoma, una célula puede perder su función y su viabilidad y esta puede ser la primera causa del envejecimiento.

Estudios realizados en los pasados 50 años apoyan estas hipótesis al

demostrar alteraciones relacionadas con la edad en el metabolismo, mutaciones y daño al DNA. Además, muchas de estas alteraciones están aceleradas en el síndrome de Werner, y en las enfermedades genéticas síndromes de Hutchinson, Gilford, Progeria y Cockayne, que muestran síntomas clínicos de envejecimiento prematuro e implican mutaciones en los genes de reparación del DNA. Curiosamente, la restricción calórica se ha demostrado que revierte gran parte de las alteraciones relacionadas con la edad en el daño/reparación del DNA y en las mutaciones. Existen muchos mecanismos por los que la integridad genómica puede resultar afectada: cambios en la activación de carcinógenos, elevada destoxificación de los carcinógenos, capacidad incrementada de reparación del DNA o una combinación de estos factores. La restricción calórica es un buen modelo para prevenir el comienzo y retrasar la progresión de tumores espontáneos o inducidos por agentes químicos. La activación en la capacidad de reparación del DNA proporciona una explicación de los mecanismos implicados en el mantenimiento de la estabilidad genómica observada en animales restringidos. La restricción calórica es una ‘intervención’ que altera la activación de genes de respuesta al estrés específicos, enzimas clave de las vías de reparación del DNA, los cuales darán como resultado la activación de la capacidad de reparación del DNA. Una mayor reparación del DNA

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reduce el nivel de daño al DNA y la frecuencia de mutaciones, lo cual redundará en el mantenimiento de la estabilidad genómica.

8. Conexión sirtuínas, restricción calórica y mitocondrias La restricción calórica es un régimen dietético que alarga la vida de

todos los organismos investigados hasta la fecha, levadura, arañas, moscas, peces y roedores. SIR2 se requiere para alargar la vida por dieta hipocalórica en levadura, gusanos y moscas. En moscas, la dieta hipocalórica con un 0.5% de glucosa, incrementa la función mitocondrial e induce la actividad SIR2. Sin embargo, en este caso, la activación mitocondrial es independiente de SIR2 y se sugiere que es anterior a la aparición de SIR2. Un régimen hipocalórico más severo (0.05% glucosa) alarga la vida replicativa de la levadura por un mecanismo diferente que es independiente tanto de SIR2 como de la respiración mitocondrial. Por ultimo, SIR2 no tiene efecto en la supervivencia de la levadura en condiciones de ayuno, y parece que reduce la supervivencia de ciertas cepas mutantes excepcionalmente longevas.

En levadura se ha encontrado que la restricción de alimento afecta dos

vías que elevan la actividad enzimática de SIR2. Por una parte, la restricción de la dieta activa la expresión del gen PNC1, que expresa una proteína enzimática cuya misión es liberar las células de nicotinamida, compuesto que normalmente reprime a SIR2. De acuerdo con la idea que la restricción calórica es una situación estresante que activa la supervivencia, PNC1 se estimula también en caso de estresantes suaves como elevada temperatura o exceso de concentración salina. Una segunda vía inducida en levadura por la restricción calórica es la respiración, forma de generar energía mediante la producción de NAD a partir del NADH. De aquí se deduce que elevando el cociente NAD/NADH se ejerce una profunda influencia en la actividad de SIR2.

Habiendo visto como el estrés biológico inducido por la dieta

hipocalórica eleva la actividad de SIR2 es necesario comprobar de qué manera SIR2 está implicada en la longevidad. Un medio para comprobarlo es eliminar el gen Sir2 y determinar si permanece el efecto. En organismos como la mosca Drosophila, se ha demostrado que SIR2 se requiere para alargar la vida. La versión en mamíferos del gen Sir2 de levadura ("SIR2 homólogo 1"), codifica la proteína SIRT1, que posee la misma actividad enzimática que SIR2, pero que desacetila también una variedad más amplia de proteínas en el citoplasma y en el núcleo. Varias de estas proteínas

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objetivo de SIRT1 se han identificado y se sabe que controlan procesos celulares críticos, tales como apoptosis, defensa celular y metabolismo. El papel de la familia de genes Sir2 de alargar la longevidad, está preservada en mamíferos, aunque en estos organismos más complejos, las vías que utilizan las sirtuínas son también más complicadas. Por ejemplo, en ratas y ratones la mayor concentración de SIRT1, permite que algunas de las células de estos animales sobrevivan frente al estrés que normalmente desencadenaría su suicidio programado. SIRT1 permite esta supervivencia al regular la actividad de proteínas clave, tales como p53, FOXO y Ku70, implicadas en disponer un umbral para la apoptosis o para la inmediata reparación celular.

En el curso de la vida, la pérdida de células por apoptosis es un factor

importante en el envejecimiento, especialmente en tejidos con poca renovación, tales como corazón y cerebro, así que la disminución de la muerte celular, puede ser un medio que utilizan las sirtuínas para promover la salud y la longevidad. Un ejemplo notable de la capacidad de SIRT1 de fomentar la supervivencia en células de mamíferos puede observarse en un mutante de ratón (Wallerian). En estos ratones un solo gen se duplica y la mutación resultante vuelve a sus neuronas muy resistentes al estrés, lo cual los protege frente al ictus, toxicidad inducida por quimioterapia y enfermedades degenerativas. La mutación del gen Wallerian eleva la actividad de un enzima que genera NAD, y ese NAD adicional es el que parece proteger las neuronas por activación de SIRT1. También se ha detectado que el resveratrol confiere un efecto protector sobre las neuronas de ratones normales similar al de la mutación Wallerian. Se ha demostrado que el resveratrol y la fisetina, previenen la muerte de células nerviosas en dos modelos animales (gusano y ratón) y en la enfermedad de Huntington humana. En ambos casos esta protección requirió la actividad de las sirtuínas.

El efecto protector de las sirtuínas en células individuales está siendo

cada vez más evidente. Pero, si estos genes son mediadores de los beneficios de la restricción calórica ¿cómo puede la dieta regular sus actividades y así el ritmo de envejecimiento en un animal completo? Recientes investigaciones han demostrado que los niveles de NAD se elevan en hepatocitos en condiciones de ayuno elevando la actividad SIRT1. Entre las proteínas, SIRT1 actúa sobre un regulador importante de la transcripción genética denominado PGC-1α, que causa cambios en el metabolismo de la glucosa e interviene en la biogénesis de las mitocondrias. De manera que SIRT1 actúa a modo de sensor de la disponibilidad de nutrientes y regulador

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de la respuesta hepática. Resultados similares han demostrado que SIRT1 es un regulador metabólico en hígado, músculo y adipocitos porque detecta las variaciones de la dieta por cambios en el cociente NAD/NADH y ejerce efectos en el perfil de transcripción génica en estos tejidos. Este modelo explica cómo SIRT1 puede integrar muchos de los genes y vías que afectan la longevidad.

Como son muchos los mecanismos que median las actividades de las

sirtuínas en el organismo, se ha emitido otra hipótesis y es que los mamíferos detectan su disponibilidad por la cantidad de energía que han almacenado en forma de grasa corporal. Los adipocitos secretan hormonas que emiten señales a otros tejidos, pero su mensaje depende de la cantidad de grasa almacenada. Al reducir la acumulación de grasa, la restricción calórica establece un modelo de señales hormonales que conectan la escasez de alimento con la activación de las defensas celulares. Consistente con esta idea está el hecho que los ratones modificados genéticamente están muy delgados a pesar de su dieta y tienden a vivir más.

Esta posibilidad nos lleva a preguntarnos si SIRT1, a su vez, regula

también el almacenamiento de grasa en respuesta a la dieta. Es un hecho que la actividad SIRT1 se eleva en los adipocitos después de la restricción de alimento, causando la movilización de los depósitos de grasa, desde los adipocitos a la corriente sanguínea para su conversión en energía en otros tejidos. SIRT1 una vez que percibe los cambios de la dieta, dicta el nivel de almacenamiento de grasa y el perfil de hormonas producidas por los adipocitos. Este efecto sobre la grasa y las señales que envía, puede, a su vez, marcar el paso del envejecimiento en el organismo completo y hace de SIRT1 un regulador clave de la longevidad conferida por la restricción calórica en los mamíferos. Esto hace que también se establezca una conexión estrecha entre el envejecimiento y enfermedades metabólicas del tipo diabetes tipo II, asociada con exceso de grasa. La intervención farmacológica en la vía SIRT1 en los adipocitos puede por tanto, prevenir no solo el envejecimiento sino también enfermedades específicas.

Otro proceso crítico modificado por SIRT1 es la inflamación, la cual se

encuentra implicada en un número muy amplio de enfermedades, entre las que se incluyen cáncer, artritis, asma, enfermedad cardiaca y neurodegeneración. Recientemente se ha detectado que SIRT1 inhibe al NFκB, factor de transcripción que promueve la respuesta inflamatoria. La investigación de moléculas que inhiben al NFκB, y con ello la inflamación,

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es un área muy activa en el desarrollo de fármacos que se encuentran relacionados con la restricción calórica.

El envejecimiento trae consigo el deterioro celular y subcelular. La

mitocondria, la maquinaria energética de la célula, que genera ATP y ROS, es muy susceptible al deterioro. Como la mayoría de los componentes celulares tienen que ser reciclados y regenerados a lo largo de la vida, se necesita el continuo recambio mitocondrial, lo cual se lleva a cabo mediante la biogénesis mitocondrial. La biogénesis de nuevas mitocondrias mantiene la producción de energía, previene del estrés oxidativo, y favorece el envejecimiento saludable. Células y tejidos ante la demanda de mayor cantidad de energía responden fabricando nuevas mitocondrias. La biogénesis mitocondrial está influenciada por condiciones fisiológicas y energéticas en continuo cambio. No es de sorprender que factores tales como la disponibilidad de nutrientes, ciertas hormonas, la temperatura, hipoxia, estrés y envejecimiento, ejerzan influencia en el proceso de la mitocondriogénesis. Los cambios dependientes de la energía celular afectan a la función y el número de las mitocondrias e implican una compleja disposición de factores que conectan los requerimientos de energía con la regulación genética. En la complejidad de la biogénesis mitocondrial intervienen más de 1000 genes, la cooperación de dos genomas, y la alteración del 20% de las proteínas celulares. En el núcleo, la regulación concertada de tantos genes requiere una serie de factores de transcripción capaces de orquestar la interacción del complejo RNA pol II con los varios promotores. Además de los genes nucleares, que codifican más del 95% de las proteínas mitocondriales, la mitocondriogénesis requiere la participación del genoma mitocondrial, que es el que genera la mayoría de las proteínas hidrofóbicas de la cadena de transporte electrónico y también el tRNA y rRNA mitocondriales.

A nivel molecular varios factores de transcripción y cofactores

intervienen en la activación de vías señalizadoras inducidas por hormonas. Otro grupo de factores interviene en la adaptación metabólica al ayuno, como la familia de los receptores activados por los proliferadores de peroxisomas (PPAR) y el receptor X hepático que junto con PGC1a elevan la biogénesis mitocondrial y el catabolismo de los ácidos grasos. A pesar de la complejidad de las diversas vías señalizadoras, todas ellas parece que comparten un componente clave de la familia PGC1 de cofactores de transcripción. El PGC1a actúa como mediador intracelular durante la biogénesis mitocondrial inducida por factores hormonales.

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La regulación, dependiente de SIRT1 del coactivador del receptor nuclear, se ha asociado a la biogénesis mitocondrial. La restricción calorica promueve la sensibilidad a la insulina con la consiguiente reducción de la glucosa y la insulina en sangre. Se ha asociado SIRT1 con el corregulador del receptor nuclear PGC1α. Su importancia fisiológica se apoya en el hecho de que la represión de PGC1a por una forma mutante de la proteína Hungtintina produce disfunción mitocondrial y neurodegeneración, mientras que la sobreexpresión de PGC1a rescata las células de los efectos deletéreos de la Hungtintina. La expresión de PGC1a está relacionada directamente con la actividad de la biogénesis mitocondrial. Muchos agentes y eventos regulan los niveles de PGC1a activando diferentes mediadores intracelulares (Figura 5)

La proteína SIRT1 como reguladora de la gluconeogénesis hepática

reprime la función de los genes glucolíticos. Mediante la desacetilación de PGC1α, SIRT1 activa la transcripción de los genes gluconeogénicos, mediante interacciones con el factor nuclear hepatocítico 4a, que se asocian con la represión de los genes glucolíticos. SIRT1 desacetila y activa a PCG1a en varios residuos de lisina e incrementa su capacidad de coactivar la transcripción de una serie de genes objetivo. Así, el incremento de SIRT1 durante la restricción calórica, interviene en la biogénesis de la mitocondria en tejidos tales como el músculo y tejido adiposo. También SIRT1 desacetila y activa el enzima NOS, lo que indica que se establece un mecanismo “feeback” positivo entre la NOS y SIRT1, que puede reajustar los niveles de SIRT1 durante la restricción calórica.

Como se comentó anteriormente, SIRT1 actúa como regulador positivo

del coactivador PGC1a mediante su desacetilación. Una acetilasa, el complejo GCN5 acetiltransferasa es un factor implicado en la represión de PGC1a. La acetilación de PGC1a da lugar a una proteína transcripcionalmente inactiva. En la Figura 6 se muestra el esquema donde PGC1a al ser desacetilado por SIRT1 se une al receptor nuclear y promueve la expresión de genes mitocondriales y genes OXPHOX, además de otros. La activación de SIRT por la dieta hipocalórica implica la elevación de la concentración de NAD+. El resveratrol, según este esquema, activa directamente a SIRT1

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Figura 5. Red señalizadora que regula PGC-1α. PGC-1α es el centro de una red compleja de señales afectada por factores metabólicos, nutricionales y ambientales que modulan, por modificaciones transcripcionales y post transcripcionales, la actividad de PGC-1α, y la biogénesis de la mitocondria (López-Lluch 2008)

Figura 6. La dieta hipocalórica mediante la elevación del cociente NAD+/NADH activa

a SIRT1, que a su vez, desacetila y activa al coactivador de la transcripción PGC1a, el cual se traslada al núcleo uniéndose al factor nuclear y activando la transcripción de genes mitocondriales y genes OXPHOX. La GCH5 acetil transerasa puede acetilar e inactivar a PGC1a. El resveratrol tiene capacidad de activar directamente a SIRT1 (López-Lluch et al, 2008)

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9. Homeostasis de la insulina y la glucosa Si SIR2 es la proteína que gobierna el control de un sistema regulador

del envejecimiento y se activa en situaciones de estrés, ha de funcionar como conductor de una orquesta que incluye redes hormonales, proteínas reguladoras y otras proteínas codificadas por genes de longevidad. Uno de los descubrimientos recientes más notables es que SIRT1 regula la producción de insulina y del factor insulínico (IGF-1) y que estas dos poderosas moléculas señalizadoras regulan, a su vez, la producción de SIRT1. La relación entre SIRT1, IGF-1 e insulina es curiosa porque explica como la actividad SIRT1 en un tejido puede comunicarse con otras células del organismo. Además, los niveles circulantes de insulina e IGF-1 dictan la expectativa de vida en varios organismos (gusanos, moscas, ratón).

Un componente crítico de la fisiología de la dieta hipocalórica es la

sensibilidad a la insulina y la correspondiente disminución en los niveles sanguíneos de glucosa e insulina. Las células β pancreáticas ayudan a la homeostasis de la glucosa secretando insulina en respuesta a glucosa. El metabolismo de la glucosa por glucolisis, en estas células, genera piruvato, el cual entra en la mitocondria donde se convierte en CO2 por el ciclo tricarboxilico. El NADH generado en este ciclo conduce el transporte electrónico y la síntesis de ATP. El incremento del cociente ATP/ADP produce el cierre de los canales KATP y despolariza la membrana plasmática lo que conlleva a un influjo de Ca2+ que desencadena la fusión de las vesículas secretoras que contienen insulina, en la membrana celular. Se ha demostrado en ratón que SIRT1 regula positivamente la secreción de insulina estimulada por glucosa en células β pancreáticas. Por tanto, SIRT1 reprime la transcripción de la proteína desacoplante mitocondrial UCP-2 que desacopla la respiración mitocondrial de la producción de ATP y reduce el gradiente de protones a través de la membrana mitocondrial. Así, bloqueando la función de UCP-2, SIRT1 promueve la generación de energía de manera más eficiente. Por otra parte, la represión de UCP-2, mediada por SIRT1, se aminora por privación aguda de alimento, la cual afecta la síntesis de ATP y la respuesta de la insulina de las células β, durante el ayuno. Aunque la concentración de SIRT1 no se afecta por esta condición hipocalórica, existe una disminución en el cociente NAD/NADH, que reduce la actividad SIRT1 en páncreas.

La presencia de UCP-2 en animales ayunados, puede también facilitar la

transición a la actividad metabólica después del siguiente alimento y

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prevenir la hiperpolarización de la membrana mitocondrial y la producción de especies reactivas de oxígeno. Aunque estos estudios demuestran que la actividad SIRT1 disminuye en células β durante el ayuno, no se sabe si SIRT1 regula la secreción de insulina durante la dieta hipocalórica o juega algún papel en las patologías que demuestran alterada secreción de insulina.

Existe la posibilidad que SIRT1 promueva la supervivencia de las

células β pancreáticas durante el estrés oxidativo. En células β estresadas, la proteína forkhead FOXO1 se traslada al núcleo donde activa los factores de transcripción NeuroD y MafA, que proporcionan resistencia al estrés. Como se describió anteriormente, SIRT1 se une y regula a los factores de transcripción forkhead negativa y positivamente. Se ha demostrado que SIRT1 desacetila a FOXO1 y la activación de esta proteína proporciona resistencia al estrés.

El mecanismo principal que se encuentra implicado en el efecto anti

envejecimiento es la baja actividad GH/IGF1 y la respiración mitocondrial más eficiente, que ejerce sus efectos beneficiosos por la menor generación de ROS. Otro factor importante asociado a la menor actividad GH/IGF1 es la mejora del síndrome metabólico, la causa principal de la morbilidad del envejecimiento, que se asocia entre otros, con una resistencia a la insulina y elevados niveles sanguíneos de glucosa y lípidos. Ratones con deficiente señalización insulínica tienen vida más larga. El concepto de mayor eficiencia metabólica, que se traduce en menor producción de ROS endógenos y mayor longevidad, puede aplicarse a la dieta hipocalórica y a la actividad desacetilasa de SIRT1. La importancia reguladora de SIRT1 se traduce en la movilización de ácidos grasos en los adipocitos, producción de glucosa en los hepatocitos, secreción de insulina en las células β pancreáticas y oxidación de los ácidos grasos en músculo esquelético.

Por tanto, la actividad desacetilasa dependiente del NAD de las sirtuinas,

se considera el mediador del incremento de la longevidad dependiente de la restricción calórica, que retrasa la vejez en todas las especies ensayadas. Las sirtuínas perciben la disponibilidad de nutrientes por mecanismos no totalmente conocidos, pero entre los que se incluye la abundancia del NAD, necesaria para la actividad de SIR y para la activación transcripcional del gen Sirt1 por un complejo formado por el factor de transcripción Forkhead box y p53. En escasez de nutrientes SIRT1 desencadena un programa metabólico mediado, en parte, por asociación de SIRT1 con el coactivador

Capítulo 10

300

de la transcripción PGC-1a, lo que da lugar a mayor eficiencia metabólica y a menor generación de ROS.

El resveratrol es un compuesto que puede ser obtenido en la

alimentación y muestra notable actividad antienvejecimiento, aunque a concentraciones mucho más elevadas que las encontradas en los alimentos. El resveratrol estimula la actividad catalítica de SIRT1 y alarga la vida de levadura, nematodos, moscas, peces y también de ratones alimentados con dieta hipercalórica elevada en grasa. Se ha descrito también, que la sobreexpresión de la proteína secretada FLOTHO retrasa el envejecimiento en ratón y actúa inhibiendo la vía IGF1-insulina.

La familia de factores de transcripción FOXO, merece ser mencionada

por su posible papel en la longevidad y protección frente al cáncer en respuesta a nutrientes. Las proteínas FOXO se activan en diversas situaciones de estrés, y en esta activación están implicadas la vía Jun quinasa, y su desacetilación por SIRT1. Por el contrario, FOXO se inactiva por factores de crecimiento, incluyendo a la insulina, a través de la quinasa AKT. Las proteínas FOXO activan la transcripcion de muchos genes que codifican enzimas gluconeogénicos y enzimas antioxidantes. En resumen, diversas manipulaciones genéticas (disminución en GH, IGF1 y receptor de la insulina, elevación de FOXO, SIRT1 y KLOTHO), e intervenciones anti envejecimiento (anti diabéticos, dietas hipocalóricas y resveratrol), comparten la capacidad de mejorar la eficacia metabólica reduciendo el ritmo de generación de ROS.

Existen evidencias contrastadas que indican que la mayor eficacia

metabólica proporciona protección frente al cáncer. Los antidiabéticos, las dietas hipocalóricas y el resveratrol previenen o retrasan varios tipos de cáncer en ratones.

10. Resveratrol La restricción calórica (nutrientes si, calorías no) supone consumir

menos de 1750 calorías diarias, lo cual puede en algunos momentos resultar difícil. Para vivir más y no sufrir los achaques de la vejez hay que restringir la dieta, pero… ¿podrán inducirse las sirtuínas sin necesidad de restringir la ingesta? Si los humanos quieren conseguir los beneficios de la restricción calórica, una dieta radical no es una opción razonable, así que, en el momento presente se está intentando encontrar el modo de activar las

Capítulo 10

301

sirtuínas sin necesidad de recurrir a dietas hipocalóricas. Existen ya fármacos que pueden modular la actividad de las sirtuínas de una manera similar a la dieta hipocalórica. Se ha demostrado que es particularmente interesante un compuesto activador de la sirtuína, el resveratrol. El resveratrol es una fitoalexina presente en uvas negras y en el vino tinto, mosto, nueces, etc., cuya fórmua, trans 3,5,4´ trihidroxi estilbeno lo caracteriza como componente fenólico de la familia flavonoides. Se sintetiza por una variedad de plantas cuando sufren situaciones de estrés. Se han encontrado muchos otros compuestos de origen vegetal que también modulan la expresión de las sirtuínas tales como los flavonoides. El resveratrol se comercializa como extracto de la raiz del Polygonum cuspidatum (Figura 7).

El resveratrol posee propiedades antioxidantes anticancerígenas,

antiinflamatorias, reduce la síntesis de eicosanoides, prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos. Es también un antiagregante plaquetario y antidiabético, y previene enfermedades degenerativas.

Figura 7. A la izquierda la estructura de la molécula de resveratrol: trans 3,5,4´

trihidroxi estilbeno, y a la derecha el Polygonum cuspidatum. La función disminuida de la mitocondria, en lo que se refiere a la

fosforilación oxidativa y la capacidad aeróbica, se asocian con la reducción de la longevidad reducida. El impacto del resveratrol sobre la mitocondria ha sido estudiado y se ha comprobado que este compuesto eleva significativamente la capacidad aeróbica y el consumo de oxígeno en las mitocondrias de las fibras musculares de ratón. Los efectos obtenidos con resveratrol se asociaron con la inducción de genes de la fosforilación oxidativa (OXFOS) y con los implicados en la biogénesis mitocondrial.

Capítulo 10

302

Estos efectos se explican por la disminución, mediada por el resveratrol, de la acetilación e incremento de la actividad del coactivador PGC1a (Figuras 5 y 6). Este mecanismo es consistente con el efecto, anteriormente mencionado, que el resveratrol es un conocido activador de la SIRT1. Además el tratamiento con resveratrol protegió a los ratones de la obesidad inducida por la dieta y la resistencia a la insulina. La administración de resveratrol a levadura, gusanos o moscas, o las dietas hipocalóricas alargan su longevidad en un 30%, pero solo si estos organismos poseen el gen SIR2. Además, una mosca que superproduce SIR2 tiene una mayor longevidad que no puede ser posteriormente alargada por resveratrol o restricción calórica. La interpretación más simple es que tanto la dieta hipocalórica como el resveratrol prolongan la vida de las moscas de la fruta al activar SIR2. Las moscas alimentadas con resveratrol no solo viven más, a pesar de comer ad libitum, sino que no padecen reducida fertilidad causada a menudo por la restricción calórica. Esta es una buena noticia para aquellos que esperan tratar las enfermedades humanas con moléculas que activan los enzimas SIRT2.

La empresa, Sirtris Pharmaceuticals cofundada por Sinclair, empezó las

pruebas clínicas un activador de SIRT1 la molécula SRT501. Recientemente Glaxo se ha hecho con este producto.

11. Conclusiones Los organismos multicelulares exhiben un declinar progresivo e

irreversible de las funciones fisiológicas, que es característico de la senectud. Aunque las bases moleculares de este declinar no se conocen aún en su totalidad, los mecanismos hasta ahora propuestos incluyen un incremento en la generación de ROS y una progresiva acumulación de lesiones en el DNA, que van a dar lugar a inestabilidad genética y a alteraciones epigenéticas. Todo ello lleva consigo el deterioro oxidativo de macromoléculas críticas, la glicación de proteínas constitutivas y el acortamiento de los telómeros de células replicativas

Uno de los sueños de la humanidad por decenas de miles de años ha sido

detener el envejecimiento, lo cual se ha intentado sin éxito. Es por tanto difícil de aceptar que la edad pueda ser controlada manipulando una serie de genes. Hoy se sabe que es posible prevenir los achaques de la vejez con un simple cambio en la dieta, y también que los genes que codifican las sirtuínas controlan las mismas vías s moleculares que la dieta hipocalórica.

Capítulo 10

303

Sin que se conozcan la multitud de causas precisas del envejecimiento, ya se ha demostrado en una amplia variedad de formas de vida, que la edad puede ser retrasada manipulando unos pocos reguladores que una vez activados van a cuidar de la salud del organismo.

12. Abreviaturas AKT, quinasa; ERC, círculos extracromosómicos; GH, hormona del

crecimiento; IGF1, factor insulínico; NFκB, factor nuclear kappa B; NAD+, nicotinamida adenina dinucleótido oxidado; NADH, nicotinamida adenina dinucleótido reducido; NAMPT nicotinamida fosforibosil transferasa; p53, proteína supresora de tumores; PGC1a, coactivador transcripcional de genes nucleares; PNC1, proteína que libera las células de la nicotinamida; rDNA, DNA ribosómico; SIR, sirtuínas, desacetilasas dependientes del NAD; UPC, proteína desacoplante mitocondrial

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Capítulo 10

307

Capítulo 11. EPIGENÉTICA 1. Introducción 2. Propiedades dinámicas y estocásticas de la cromatina 3. Senescencia celular y redistribución de la cromatina 4 Cambios epigenéticos 5. DNA metilomas 6. Silenciamiento epigenético de los genes progeroides 7. Silenciamiento epigenético por microRNA 8. Modificación de las histonas 8.1. Sirtuína 1 y su relación con el envejecimiento y el cáncer 8.2. Sirtuína 2 y progresión del ciclo celular 9. Envejecimiento y longevidad se asocian con cambios epigenéticos 10. Evolución epigenética entre envejecimiento y cáncer 11 Cuestiones pendientes e implicaciones terapéuticas 12. Conclusiones 13 Abreviaturas 14 Bibliografía 1. Introducción La epigenética es una frontera emergente de la ciencia, que implica el

estudio de cambios heredables en la regulación de la actividad y expresión genética que no dependen de la secuencia del genoma. Todos nuestros tejidos presentan los mismos 30.000 a 40.000 genes, pero debido al código epigenético sólo unos pocos se expresan en un determinado tejido y en un determinado momento, dando lugar al fenotipo. Los patrones epigenéticos específicos condicionan la accesibilidad de los factores de transcripción a la cromatina y facilitan su reconocimiento por parte de los genes, para ser silenciados temporal o permanentemente. Las marcas epigenéticas de la cromatina pueden ser propagadas por mitosis y, en algunos casos, por meiosis, dando lugar a la herencia estable de esos factores reguladores. Algunos genotipos son más susceptibles de sufrir modificación por estos factores reguladores, mientras que otros presentan una cierta resistencia. La modificación epigenética mejor estudiada es la metilación del DNA, en aquellos residuos citosina que van seguidos de un nucleótido guanina. Normalmente, la metilación conduce al silenciamiento del gen, pero puede llevar también a la expresión de genes vecinos. La expresión de genes está también determinada por la organización de las histonas y principalmente por su acetilación o metilación, que puede alterar la accesibilidad al DNA

Capítulo 11

309

para la transcripción. Estos mecanismos están regulados en parte por el balance energético en la célula, ya que la disminución de las calorías de la dieta produce una alteración en la organización de la cromatina, mediante un cambio en la relación NAD+/NADH y en la actividad de SIRT1, una desacetilasa de histonas que depende del NAD+. La remodelación de la cromatina se produce por medio de una serie de reacciones enzimáticas e interacciones entre proteínas que finalmente afectan a la expresión de la información genética. Por tanto, las variaciones en el nivel de enzimas, proteínas y RNA de interferencia (RNAi), involucrados en la remodelación de la cromatina, tanto por medio de la dieta, como de otros factores ambientales, son otro punto de control para regular la expresión génica.

2. Propiedades dinámicas y estocásticas de la cromatina La estructura de la cromatina es dinámica y está sometida a grandes

remodelaciones asociadas con el desarrollo, el envejecimiento y la enfermedad. En algunos casos la remodelación tiene también que ver con las enfermedades asociadas a la edad, tales como el cáncer y también con la esperanza de vida del organismo. Sin embargo, los cambios estocásticos no determinísticos en la estructura de la cromatina, pueden, en el transcurso del tiempo, contribuir también a alterar la función nuclear, celular y tisular y por consiguiente conducir al envejecimiento y a los achaques de la edad.

La longevidad del organismo y el envejecimiento están influenciados

por muchos factores complejos que interaccionan, entre los que cabe destacar, el acumulo de mutaciones en los genomas nuclear y mitocondrial, el acortamiento y disfunción de los telómeros, el daño oxidativo al DNA y otras macromoléculas celulares y factores hormonales sistémicos, tales como la señalización insulina/factor insulínico, la senescencia y la apoptosis y la diferenciación alterada de los tejidos autorrenovables, que dependen de las células madre.

Estrictamente hablando, la epigenética se refiere a las modificaciones de

la cromatina y el DNA, que se heredan a través de la división celular, pero que no implican cambios en la secuencia del DNA. Sin embargo, como el proceso del envejecimiento no está restringido a tejidos proliferantes y puede, de hecho, ser influenciado por la irreversible parada proliferativa, vamos a referirnos a los efectos mediados por la estructura de la cromatina y la metilación del DNA.

Capítulo 11

310

La unidad básica repetitiva en la estructura de la cromatina es el nucleosoma, que comprende 146 pares de bases enrrolladas alrededor de un octámero de histonas (H1 – H4) (Figura 1). La cromatina se divide en dos tipos, heterocromatina y eucromatina. La eucromatina se descondensa durante la interfase, es activa transcripcionalmente y se replica al inicio de la fase S. Por el contrario, la heterocromatina permanence condensada durante la interfase, es transcripcionalmente silente y se replica más tarde. La heterocromatina se subdivide en dos tipos: constitutiva y facultativa. La constitutiva se encuentra en el DNA pericentromérico y telomérico, es heterocromática en todas las células de un organismo y se ha considerado que es esencialmente fija e irreversible a lo largo de la vida, aunque esto no es totalmente verdadero. Por el contrario, la heterocromatina facultativa interviene en los procesos regulados de diferenciación celular u otros cambios en el fenotipo celular. Por ejemplo, un solo cromosoma X se silencia por heterocromatinización en células de mamífero hembra, para la compensación de la dosis de cromosoma sexual. El que la cromatina forme eucromatina o heterocromatina lo dictan las modificaciones de las histonas y del DNA. Por ejemplo, la acetilación de las colas del N-terminal de las histonas, promueve la formación de eucromatina. A la inversa, la metilación del DNA es característica de la heterocromatina.

Figura 1. Nucleosoma: 146 pares de bases enrolladas alrededor de un octámero de

histonas. La cromatina es una entidad altamente dinámica y estocásica. El

fenómeno de variegación por efecto de posición (PEV), fue el primer efecto que indicó las propiedades dinámicas y estocásticas de la cromatina. La variegación es un fenómeno causado por la inactivación de un gen debido a su yuxtaposición anormal con la heterocromatina. PEV fue descrita por primera vez en moscas, como un fenotipo de ojo multicolor rojo y blanco.

Capítulo 11

311

Debido a una inversión en el cromosoma y cambio de posición del gen blanco, relativa a la heterocromatina centromérica, el gen pudo ser silenciado por la heterocromatina en un subgrupo de células que tenían pigmento rojo en el ojo. La capacidad de los genes sometidos a PEV para cambiar de estado activo a inactivo, refleja la naturaleza dinámica de la estructura de la cromatina. Esta naturaleza dinámica ha sido confirmada por estudios más recientes celulares y moleculares, en base a una serie de razonamientos:

1. Procesos esenciales, tales como la transcripción génica, la

replicación y la reparación del DNA, todos implican disrupción y reensamblaje de la estructura de la cromatina.

2. La recuperación de la fluorescencia después de estudios de

fotoblanqueo (FRAP), han demostrado que la mayoría de las proteínas unidas a la cromatina no se unen de manera estática sino que exhiben ritmos relativamente elevados de activación y desactivación, incluso en la supuestamente cerrada heterocromatina.

3. La notable y paradójica formación de la heterocromatina, depende de

un grado de transcripción, el cual contribuye a la heterocromatinización mediante vías de RNAi. De acuerdo con lo anteriormente dicho, una serie de análisis del genoma han demostrado que virtualmente todos los nucleótidos del DNA del genoma humano, son en algún grado, transcritos en RNA. Incluso se ha demostrado que la heterocromatina telomérica se transcribe. Estas observaciones indican que la heterocromatina no es una entidad cerrada y estática.

4. La heterocromatina puede diseminarse a lo largo de la cromatina,

mediante interacciones cooperativas entre proteínas enzimáticas y proteínas de enlace, responsables de su formación. El acontecimiento fortuito de la expresión del blanco en células del ojo de la mosca, refleja la naturaleza estocástica del establecimiento y mantenimiento de la heterocromatina. La naturaleza estocástica de la estructura y función de la cromatina, se reafirma por muchos estudios que han demostrado la existencia de un componente estocástico en el control de la expresión génica.

Capítulo 11

312

En resumen, la cromatina tiene propiedades dinámicas y estocásticas. La cromatina no está fija, está continuamente remodelándose y puede redistribuirse y “respirar” a veces de una manera completamente determinista. En algunos casos esta propiedad dinámica parece que interviene en el proceso de envejecimiento y en el alargamiento o acortamiento de la vida. Sin embargo, el componente fortuito de la estructura de la cromatina puede, a medida que transcurre el tiempo, contribuir también a la alteración nuclear, de la función celular y tisular y consecuentemente al envejecimiento y las enfermedades y achaques asociados.

3. Senescencia celular y redistribución de la cromatina La senescencia celular se caracteriza por una parada irreversible de la

proliferación, que puede ser iniciada por varios desencadenantes, entre ellos, el excesivo número de divisiones celulares y el acortamiento de los telómeros (senescencia replicativa). Debido a la senescencia, la mayoría de células primarias humanas tienen una vida proliferativa limitada y la senescencia contribuye al envejecimiento del tejido in vivo, al limitar su autorrenovación celular. Las células senescentes y los marcadores moleculares del fenotipo senescente incrementan en algunos tejidos envejecidos y están conectados a algunas patologías asociadas a la edad, como la osteoartritis, la aterosclerosis y la cirrosis hepática. Además, la manipulación de las señales que inician la senescencia como la longitud de los telómeros y la expresión del inhibidor de la proliferación p16INK4a, pueden modular algunos aspectos del envejecimiento del organismo. Además de un probable papel en el envejecimiento de los tejidos, la senescencia celular es también un proceso bien establecido de supresión tumoral, en virtud de su capacidad de frenar la proliferación y la progresión neoplásica en células que acarrean lesiones oncogénicas.

Muchas células senescentes, tanto si son consecuencia de excesivas

rondas de proliferación o activadas por oncogenes, muestran grandes cambios en la estructura de la cromatina. Muchas de estas células senescentes forman dominios especializados de heterocromatina facultativa, denominados focos de heterocromatina asociados a la senescencia (SAHF). Estos SAHF son visiblemente más condensados que la cromatina de la interfase y contienen modificaciones en las histonas y proteínas asociadas, características de la heterocromatina. Los SAHF silencian la expresión de genes promotores de la división celular, y así contribuyen a la parada de la proliferación asociada a la senescencia. Evidencia acumulada indica que los

Capítulo 11

313

SAHF, o cambios similares en la cromatina, son relevantes en el envejecimiento del organismo y que la carabina de las histonas (HIRA), juega un papel clave en la formación de SAHF.

Aunque los SAHF parecen ser el resultado de la condensación de

cromosomas casi enteros, las secuencias de DNA que están típicamente contenidas en la heterocromatina constitutiva, tal como los pericentrómeros y telómeros, parece que son excluidos del grueso del cromosoma condensado. Esto sugiere que estas regiones heterocromáticas, normalmente constitutivas son quizás desheterocromatinizadas en células senescentes. De acuerdo con esta idea, al menos para los telómeros, María Blasco et al., han demostrado que los telómeros cortos de ratones que carecen de telomerasa, tienen la heterocromatina reducida cuando se los compara con los telómeros de las células normales. Así que, en tanto en cuanto envejece el tejido, la senescencia celular parece estar acompañada por una redistribución de la heterocromatina, desde la heterocromatina constitutiva hasta otros sitios normalmente eucromáticos, específicamente hasta aquellos dominios especializados de heterocromatina facultativa, (SAHF).

4. Cambios epigenéticos La epigenética se ha definido como la herencia de cambios en la función

de los genes sin cambios en la secuencia de nucleótidos en el DNA. Se ha establecido que la señalización epigenética anómala tiene un papel crucial en la tumorigenesis, pero puede ser también un determinante importante en la senescencia celular y en el envejecimiento del organismo. La modificación epigenética mejor conocida es la metilación del DNA y las modificaciones post-transcripcionales de las histonas, incluyendo la metilación, acetilación, ubiquitinación, ADP ribosilación, fosforilación, etc. Las modificaciones epigenéticas en cáncer han sido estudiadas durante muchos años, pero la epigenética del envejecimiento es una disciplina emergente que promete descubrimientos importantes en el cercano futuro, tal como la definición del metiloma del DNA y un mapa de modificación de las histonas, que ha de ayudar a definir una célula joven versus una vieja y caracterizar los enzimas modificadores de la cromatina implicados en el proceso. Es necesario profundizar en el conocimiento de los cuatro aspectos relevantes que se expresan a continuación:

1. los cambios producidos por eventos ambientales y estocásticos

en la panorámica epigenética, durante la vida de un individuo.

Capítulo 11

314

2. de qué manera el envejecimiento marca el perfil de metilación del DNA de nuestro genoma.

3. cómo las alteraciones genéticas y epigenéticas de los genes progeroides convergen en las células envejecidas y

4. la asociación entre la modificación de las histonas, acetilación de la lisina 16 y la trimetilación de la lisina 20 de la histona 4, y el envejecimiento.

La metilación del genoma puede hacer que determinadas áreas del DNA

se conviertan en silenciosas. Hay dos tipos de metilación, la metilación de mantenimiento y la metilación de novo. La primera añade grupos metilo a cadenas de DNA recientemente sintetizadas en puntos opuestos a los sitios metilados en la cadena madre. Esta actividad asegura que las moléculas hijas de DNA mantengan un patrón de metilación después de la división celular. La metilación de novo, añade grupos metilo en posiciones totalmente nuevas, cambiando el patrón de metilación en una región localizada del genoma.

Los genes que se deben expresar en todos los tejidos tienen regiones no

metiladas, conocidas como islotes CpG, localizadas en la dirección opuesta a los genes. Los genes que se deben silenciar en los tejidos diferenciados tienen metilados los islotes CpC, lo que permite que un complejo histona-desacetilasa (histone deacetylase complex o HDAC), se una y comprima la forma del material genómico e inactive el gen. Los islotes CpG son regiones del DNA que poseen dinucleótidos de citosina y guanina en elevada frecuencia. La metilación de los islotes CpG cerca o dentro de los promotores de los genes es lo que causa el silenciamiento de dichos genes.

Dado que envejecimiento y cáncer presentan alteraciones epigenéticas

que convergen en algunos casos, interesa conocer la función y la significación biológica de las alteraciones epigenéticas que se acumulan durante el envejecimiento y son importantes en la tumorigénesis. Ejemplos paradigmáticos los proporcionan la pérdida global de la metilación del DNA en el cáncer y el envejecimiento por el promotor de la hipermetilación de genes con un papel dual en la supresión tumoral y en la progeria (síndrome de Werner y genes lamina A/C). Otro cambio lo proporcionan las sirtuínas, una familia de desacetilasas dependientes de NAD, que actúan sobre la lisina 16 de la histona 4, las cuales están emergiendo como una conexión entre la transformación celular y la longevidad. Los primeros estudios encontraron un perfil de bajos niveles globales de metilación del DNA en muchos tejidos

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de mamíferos viejos, y más recientemente, datos obtenidos de gemelos monocigóticos (MZ), han proporcionado suficiente evidencia que corrobora que las variantes epigenéticas se acumulan durante la edad de manera independiente de la secuencia genética. En este estudio se analizó la contribución epigenética a la discordancia entre gemelos y se aclaró el efecto de las características ambientales sobre la función genética. Hasta la fecha se han analizado en una gran cantidad de de gemelos homozigóticos las diferencias globales y la metilación específica del locus DNA y la modificación de las histonas. Los datos obtenidos revelaron un cambio epigenético entre estos hermanos durante el envejecimiento, que se asoció con discordancias fenotípicas, las cuales en tales gemelos fue atribuida a un ambiente no compartido. La interacción entre factores medioambientales y la discordancia fenotípica entre gemelos MZ fueron observadas hace muchos años, sin embargo, poco se sabía entonces de los mecanismos moleculares mediante los cuales los factores medioambientales podían de manera permanente, o quizás transitoria, influenciar la función genética.

Existen pruebas experimentales de la modulación epigenética en

respuesta a factores medioambientales a partir de otras fuentes. Ejemplos incluyen un ambiente intrauterino anormal asociado con la regulación de genes implicados en la función de las células beta pancreáticas y la dieta materna respecto al perfil de metilación del DNA de la descendencia. Existen, sin embargo, varios cambios epigenéticos que ocurren durante el desarrollo ontogénico que no se pueden explicar solo por factores ambientales, tales como en estudios de animales gemelos y endogámicos, cuando las diferencias fenotípicas ocurren en ausencia de diferencias ambientales observables y también cuando las diferencias ambientales no incrementan significativamente el grado de variación fenotípica. Esta serie de experimentos demuestra que, aparte del medioambiente, se requieren otros componentes para conseguir la variabilidad fenotípica. Estos componentes pueden ser considerados el resultado de una clase de recombinación epigenética estocástica, también conocida como el tercer componente, después de la reproducción sexual. La hipótesis del tercer componente está en consonancia con el concepto de epigenotipos múltiples (variaciones epigenéticas intraindividuales, específicas de los tejidos e interindividuales), que pueden explicar los diferentes perfiles encontrados incluso entre individuos jóvenes. Por tanto, las modificaciones epigenéticas pueden resultar, tanto de eventos estocásticos como de factores ambientales externos, y así constituyen un mecanismo molecular candidato para la variación fenotípica. Como la función genética y la estructura de la

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cromatina pueden ser moduladas por medio de modificaciones químicas en el DNA y en las histonas que lo acompañan, y como estas modificaciones pueden estar afectadas por factores medioambientales, la idea de que los efectos del medio ambiente pueden provocar respuestas fenotípicas mediadas por factores epigenéticos es muy atractiva. No obstante, los mecanismos precisos mediante los cuales el ambiente puede generar respuestas fenotípicas adaptativas no se conoce todavía y representa un área de extraordinario interés de investigación futura.

Las consecuencias de los cambios epigenéticos asociados al

envejecimiento se han estudiado con profundidad en levadura. En este organismo la redistribución de Sir2 y las proteínas heterocromatínicas, contrarrestan el proceso del envejecimiento. La consecuencia de los varios modos de regulación epigenética asociada a la edad en mamíferos, permanece de alguna manera especulativa. Sin embargo, el envejecimiento va acompañado por varios fenotipos alterados que pueden estar conectados con los cambios epigenéticos asociados a la edad. Estudios pioneros de Richard Doll et al., en los pasados sesenta, indicaron que la edad se asociaba con la aneuploidia celular. Como la propia segregación cromosómica depende de la estructura y función de la heterocromatina constitutiva pericéntrica, la disminución en la metilación del DNA y la desheterocromatinización de secuencias pericentroméricas repetitivas, pueden contribuir a la segregación cromosómica defectuosa y a la aneuploidia asociada a la edad. Estudios más recientes en levadura han demostrado que la aneuploidia confiere varios fenotipos celulares alterados, incluyendo una alteración proliferativa, que puede contribuir a la disminución de la capacidad de renovación tisular con la edad. La aneuploidia puede también promover el cáncer, enfermedad para la cual el envejecimiento es el principal factor de riesgo.

El envejecimiento está también asociado con cambios en patrones de

expresión génica. Es importante destacar que alguno de estos cambios parece que tienen un componente estocástico. Por ejemplo, el envejecimiento está asociado con una variabilidad incrementada en la expresión génica en cardiomiocitos. Las células madre hematopoyéticas viejas también exhiben cambios en la expresión génica. Estos cambios son consistentes con una predisposición hacia la diferenciación mieloide y así parecen asemejarse al cambio linfoide a mieloide, que va unido al envejecimiento del sistema inmune y contribuye al declinar de la inmunidad adaptativa. No está claro si estos cambios asociados a la edad se deben a alteraciones epigenéticas o a

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alteraciones genéticas (acúmulo en el daño al DNA), pero es posible que la epigenética cuente en una buena parte en el cambio. De acuerdo con esta posibilidad, se han encontrado divergencias dependientes de la edad, en el perfil de metilación del DNA y acetilación de las histonas, en parejas de gemelos homozigóticos, que son genéticamente idénticos. En este estudio con gemelos, aquellos genes que estaban modificados de manera diferente fueron también expresados de la misma manera, lo que sugiere que la divergencia epigenética dependiente de la edad conduce a la divergencia de los perfiles de expresión génica. Esta divergencia en individuos genéticamente idénticos está de acuerdo otra vez con un componente estocástico del cambio.

La metilación de los islotes CpG dependiente del envejecimiento, puede

tener profundas consecuencias funcionales, ya que este es un modo bien conocido de silenciar algún gen supresor de tumores, como INK4a y VHL. La metilación de CpG, por efecto de la edad, de algún supresor de tumores ha sido descrita en tejido histológicamente normal y parece que precede al desarrollo de cambios neoplásicos en la organización tisular. Esto sugiere que la metilación de los islotes CpG tisulares, asociada a la edad, puede ser un evento temprano causal en el desarrollo de los neoplasmas. Si una consecuencia de esta metilación de los CpG es silenciar genes supresores de tumores, un proceso que parece desventajoso para el organismo, es posible que esté conectado a otros cambios beneficiosos en la estructura de la cromatina, pero refleja una dirección estocástica, no determinada de este proceso. Por ejemplo, si los SAHF contribuyen al fenotipo senescente han de contribuir en primer lugar a la supresión tumoral mediada por la senescencia. Sin embargo, los “errores” estocásticos en los procesos de ensamblaje de SAHF pueden contribuir de manera errónea a la metilación de los islotes CpG en los promotores de algunos genes supresores de tumores, teniendo en cuenta el silenciamiento de estos genes en el envejecimiento. Incluso si estos errores epigenéticos estocásticos, asociados a la edad, ocurren solo como raras mutaciones genéticas, deben conferir la primera ventaja selectiva en el camino hacia el cáncer

5. DNA metilomas La gran fidelidad con la cual el patrón de metilación del DNA se hereda

después de cada ronda de división celular, está asegurada por las DNA metiltransferasas (DNMT). Sin embargo, la célula vieja sufre un cambio en la metilación del DNA (Figura 2). Estudios tempranos han demostrado que

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la metilación global del DNA disminuye durante el envejecimiento en muchos tipos de tejidos y después se ha observado que los fibroblastos de mamíferos cultivados hasta la senescencia, sufrían un incremento en la pérdida de la metilación del DNA. La pérdida de la metilación global del DNA durante el envejecimiento se debe probablemente a la desmetilación pasiva de la heterocromatina, como consecuencia de una pérdida progresiva de la eficacia de novo de las DNMT o de la expresión errónea del enzima por otros cofactores. Es también posible que la respuesta natural de la célula a la pérdida de la metilación del DNA en secuencias repetidas del DNA, sea la sobreexpresión de la metilasa del DNA, DNMT3b, como se encontró previamante en fibroblastos en cultivo. Un resultado lógico de la sobreexpresión de DNMT3b es que regiones tales como los islotes CpG, que se encuentran no metilados en células normales, sean hipermetiladas de manera aberrante, para los genes humanos MutL homólogo 1 (MLH1) y p14ARF. Curiosamente, la hipometilación global del DNA, la aberrante hipermetilación y la modesta sobreexpresión de la DNMT3b, son alteraciones epigenéticas conocidas en cáncer. Así que, el acumulo de alteraciones epigenéticas durante el envejecimiento puede contribuir a la transformación tumorigénica.

Varias regiones del DNA genómico se hipermetilan durante el

envejecimiento. Por ejemplo, se ha detectado un incremento en metilcitosina dentro de los grupos de DNA ribosómico en hígado de ratas viejas, que puede asociarse con la disminución de niveles del RNA durante el envejecimiento. La metilación de los islotes CpG en tejidos no tumorigénicos se ha descrito para varios genes, incluyendo el receptor de estrógenos (ER), el antígeno de diferenciación miogénica 1 (MYOD1), el factor de crecimiento insulínico II (IGF2) y el candidato 33 supresor tumoral (N33). En algunos casos, tales como MLH1 y p14ARF, la hipermetilación del promotor fue más común en tejidos envejecidos. Un estudio mas reciente ha encontrado hipermetilación en el promotor de los genes supresores de tumores lisil oxidasa (LOX), p16INK4a, factor de transcripción 3 relacionado con runt (RUNX3), y el gen inducible TPA (TIG1), en mucosa gástrica no neoplásica, que se relacionó significativamente con el envejecimiento.

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Figura 2. Epigenomas de células normales, senescentes y cancerosas. Los círculos

blancos y negros indican dinucleótidos no metilados y metilados, respectivamente. Las células sanas tienen una disposición epigenética caracterizada por secuencias repetitivas con densa metilación del DNA, islotes CpG no metilados de genes constitutivos, y elevados niveles de lisina 16 monoacetilada y lisina 20 trimetilada en la histona H4. Las células cancerosas sufren hipometilación en secuencias repetitivas de DNA, hipermetilación en CpG de los genes supresores de tumores asociados con el silenciamiento transcripcional, reclutamiento de DNMT y SIRT1 en estos locus y reducción de las formas lisina 16 monoacetilada y lisina 20 trimetilada, de la histona H4. En las células senescentes debe haber una pérdida progresiva de citosinas metiladas en las regiones repetitivas y la presencia de sitios de 5-metilcitosinas en las regiones promotoras, acompañados por una disminución en la actividad SIRT1. Genes relacionados con el envejecimiento, tales como WRN y lamin A/C, que funcionan correctamente en la célula joven sana, pueden convertirse en hipermetilados y silenciados en células cancerosas o tener mutaciones en la línea germinal (MUT*), en casos de síndromes progeroides, como el de Werner (WRN) o la progeria de Hutchinson–Gilford (lamin A/C) (Fraga y Esteller 2007).

Otros ejemplos de genes cuyo promotor está hipermetilado durante el

envejecimiento, son los que codifican la E-cadherina, c-fos y colágeno (I). Aunque es posible asociar el acumulo de la metilación en los promotores de los genes supresores de tumores durante el envejecimiento, con la predisposición a desarrollar cáncer, no existe evidencia experimental ni mecanística de una relación directa entre estos genes y el envejecimiento.

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La regulación del locus INK4/ARF durante el envejecimiento reclama atención especial. Por un lado, la región promotora del gen p16INK4a gana un número mayor de islotes CpG metilados en tejidos normales durante el envejecimiento. Aunque todavía no se ha investigado, la hipermetilación en el interior de este promotor sugiere que p16INK4a se encuentra reducido en células viejas. Por otra parte, la expresión de p16INK4a se sabe que aumenta con la edad en mamíferos y lo más notable es que su regulación (activación) está directamente implicada en la disminución del potencial de autorrenovación de algunas células madre maduras. Así que, la regulación del locus INK4/ARF tiene que tener un papel importante en el envejecimiento y el cáncer. Durante el envejecimiento INK4/ARF puede llegar a hipermetilarse y a veces cuando la hipermetilación es extensa y densa, en los islotes CpG del promotor, el locus puede ser reprimido, favoreciendo así la transformación maligna. Al mismo tiempo, el locus parece estar epigenética e independientemente activado durante el envejecimiento en un proceso que puede tener un papel directo en el descenso del potencial proliferativo de células progenitoras maduras.

6. Silenciamiento epigenético de los genes progeroides Los síndromes progeroides comprenden un grupo de enfermedades

caracterizadas por rasgos clínicos que se asemejan a envejecimiento prematuro. Dos de las entidades clínicas reconocidas son el síndrome de Werner y la progeria de Hutchinson–Gilford, asociadas con mutaciones genéticas en el gen WRN, que codifica un miembro de la familia RECQ de helicasas, y el de la lámina nuclear A/C (LMNA), respectivamente. Se ha demostrado que la inactivación epigenética de los genes progeroides, WRN y LMNA, pueden también contribuir a la transformación maligna (Figura 2). El gen LMNA fue el primer gen conocido implicado en el envejecimiento, que exhibe actividad supresora de tumores y está frecuentemente reprimido en cáncer por hipermetilación del promotor. La lámina nuclear se localiza en el lado interno de la membrana nuclear y consiste en filamentos del intermediario lámina tipo A y B. Las láminas nucleares son muy dinámicas sugiriéndose que están implicadas en el posicionamiento, no al azar, de los dominios subcromosómicos en la organización total de la cromatina y posiblemente en la regulación de la expresión génica. Las laminas se agrupan en las dos subfamilias anteriormente mencionadas: Tipo A, cuyos miembros se expresan en la mayoría de las células somáticas diferenciadas; y tipo B, cuyos miembros se expresan en casi todas las células y son esenciales para la viabilidad celular. El gen lamina A/C codifica las laminas

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A y C, dos isoformas que surgen como resultado de una rotura del RNA alternativo. Aunque las del tipo A son importantes en el mantenimiento de la estabilidad de las láminas nucleares, también tienen un papel central en el control de la expresión genética. Las mutaciones en el gen lamina A/C causa varias enfermedades hereditarias específicas de tejidos, como el síndrome de distrofia muscular Emery–Dreifuss y la lipodistrofia familiar parcial tipo Dunnigan. Es interesante destacar que la represión del gen de lamina A/C en leucemia y linfoma está frecuentemente asociada con la hipermetilación de su promotor. Otras proteínas asociadas a lámina, tal como LAP2a, se han asociado también con la tumorigénesis; sin embargo, los mecanismos precisos moleculares mediante los cuales las láminas contribuyen al cáncer están todavía poco claros.

El síndrome de Werner proporciona otro ejemplo de un gen implicado

directamente en el envejecimiento y con propiedades de supresor tumoral. El síndrome de Werner es una enfermedad rara autosómica recesiva que se caracteriza por varios rasgos indicativos de envejecimiento acelerado, tales como cataratas, diabetes tipo 2, osteoporosis, varias formas de arterioesclerosis e hipogonadismo a una edad relativamente temprana. La proteína WRN es un miembro de la familia de helicasas RECQ que incluye proteínas que son defectuosas en enfermedades de inestabilidad genómica humana, como los síndromes de Rothmund–Thomson (RECQ4) y Bloom (BLM). La especificidad del sustrato de la helicasa WRN in vitro, incluye una variedad de intermediarios de la replicación, recombinación y reparación del DNA, entre los que se incluyen las uniones Holliday, horquillas duplex y estructuras RNA–DNA. La proteína WRN ejerce un papel importante en muchas vías diferentes, tales como las mediadas por p53, la replicación del DNA, la reparación del DNA y el metabolismo de los telómeros. Se ha sugerido que la familia de proteínas RECQ tiene propiedades supresoras de tumores, y se ha demostrado que la expresión de WRN está frecuentemente reprimida por la hipermetilación del islote CpG del promotor en cáncer humano. Incluso más interesante es el hecho que el tipo de los neoplasmas que ocurren en pacientes con el síndrome de Werner es notablemente diferente de aquellos observados en individuos que no padecían el síndrome. Así, el cociente cáncer mesenquimático/cáncer epitelial es 1:1, mientras que en la población normal senescente es de 1:10. Por tanto, parece que el proceso acelerado del envejecimiento en pacientes con el síndrome de Werner contribuye a la mayor incidencia en tumores, pero la pérdida específica del gen WRN confiere un fenotipo particular propenso a tumores,

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en una manera similar a la observada con otros genes supresores de tumores familiares con función reparadora del DNA, tal como MLH1.

7. Silenciamiento epigenético por microRNA

En los últimos años el estudio de la función de los genes y su relevancia

en enfermedades se ha enriquecido enormemente con el descubrimiento de los microRNAs, unos mini-genes que si bien no producen proteínas con las que se estructuran los organismos, generan unas pequeñas moléculas de RNA capaces de regular la mayor parte de los genes de nuestras células. Dependiendo de su función, nos encontramos con microRNAs oncogénicos, que pueden favorecer el desarrollo de los tumores, o microRNAs con una actividad supresora de tumores.

Los microRNA (miRNA) consisten en una clase abundante de pequeños

RNA endógenos, que no codifican, evolutivamente conservados, que regulan los mRNA por mecanismos tales como emparejamiento de bases y silenciamiento post-transcripcional de genes. Los miRNA, de unos 22 nucleótidos de tamaño, regulan la expresión génica post transcripcional, al afectar la degradación y traducción de los mRNA. Los miRNA juegan un papel importante en el crecimiento celular, diferenciación, proliferación, apoptosis y polarización de neuronas. Hasta un 30% de genes humanos están probablemente regulados por los miRNA y cada uno de ellos puede controlar cientos de genes objetivo. Sin embargo, solo unos pocos de estos genes han sido confirmados hasta la fecha para un miRNA particular. La patogénesis de muchas enfermedades tales como cardiacas, cáncer y autoinmunes se relaciona con la expresión aberrante de genes regulados potencialmente por miRNA.

El proceso de biosíntesis de los miRNA es complicado. Después de la

transcripción, el producto inicial de un gen miRNA se denomina “transcrito primario” o pri-miRNA. El pri-miRNA se procesa por el enzima Drosha (una RNAsa) y libera al “precursor” pre-miRNA, una estructura tallo-bucle, de 72 nucleótidos, que forma parte del RNA de interferencia (RNAi), que se exporta al citoplasma. Posteriormente el enzima Dicer (otra RNAsa), libera el miRNA maduro de 22 nucleótidos. El miRNA maduro se incorpora al complejo efector RNAi (RNA de interferencia) (RISC, complejo silenciador inducido por RNA) y dirige la silenciación de determinados genes (Figura 3).

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Figura 3. Las RNAsas Drosha y Dicer procesan el transcrito primario del miRNA y

generan el miRNA maduro de 22 nucleótidos. El miRNA let-7 se muestra como ejemplo. En células normales, let maduro se produce y silencia la transcripción de varios oncogenes (Ras, Myc, HmgA2 y otros). En células cancerosas, la concentración de let-7 disminuye lo que permite la superproducción de los oncogenes y con ello promueve el crecimiento celular y el cáncer. Kumar el al., han conseguido reducir experimentalmente los niveles de miRNA impidiendo la expresión de Drosha y Dicer (Hammond 2007, modificado).

Los cambios heredables en la expresión génica que no implican

modificaciones en la secuencia codificadora se denominan “epigenéticos”. Los mecanismos tradicionales de regulación epigenética incluyen la metilación del DNA y la modificación de las histonas. Recientemente se ha considerado la regulación por miRNA como un mecanismo epigenético. Las moléculas no codificadoras de RNA pueden dividirse en base a su tamaño en RNA de larga cadena y RNA de cadena corta. Los primeros juegan un papel el la cis-regulación de grupos de genes y del cromosoma completo, incluyendo la mediación de la inactivación de un solo cromosoma. Los segundos incluyen dos clases de pequeños RNA, RNA pequeño de interferencia siRNA y los miRNA, los cuales ejercen su influencia de regulación de la expresión génica, a nivel posttranscripcional. Algún miRNA

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específico puede dirigirse a un mRNA específico, silenciando o inhibiendo su traducción. Esta observación muestra que estas nuevas vías para modificar la expresión génica, hace que el abordaje a los miRNA, al evitar la técnica compleja de los knockout, facilite la investigación funcional genómica.

Un gran número de estudios han demostrado que los niveles de los

miRNA cambian en el transcurso de la vida de los individuos y están asociados con muchos de los achaques adquiridos en el envejecimiento. Se ha demostrado que al eliminar el gen lin-4 en el nematodo C. elegans la esperanza de vida del mutante obtenido fue más corta, mientras que la sobreexpresión de lin-4 la alargaba. Esto demostró un papel del miRNA let-4 en el bloqueo de la muerte prematura y proporcionó evidencia de que los miRNA podían controlar el crecimiento y el envejecimiento. Se encontró también que tal regulación de los miRNA necesitaba de la vía de señalización mediada por la insulina, lo que demuestra también la relación entre el envejecimiento y el metabolismo de la insulina.

Otras evidencias han sugerido que los miRNA pueden ser un factor que

contribuya en la neurodegeneración. Por tanto, los miRNA se propone que juegan un papel dinámico en muchas vías relacionadas con el cerebro de mamíferos, incluyendo la neuroplasticidad y las respuesta al estrés. Otro estudio previo ha demostrado que los miRNA pueden ser relevantes en la enfermedad de Parkinson y en la función dopaminérgica normal. Otro estudio ha demostrado que la alteración del miRo-107, puede estar implicada en la aceleración de la progresión de la enfermedad de Alzheimer mediante la regulación de la proteína enzimática que rompe el sitio beta del precursor del amiloide.

Los primeros esfuerzos para establecer una conexión entre los miRNA y

el cáncer tuvieron su base en análisis de expresión en tumores y líneas celulares en comparación con tejidos normales. Las observaciones fueron impresionantes: los cánceres tenían una clara señal de expresión miRNA. Un número pequeño de miRNA se expresaba en cáncer, incluyendo el grupo miR-17-92, que se demostró más tarde que era oncogénico. No obstante, la mayoría de los miRNA tenía una expresión muy reducida en tumores, expresión muy similar a la encontrada en mamíferos en desarrollo temprano. Esto quiere decir que la mayoría de los miRNA no se expresan al inicio del desarrollo, pero se inducen de manera espectacular a la mitad de la gestación, lo que hace pensar que la expresión de los miRNA es, de alguna

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manera, responsable de la diferenciación celular. Por tanto, las alteraciones en la expresión de miRNA observadas en cáncer, pueden promover un estado celular menos diferenciado, típico del cáncer. A pesar de lo interesante de estos datos, no se ha podido comprobar hasta la fecha que la expresión reducida de miRNA sea la causante del cáncer y no sea una consecuencia del estado menos diferenciado del cáncer. La producción global de miRNA maduro disminuyó al disminuir la expresión de los enzimas Drosha y Dicer. Cuando los niveles de miRNA se redujeron en una línea celular de adenocarcinoma de pulmón, estas células casi carentes de miRNA, mostraron un incremento en la formación de colonias en cultivo y crecimiento tumoral en ratones nudos. Este efecto solo pudo ser detectado en líneas celulares que habían sido ya transformadas. Por ejemplo, células primarias con niveles muy disminuidos de miRNA no mostraron propiedades transformantes; tales células crecieron más lentamente que las células no deplecionadas. Aparentemente, la reducción de los niveles de miRNA no es un evento iniciador. En combinación con la expresión del oncogén Ras, la menor expresión de miRNA incrementó el crecimiento de células en cultivo y aumentó el desarrollo de carcinoma de pulmón in vivo.

Si todos los miRNA son supresores de tumores se puede esperar la

existencia, en cánceres humanos, de mutaciones o supresiones en genes que codifican las RNAsas Dicer y Drosha. Aunque se ha demostrado que existen concentraciones reducidas de la proteína Dicer en tumores, éste no es un evento citogenético ampliamente distribuido. Es más probable que solo un subgrupo de miRNA tenga actividad supresora, demostrada en la familia de genes let-7 (Figura 6). Estos miRNA inducen la expresión de varios oncogenes: ras, myc y hmgA2. Kumar et al., en sus recientes experimentos observaron aumentos en la tumorigénesis, cuando se disminuyó la concentración de todos los miRNA. Es probable que la disminución de los miRNA clave, supresores de tumores, tal como let-7, sea el evento que promueve la tumorigénesis. Esto se apoya en el hecho que la disminución de miRNA en células primarias inhibe el crecimiento. En este aspecto, la disminución de los miRNA que promueven el crecimiento celular, tal como el oncogén miR-17-92, puede compensar la reducción de los miRNA inhibidores del crecimiento tales como let-7. Es interesante profundizar en el hecho de cómo se orquesta la expresión de tantos miRNA diferentes. Es posible que redes transcripcionales que se encuentran alteradas en células cancerosas, conduzcan a la transcripción alterada de los genes miRNA, lo que suponga una ventaja del crecimiento para la célula cancerosa. Hay que destacar que se ha descrito la regulación de la producción de let-7 a nivel de

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Drosha y Dicer. Cualquier interferencia en tal etapa reguladora ha de conducir a la menor producción del miRNA supresor, permitiendo, a su vez, la producción del miRNA oncogénico. Estos acontecimientos ejercerían profundos efectos en el equilibrio de la expresión de los miRNA y en su contribución a la tumorigénesis. Si la producción de miRNA pudiera ser restaurada, ello bloquearía el crecimiento de las células cancerosas o podría promover la diferenciación de tales células. Ambas posibilidades tendrían un valor terapéutico. Al menos estos estudios fuerzan a los investigadores a considerar las contribuciones de genes, no convencionales no codificadores, en el desarrollo del cáncer. Los resultados obtenidos hasta la fecha sugieren nuevas estrategias terapéuticas.

Los cánceres humanos se caracterizan por una notable reducción en la

expresión genética de los miRNA. Hasta el momento se desconoce que papel juega este fenómeno en la patología de la enfermedad. Estudios recientes prueban que la menor expresión en miRNA promueve la carcinogénesis, lo que cambia la idea que se ha tenido hasta ahora acerca del cáncer. El primer miRNA se descubrió hace años en el nematodo Caenorhabditis elegans. El interés en este pequeño RNA se desató cuando se identificaron varios miles de ellos entre muchas especies. Hasta aquí, se han identificado unos 450 genes miRNA en humanos y se cree que regulan la expresión de un tercio de todos los genes. Poco tiempo después de que los miRNA fueran encontrados en el genoma humano, la especulación surgió que ellos podían tener algún papel en el cáncer. De hecho, la expresión de miRNA perfilada por muchos grupos, presenta características moleculares asociadas con el cáncer. Se ha demostrado que las alteraciones en la expresión de los miRNA promueven la tumorigenesis en un modelo de cáncer de pulmón en ratón. Este estudio ha proporcionado evidencia funcional para una gran cantidad de datos referentes a la expresión de miRNA y sugiere una estrategia para el desarrollo de nuevas terapias anticáncer.

8. Modificación de las histonas Otros estratos epigenéticos, tales como la modificación de las histonas,

tiene también un perfil definido durante en envejecimiento y la transformación celular. Por ejemplo, la trimetilación de H4-K20, la cual está enriquecida en células indiferenciadas, se eleva con la edad, y está normalmente reducida en células cancerosas (Figura 2). Es curioso observar que la trimetilación de H4-K20, se reduce después del tratamiento con el hepatocarcinógeno tamoxifeno. La pérdida de H4-K20 trimetilada en células

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cancerosas puede estar causada por la pérdida de expresión de la metiltransferasa específica de H4-K20, Suv4-20h (homólogo 4-20 del supresor de la variegación de la Drosophila), la pérdida del supresor de tumores retinoblastoma, o la alteración de otros enzimas modificadores de las histonas. El incremento de la H4-K20 trimetilada en células envejecidas se ha asociado con defectos en la lamina nuclear, pero existen pocos datos sobre los mecanismos moleculares que conectan las laminas nucleares con la maquinaria modificadora de histonas. Sin embargo, existe una asociación entre las alteraciones de las laminas nucleares y la morfología nuclear alterada. En este aspecto, un estudio en ratones ha observado que la alteración de FACE1, una metaloproteasa implicada en la maduración proteolítica del precursor de la lamina A, se asocia con el envejecimiento prematuro y con la disrupción de la integridad de la envuelta nuclear. No se sabe si las alteraciones nucleares dependientes de lamina se asocian con alteraciones epigenéticas en estos ratones transgénicos. Desde el punto de vista epigenético, se observan también alteraciones en la morfología nuclear en células humanas deficientes en DNMT.

Se han descrito otros mecanismos epigenéticos que están potencialmente

implicados en el envejecimiento y el cáncer. De estos, merece atención especial la familia de enzimas epigenéticos con actividad histona desacetilasa (HDAC), conocidos como sirtuinas. La acetilación de las histonas es crucial para el control de la estructura de la cromatina y para la regulación de la expresión génica. Las proteínas sirtuínas, que comprenden la clase III de la familia de las HDAC, dependientes del NAD, se encuentran implicadas en eventos celulares múltiples, entre los que se incluyen la remodelación de la cromatina, el silenciamiento transcripcional, la mitosis y el control de la longevidad. El primer miembro de la familia, SIR2 (regulador silente de la información 2), fue inicialmente descrito en levadura. Los enzimas SIR2, catalizan una reacción que implica la rotura del NAD. En la levadura, la deleción de SIR2 acorta la vida de la levadura, mientras que una copia extra del gen la alarga, lo que implica que la familia SIR2 juega un importante papel en el envejecimiento y en la longevidad.

La importancia crucial del NAD en muchas vías metabólicas, y el hecho

de que las sirtuínas puedan controlar la actividad de muchas otras proteínas que intervienen en el crecimiento celular, sugiere que la familia de proteínas SIR2 se encuentra implicada en la longevidad mediada por restricción calórica. Se ha sugerido que el flujo de carbono en la glucolisis y el ciclo tricarboxílico (TCA) está muy reducido en condiciones de restricción

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calórica y de esta manera SIR2 dispone de más cantidad de NAD para ejercer su actividad catalítica. Así que, las proteínas Sir2 establecen conexión entre el ritmo metabólico y el envejecimiento, a través de la regulación de genes que dependen del NAD y la remodelación de la cromatina. La longevidad alcanzada por restricción calórica requiere SIR2 y se acompaña por un incremento en la respiración, el cual, a su vez, eleva la actividad de las sirtuínas. Esta evidencia ha provocado un interés considerable en las sirtuínas de mamíferos, los ortólogos de SIR2. Se conocen siete homólogos de la proteína SIR2 de levadura, en mamíferos: las sirtuínas 1–7 (SIRT1–7), que juegan papeles importantes en la expresión de genes, en la respuesta al estrés, reparación del DNA, apoptosis, ciclo celular, estabilidad genómica y regulación de la insulina. Por tanto, las sirtuínas son fundamentales para el control de vías metabólicas y la regulación del crecimiento celular y el cáncer. Entre los miembros de esta familia, SIRT1 y SIRT2 son de interés particular porque se ha descrito que están alteradas en células cancerosas, que su expresión puede depender del envejecimiento y que actúan sobre las colas de las histonas. (Ver capítulo 10).

8.1. Sirtuina 1 y su relación con el envejecimiento y el cáncer La proteína SIRT1 muestra actividad desacetilasa dependiente de NAD,

similar a la de SIR2 de la levadura. En mamíferos SIRT1 puede actuar sobre las histonas, principalmente sobre las posiciones H4-K16 y H3-K9, y también sobre factores de transcripción claves, tales como la proteína supresora de tumores p53, factores de transcripción forkhead (FOXO), histona p300 acetiltransferasa, el supresor tumoral p73, el factor de transcripción E2F1, la subunidad del antígeno de 70 kDa (Ku70) del factor de reparación del DNA, el factor nuclear kappa B (NF-κB) y el receptor de andrógenos (AR). La proteína SIRT1 está ampliamente expresada en la mayoría de los tejidos y se inhibe en células senescentes y durante el envejecimiento. La proteína SIRT1 se activa en carcinomas de pulmón, linfomas y sarcomas de tejidos suaves de ratón, y en cáncer de pulmón, cáncer de próstata y leucemia en humanos. Más importante aún, es que las histonas objetivo de SIRT1, H4-K16 y H3-K9, están alteradas en varios tipos de tumor. Las células cancerosas tienen un nivel más bajo de H4-K16 monoacetilada y la hipoacetilación de H3-K9 se asocia con mayor riesgo de recurrencia en cáncer de próstata. Como SIRT1 puede desacetilar específicamente estas posiciones, su regulación en tumorigenesis podría contribuir al establecimiento del perfil específico de modificación de histonas en cáncer. En el caso de la H4-K16 monoacetilada, SIRT1 se ha

Capítulo 11

329

descrito como activadora principalmente a nivel del promotor del gen. Así, la influencia de las alteraciones de SIRT1 en la H4-K16 acetilada global puede ser modulada. De hecho, una porción sustancial de las histonas H4-K16 monoacetiladas, que se pierden en células cancerosas, puede proceder de la acetilación de otras lisinas de la cola de histona y del incremento de la cantidad de isoformas H4 poliacetiladas.

La activación de la proteína SIRT1 en algunos tipos de tumor y su

relación con la proliferación y esperanza de vida, sugiere que esta desacetilasa dependiente de NAD, puede estar directamente implicada en la tumorigenesis. El potencial oncogénico de SIRT1 es el resultado de su papel en el control de varias moléculas cruciales. La relación más obvia con el cáncer es probablemente su capacidad de desacetilar e inactivar los genes supresores de tumores p53 y p73, aunque se ha implicado también en otros mecanismos tales como la desacetilación de las histonas H4-K16 localizadas dentro de los promotores de los genes supresores de tumores y otros factores como E2F1, Ku70, FOXOs, el receptor de andrógenos y el NFκB.

8.2. Sirtuina 2 y progresión del ciclo celular La proteína SIRT2 se conoció en un principio como tubulina

desacetilasa. Posteriormente se demostró su papel en el control de la progresión del ciclo celular, particularmente a través de la desacetilación de la H4-K16 a nivel global. La histona H4-K16 acetilada (H4-AcK16), se ha observado que cambia durante el ciclo celular, sufriendo una caída característica muy marcada durante la transición G2-M. Antes de la mitosis, la cromatina necesita ser desacetilada en la histona H4-K16, probablemente para conseguir el estado de fibra compacta de los cromosomas en metafase. La proteína SIRT2 puede ser la responsable de gran parte de esta desacetilación global de la histona H4-K16, para recuperar el status de la cromatina en G1. Posteriormente, la histona H4-K16 necesita ser reacetilada por histona acetiltransferasas específicas del dominio familiar MYST, tal como hMOF (homólogo humano de MOF). Consistente con tal mecanismo, la sobreexpresión de SIRT2 conduce a una disminución de la histona acetilada H4-AcK16 y a la acumulación de las células en la transición en G2-M. El RNA de interferencia (RNAi) y los knockouts de SIRT2 provocan un incremento de H4-AcK16 y una parada del ciclo celular en G0–G1. El RNAi del hMOF induce la pérdida de H4-AcK16 y la parada de ciclo en la transición G2-M.

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La pérdida de H4-AcK16 en células transformadas y proliferantes puede estar asociada con la alteración de SIRT2, pero la alteración de esta desacetilasa durante el envejecimiento y el cáncer permanece sin identificar. De hecho, se ha descrito que SIRT2 se activa frecuentemente en gliomas humanos. Por consiguiente, la actividad de SIRT2 dependiente de tubulina se ha propuesto que supone un nuevo punto de chequeo mitótico que puede prevenir la inestabilidad cromosómica. Así que, SIRT2 parece tener un doble papel en el cáncer, dependiendo de su objetivo molecular primario y de la situación ambiental y de estrés de la célula.

9. Envejecimiento y longevidad se asocian con cambios

epigenéticos Los enzimas que añaden o eliminan grupos acetilo, las histonas

acetiltransferasas (HAT) y las histonas desacetilasas (HDAC) respectivamente, determinan el nivel de acetilación de las histonas. En S. cerevisiae, la inactivación de la histona desacetilasa, SIR2, acorta la esperanza de vida de la levadura, mientras que la activación de SIR2 la alarga. Los efectos anti envejecimiento de SIR2 en la levadura son, al menos en parte, debidos a la traslocación de un complejo proteínico que contiene SIR2, desde los telómeros a las repeticiones de DNA ribosómico (rDNA). Estas repeticiones son propicias a la recombinación y forman círculos de rDNA extracromosómicos (ERC), los cuales acortan la vida de la levadura. A nivel de las repeticiones de rDNA, la desacetilación de las histonas mediada por SIR2 y la consiguiente heterocromatinización por las proteínas asociadas a SIR2, SIR3 y SIR4, previene la recombinación y formación de ERC, lo cual hace que se alargue la vida. Así que, el envejecimiento de la levadura se asocia con la redistribución nuclear de un enzima que modifica las histonas y sus proteínas asociadas que se unen a la heterocromatina. Esta redistribución epigenética contrarresta el envejecimiento del organismo.

Los ortólogos de SIR2 tienen funciones anti-envejecimiento en muchas

otras especies, incluyendo los nematodos y las moscas, aunque los mecanismos no parece que implican los ERC en estos organismos. En este aspecto, la disminución en la expresión del ortólogo de mamíferos más cercano a SIR2, SIRT1, se relaciona con un prematuro envejecimiento en ratones, con actividad incrementada en miembros de la familia p53. Además, en ratones de tipo silvestre, la proteína SIRT1 disminuye con la edad en tejidos mitóticos. Por tanto, la capacidad de las proteínas tipo SIR2 de regular el envejecimiento, parece estar conservada a través de la evolución.

Capítulo 11

331

Sin embargo, como SIRT1 tiene también muchos sustratos no cromatínicos, el que cualquier efecto sobre el envejecimiento de mamíferos sea determinado epigenéticamente permanece sin aclarar. En mamíferos, la metilación total del DNA, disminuye con la edad, y esta disminución ocurre principalmente en las secuencias de DNA repetitivo características de los dominios de heterocromatina constitutiva. Como la metilación del DNA promueve la formación de heterocromatina silente, este cambio facilitará la desheterocromatinización de estas regiones.

Sin embargo, aunque los niveles de metilación en el genoma de

mamíferos disminuyen con la edad en determinados sitios, hay una tendencia hacia un incremento en la metilación del DNA en otros sitios. Esto ocurre en los islotes CpG, alguno de los cuales se encuentra cerca o está en las regiones promotoras de los genes. Los islotes CpG son secuencias ricas en CG que normalmente no están metiladas, pero pueden metilarse en algún momento. Además de la total abundancia de histona H4 metilada en lisina 20 (H4K20Me), se ha descrito que se incrementa con la edad, en riñón e hígado de rata. Al igual que en la metilación del DNA, H4K20Me se conecta con la represión transcripcional, lo que apoya la noción que la heterocromatina se acumula con el envejecimiento de los tejidos al menos en algunos sitios.

Las carabinas de las histonas son proteínas de unión a las histonas, que

colaboran en el ensamblaje de las histonas a los nucleosomas. De esta manera, estas carabinas son determinantes clave de la estructura y función de la cromatina. Al menos una de estas carabinas de histonas, HIRA se ha demostrado que incrementa su expresión o sufre algún tipo de regulación en piel de mandril viejo. Aunque la carabina HIRA puede tener algunas funciones ligadas a la activación de la transcripción, tiene un papel evolutivamente conservado en la formación de la heterocromatina.

Todas estas observaciones sugieren que el envejecimiento en los

mamíferos está también asociado con la remodelación de la estructura de la cromatina. En particular, los análisis de los patrones de metilación del DNA sugieren que el envejecimiento de los mamíferos se asocia con la disminución total de la heterocromatina, pero con un incremento en sitios específicos del genoma. Se concibe pues, que existe una "redistribución" de la heterocromatina silenciadora de la transcripción a partir del DNA repetitivo, que está normalmente empaquetado en heterocromatina constitutiva, hacia regiones del genoma que se transcriben normalmente.

Capítulo 11

332

10. Evolución epigenética entre envejecimiento y cáncer La señalización anormal epigenética juega un papel importante en la

tumorigénesis y además, los cambios epigenéticos pueden ser determinantes importantes en la senescencia celular y el envejecimiento del organismo. Se ha comentado anteriormente, que las modificaciones epigenéticas mejor conocidas son la metilación del DNA y las modificaciones post-transcripcionales de las histonas, tales como metilación, acetilación, ubiquitinación, ADP ribosilación, fosforilación, etc. Diversas alteraciones epigenéticas, tales como la hipometilación global y la hipermetilación de los islotes CpG, se acumulan progresivamente durante el envejecimiento y contribuyen directamente a la transformación celular. Aunque el campo de las modificaciones epigenéticas en cáncer ha sido intensamente estudiado en los últimos 15 años, no ocurre lo mismo con el envejecimiento. La epigenética del envejecimiento es una disciplina que en el momento actual se encuentra en estado emergente, lo que hace concebir grandes esperanzas en las revelaciones futuras, que han de presentar un enorme interés y ser de gran utilidad por su gran repercusión a nivel patológico y social.

Interesa saber la significación biológica de las alteraciones epigenéticas

en términos de sus relativas contribuciones al desarrollo ontogénico, la senescencia y la proliferación celular. También interesa conocer cuáles son las alteraciones epigenéticas que se acumulan a lo largo de la vida y tienen un papel directo en la transformación celular, y aquellas modificaciones epigenéticas que muestran una clara evolución durante el envejecimiento, que se invierten en cáncer. El ejemplo mejor conocido del primer caso, es la pérdida global de metilación del DNA en envejecimiento y en cáncer y la hipermetilación del promotor de genes con un doble papel en la supresión tumoral y en la progeria, tales como WRN y LNMA. Uno de los ejemplos más estudiados del segundo caso es probablemente la longitud telomérica que puede ser controlada por modificaciones epigenéticas y decrece con la edad, pero se eleva rápidamente después de la transformación. Más recientemente se ha descrito que la actividad de varios miembros de la familia de sirtuínas (desacetilasas dependientes del NAD), que actúan sobre las colas de las histonas, disminuye durante el envejecimiento, mientras que se eleva en células cancerosas. Como la familia de las sirtuínas se ha propuesto como la conexión entre la dieta y la longevidad, considerando el papel específico de varios miembros de esta familia en la tumorigénesis, surge la posibilidad que las sirtuínas sean una de las conexiones perdidas entre dieta y cáncer (Figura 4).

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333

Figura 4. Evolución de los mecanismos moleculares relacionados con la epigenética

durante el envejecimiento y el cáncer (Fraga, Agrelo y Esteller 2007, modificado) 11. Cuestiones pendientes e implicaciones terapéuticas Es aparente que la estructura de la cromatina cambia con la edad en

organismos tan diversos como la levadura y los mamíferos. Sin embargo, con la excepción de SIR2 en levadura, la intensidad a la cual esto ejerce impacto en el proceso de envejecimiento no ha sido aún definido. Aunque nos encontramos al principio de las investigaciones sobre este campo, se puede proponer que algunas alteraciones epigenéticas asociadas a la edad en mamíferos, tal como la formación de SAHF, pueden influir sobre la longevidad al suprimir las enfermedades asociadas al envejecimiento, tales como el cáncer. Sin embargo, como inmersos en la hipótesis de la pleiotropía antagónica, SAHF y otros eventos, que gobiernan la senescencia, pueden en último lugar promover el envejecimiento disminuyendo la capacidad renovadora de los tejidos. Se ha sugerido que un componente estocástico no regulado, derivado de los cambios en la estructura de la cromatina, puede conducir al gradual deterioro en la función de células y tejidos. Por analogía con las alteraciones genéticas (daño al DNA), el acumulo de los cambios epigenéticos puede considerarse como “daño a la cromatina”. En resumen, los efectos de la cromatina sobre el envejecimiento es probable que sean complejos y bidireccionales. Un prerrequisito para conocer la contribución de la epigenética al envejecimiento es comprender mejor los fenotipos senescentes específicos, tales como la osteoporosis, sarcopenia, el declinar de la función del sistema inmune, alopecia, cáncer y

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334

muchos otros. Entonces será posible analizar la contribución a cada fenotipo, de los candidatos epigenéticos determinantes, tales como la hipometilación global, la hipermetilación de los islotes CpG y la aparición de SAHF.

Hasta que esto llegue, se puede ya empezar a aplicar el conocimiento

adquirido. Por ejemplo, podemos ser capaces de usar las alteraciones epigenéticas asociadas a la edad, como un medio de detección temprana y estratificación del riesgo de enfermedades asociadas al envejecimiento. Existe ya un considerable interés en el desarrollo de métodos para la detección temprana del cáncer, basados en la hipermetilación de los islotes CpG del promotor de genes supresores de tumores, en un número muy pequeño de células cancerosas encontradas en sangre u otros fluidos accesibles del organismo. Sin embargo, si la hipermetilación de CpG es un evento frecuente preneoplásico asociado a la edad, ha de ser posible ampliar esta tecnología al riesgo del cáncer, en base a la hipermetilación en tejidos preneoplásicos. Igualmente, puede ser también posible usar los cambios epigenéticos de la edad en células cardiacas o inmunes para la valoración del riesgo o la detección temprana de enfermedad cardiovascular o pérdida de la función inmune.

La meta última de la investigación sobre el envejecimiento es retrasar o

aliviar algunas de las enfermedades o achaques de la edad, prolongando la vida de manera saludable. Para los aspectos del envejecimiento movidos por alteraciones epigenéticas, esto puede ser un logro accesible, porque en principio las alteraciones epigenéticas son más fácilmente reversibles que las alteraciones genéticas. No solo pueden utilizarse las alteraciones epigenéticas en la valoración del riesgo y en la detección temprana del cáncer, sino que el revertir los cambios epigenéticos puede ser una estrategia quimiopreventiva del mismo cáncer. Estas estrategias pueden también contar en el caso de las enfermedades típicas de la edad, distintas del cáncer. Es un hecho demostrado que la adición de un activador de SIRT1, el resveratrol, a la dieta de ratones alimentados con dieta rica en grasas, prolonga la vida saludable de estos ratones, simulando aparentemente la contribución bien establecida de la restricción calórica de la dieta a la longevidad. Aunque existen muchas cuestiones por resolver, estos estudios demuestran que existe en la actualidad gran interés en profundizar en estos temas y un potencial de estrategias quimiopreventivas que pueden ser utilizadas con éxito para combatir los achaques el envejecimiento y el desarrollo del cáncer.

Capítulo 11

335

12. Conclusiones Los organismos viejos tienen epigenomas modificados y el

envejecimiento es el factor de riesgo principal asociado con el desarrollo del cáncer. Por tanto, puede sugerirse que la inactivación de los genes implicados en “prevenir” el envejecimiento, es un hecho que ocurre en células cancerosas. Los primeros ejemplos de este concepto lo proporcionan los genes WRN y lamina A/C. Las modificaciones de las histonas, tales como la pérdida de la trimetilación de la H4-K20 y de la monoacetilación de H4-K16, y de los mismos modificadores de las histonas, tales como las sirtuínas, señalan a la epigenética como un puente común entre el envejecimiento y la tumorigenesis. Aunque un estudio relativamente reciente concluye que las grandes diferencias en la metilación de los islotes CpG relacionadas con el envejecimiento pueden no ser aparentes, el desarrollo de proyectos comprensivos del epigenoma humano, utilizando individuos de diferentes edades y distintos tipos de tejidos y secuencias de DNA, ha de proporcionarnos una visión más completa de las conexiones entre la metilación del DNA y las modificaciones de las histonas en el envejecimiento y el cáncer.

13. Abreviaturas CpG, secuencias ricas en CG; DNMT, DNA metil transferasas; E2F,

factor de transcripción; ERC, círculos de rDNA extracromosómico; FACE, metaloproteasa implicada en la maduración proteolítica del precursor de la lamina; FOXO, factor de transcripción de la familia forkhead; FRAP, fluorescencia de fotoblanqueo (photobleaching); HAT, histona acetiltransferasa; HDAC, histona desacetilasa; H4-K16, histona 4 acetilada en lisina 16; HIRA, carabina molecular, proteína que se une a las histonas; miRNA, microRNA, pequeño RNA de 22 nucleótidos; MOF, histona acetiltransferasa; MYST, histona acetiltransferasa (leucemia monocítica); MZ, monocigóticos, NFκB, factor nuclear kappa B; PEV, variegación por efecto de posición; rDNA, DNA ribosómico; RNAi, RNA de interferencia; SAHF, focos de heterocromatina asociados a la senescencia; SIRT1, sirtuína 1, desacetilasa dependiente de NAD+

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Capítulo 12. OSTEOPOROSIS. MECANISMOS QUE REGULAN EL RECAMBIO ÓSEO.

1. Introducción 2. Generalidades del tejido óseo 3. Remodelación ósea 4. Cambios en la masa ósea dependientes del envejecimiento 5. Factores genéticos 6. Clases de osteoporosis 7. Diagnóstico 8 Tratamiento de la osteoporosis 9. Vitamina D y sus efectos sobre la calcificación ósea 10 Osteoporosis y cáncer 11. Aplicaciones clínicas 12. Consideraciones finales 13 Abreviaturas 14. Bibliografía 1. Introducción La osteoporosis o hueso poroso, es una enfermedad del esqueleto

caracterizada por una disminución progresiva de la densidad ósea (masa ósea por unidad de volumen), que acarrea un debilitamiento del hueso. Los huesos se vuelven más delgados y frágiles y muestran una menor resistencia a los golpes. La menor densidad ósea unida al deterioro estructural del tejido es causa de un mayor riesgo de fractura. Son precisamente las fracturas los únicos síntomas aparentes de esta enfermedad, por ello se conoce a la osteoporosis como la “enfermedad silenciosa” ya que la pérdida ósea ocurre sin síntomas aparentes.

La densidad ósea se relaciona directamente con la resistencia de este tejido

de soporte en el organismo. La pérdida de la densidad y resistencia óseas se debe a la reabsorción y solubilización del hueso y a la excreción de fosfato cálcico por el torrente circulatorio.

La osteoporosis afecta generalmente a personas de edad avanzada, es

insidiosa y degenerativa y además de la pérdida del hueso, lleva unida alteraciones en su microarquitectura. Una y otras son la causa del deterioro del tejido, de la merma de su resistencia mecánica y de su mayor fragilidad. Las causas y la velocidad de la pérdida ósea pueden ser de naturaleza diversa, pero

Capítulo 12

341

en la patogénesis de la osteoporosis juega un papel clave el desequilibrio entre la destrucción y la formación. Las fracturas óseas debidas a la osteoporosis son, en la mayoría de los casos, la causa principal de la morbilidad y la mortalidad de la población senescente. La osteoporosis es uno de los problemas con los que se enfrentan los astronautas que permanecen durante largos períodos de tiempo en gravedad cero. Se ha observado que una permanencia de 8 meses en el espacio en situación de ingravidez, produce una pérdida ósea similar a la que padece un humano normal entre los 50 y 60 años. Son muchos los factores de riesgo ambientales que se encuentran involucrados en la génesis de esta enfermedad. Entre ellos, los factores de riesgo genéticos juegan un papel importante como se refleja por la elevada transmisión por herencia de muchos componentes de la formación ósea. La mayoría de fármacos utilizados en la actualidad en el tratamiento de esta enfermedad se encaminan a prevenir o tratar la osteoporosis en la menopausia y en la vejez, a pesar de que existen otras formas de osteoporosis, como la inducida por glucocorticoides, y la juvenil, las cuales han recibido hasta el momento muy poca atención y van a ser en el futuro objetivos importantes de investigación. La regulación de la homeostasis mineral ósea se encuentra regulada con el control intra y extracelular de tres iones, calcio, magnesio y fósforo y con tres hormonas, paratioridea, calcitonina y dihidroxi vitamina D, que actúan sobre tres órganos, el hueso, el intestino y el riñón.

2. Generalidades del tejido óseo El hueso es un tejido especializado que forma, junto con el cartílago, el

sistema esquelético de los vertebrados. Es un tejido dinámico que posee un ritmo continuo de recambio a lo largo de la vida. El esqueleto posee su propio sistema vascular y recibe el 10% del flujo sanguíneo del organismo. La estructura del hueso está diseñada para proporcionar las funciones siguientes:

a. mecánicas tales como soporte rígido y anclaje muscular para la

locomoción y prehensión; b. protectoras para órganos vitales tales como cerebro y médula ósea;

y c. metabólicas como reservorio de calcio, fósforo, magnesio, sodio y

otros elementos esenciales para la vida.

Capítulo 12

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Las propiedades del hueso dependen de su estructura química y de su organización biológica. Los requerimientos mecánicos del organismo necesitan que el hueso sea un tejido rígido, a la vez ligero, capaz de resistir el empuje muscular. La combinación de hueso compacto y hueso esponjoso, reforzados en los puntos que soportan mayor tensión, hacen al hueso un órgano ideal para sus funciones. Aunque el hueso posee la resistencia del hierro fundido, es tres veces más ligero que este elemento, diez veces más flexible y presenta una elevada elasticidad. Estas propiedades del hueso provienen de su organización extracelular que consiste en una fase inorgánica mineral, que ocupa los dos tercios del peso del hueso, pequeñas cantidades de agua y una porción orgánica que constituye la matriz ósea.

La matriz ósea formada por proteínas está compuesta principalmente por

colágeno (70% del peso seco), que constituye el 95% de las proteínas. El colágeno es predominantemente del tipo 1, el cual consiste en tres cadenas de polipéptidos dos α1 y una α2, que conforman su estructura helicoidal. La secuencia de cada cadena contiene glicina-X-Y en trímeros repetidos, donde X y Y son otros aminoácidos (los más comunes son la prolina y la hidroxiprolina). Las fibras de colágeno son la matriz para el depósito del mineral.

Además del colágeno, se han identificado otras proteínas integrantes

también de la matriz orgánica. Entre ellas las más abundantes son la osteonectina y la osteocalcina. La osteonectina es una glicoproteína de 32 kDa que actúa como un complejo con la fosfatasa ácida que une colágeno, calcio e hidroxiapatito. La osteocalcina, es una proteína GLA, de pequeño tamaño, 5,8 kDa, que contiene en su molécula tres residuos de γ-carboxiglutamato, que le confieren afinidad por el calcio y capacidad reguladora durante la mineralización. Los niveles séricos de osteocalcina son un indicador de la actividad osteoblástica. Ambas osteocalcina y osteonectina están sintetizadas por los osteoblastos. Otras proteínas son proteoglicanos, sialoproteínas y fosfoproteínas. Algunas de ellas, como la glicoproteína α-2HS y la albúmina, se sintetizan en el hígado, circulan por el plasma y se incorporan en la matriz ósea recién formada. Se ha podido detectar que la cantidad de glicoproteína α-2HS circulante se relaciona inversamente con la velocidad de formación del hueso, mientras que la de osteocalcina lo hace directamente. La osteonectina y la osteopontina se encargan de la adhesión celular.

Capítulo 12

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El componente mineral está constituido principalmente por calcio, magnesio y fosfatos. El calcio y los fosfatos se encuentran en forma de cristales de hidroxiapatito [Ca10(PO4)6(OH)2]

El tejido óseo contiene diversas clases de células: osteoclastos y

osteoblastos. De los osteoblastos derivan las células de revestimiento óseo y los osteocitos.

Los osteoclastos son células grandes multinucleares diferenciadas terminales, responsables de la destrucción del hueso y aparecen en los lugares de remodelación ósea. Proceden de la médula ósea y derivan de células precursoras hematopoyéticas relacionadas con fagocitos mononucleares. Están formadas por dos o más células que se fusionan por lo cual los osteoclastos son células grandes que poseen varios núcleos, y su vida media es de dos semanas. Estas células reabsorben el hueso insertándose en su superficie mediante un anillo de proteínas contráctiles. El área que rodea el lugar de unión, entre la célula y el hueso, adquiere un ambiente ácido necesario para la solubilización de la fase mineral. Sistemas enzimáticos tales como la bomba de protones ATPasa y la anhidrasa carbónica II son los responsables del mantenimiento del pH ácido. Cuando el hueso se reabsorbe, los iones calcio y fósforo se liberan de la fase sólida y pasan al fluido extracelular. Posteriormente se destruye la matriz mediante la acción de proteasas que actúan también en medio ácido.

Los osteoblastos son células linfoides que derivan de las células precursoras del estroma de la médula, que tienen la misión de formar el tejido óseo y funcionan sintetizando la matriz extracelular, depositándola en la cantidad y orientación apropiadas e iniciando su mineralización. Los osteoblastos poseen un solo núcleo y presentan la apariencia típica de células activas sintetizadoras y secretoras con abundante retículo endoplásmico rugoso (ribosomas) y un aparato de Golgi prominente. Estas células en su misión de construir el hueso destruido por los osteoclastos, trabajan en equipo y rellenan las lagunas producidas por efecto de los osteoclastos. La matriz ósea producida

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por los osteoblastos se denomina osteoide, el cual está hecho de colágeno y otras proteínas. A partir de aquí los osteoblastos controlan la deposición de la parte inorgánica mineral. Los osteoblastos se encuentran en la superficie del hueso nuevo y su supervivencia es de unos tres meses.

Cuando el equipo de osteoblastos ha terminado su operación de relleno de la cavidad ocasionada por acción de los osteoclastos, las células se vuelven aplanadas y tapizan la superficie del hueso. Estos viejos osteoblastos pasan a denominarse células de revestimiento y su misión es la regular el paso del calcio y responder a hormonas sintetizando proteínas específicas activadoras de los osteoclastos.

Los osteocitos son células que proceden de los osteoblastos que quedan incluidos en la matriz ósea, que una vez mineralizada los atrapa. Quedan rodeadas por hueso nuevo y pierden su actividad como osteoblastos. Estas células no quedan aisladas ya que emiten ramas largas que las conectan con otros osteocitos y con las células del revestimiento. Su nueva misión es detectar presiones o roturas en el hueso y emitir señales a los osteoclastos para que actúen disolviendo y eliminando el hueso deteriorado.

La actividad de osteoblastos y osteoclastos está modulada por hormonas y

factores producidos localmente por otras células. La calcitonina actúa inhibiendo la reabsorción ósea por actuación directa sobre los osteoclastos que poseen receptores para esta hormona. La hormona paratiroidea (PTH) actúa indirectamente sobre los osteoclastos a través de los osteoblastos y las células del estroma que producen factor(es) activador(es) de la diferenciación de sus células percursoras.

La mineralización del hueso es un proceso complejo cuidadosamente

orquestado en el cual la fase mineral inorgánica de fosfato tricalcico se deposita de forma ordenada en relación con el desarrollo de la matriz orgánica. Para que se verifique una mineralización óptima en la superficie del hueso en formación, se necesita la acción coordinada de una serie de factores:

a. actividad de los osteoblastos, b. síntesis de la matriz a una determinada velocidad y con una

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determinada composición, c. suministro de calcio y fosfato por el fluido extracelular, d. pH aproximado a 7,6 en el lugar de la mineralización , y e. control sobre los inhibidores de la calcificación.

Anatómicamente pueden distinguirse dos tipos de hueso: cortos (cráneo,

escápula, ilión, etc) y largos (tibia, fémur, humero), que se diferencian por su osificación. En los cortos la osificación es intramembranosa sin fase cartilaginosa, y en los largos la osificación es endocondral con fase cartilaginosa. Existen, a su vez, dos clases de hueso en el adulto: hueso esponjoso trabecular y hueso compacto cortical. El primero, forma el 20% de la masa esquelética total del organismo, pero constituye el 70% de la superficie ósea interna. Se localiza fundamentalmente en las vértebras y epífisis. Es dinámicamente muy activo con una velocidad de recambio (formación/destrucción) del 40% por año. El hueso cortical ocupa el 80% de la masa esquelética total y un tercio de su superficie. Forma la parte externa de la mayoría de los huesos, aunque la mayor parte del hueso cortical aparece en los huesos largos. La velocidad de recambio del hueso cortical es menor que la del hueso trabecular. En el adulto normal, el hueso esponjoso y el compacto tienen una distribución topográfica exacta en las diferentes piezas del esqueleto

La zona cortical de los huesos largos se renueva completamente en un

período de 10 años, mientras que el hueso trabecular, que se encuentra en las terminaciones de los huesos largos y en las vértebras, presenta un recambio más rápido entre los 2 y 3 años. Por ello, la progresión de la osteoporosis se detecta antes en el hueso trabecular que en el cortical.

3. Remodelación ósea El hueso, al igual que otros tejidos del organismo, sufre un continuo

proceso de remodelación mediante el cual el hueso viejo se degrada y es reemplazado por hueso nuevo, sin que ello implique cambios bruscos en la forma y la cantidad del tejido. Este recambio no se realiza simultáneamente en toda la superficie ósea sino únicamente en áreas predeterminadas, llamadas unidades multicelulares de remodelación ósea (bone multicelular unit, BMU). El proceso de recambio óseo tiene varias etapas: activación, reabsorción, reversión, y formación. En primer lugar, las superficies óseas se recubren de osteoblastos que, en respuesta a estímulos hormonales, van a liberar enzimas proteolíticos, los cuales en contacto con la superficie ósea mineralizada, la degradan permitiendo así su reabsorción por los osteoclastos. Este segundo paso

Capítulo 12

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ha de ir precedido por la replicación de las células progenitoras de los osteoclastos y su diferenciación en células maduras bajo el control de factores hormonales. Una vez que los osteoclastos han reabsorbido y solubilizado la mayor parte del componente mineral de la matriz, se inicia la fase de formación en la cual, los osteoblastos rellenan las cavidades originadas por los osteoclastos, con tejido óseo nuevo. De este modo, el esqueleto de un adulto se regenera completamente en un período de 10 años. En la remodelación existe una yuxtaposición de osteoclastos y osteoblastos incluidos en la BMU. En el hueso cortical, la BMU labra un túnel a través del tejido, mientras que en el hueso trabecular esta unidad se moviliza a través de la superficie formando un surco. En ambas situaciones los componentes celulares de la BMU mantienen una relación espacial y temporal bien organizada. Los osteoclastos se adhieren al hueso y lo reabsorben por acidificación y digestión proteolítica. A medida que la BMU avanza, los osteoclastos dejan de reabsorber hueso y los osteoblastos se movilizan para cubrir el área excavada y comenzar el proceso de formación ósea con la secreción de osteoide mineralizado. En sujetos adultos sanos se generan entre 3 a 4 millones de BMU por año y casi 1 millón de ellas actúa en cada momento.

Durante la remodelación, la actuación secuencial de los osteoclastos y los

osteoblastos en la superficie ósea, depende de factores locales tales como citoquinas y factores del crecimiento, mediadores de la comunicación célula-célula y célula-matriz extracelular, que juegan un papel importante en el recambio del tejido óseo.

La reabsorción ósea por los osteoclastos consiste en una serie de procesos

que se inician con la diferenciación de los osteoclastos y su inserción en los tejidos calcificados. Los osteoclastos multinucleados derivan de células hematopoyéticas del linaje monocito-macrófago, que proceden, a su vez, de los tejidos hematopoyéticos, médula ósea y bazo, y llegan al hueso vía torrente circulatorio, donde proliferan y se diferencian en osteoclastos mediante mecanismos que implican interacciones celulares con células del estroma osteoblástico. Los osteoclastos poseen varias características específicas para la reabsorción ósea, entre las que se encuentran los rebordes ondulados y zonas despejadas en sus membranas. Las zonas despejadas le sirven para ponerse en contacto con la superficie del hueso. El área a reabsorber bajo el reborde es ácida, lo cual va a favorecer la disolución del mineral. Los protones son suministrados por la anhidrasa carbónica II de los osteoclastos. En el reborde de las membranas de los osteoclastos existe una ATPasa de tipo vacuolar. El transporte de protones hacia la zona de reabsorción está mediado por este tipo

Capítulo 12

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protónico de ATPasa. Los enzimas lisosómicos de los osteoclastos se segregan para degradar la matriz orgánica del hueso. El colágeno del tipo I del hueso desmineralizado se degrada en medio ácido por sistemas enzimáticos cisteina proteasas, como la catepsina K y metaloproteasas (Figura 1).

Figura 1. Osteoclasto unido a la superficie del hueso a destruir. Acidificación de la laguna

de reabsorción., (Basle et al., 1990, modificado) Las distintas etapas en la secuencia remodeladora de la BMU son las

siguientes: 1. Formación de una BMU después de una microlesión ósea 2. Reclutamiento de osteoclastos 3. Reabsorción 4. Reclutamiento de osteoblastos 5. Formación del osteoide 6. Mineralización 7. Maduración mineral 8. Reposo Los componentes celulares de la BMU mantienen una relación espacial y

temporal bien orquestada. La vida media de una BMU es de 6 a 9 meses, mucho más que la de las células ejecutoras, por tanto se requiere un continuo

Capítulo 12

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suministro de nuevos osteoclastos y nuevos osteoblastos desde sus progenitores respectivos.

Después de una microlesión ósea, se desencadena la producción de algunos

factores (PTH, IGF, IL1, IL6, PGE, calcitriol y TNF), y se forma la BMU. Las células de revestimiento se activan, cambian de forma y segregan el ligando RANK (RANKL) que permanece unido a la superficie celular. Los preosteoclastos poseen receptores RANK en su membrana. Cuando RANKL se une y activa a su receptor, las células se fusionan y se diferencian en osteoclastos multinucleados maduros que desarrollan un borde arrugado y reabsorben el hueso. Mientras tanto la osteoprotegerina (OPG), receptor relacionado con la familia de los TNFR, circula libremente y puede unirse al RANKL, previniendo así que active a su receptor específico RANK (receptor activador del NFκB). Los osteoclastos maduros reabsorben el hueso, mientras en la BMU se activan nuevos osteoclastos y continúan la reabsorción. En alguno de los puntos de la superficie la reabsorción dura unas dos semanas. Una vez finalizado el proceso de reabsorción, los osteoclastos sufren apoptosis, la cual se retrasa en casos de deficiencia estrógénica. Los preosteoblastos se diferencian en adipocitos u osteoblastos, para lo cual se necesita el factor de transcripción Cbfa1. Las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) inician la osteoblastogénesis desde sus protegitores estimulando la transcripción del gen que codifica un factor específico de osteoblastos Cbfa1 (core binding factor 1). Este factor, a su vez, activa la expresión de osteopontina, sialoproteína ósea, colágeno del tipo I y osteocalcina. Los osteoblastos son atraídos por factores del crecimiento derivados del hueso y quizás por los residuos de los osteoclastos autodestruídos. Los osteoblastos secretores activos fabrican capas de osteoide y así van rellenando lentamente la cavidad ósea producida por los osteoclastos. También estas células segregan osteopontina, osteocalcina y otras proteínas. Cuando el osteoide posee unas 6 micras de grosor comienza la mineralización. Este proceso está también regulado por los osteoblastos. Durante meses después de que la cavidad fuera rellenada con hueso nuevo, los cristales del mineral se van empaquetando cada vez más estrechamente con lo cual se incrementa la densidad del hueso. Los osteoblastos, una vez finalizada la misión de rellenar las cavidades con hueso nuevo, se convierten en células de revestimiento las cuales participan minuto a minuto en la liberación del calcio de los huesos. Algunos osteoblastos quedan retenidos en el hueso y se convierten en osteocitos que se conectan entre ellos emitiendo largas protuberancias que les sirven para detectar microalteraciones óseas.

En la morfogénesis y la remodelación del hueso, la molécula del ligando

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de la osteoprotegerina (OPGL) es un factor clave para estimular la diferenciación y actividad de osteoclastos y osteoblastos y es esencial para la remodelación ósea y la movilización del calcio de los huesos. La inactivación del gen opgl en ratón ha llevado a un completo bloqueo del desarrollo de los osteoclastos produciendo una osteopetrosis severa. El OPGL ejerce su efecto sobre los osteoclastos por unión con el receptor RANK (receptor activador del NFκB) de la familia de los TNFR. La OPG es un receptor soluble que compite con RANK por el RANKL (Figura 2).

Figura 2. Regulación de la función de los osteoclastos. Los factores que estimulan se

muestran en rosa y los que inhiben se muestran en azul. Los efectos (+) y (-) de los estrógenos se muestran como E+ y E- (Vuori 1996 y Riggs 2000 modificado)

La BMP7 es miembro de la superfamilia del TGF-β. La unión de BMP a

su receptor en la superficie celular conduce a la activación de la quinasa del receptor, que fosforila a SMAD1/5/8. SMAD1, 5, u 8, con Smad4, forma un complejo que se trasloca al núcleo, donde se une a la secuencia DNA consenso para regular la transcripción de numerosos genes osteogénicos. Estudios genéticos en ratones y humanos han demostrado que BMP7 juega papeles positivos en la homeostasis postnatal del hueso, expansión de los osteoblastos, diferenciación y formación del hueso. Defectos en la señalización BMP-SMAD causa alteraciones en la formación del hueso, osteoporosis y además juega un papel importante en la tumorigénesis. Se ha comprobado que en muchos tejidos, la vía señalizadora BMP-SMAD tiene una actividad supresora de tumores y que BMP puede reprimir el crecimiento tumoral. Estos hallazgos sugieren que la vía BMP-SMAD puede ser un objetivo potencial, no solo para la terapia de

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la osteoporosis sino también para la del cáncer. 4. Cambios de la masa ósea dependientes del envejecimiento En la infancia el metabolismo del calcio se encuentra influenciado por el

crecimiento. El contenido de calcio aumenta desde el 0,1 - 0,2% del peso corporal de las etapas fetales más tempranas, hasta el 2% del peso del adulto. En términos absolutos esto representa una subida desde 25 g en el momento del nacimiento, hasta 1.300 g en la madurez. Se considera que desde la concepción hasta el cierre epifisario se verifica un incremento progresivo de la masa ósea cortical y trabecular que constituye el 90% del peso de la masa ósea total. A este período de crecimiento le sigue el período de consolidación, de 5 a 10 años, durante el cual la superficie trabecular aumenta de grosor y disminuye gradualmente la porosidad cortical, alcanzándose en este momento el punto máximo de contenido mineral. A partir de este momento se inicia el proceso de pérdida ósea que depende de la edad.

En la mujer, el efecto de la edad sobre el metabolismo del calcio está

sujeto a cambios más dramáticos. Antes de la menopausia, las mujeres sanas experimentan la misma pérdida en su masa ósea que los hombres, pero en las proximidades de la menopausia el metabolismo del calcio cambia considerablemente, superponiendo a la pérdida propia de la edad, un recambio acelerado que va a originar una pérdida de hueso cortical del 2 al 3% por año. La disminución de hueso trabecular axial comienza un poco antes que la del hueso cortical. Se ha calculado que la pérdida del contenido mineral óseo debido a la menopausia es del 10 al 15% en el hueso cortical (medido en el radio) y del 15 al 20% en el hueso trabecular (medidos en la columna vertebral y en la cabeza del fémur) (Figuras 3, 4, 5).

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Figura 3. Secciones transversal y frontal de vértebras de pacientes normales y

osteoporóticos.

Figura 4. Detalle de un hueso con osteoporosis

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Figura 5. Modelo de cambio en la masa ósea con la edad en mujeres y hombres de la raza

blanca. Esta disminución de la masa ósea se produce por un balance positivo de la

reabsorción respecto a la formación del tejido óseo. Existen dos factores determinantes para que se desarrolle osteoporosis: el primero se relaciona con el máximo de masa ósea alcanzada en el período de consolidación, y el segundo con el tanto por ciento de pérdida a partir de este punto máximo. La mayor pérdida en la mujer se debe a que la insuficiencia estrogénica de la menopausia juega un papel mucho más importante que el propio envejecimiento.

Un factor que influye de manera decisiva en la osteoporosis senil es la falta

de ejercicio físico, bien por sedentarismo o por ingravidez. El ejercicio físico a cualquier nivel, moderado o intenso, incrementa la masa y la calidad óseas, pero su rendimiento disminuye con la edad por el deterioro de las células sensoras o efectoras. Los casos extremos de inmovilidad o de ingravidez hacen que se pierda hasta la mitad de la masa ósea en pocas semanas.

5. Factores genéticos La osteoporosis es un proceso complejo y multifactorial en el que se

encuentran involucrados muchos factores ambientales. El componente genético juega un papel importante en el desarrollo de esta enfermedad como se refleja por la transmisión hereditaria de muchos componentes de la resistencia ósea.

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Estudios de Gennari et al., sobre diferentes familias han observado que los factores genéticos juegan un papel importante en la regulación de la densidad mineral del hueso (BMD). En algunas condiciones aisladas la osteoporosis puede ser hereditaria por el patrón mendeliano, debido a mutaciones genéticas aisladas, pero en la mayoría de los casos la osteoporosis ha de ser considerada una enfermedad multifactorial poligénica en la cual los determinantes genéticos se encuentran modulados por factores hormonales, ambientales y nutricionales. Dado el importante papel que las hormonas esteroideas juegan en el desarrollo de las células óseas y en el mantenimiento de la arquitectura normal del hueso, se han investigado en los últimos años los polimorfimos genéticos en la superfamilia de receptores de hormonas esteroideas/tiroideas, tales como el receptor α de estrógenos (ERα) y el receptor de la vitamina D (VDR), y estos genes parece que son importantes candidatos. La contribución individual de estos polimorfismos genéticos a la patogénesis de la osteoporosis parece que está confirmada universalmente y uno de los desafíos importantes en el futuro ha de ser definir sus consecuencias funcionales a nivel molecular y como estos polimorfismos interaccionan entre sí y con el ambiente para causar el fenotipo osteoporótico. En el largo camino hacia el mejor conocimiento de las vías moleculares que conducen a las alteraciones en la resistencia, la identificación de los genes de susceptibilidad a la osteoporosis es uno los proyectos a conseguir a corto plazo. Como todos los estudios en humanos, los avances científicos en este área han de realizarse dentro de ambientes legales y éticos para ser aceptados por el gran público. Una aplicación prometedora de estos estudios genéticos en la osteoporosis viene de sus implicaciones farmacogenómicas y de proporcionar una mejor orientación para los agentes terapéuticos usados en el tratamiento de esta enfermedad o para identificar moléculas diana para nuevos agentes terapéuticos.

6. Clases de osteoporosis En una primera clasificación se pueden distinguir la osteoporosis primaria

y la osteoporosis secundaria. La osteoporosis primaria se caracteriza por carecer de causa externa, ya

sea médica, quirúrgica o terapéutica y se divide en: involucional, idiopática adulta e idiopática juvenil

A) Osteoporosis involucional Es el tipo más frecuente y representa el 95% de los casos. Afecta

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preferentemente a mujeres de raza blanca a partir de los sesenta años. Se distinguen dos tipos:

Tipo I. Osteoporosis postmenopáusica. Aparece en mujeres en los 7 a 10

años posteriores a la menopausia. Se caracteriza por una gran pérdida de hueso trabecular que causa frecuentes fracturas vertebrales globales.

Tipo II. Osteoporosis senil. Aparece en hombres y mujeres de más de 70

años. Se caracteriza por una pérdida proporcional de hueso trabecular y cortical y causa fracturas vertebrales y de cadera.

B) Osteoporosis idiopática del adulto. Es una forma poco frecuente de osteoporosis que afecta principalmente a

varones de edad media. Suele ser transitoria y evoluciona hacia la curación en pocos años, de manera espontánea. Estos pacientes presentan un recambio óseo acelerado con predominio de la destrucción sobre la formación

C) Osteoporosis juvenil idiopática. Es agresiva y también poco frecuente y puede presentarse en adolescentes

de ambos sexos. Se resuelve espontáneamente en meses o años y se debe a un recambio óseo acelerado.

La osteporosis secundaria se asocia con condiciones patológicas

reconocidas Además de la menopausia y el envejecimiento, otras causas pueden

ocasionar osteoporosis como la deficiencia nutricional en calcio y vitamina D, el tabaco, el alcoholismo y la inactividad. Se asocian también con la osteoporosis una serie de enfermedades endocrinas, gastrointestinales y de los tejidos conjuntivo y óseo, la terapia corticoidea y la anorexia nerviosa. Entre estas es interesante destacar la osteoporosis originada por exceso de glucocorticoides. La patogenia de la pérdida ósea por terapia corticoidea es multifuncional, pero se conocen dos mecanismos implicados en esta patogenia que juegan un importante papel. Los glucocorticoides actúan directamente sobre los osteoblastos impidiendo la síntesis de colágeno y con ello la formación de hueso nuevo. Inhiben también la formación de osteocalcina por los osteoblastos maduros, por un efecto sobre el promotor del gen de la osteocalcina. Los glucocorticoides inhiben directamente la absorción intestinal de calcio, lo cual va a ejercer un efecto secundario sobre la hormona paratiroidea (hiperparatioridismo) y una elevación de la reabsorción ósea por

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los osteoclastos. Los glucocorticoides estimulan directamente la excreción renal de calcio y disminuyen la producción de ciertos factores del crecimiento implicados en la mineralización del esqueleto (TGFβ, IGF1, etc.), y altera el eje hipotalámico, pituitario y gonadal, lo cual da lugar a un hipogonadismo funcional. Muchos estados de enfermedad en los que se prescribe la terapia corticoidea (artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal y cirrosis biliar primaria), se asocian con osteoporosis. Además de la terapia corticoidea otras situaciones conducen a la osteoporosis, tales como: hipertiroidismo, reemplazo inapropiadamente elevado de T4, vida sedentaria, afecciones gastrointestinales y alcoholismo.

El tipo de osteoporosis asociada a la anorexia nerviosa afecta al hueso

trabecular y al cortical. Esta es una enfermedad que afecta al 1% de las mujeres adolescentes, predispone a la osteoporosis por deficiencia hipotalámica que origina una elevada concentración en el cortisol, deficiencia de estrógenos y progesterona.

7. Diagnóstico La masa ósea, que se incrementa durante la infancia y la adolescencia y

alcanza su máximo en el tercer decenio de la vida, comienza a decrecer, tanto en el hombre como en la mujer, alrededor de la cuarentena, acelerándose la pérdida durante la menopausia femenina (Figura 5). Son tres los medios que dispone la clínica para efectuar el diagnóstico de la osteoporosis: medida de la masa ósea y del contenido mineral del hueso, medidas bioquímicas en sangre y orina y diagnóstico diferencial.

a) Medida de la masa ósea por densitometría y del contenido mineral

mediante absorción de rayos X de doble energía. Estos métodos permiten la detección precoz y son convenientes para prevenir la aparición de fracturas con un tratamiento adecuado. De acuerdo con estas medidas se puede clasificar la osteoporosis en tres grados: pérdida ósea discreta u osteopenia, entre el 10 y el 20%; osteoporosis moderada, entre el 20 y el 30%; y osteoporosis severa cuando el descenso en la masa ósea supera el 30% (Figura 6).

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Figura 6. Definición de la osteoporosis en base a la densidad ósea. Las medidas de la

densidad ósea definen como hueso normal el que tiene una densidad de 833 mg/cm2, osteopenia el que se encuentra entre 833 y 648 mg/cm2, osteoporosis con menos de 648 mg/cm2 y osteoporosis severa cuando existe una fractura.

b) Medidas bioquímicas de la remodelación ósea. Se reconocen como

marcadores de formación ósea la actividad fosfatasa alcalina sérica total o de su isoenzima óseo, la concentración sérica de osteocalcina y de los péptidos del colágeno. Entre los marcadores de reabsorción ósea el más utilizados es la evaluación en orina de las concentraciones de calcio e hidroxiprolina. Estos marcadores ayudan a predecir el grado rápido o lento de pérdida de hueso en la menopausia, así como permiten hacer un seguimiento del efecto del tratamiento sobre el equilibrio degradación/formación óseas.

c) Diagnóstico diferencial. Se utiliza para caracterizar la osteoporosis

frente a otras alteraciones de deficiencia ósea, como la osteomalacia, la osteitis fibrosa y la osteopenia difusa.

La osteomalacia se caracteriza por una deficiente mineralización del hueso

con un exceso de matriz orgánica. El único método de diagnóstico es el estudio histopatológico de una biopsia ósea. La causa es un exceso de vitamina D o de fósforo. La diferencia con la osteoporosis es que mientras que en ésta la relación entre matriz orgánica y la fase mineral es normal, en la osteomalacia sólo existe una deficiencia en el índice de mineralización. La osteitis fibrosa se caracteriza por fracturas, disminución de talla, quistes óseos y reabsorción superperióstica de los márgenes distales de las falanges. Está causada por hiperparatiroidismo primario y el diagnóstico se establece por excesos de

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calcio, fosfato y hormona paratiroidea en sangre. Un 75% de los pacientes que sufren esta enfermedad son mujeres mayores de 60 años. En la osteopenia difusa la pérdida ósea se debe a un aumento de la actividad osteoclástica producida por la liberación de factores locales a partir de células neoplásicas. El diagnóstico requiere una exploración física cuidadosa, inmunoelectroforesis en sangre y orina, detección de cadenas ligeras libres en orina (proteinuria de Bence Jones) y gammagrafía en casos dudosos. Esta alteración de deficiencia ósea se presenta en casos de mieloma, neoplasias linfoproliferativas y algunos tumores sólidos.

8. Tratamiento de la osteoporosis El objetivo principal en el tratamiento de la osteoporosis es la prevención

de la pérdida ósea para evitar el riesgo de fracturas debidas a la mayor fragilidad y a una menor resistencia óseas. Otros objetivos no menos importantes de dicha terapia son la recuperación de la masa ósea una vez perdida y aminorar el dolor y las molestias que puedan surgir de las fracturas óseas en pacientes con osteoporosis declarada.

Los fármacos que se utilizan en la prevención y tratamiento de la

osteoporosis se clasifican como antireabsortivos y anabólicos, perteneciendo la mayoría de ellos a la primera categoría (Tabla 1). El efecto predominante de los agentes antireabsortivos es prevenir la pérdida ósea, pero pueden también originar incrementos en la masa ósea como resultado del relleno del espacio remodelado o de una mineralización secundaria. Es cierto que la efectividad de estas drogas es mayor cuando se utilizan en la prevención, antes de que ocurra la pérdida y la disrupción de la microestructura ósea esponjosa. Por otra parte, parece ser que los agentes anabólicos que tienen la capacidad de incrementar significativamente la masa y de restaurar la arquitectura ósea, son más propios para pacientes con pérdida ósea avanzada.

Tabla 1. Agentes usados en la prevención y tratamiento de la osteoporosis

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Terapia de reemplazo hormonal (HTR) La deficiencia estrogénica postmenopausica produce un desequilibrio entre

los procesos de reabsorción y formación óseas, que conduce a una pérdida de la masa ósea. Albright et al., postularon en 1941, que la deficiencia estrogénica estaba implicada en el desarrollo de la osteoporosis. Hasta no hace mucho tiempo se consideraba que esta enfermedad era una consecuencia inevitable del envejecimiento y que no había tratamiento para ella. Hoy con el mayor conocimiento de la fisiología del hueso, se ha llegado a la conclusión que la emergencia de la osteoporosis, tanto en mujeres como en hombres, se debe a una serie de factores, entre los que hay que destacar:

1. la deficiencia de calcio y vitamina D, 2. la vida sedentaria, 3. la deficiencia hormonal, y 4. los genéticos. Es un hecho bien demostrado que la terapia de reemplazo hormonal

(estrógenos + gestágenos) (HRT) es la terapia más eficaz para la prevención de la pérdida ósea en mujeres durante y después de la menopausia. Para preservar la densidad ósea es recomendable que dicha terapia comience al inicio de la menopausia y se mantenga durante períodos de siete a diez años. Existe un rechazo muy extendido a la HRT debido a la reaparición de la hemorragia menstrual ocasionada por la administración secuencial de estrógeno y gestágeno. En mujeres con el útero intacto la administración de estrógenos puede incrementar el riesgo de hiperplasia y cáncer de endometrio, lo cual se evita con la adición simultánea del gestágeno. En una revisión de Manson se comentan las distintas opiniones controvertidas que rodean a esta terapia.

El estrógeno unido al progestágeno se recomienda como tratamiento de

rutina para prevenir la pérdida de la masa ósea y las fracturas osteoporóticas. El resultado de la HRT, claramente favorable en lo que se refiere a la osteoporosis y a afecciones cardiovasculares, frente a su menor asociación con el cáncer uterino o mamario, ha hecho que la opinión general vaya gradualmente encaminándose hacia su uso. Otro de estos efectos beneficiosos de la terapia estrogénica se manifiesta en la prevención de la hipercolesterolemia.

Hoy no se duda que la deficiencia de estrógeno es la que causa las dos

formas de osteoporosis, temprana y tardía, en mujeres postmenopausicas y contribuye a la osteoporosis de los hombres ancianos. Esta deficiencia se asocia

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con una mayor reabsorción ósea causada por un mayor número de osteoclastos activos, cuya función está regulada por citoquinas. Las siguientes citoquinas: IL-1, IL-6, TNFα, PGE2 y M-CSF, aceleran el ritmo de reabsorción ósea incrementando el número de precursores de osteoclastos en la médula ósea. El estrógeno ejerce una influencia negativa sobre estas citoquinas. Por otro lado el estrógeno estimula la expresión del TGFβ un inhibidor de la reabsorción ósea, que actúa directamente sobre los osteoclastos disminuyendo su actividad e incrementando su apoptosis. Ha sido ya identificado el efector paracrino de la diferenciación de los osteoclastos, derivado de los osteoblastos, el ligando RANKL, que se expresa en células del estroma del linaje de los osteoblastos. El contacto entre estas células osteoblásticas y las células del linaje osteoclástico permite a RANKL unirse a su receptor fisiológico, RANK, lo cual ejerce un potente estímulo sobre la función de los osteoclastos siempre que exista un determinado nivel de M-CSF. Las células del estroma del linaje osteoblástico segregan también el receptor soluble, la osteoprotegerina (OPG) que neutraliza a RANKL. Parte del efecto del estrógeno sobre este sistema señalizador debe ser indirecto, actuando a través de intermediarios sensibles a estrógenos. Ciertas citoquinas IL-1 y TNFα elevan la concentración de RANKL, OPG y M-CSF, mientras que la PGE2 eleva la del ligando RANKL y disminuye la del receptor OPG. No se ha demostrado aún que el estrógeno regule a RANKL directamente. Cenci et al han observado la capacidad que posee el estrógeno para obligar a las células T a suprimir su producción de TNFα. Éste podría ser un mecanismo clave mediante el cual el estrógeno actuaría previniendo la reabsorción ósea por los osteoclastos. La osteoclastogénesis se encuentra estimulada por M-CSF y por RANKL.

En la Figura 2 se muestran la intervención de una serie de citoquinas en la

regulación de la función de los osteoclastos y la intervención positiva o negativa del estrógeno en la modulación de dicha regulación.

Falahate-Nini et al han observado que el estrógeno es también la hormona

esteroidea dominante en la regulación de la reabsorción ósea en el envejecimiento del hombre. Ambos estrógeno y testosterona juegan papeles importantes en el mantenimiento de la formación ósea, pero es la deficiencia de estrógeno la causa principal de la pérdida de hueso en la vejez en ambos sexos y es el estrógeno la hormona clave para el mantenimiento de la masa ósea. El estrógeno se requiere para alcanzar el pico máximo de masa ósea en ambos sexos, aunque la acción adicional de testosterona, al estimular la aposición periosteal, es la que hace que los huesos del esqueleto adulto masculino

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alcancen mayor tamaño. A lo largo de los años la mujer sufre dos fases de pérdida ósea, una rápida del hueso trabecular que se inicia con la menopausia y prosigue 4 a 8 años después, y otra más lenta que continúa indefinidamente. La fase acelerada es consecuencia de la perdida de los efectos de los estrógenos sobre el recambio óseo, una acción mediada por el receptor de estrógenos sobre osteoclastos y osteoblastos. En la fase lenta, la velocidad de pérdida del hueso trabecular disminuye, pero la pérdida de hueso cortical se mantiene e incluso incrementa. Esta fase lenta está mediada por hiperparatiroidismo secundario que resulta de la perdida de la acción de estrógeno sobre el metabolismo del calcio extraesquelético. El desequilibrio de la función de los osteoblastos debido a la deficiencia de estrógeno, envejecimiento o ambos, contribuye también a la fase lenta de pérdida ósea. Aunque tanto la biodisponibilidad de estrógeno como de testosterona, declinan en hombre senescente, es la del estrógeno la responsable principal de su pérdida ósea. Así que, ambos esteroides son importantes para el desarrollo del pico de masa ósea, pero la deficiencia de estrógeno es el determinante más importante de la pérdida de masa ósea en el envejecimiento en ambos sexos.

Moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERM) Los SERM actúan como agonistas o antagonistas de los estrógenos. Los

mecanismos moleculares que tratan de explicar la acción moduladora selectiva de estos compuestos implican todos los pasos de la cascada fisiológica que conduce a la expresión de los genes inducidos por la unión del 17β-estradiol a su receptor. Dentro de estos moduladores selectivos el raloxifeno es una nueva alternativa para el tratamiento de la osteoporosis en la etapa postmenopausica. El raloxifeno es un benzotiofeno que inhibe competitivamente la acción estrogénica frente al endometrio y el tejido mamario y actúa como agonista sobre el metabolismo lipídico y óseo. En los inicios de la menopausia el raloxifeno previene la pérdida de la masa ósea en todo el esqueleto, reduce los marcadores del recambio óseo a sus valores premenopáusicos y reduce la concentración de colesterol en suero y su fracción LDL sin estimular el endometrio. Este compuesto permite tratamientos más prolongados que la HRT con ausencia de efectos sobre el aparato reproductor. El raloxifeno no altera la función cognitiva en la postmenopausia e incluso retrasa el deterioro de la memoria verbal y la atención. En raras ocasiones se ha detectado un incremento en tromboembolia venosa similar a lo que ocurre con HRT. En resumen, el raloxifeno estaría indicado para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis en mujeres postmenopáusicas con más de 2 años de amenorrea y en lo posible sin síntomas vasomotores, dado que el raloxifeno los puede incrementar. Especialmente indicada en pacientes con contraindicación de uso

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de estrógenos. Como beneficio extra, el raloxifeno se asocia con una reducción del riesgo de cáncer de mama, situación que está siendo estudiada intensamente.

Otro esteroide sintético, la tibolona, muestra simultáneamente actividad

estrogénica, androgénica y progestágena, evita la proliferación del endometrio y con ello el riesgo de cáncer. Este esteroide se ha propuesto para el tratamiento de los síntomas climatéricos y su eficacia se ha comparado con la de la HRT convencional, oral o transdérmica. Así, se administró tibolona a 140 mujeres posmenopáusicas durante un período de 2 años, en dosis orales de 2,5 mg/día frente a la de estrógeno oral (2 mg/día) o transdérmica (parche de 50 μg), adicionadas estas dos últimas con 10 mg/día de dihidroprogesterona durante 14 días del ciclo. La densitometría ósea de la porción lumbar de la columna vertebral y de la cabeza del fémur se llevó a cabo por medida de la absorción de rayos X de doble energía a los 6, 12, 18 y 24 meses del tratamiento. Se observó que los tres tratamientos ejercían un efecto preventivo de la pérdida ósea cuando se compararon con controles no tratados. Este estudio demuestra que la tibolona puede ser considerada como una terapia alternativa, frente a la estrogénica convencional, en el tratamiento de la osteoporosis menopáusica.

Bisfosfonatos Los bisfosfonatos son una clase de fármacos que poseen la capacidad de

detener la degradación ósea menopausica o senil. Son potentes inhibidores de la reabsorción ósea, reduciendo el reclutamiento y activación de los osteoclastos e incrementando su apoptosis. Estos compuestos se caracterizan por poseer dos enlaces carbono-fósforo (P-C-P), localizados en el mismo carbono y por poseer actividad sobre la mineralización del esqueleto. Esta estructura permite un gran número de variaciones, especialmente en las dos cadenas laterales sobre el carbono. La figura 7 muestra la estructura de los dos bisfosfonatos más frecuentemente utilizados, el etidronato y el alendronato.

Los bisfosfonatos son fármacos diseñados sobre la base del pirofosfato. El

pirofosfato se observó que prevenía la calcificación de los tejidos debido a que la fosfatasa alcalina hidrolizaba la molécula e impedía su acceso al colágeno del hueso. Al sustituir un oxígeno del pirofosfato por un carbono se consiguió un compuesto resistente a la acción de la fosfatasa alcalina que podía insertarse en el hueso. El primer bisfosfonato utilizado fue el etidronato (Figura 7). La posterior modificación de las cadenas laterales ha permitido lograr una serie de compuestos con mayor capacidad de inhibición de la reabsorción ósea.

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Figura 7. Formulas estructurales de los ácidos pirofosfórico, etidrónico y alendrónico. Los bisfosfonatos, como análogos no hidrolizables del pirofosfato, se unen

a las moléculas de hidroxiapatito del hueso merced a su estructura molecular e inhiben la degradación del tejido óseo. Los aminobisfosfonatos están entre los agentes más potentes de este grupo. La potencia antireabsortiva de estos agentes es variable como resultado de sus diferentes mecanismos de acción celular. Los bisfosfonatos pueden también inhibir la mineralización, propiedad ésta que varía según el derivado y no se relaciona con la propiedad antireabsortiva. El tejido óseo presenta una elevada afinidad por estos compuestos y se ha observado que después de la administración de una dosis oral, una gran parte de la fracción absorbida (20 - 60%) se incorpora al esqueleto y el resto se excreta por orina. La vida media de estos compuestos en el esqueleto es larga y a ello se debe su acción prolongada sobre el hueso. La absorción gastrointestinal de los bisfosfonatos es baja cuando se administran por vía oral y se reduce aún más en presencia de alimento, suplementos de calcio, leche o jugos de frutas. Los pacientes deben tomar estos compuestos dos o más horas antes de la comida.

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Los bisfosfonatos más utilizados para el tratamiento de la osteoporosis, son los ácidos etidrónico y alendrónico. El etidronato se administra en régimen cíclico intermitente: dosis de 400 mg/día durante dos semanas, seguido por dosis de calcio durante 76 días. El alendronato posee una potencia antireabsortiva mucho más elevada que etidronato. Se administra de manera continua en dosis de 10 mg/día, no incluyendo el calcio en este tratamiento y recomendándose en pacientes con un contenido bajo de calcio en sus dietas. Ambos compuestos, administrados de la forma anteriormente mencionada, evitan la pérdida de hueso en la columna vertebral de mujeres con osteoporosis menopáusica. Se ha observado que después de 3 años de tratamiento los bisfosfonatos son capaces de reponer la masa ósea espinal perdida. En vista de su prolongada vida media en el esqueleto, no se recomienda que sean administrados indefinidamente.

Los bisfosfonatos suelen ser bien tolerados, aunque algunos, como los

aminobisfosfonatos pueden producir efectos adversos gastrointestinales, y en algunos casos de administración de alendronato se ha detectado una esofagitis erosiva. Por tanto, estos compuestos están contraindicados en pacientes con afecciones esofágicas y deben ser usados con precaución en casos de dispepsia o disfagia. Deben ingerirse con un mínimo de 200 ml de agua al levantarse por la mañana y se aconseja a los pacientes no acostarse en los 30 minutos siguientes a la ingestión.

El risendronato es el tercer fármaco utilizado del grupo de los

bisfosfonatos. Es un agente bien tolerado, incluso en pacientes con alteraciones gastrointestinales, que no muestra efectos secundarios cuando se le comparó con un placebo. Es el único fármaco que ha mostrado efectos positivos frente a la osteoporosis asociada a los glucocorticoides.

Potencia antireabsortiva de los bisfosfonatos

Etidronato + calcio (Didronel PMO) Clodronato Tiludronato Pamidronato Alendronato (Fosamax) Risedronato (Actonel) Ibandronato

1 10 100 1000 5000 10000 50000

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Estatinas Las estatinas son inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A

(HMG-CoA) reductasa, enzima de la vía del mevalonato. El mevalonato es, a su vez, un inhibidor fisiológico de la expresión del gen de la proteína morfogenética ósea (BPU) y precursor del colesterol. La BMP-2 es un factor de crecimiento óseo que estimula la actividad de los osteoblastos. Mundy et al observaron un incremento en la expresión de la proteína morfogenética ósea (BMP) en células expuestas a estatinas. Garret y Mundy demostraron que las estatinas actúan por una doble vía, bloqueando la acción de los osteoclastos y activando los osteoblastos. La misma droga ejerce ambos efectos.

La lovastatina, estatina derivadade una cepa de Aspergillus terreus

(Mevacor, Merck USA) y la simvastatina (Zocor) bloquean la HMG CoA reductasa y con ello la producción de lípidos que atacan a proteínas señalizadoras implicadas en la síntesis de la BMP-2. El efecto de estos fármacos sobre la densidad mineral ósea y el riesgo de fracturas, demuestra la existencia de una dirección nueva y prometedora que ha de permitir éxitos futuros en la terapia de la osteoporosis.

Calcio El equilibrio del calcio en el organismo es función de los flujos integrados

a través del hueso, intestino y riñón que cambian continuamente y están afectados por muchos factores, tales como vitaminas, oligoelementos y hormonas. Las hormonas que afectan el metabolismo del calcio en el hueso se pueden dividir en: hormonas reguladoras del calcio, y hormonas que influyen sobre el calcio. Entre las primeras cabe citar la hormona paratiroidea, la calcitonina y los metabolitos de la vitamina D, y entre las segundas la hormona tiroidea, la hormona del crecimiento y los esteroides adrenales y gonadales.

Está demostrado que el suplemento de calcio a la dieta ejerce efectos

beneficiosos sobre la masa ósea, tanto en niños como en adultos. Estos beneficios se observan en el hueso cortical apendicular y son menos evidentes en hueso espinal lumbar, donde los efectos parece que son transitorios. Los suplementos de calcio en la dieta son menos efectivos en los años cercanos y posteriores a la menopausia, que es cuando se hace más patente la carencia de estrógenos y pueden ser beneficiosos en hombres y mujeres de más edad. Esto se hace patente en casos de deficiencia de calcio en la senectud que van acompañados de hipertensión, ya que en estos casos existe un incremento en la excreción urinaria de calcio.

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No se ha establecido aún con claridad la influencia de la vitamina D en respuesta al calcio ingerido, pero se sabe que el genotipo que posee el receptor de vitamina D (VDR), puede determinar los efectos de los suplementos del calcio sobre el esqueleto. A este respecto se ha demostrado la efectividad del calcio administrado en forma de carbonato, gluconato y lactato, aunque no existe hasta el momento una evidencia definitiva de que el calcio por sí sólo suponga una terapia que reduzca el riesgo de fracturas vertebrales o no vertebrales. Sin embargo, el suplemento de calcio a la dieta unido a otros tratamientos puede considerarse efectivo en pacientes con ingesta baja en calcio. En lo posible ha de aconsejarse una ingesta en calcio entre 1 - 1,5 g/día.

Casi todo el calcio y fosfato residen en el organismo en forma insoluble en

la fase mineral del hueso, la cual es la determinante principal de las propiedades mecánicas del esqueleto. Para la mineralización normal del hueso es necesaria una adecuada disponibilidad de calcio y fosfato en el fluido extracelular. En casos en que esto no ocurra, la disminución crónica de ambos iones lleva inevitablemente a la pérdida del contenido mineral del hueso y a un incremento en el riesgo de fracturas.

El control hormonal de la absorción intestinal del calcio integrante de la

dieta, es similar a la del fosfato y ambos se liberan durante la destrucción ósea. Como la solubilidad del fosfato tricálcico es aproximadamente la mitad de la máxima en fluidos extracelulares, extremos en la concentración de un ión puede afectar la concentración del otro por efectos fisicoquímicos recíprocos. A pesar de ello existen muchas diferencias entre calcio y fosfato respecto a su distribución extra e intracelular, la precisión con la que se regulan sus concentraciones extracelulares, etc.

La concentración de calcio en el fluido extracelular, es un factor

importante, no sólo en la formación del hueso, sino también en la coagulación sanguínea y en la función muscular. El calcio presenta también un considerable interés como segundo mensajero para los reguladores extracelulares, para los mecanismos de señalización extracelular y como coordinador de la actividad metabólica celular. De esta manera, los flujos de este elemento a través de la membrana y la concentración citosólica del calcio en respuesta a la despolarización de la membrana o al acoplamiento ligando-receptor, modulan la actividad de una serie de sistemas reguladores intracelulares críticos, mediante interacciones con la calmodulina, la proteina quinasa C, la fosfolipasa C, proteína fosfatasas y otros efectores celulares. Estas acciones directas del calcio intracelular implican interrelaciones complejas con los fenómenos que

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dependen del calcio como el AMP cíclico, los fosfatidilinositoles, el ácido araquidónico, etc.

La ingestión diaria de calcio oscila entre los 300 mg a 1,5g. El calcio se

transporta a través del epitelio intestinal, como ión libre que debe ser liberado de complejos con otros constituyentes de la dieta, antes de la absorción. Los ácidos del estómago facilitan esta disociación. La menor solubilidad del calcio a pH neutro o alcalino puede contribuir a la menor eficiencia de la absorción por segmentos intestinales alejados del duodeno. La biodisponibilidad del calcio puede modificarse por diversos componentes de la dieta. Las dietas ricas en fibra pueden desequilibrar la absorción del calcio, ya que poseen compuestos tales como los ácidos urónicos y fítico (inositohexafosfórico) y la celulosa, que poseen capacidad de unirse al calcio. El oxalacetato, presente en vegetales de hoja verdes, se une también al calcio.

Calcitonina La calcitonina es una hormona de 32-aminoácidos que inhibe la

reabsorción osteoclástica, y por lo tanto la destrucción ósea. Su administración para el tratamiento de la osteoporosis incluye las calcitoninas porcinas y las sintéticas humanas, de salmón y de anguila. La administración de calcitonina de salmón, por vía nasal, ha hecho posible contar con un agente de potencia comparable a la de los estrógenos frente a los marcadores del recambio y del metabolism óseo y en suprimir la velocidad de destrucción del hueso. La calcitonina de salmón debe ser considerada como una terapia alternativa a la de HRT en todos los pacientes, ya que el efecto máximo de este fármaco sobre el recambio óseo se observa a las ocho semanas de iniciar el tratamiento. La inocuidad de la calcitonina se ha demostrado clínicamente desde los años setenta, cuando se aprobó la primera formulación inyectable en diversos países europeos. La administración por vía nasal ofrece la ventaja de la facilidad de su administración y dosificación. En pacientes con fracturas vertebrales la acción analgésica de la calcitonina proporciona un beneficio terapéutico adicional. Todo esto unido a que no se han descrito interacciones con otros fármacos, justifica la conclusión que la calcitonina, proporciona una terapia apropiada y efectiva para el tratamiento de la osteoporosis en cualquiera de sus formas.

Ranelato de estroncio El ranelato de estroncio está compuesto por ácido ranélico unido a dos

átomos de estroncio estable no radiactivo. Se ha observado que este agente cuando se adiciona a cultivos celulares enriquecidos en osteoblastos, eleva la síntesis del colágeno y de otras proteínas componentes de la matriz ósea. Estos

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efectos han sido confirmados comprobar su efecto activador sobre la replicación de las células progenitoras de los osteoblastos. Estos datos proporcionan una importante evidencia de la acción del ranelato de estroncio como inductor de la formación de hueso. El efecto inhibidor de este compuesto sobre la reabsorción ósea ha hecho que se considere un agente antireabsortivo con acción similar a la de la calcitonina.

Fluoruro sódico El fluoruro sódico es una sustancia, clasificada entre los anabolizantes

óseos, que estimula la formación del hueso y produce incrementos en la masa ósea mayores que los observados con agentes antireabsortivos. Se ha usado en el tratamiento de la osteoporosis desde 1966, ya que se observó que las comunidades con niveles elevados de FNa en el agua de bebida, presentaban elevadas incidencias de deformaciones óseas debidas a incremento en la formación de hueso. A pesar de haberse detectado incrementos de un 5% anual en la densidad mineral del hueso de la columna vertebral, existe aún controversia acerca de los efectos de este agente químico sobre la resistencia ósea y el riesgo de fracturas. Utilizando dosis bajas de este compuesto (50 mg/día), se ha observado una reducción significativa en las fracturas de vértebras en mujeres con osteoporosis menopáusica. Sin embargo, otros estudios con dosis más elevadas no han observado ningún beneficio y parece ser que la administración continuada de fluoruro sódico produce a debilitamiento óseo e incremento del riesgo de fracturas en sitios no vertebrales. Esta terapia presenta una serie de complicaciones, debidas por una parte a la acción del fluoruro sobre la mucosa gástrica (dolor, nauseas, etc.) y por otra, por ejercer un efecto colateral en tratamientos a largo plazo, que da lugar al "síndrome de dolor en las extremidades" debido a formación abundante de hueso poco mineralizado. El fluoruro sódico actúa incrementando el reclutamiento de los osteoblastos y con ello la formación de la matriz extracelular, sin efectos sobre la reabsorción ósea. Por todo ello, y a pesar de sus efectos claramente anabolizantes, el futuro de este tratamiento permanece aún en debate.

Esteroides anabólicos Estos compuestos, que incluyen la nandrolona, el estanozolol y la

testosterona, actúan predominantemente impidiendo la reabsorción ósea. La testosterona es útil en el tratamiento de la osteoporosis en hombres con deficiencias gonadales. El uso de estos agentes en mujeres se encuentra limitado por los efectos adversos que incluyen virilización, retención de sodio y disfunción hepática.

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Hormona paratiroidea (PTH) Esta hormona es la reguladora inmediata de la concentración de calcio en

el fluido extracelular. Su producción se estimula en casos de disminución del calcio sanguíneo. Sus acciones principales son incrementar la liberación de calcio del hueso y reducir el aclaramiento de calcio renal. Otra acción secundaria es la de aumentar la absorción intestinal del calcio de la dieta mediante la estimulación del la actividad 1-hidroxilasa renal, enzima responsable de la producción del metabolito de la vitamina D [1, 25 (OH)2-vitamina D3 o calcitriol]. La secreción de la hormona paratifoidea se inhibe en casos de elevación del calcio plasmático (Figura 8).

Figura 8. La hormona patatiroidea actúa directamente sobre receptores en el hueso y en

el riñón e indirectamente, mediante la vitamina D, sobre el intestino, para elevar la concentra-ción de calcio en el fluido extracelular, la cual ejerce un control negativo sobre la glándula.

Durante años se ha considerado la hormona paratiroidea como un agente

catabólico para el esqueleto. Sin embargo, ya en 1929 Bauer y Albritch observaron que el extracto peptídico de esta glándula podía ejercer un efecto anabolizante sobre el hueso. Se ha observado que a dosis pequeñas la hormona paratiroidea estimula la actividad de la adenilato ciclasa. Se considera que esta hormona podría clasificarse entre los agentes terapéuticos prometedores para el tratamiento de la osteoporosis, por su acción estimuladora de los osteoblastos y con ello de la formación del hueso. Se ha demostrado que la administración

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intermitente de dosis de extracto paratiroideo ejercen un efecto anabólico sobre animales sanos y osteopénicos. En el riñón, la hormona paratiroidea estimula la hidroxilación de la vitamina D. Este metabolito dihidroxilado actúa facilitando la absorción intestinal de calcio y fósforo, elementos necesarios para la mineralización del hueso. Ambas sustancias, la hormona paratiroidea y el metabolito dihidroxilado de la vitamina D, pertenecen al grupo más importante de reguladores del recambio óseo. Regulan, por un lado, la diferenciación de los osteoclastos a partir de sus precursores hematopoyéticos mononucleares y por otro las funciones y actividad osteoblásticas.

La hormona paratiroidea, cuando se administra intermitentemente eleva la

formación del hueso y con ello la masa y la densidad ósea. Se desconoce el mecanismo exacto de este proceso, pero se sabe que esta hormona influye sobre el efecto favorecedor de la vitamina D sobre la absorción intestinal del calcio y eleva la diferenciación de las células osteoprogenitoras. La acción de esta hormona se transduce al interior de la célula mediante su unión a péptidos receptores relacionados con la hormona que contienen 7 dominios transmembrana, acoplados a proteinas G. La ocupación del receptor por la hormona paratiroidea origina la activación de la vía de la adenilato ciclasa y la fosfolipasa C, que originan la acumulación de múltiples transductores de señales como el AMP cíclico, los inositol fosfatos, un incremento transitorio en la concentración de calcio intracelular y la activación de la proteína quinasa C.

Por otro lado, como reguladora crucial del calcio sanguíneo, la hormona

paratiroidea activa la reabsorción ósea, la reabsorción tubular renal y la activación de la vitamina D. El calcio, a su vez, actúa sobre las células de la glándula paratifoidea a través de un sensor recientemente caracterizado, disminuyendo la síntesis y secreción de la hormona. Estos mecanismos de regulación llevan a considerar que la misión principal de esta hormona es el mantenimiento de la concentración de calcio en sangre y para ello puede utilizar el calcio del hueso. No sorprende, por tanto, que en estados de hiperparatiroidismo, el hueso se debilite por exceso de reabsorción de su fase mineral. Con esta perspectiva, la observación de que la administración intermitente de hormona paratiroidea conduzca al incremento de la masa ósea tiene, al parecer, poco sentido. Para resolver esta paradoja se requiere comprender mejor la complejidad de la regulación de las células implicadas en el recambio óseo.

Una parte de esta resolución se deduce de la observación de que los

precursores de los osteoblastos y osteoclastos segregan una proteína relacionada

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con la hormona paratiroidea, prPTH, un factor paracrino que en el hueso puede tener papeles no relacionados con la homeostasis del calcio. A pesar de las misiones fisiológicas diferentes de la hormona paratiroidea y la prPTH, muchas de las acciones de ambas están mediadas por un receptor común que interacciona con las regiones aminoterminales de cada ligando. Este receptor se encuentra en osteoblastos y osteoclastos.

En un estudio sobre la PTH en 1637 mujeres post menopáusicas se ha

demostrado que esta hormona reduce las fracturas. La incidencia de fracturas vertebrales en estas mujeres disminuyó en un 65% y en las no vertebrales en un 50%.

9. Vitamina D y sus efectos sobre la calcificación ósea. La vitamina D se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza y se

fotosintetiza en la mayor parte de tejidos animales y vegetales expuestos a la luz del sol. Su misión principal en animales vertebrados es elevar la absorción del calcio y fosfatos para la mineralización del esqueleto. En la infancia, en casos de deficiencia de vitamina D, el cartílago no se calcifica y se produce raquitismo. En el estado adulto la matriz ósea recién formada por los osteoblastos, el osteoide, no se mineraliza convenientemente y ocasiona una patología denominada osteomalacia.

Esta vitamina se forma en la piel después de la exposición a rediaciones

ultravioleta (UV) y también se absorbe por la dieta. Se hidroxila en el hígado a 25, hidroxi vitamina D y se hidroxila otra vez en riñón a 25, dihidroxi vitamina D o calcitriol, que es la vitamina D en su forma activa. En los años pasados se ha encontrado que una serie de tejidos contienen receptores para este metabolito activo de la vitamina D, el calcitriol (VDR), y responden a esta hormona con un cambio en sus funciones. Los tejidos clásicos, hueso, riñón e intestino, responsables del mantenimiento de la homeostasis mineral ósea en respuesta a la vitamina D, son ahora parte de una lista que incluye varias docenas de tejidos entre los que se incluye elementos del sistema hematopoyético e inmune, cardiaco, esquelético, muscular, neural, hepático y endotelial. La forma más activa de la vitamina D en cuanto a estimular el transporte intestinal de calcio, movilizar el calcio del hueso, elevar el calcio extracelular y remediar el raquitismo, es el calcitriol. Esta molécula tiene tres grupos hidroxilo dos de los cuales se encuentran en el anillo A en lados opuestos al plano del anillo, en posición 1 y 3 y el tercero en posición 25 en la cadena lateral (Figura 8). Los OH en posición 1 y 25 son críticos para unirse al receptor VDR.

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Figura 9. Metabolismo de la vitamina D en el organismo Está bien establecido el uso de la vitamina D y sus metabolitos para el

tratamiento de deficiencias óseas. Sin embargo, los nuevos conocimientos del papel del calcitriol en la diferenciación de los osteoblastos y los osteoclastos ofrecen una explicación razonable para el uso de estas sustancias en el tratamiento de la osteoporosis. Los osteoblastos contienen receptores VDR y los osteoclastos no. Los osteoblastos son los responsables de la formación ósea, pero el papel de la vitamina D en este proceso no está claro. A pesar de que los osteoclastos no tienen VDR y no responden al calcitriol directamente, el calcitriol es un regulador importante de su diferenciación, ya que promueve su formación a partir de precursores hematopoyéticos que tienen VDR. Por tanto, el calcitriol es probable que juegue un importante papel en la remodelación ósea, no sólo por su capacidad para suministrar las cantidades adecuadas de calcio y fosfato para la mineralización, sino también por influir en la secreción de citoquinas por células linfoides que van a activar la diferenciación de las células óseas.

Otro tema importante es que la acción del calcitriol está mediada, en parte,

por las vías de transducción de señales a través de la membrana, especialmente

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aquellas que implican al calcio extracelular. Esta hormona está involucrada en la activación de canales de calcio por mecanismos que incluyen el metabolismo de fosfolípidos y la proteína quinasa C.

10. Osteoporosis y cáncer Es un hecho indiscutible que la incidencia de osteoporosis y cáncer

incrementan con el envejecimiento, y también que estos dos diagnósticos son a menudo hechos en el mismo individuo. Tanto el envejecimiento como el hipogonadismo asociado a la edad, unido a las terapias del cáncer, conducen a la pérdida de masa ósea y al riego mayor se fragilidad ósea y fracturas. La edad avanzada lleva consigo una asociación con la elevada incidencia del cáncer. Por tanto, el cáncer y sus terapias pueden predisponer al individuo a la osteoporosis y su morbilidad y mortalidad.

La relación entre la osteoporosis y el cáncer se puede considerar en un

doble sentido. Algunas neoplasias malignas se encuentran entre las causas de osteoporosis secundaria y, además, se ha descrito un aumento en la mortalidad por cáncer en pacientes con osteoporosis. Por otra parte, la detección de secuelas tardías entre los supervivientes de distintos procesos oncológicos, ha ido aumentando en los últimos años al mejorar los esquemas terapéuticos y conseguirse mayores y más prolongadas tasas de remisión tumoral. Entre las secuelas que pueden aparecer tras la curación de un tumor cabe mencionar la osteoporosis. Por lo tanto, existen razones fundadas para pensar en la intervención de los procesos cancerosos en el desarrollo de la osteoporosis. Algunas guardan relación con el propio tumor y otras con el tratamiento antitumoral.

Al margen de la inmovilidad y la malnutrición que con frecuencia

presentan los enfermos de cáncer, y que colaborar al desarrollo de osteoporosis, algunas neoplasias hematológicas (mieloma, leucemia, mastocitosis sistémica), pueden causar osteoporosis por mecanismos específicos. Desde hace algunos años se sabe que los tumores inducen la liberación de algunas citoquinas que intervienen en el proceso de remodelación ósea modulando el sistema RANK/RANKL/OPG. El TNFα, IL-1, IL6 y la linfotoxina estimulan el proceso de resorción ósea y serían los responsables de la pérdida de hueso local, e incluso generalizada, que puede apreciarse en algunos tumores.

El caso más típico es el del mieloma. Aunque en esta enfermedad son

posibles también otras alteraciones óseas, es ya clásico observar que con

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frecuencia cursa con una osteoporosis indistinguible de la idiopática. Si bien la afirmación es cierta, ya que entre un 10-25% de los pacientes con mieloma presentan una osteopenia difusa y en más de una tercera parte se observan fracturas vertebrales, la posible coexistencia de pequeños focos líticos puede determinar diferencias sustanciales. Otra hemopatía maligna que debe tenerse en cuenta como causa de osteoporosis es la leucemia, especialmente en el niño. La pérdida de masa ósea suele ser difusa y puede afectar incluso a los huesos de las manos y de los pies. Los aplastamientos vertebrales, presentes hasta en el 1-2% de los pacientes, pueden ser un poco atípicos, en razón de que asientan sobre un hueso no desarrollado plenamente. En tercer lugar debe señalarse la mastocitosis, aunque puede cursar con otros patrones de alteración ósea, lesiones focales escleróticas, líticas o mixtas, la osteopenia difusa es, probablemente, el rasgo más típico. La afectación ósea se da en el 70% de los casos.

Algunas intervenciones quirúrgicas pueden tener una repercusión sobre el

hueso, como sucede con la gastrectomía y otros tipos de cirugía digestiva, la orquiectomía o la ovariectomía. Los efectos de la radioterapia sobre la actividad osteoblástica suelen ser transitorios, sin embargo, el daño vascular puede reducir el aporte sanguíneo al hueso, dificultando los procesos de reparación y aumentando con ello su fragilidad. Además, la radioterapia puede resultar perjudicial de forma indirecta. Por ejemplo, la radiación craneal que suele utilizarse en el tratamiento de los tumores cerebrales o de la leucemia linfoblástica, puede dañar el eje hipotálamo-hipofisario, dando lugar a un déficit en la secreción de GH y de gonadotropinas. Este déficit hormonal parece ser el responsable de la menor masa ósea que presentan los pacientes que sufrieron una leucemia linfoblástica durante su infancia. La radioterapia craneoespinal, además de dañar a la hipófisis, puede afectar al tiroides, las gónadas y la propia columna. La irradiación gonadal utilizada en pacientes con recidiva testicular de una leucemia linfoblástica suele ser perjudicial especialmente en niños. En estos casos el déficit gonadal se establece antes de que finalice el período de crecimiento por lo que la repercusión sobre el esqueleto es aún mayor. Las mujeres premenopáusicas con cáncer de mama que reciben irradiación ovárica también presentan una pérdida acelerada de hueso.

En cuanto al tratamiento quimioterápico, tanto los fármacos citotóxicos,

como las hormonas, y desde luego los glucocorticoides, facilitan el desarrollo de osteoporosis. Los agentes citotóxicos pueden alterar la actividad osteoblástica y la función gonadal. La insuficiencia ovárica es una complicación frecuente en las mujeres premenopáusicas con cáncer de mama que reciben

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quimioterapia adyuvante. El principal responsable de este trastorno es la ciclofosfamida, agente capaz de lesionar las células de la capa granulosa del ovario. La disfunción gonadal, que está presente en la mayoría de las mujeres al finalizar el tratamiento con este fármaco, puede persistir de manera indefinida dependiendo de la edad y de la dosis y duración del tratamiento. La pérdida de masa ósea en las mujeres premenopáusicas tratadas con quimioterapia por cáncer de mama llega a alcanzar el 10% anual.

Algo similar sucede con las mujeres con enfermedad de Hodgkin que

reciben poliquimioterapia. En estos casos, la ciclofosfamida, la mecloretamina y la procarbazina serían las responsables de la afectación gonadal y, como consecuencia, de la pérdida de masa ósea. Sin embargo, la administración de estrógenos frena la pérdida de hueso en estas mujeres. En los hombres, los agentes alquilantes y la procarbazina lesionan las células germinales, pero no suelen dañar las células de Leydig, por lo que la afectación ósea no suele ser muy relevante. Algo similar ocurre en los pacientes con cáncer testicular tratados con dosis altas de cisplatino. Además de los efectos de la quimioterapia sobre la función gonadal, los agentes quimioterápicos afectan al hueso a través de otros mecanismos. Las dosis altas de metotrexato utilizadas en el tratamiento de diversos tumores provocan un aumento de la resorción ósea y una inhibición de la formación del hueso que conducen a la pérdida de masa ósea (osteopatía por metotrexato). La ciclofosfamida y la doxorrubicina actúan también directamente sobre el hueso y las dosis altas de ifosfamida (utilizadas generalmente en niños con tumores sólidos, como el osteosarcoma) pueden lesionar el túbulo proximal determinando la aparición de osteomalacia hipofosfatémica.

El tratamiento hormonal puede ser también perjudicial para el hueso. Los

análogos de los factores de liberación de las gonadotropinas (GnRH), se han utilizado en ambos sexos como alternativa a la castración quirúrgica. En los varones con adenocarcinoma prostático se ha generalizado su uso en los últimos años en detrimento de la cirugía. En estos pacientes se observa una disminución en la DMO en la columna lumbar cercana al 7% anual, cifra similar a la que se observa tras la orquiectomía. La pérdida de hueso es más intensa cuando se administran conjuntamente con antiandrógenos, mientras que la adición de estrógenos parece prevenir este trastorno.

En las mujeres premenopáusicas con cáncer de mama avanzado, el

tratamiento con análogos de los GnRH provoca también una pérdida significativa de hueso. Los inhibidores de la aromatasa, fármacos utilizados en

Capítulo 12

375

las mujeres postmenopáusicas con cáncer de mama para impedir la conversión periférica de los andrógenos en estrógenos, resultan también perjudiciales para el esqueleto. Por el contrario, el tratamiento adyuvante con algunos moduladores selectivos de los receptores estrogénicos (SERM), como el tamoxifeno o el toremifeno, ha demostrado que previene la pérdida de la masa ósea en mujeres postmenopáusicas con cáncer de mama.

En los pacientes con antecedentes tumorales debe realizarse una detallada

historia clínica que preste una especial atención al tratamiento recibido y a las posibles consecuencias del mismo, especialmente en la esfera gonadal. Debe realizarse una densitometría ósea siempre que existan datos de hipogonadismo, cuando el propio tumor pueda contribuir al desarrollo de la osteoporosis (mieloma, leucemia linfoblástica), o cuando el paciente haya recibido tratamiento con dosis altas de glucocorticoides, metotrexato o ifosfamida. Lo ideal sería realizar la densitometría antes y después de finalizar el tratamiento oncológico. Se debe insistir en las medidas generales: ejercicio físico, ingesta adecuada de calcio y vitamina D, corrección de los factores de riesgo. Los pacientes con hipogonadismo deben recibir tratamiento hormonal sustitutivo siempre que el tumor no sea hormonodependiente (cáncer de mama o de próstata). En estos casos puede recurrirse a los bisfosfonatos, que se han utilizado con éxito para prevenir la pérdida de masa ósea en pacientes con cáncer de mama (clodronato y risedronato) y de próstata (pamidronato). Además, algunos de estos compuestos (pamidronato, zoledronato) parecen dificultar el desarrollo de las metástasis óseas. Los bisfosfonatos también serían los fármacos de primera elección en otras situaciones distintas del hipogonadismo. Los más utilizados hoy son el alendronato y el risedronato. Además, en las mujeres postmenopáusicas pueden utilizarse los moduladores selectivos de los receptores estrogénicos (tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno), especialmente si han padecido un cáncer de mama. En el carcinoma prostático se puede también sustituir los antiandrógenos por estrógenos. Finalmente, en los niños que sobreviven a una leucemia linfoblástica o a una tumoración cerebral, conviene realizar un estrecho seguimiento para descartar la existencia de una deficiencia de GH o de hormonas sexuales con objeto de realizar el adecuado tratamiento hormonal sustitutivo.

11. Aplicaciones clínicas En el diagnóstico de la osteoporosis se distinguen claramente dos

poblaciones: la que muestra una predisposición o tendencia a padecerla y la que ya se encuentra ya padeciendo una pérdida ósea establecida.

Capítulo 12

376

Frente a la población con predisposición hay que evitar, en lo posible, los factores de riesgo. El tamaño y masa del esqueleto se encuentran programados genéticamente y está claro que los factores de riesgo genéticos no pueden eludirse, pero sí se puede actuar sobre los otros tipos de factores. En términos generales deberá evitarse el tabaco, el consumo elevado de café y alcohol, las dietas muy ricas en proteínas y en fibra, y la vida sedentaria (existen ejercicios recomendados para prevenir la pérdida de masa ósea). Se recomienda también que las dietas vayan suplementadas con calcio y vitamina D.

Es un hecho reconocido que la terapia estrogénica se presenta como la

más indicada en casos de menopausia. Los beneficios del reemplazo hormonal no se discuten: a corto plazo mejoran la calidad de vida y a largo plazo previenen la osteoporosis. La calcitonina y los bisfosfonatos pueden ser utilizados como alternativa a la terapia estrogénica y pueden aplicarse también a la normalización de estado andropáusico. Todos estos tratamientos detienen la reabsorción ósea suprimiendo la actividad de los osteoclastos sin estimular el crecimiento del hueso nuevo. Es importante el potencial de un agente que puede incrementar el tejido óseo y revertir el defecto de los pacientes con osteoporosis, y más aún si además de incrementar la masa ósea repara la microarquitectura dañada. Los agentes utilizados normalmente, estrógenos y calcitonina, actúan primero estabilizando la masa ósea mediante la prevención de futuras pérdidas. Este incremento no es un efecto anabólico verdadero, pero se relaciona con efectos temporales sobre el recambio óseo en el cual la reabsorción decrece y una vez estabilizada la masa ósea se verifica también una reducción en la formación.

Frente a una pérdida ósea que conlleva un estado de osteoporosis ya

establecida, la efectividad terapéutica es menor. La mayoría de los fármacos son antireabsortivos: estrógenos, calcio, metabolitos de la vitamina D, calcitonina, difosfonatos, etc. Estos tratamientos van dirigidos a las distintas etapas de la remodelación ósea. Las terapias que estimulan la formación incluyen el fluoruro sódico (en dosis bajas), esteroides anabolizantes y hormona paratiroidea intermitente. En los tratamientos secuenciales la acción va dirigida a las distintas etapas del remodelamiento óseo. Entre estos tratamientos el régimen ADFR (A = activación; D = depresión; F = formación; R = repetición), presenta un prometedor futuro. Se inicia el tratamiento con activadores de la remodelación (por ejemplo, hormona paratiroidea), con ello se acelera el recambio óseo, tanto la reabsorción como la formación. Posteriormente se deprime la reabsorción (con calcitonina o bisfosfonatos). Al deprimir la reabsorción por los osteoclastos se mantiene el proceso de formación del hueso

Capítulo 12

377

por los osteoblastos durante un período libre, y se repite tantas veces como sea necesario. Esta terapia se desarrolla en ciclos de unos 90 días y los resultados obtenidos hasta la fecha muestran gran eficacia en casos de osteoporosis declarada en los que no ha habido respuesta o ha habido muy poca frente a los tratamientos preventivos.

12. Consideraciones finales Como consecuencia del incremento de la esperanza de vida media, la

osteoporosis constituye actualmente uno de los mayores problemas de salud pública en los países industrializados. Se estima que el 15% de la población mundial padece este mal y su frecuencia se eleva considerablemente a partir de los 50 años. La osteoporosis es la "plaga silenciosa de nuestra época".

Un cierto grado de pérdida de la masa ósea es inevitable a medida que

transcurre la edad. Para prevenir un exceso en dicha pérdida, es aconsejable conocer qué factores pueden acelerarla. Los factores causales han sido localizados en su mayor parte en investigaciones epidemiológicas, aunque pocos de ellos, exceptuando la deficiencia estrogénica, han sido comprobados experimentalmente. Si se conocen los riesgos podría indicarse aquellos que son susceptibles de estudio diagnóstico y de una terapia preventiva. La Tabla 3 muestra un resumen de los factores de riesgo que conllevan a la osteoporosis.

Dadas las consecuencias de la osteoporosis en la salud pública, la primera

atención médica ha de dirigirse, no sólo a educar al segmento de la población senescente, respecto a la inevitable pérdida de su masa ósea, sino también promocionar activamente la profilaxis y la terapéutica a seguir entre aquellos pacientes con tendencia hacia la osteoporosis o a aquellos pacientes con pérdida

Capítulo 12

378

ósea severa y riesgo de fracturas. En 1995 Manolagas propuso que eran los cambios en el número de células

en el tejido óseo y no los cambios en la actividad de las células individuales las causantes de las bases patogénicas de la osteoporosis y que un exceso de osteoclastogénesis unido a una inadecuada osteoblastogénesis eran los responsables del desacoplamiento entre la reabsorción y la formación óseas. Desde entonces este paradigma ha sido la base de numerosos estudios que han originado importantes descubrimientos que reafirman la relevancia de las células y su número en la fisiología y fisiopatología del hueso. Estos descubrimientos proporcionan una nueva panorámica para la evaluación crítica de los conocimientos actuales sobre las estrategias terapéuticas dirigidas a las enfermedades óseas. Es un hecho claro que las células óseas tienen que ser continuamente reemplazadas y que el número de dichas células en un momento dado, depende de su ritmo de generación, reflejo de la frecuencia de división celular de sus progenitores, y de su supervivencia. Los mecanismos que intervienen en el reemplazo de osteoblastos y osteoclastos han de encontrarse estrechamente coordinados y orquestados a nivel de progenitores. Así que, cualquier alteración en los ritmos de generación o muerte de las células óseas ha de ocasionar la osteoporosis causada por deficiencia esteroidea o por envejecimiento. La atenuación del ritmo de apoptosis de los osteoblastos puede ser un mecanismo clave utilizado por los agentes anabólicos como la PTH.

El hecho importante de que sea el estrógeno la hormona juega un papel

central en la regulación de la masa ósea en ambos sexos, nos lleva a una serie de preguntas.

¿Por qué son las hormonas sexuales esteroideas en vez de las

calciotrópicas los principales reguladores de la masa ósea? ¿Por qué es el estrógeno la hormona más importante frente a la regulación de la homeostasis externa del calcio? ¿Por qué es el estrógeno, en vez de la testosterona, el principal regulador de la masa ósea en hombre?

En las últimas décadas las investigaciones de grupos de bioquímicos y

biólogos moleculares han hecho una enorme contribución al conocimiento de los mecanismos de acción implicados en el recambio óseo. Estos estudios están permitiendo establecer unos objetivos terapéuticos que han de jugar un importante papel en el descubrimiento y desarrollo y nuevos fármacos Aunque los resultados de los estudios en curso han de continuar para expandir el conocimiento básico del tratamiento médico primario de la osteoporosis, estos

Capítulo 12

379

datos han de servir como guía al clínico en el desarrollo de un régimen terapéutico óptimo que trate de resolver las necesidades del paciente que sufre del desolador problema de la osteoporosis debida principalmente a la menopáusia y/o al envejecimiento.

13. Abreviaturas BMD, densidad mineral del hueso; BMP7, proteína morfogenética del

hueso 7; BMU, unidad multicelular básica; Cbfa1 (core binding factor 1), factor de transcripción específico de osteoblastos; DMO, densidad mineral ósea; FCE, factor de crecimiento del esqueleto; FRDO, factor de resorción derivado de los osteoblastos; HTR, terapia de reemplazo hormonal; IGF, factor de crecimiento insulínico; IL-1, interleuquina-1; IL-6, interleuquina-6; Linfoquinas, citoquinas segregadas por los linfocitos; M-CSF, factor estimulador del crecimiento de colonias de macrófagos; Osf2, factor de transcripción específico de osteoblastos o Cbfa1; OPGL, ligando de la osteoprotegerina; RANKL, polipéptido de membrana de 316 aminoácidos ligando del receptor RANK; PTH, hormona paratifoidea; RANK, proteína de membrana de 616 aminoácidos, se expresa en osteoclastos; SERM, moduladores selectivos del receptor del estrógeno; SMAD, factor de transcripción: TGFβ, factor transformante del crecimiento beta; TNFR, receptor del factor transformante del crecimiento; TNF, factor de Necrosis Tumoral; VDR, receptor de la vitamina D.

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Capítulo 12

384

Capítulo 13. ESTRÉS OXIDATIVO Y ENFERMEDAD DE ALZHEIMER

1. Introducción 2. Marcadores patológicos de la enfermedad de Alzheimer 3. Producción del péptido β-amiloide, procesamiento del APP y formación dependiente de nucleación 4. Proteína tau, microtúbulos y formación de marañas neurofibrilares 5. Especies activas de oxígeno (ROS) y enfermedad de Alzheimer 5.1. Estrés oxidativo y muerte celular. Excitotoxicidad del glutamato 5.2 Transporte electrónico mitocondrial 5.3. Daño oxidativo al DNA y mutaciones en el DNA mitocondrial 6. Procesos inflamatorios, microglia y óxido nítrico 7. Antioxidantes y neuroprotección 8. Estrategias terapéuticas 9. Conclusiones 10. Abreviaturas 11. Bibliografía 1. Introducción Es cada vez más evidente el papel ubícuo que juega el estrés oxidativo en

las enfermedades neurodegenerativas, aunque hay que distinguir entre la situación de estrés oxidativo que ocurre en los primeros estadios de la enfermedad de aquella que es una manifestación secundaria de la degeneración neuronal. Esta perspectiva subraya el papel del estrés oxidativo en las enfermedades de Alzheimer, Parkinson y Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y esclerosis múltiple, y enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias, donde se ha demostrado la contribución primaria del estrés oxidativo en la muerte neuronal, en oposición a otras enfermedades donde el estrés oxidativo juega un papel secundario.

La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad degenerativa crónica y

progresiva, descrita por Alzheimer en 1907. Los síntomas de la enfermedad de Alzheimer fueron identificados por Emil Kraepelin y la neuropatología característica fue observada por primera vez en 1907 por Alois Alzheimer, que trabajaba en el laboratorio del primero. Asi pués, la enfermedad en su conjunto, fue descubierta por ambos científicos, pero, dada la importancia que Kraepelin daba a las bases neurológicas de desórdenes psiquiátricos, decició nombrar la

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enfermedad en honor a Alzheimer. Esta enfermedad se describió entonces como una entidad clínico-patológica que se presenta con progresivo deterioro de la memoria, la orientación, el habla, y otras funciones relacionadas con la personalidad y la capacidad visual-espacial. Esta demencia neurodegenerativa, se caracteriza por fallo en la consciencia en combinación con amiloidosis cerebral, cambios fibrilares intraneuronales, pérdida neuronal y sináptica y deficiencias en los neurotransmisores. La enfermedad suele tener una duración de 10 a 12 años, dependiendo de las caracteristicas de cada paciente y el índice de incidencia se incrementa con la edad siendo del órden del 3 % entre los 65-70 años y del 69 % a los 90 años de edad. Hasta los pasados sesenta se consideró que la enfermedad de Alzheimer era una consecuencia de la aterosclerosis cerebral, pero a partir de este momento se profundizó en la ultraestructura de las lesiones de la corteza cerebral y en las deficiencias en neurotransmisores específicos y se llegó al reconocimiento de la enfermedad de Alzheimer como una entidad. A final de los setenta y principio de los ochenta los estudios se enfocaron en la búsqueda de una lesión neuroquímica, en particular con respecto al sistema colinérgico pensándose que la enfermedad se debia a una disminución de la síntesis del neurotransmisor acetilcolina. Esta hipótesis no ha tenido demasiada relevancia por el hecho de que los medicamenteos que tratan deficiencias colinérgicas no tienen gran efecto sobre el curso de esta enfermedad. Otra hipótesis propuesta se relaciona con el acúmulo de proteinas β-amiloide y tau en los pacientes con esta ennfermedad. En un pequeño número de casos la enfermedad de Alzheimer se produce por la aparición de mutaciones de los genes PS1, PS2 y el APP localizado en el cromosoma 21. En este último caso la enfermedad aparece en pacientes con síndrome de Down (trisomía en el cromosoma 21) y suele ser transmitida genéticamente. Posteriores estudios de biología molecular y otras tecnologías han ofrecido la posibilidad de conocer las alteraciones moleculares de esta enfermedad. En los últimos años el interés por profundizar en su conocimiento es cada vez mayor debido a su elevada incidencia en la población de más de 65 años y al requerimiento de cuidados a largo término, que hace que sea urgente encontar una terapia adecuada.

2. Marcadores patológicos de la enfermedad de Alzheimer La enfermedad de Alzheimer implica la muerte neuronal regionalizada

unida a la acumulación extra e intracelular de agregados proteicos filamentosos que forman lesiones denominadas marañas neurofibrilares, placas amiloides neuríticas o seniles y amiloidosis cerebrovascular. Como factores primarios responsables de esta patogénesis, se han propuesto diversos parámetros

Capítulo 13

386

independientes que incluyen: el metabolismo anormal de la proteína amiloide causante de las placas amiloides que forman conglomerados extracelulares, la hiperfosforilación de las proteínas tau del citoesqueleto que se ensamblan formando las marañas neurofifrilares en el interior de las neuronas (Figura 1) y el genotipo de la apolipoproteína E. El β-amiloide es un fragmento proteico que proviene de una proteína de mayor tamaño denominada APP (Proteína Precursora de Amiloide) Esta proteína es necesaria para el crecimiento y supervivencia de la neurona. En la enfermedad de Alzheimer, mediante un proceso no bien conocido, esta proteína se desdobla en varios fragmentos por acción de enzimas proteolíticas. Uno de estos fragmentos es el β-amiloide que se deposita fuera de las neuronas. La enfermedad de Alzehimer se considera también como una taupatía, debida a la agregación anormal de la proteína tau. Esta es una proteína que estabiliza los microtúbulos, estructuras conductoras de nutrientes y otras moléculas desde el cuerpo neuronal a la terminación nerviosa y viceversa. Cuando los microtúbulos se desestabilizan falla esta función fisiológica de la neurona, dando lugar a su muerte. Sin embargo, ninguna teoría explica totalmente las numerosas facetas bioquímicas y patológicas de la enfermedad. Se considera que la situación de estrés oxidativo inherente a la edad y la glicoxidación proteica pueden, de manera individual, explicar aspectos de esta enfermedad.

La enfermedad de Alzheimer implica también una deficiencia en

neurotransmisores múltiples. La alteración más consistente en los neurotransmisores de la corteza cerebral de estos enfermos es la pérdida de marcadores colinérgicos, colina acetiltransferasa y acetilcolinesterasa. Además, existen deficiencias en serotonina, noradrenalina, somatostatina y en factores que liberan corticotropina.

En pacientes con enfermedad de Alzheimer familiar de iniciación

temprana, se han encontrado mutaciones en el gen que codifica la proteína precursora del amiloide, que se ubica en el cromosoma 21. El genotipo apolipoproteina E4 aparece como factor de riesgo en la enfermedad familiar de iniciación tardía y en la esporádica. También aparecen mutaciones múltiples en los genes de la presenilina 1 y la presenilina 2. Es importante definir los factores de riesgo como vía para prevenir esta enfermedad tales como: la edad, la presencia de alelos de apolipoproteína E4, historia familiar, lesión cerebral y alteraciones en el habla en la infancia.

En el cerebro de esta clase de enfermos se observan dos anomalías

características: una abundancia de depósitos amiloides extracelulares,

Capítulo 13

387

denominados placas seniles o neuríticas, y depósitos de proteina fibrilar en el interior de las neuronas, conocidos como marañas neurofibrilares, que aparecen predominantemente en los lóbulos frontal y temporal (Figura 1).

Figura 1. Neuronas de cerebro normal y de cerebro de enfermo de Alzheimer. El péptido

β -amiloide polimeriza y forma las placas amiloides o neuríticas, que se acumulan en el espacio extracelular. La proteína tau al sufrir la fosforilación se separa de los microtúbulos y polimeriza en filamentos helicoidales emparejados y posteriormente en marañas neurofibrilares en el interior de las neuronas

Las placas seniles están constituidas por depósitos extracelulares

insolubles formados por varios compuestos, siendo el más abundante el péptido β amiloide. Este péptido, como ya se comentó antes, deriva, por procesamiento proteolítico, de una proteína de mayor tamaño, la proteína precursora del β amiloide (APP). Las placas pueden describirse como difusas o clásicas. Las difusas son agregados amorfos de β amiloide que no se asocian con neuronas distróficas o neuritas anormales. Las placas neuríticas clásicas contienen densos agregados fibrilares del β amiloide insoluble rodeados de neuritas distróficas, astrocitos activos y microglía activa, que se asocian con degeneración y pérdida neuronal. Las marañas neurofibrilares son agregaciones intracelulares que se generan cuando la proteína tau se hiperfosforila, se disocia de los microtúbulos y forma, espontáneamente por polimerización, filamentos helicoidales

Capítulo 13

388

apareados que más tarde ocasionarán las marañas neurofibrilares visibles por microscopía electrónica en el interior de neuronas distróficas.

Las placas seniles producen reacción inflamatoria alrededor de los

depósitos de β amiloide. Los terminales nerviosos en degeneración en las placas contienen también proteína tau. A medida que estos procesos celulares se desarrollan, las neuronas van muriendo en el hipocampo y la corteza. Se desconoce hasta el momento cual es el primer factor que causa la enfermedad de Alzheimer, las placas seniles o las marañas neurofibrilares.

Como ya se ha indicado anteriormente, los marcadores patológicos de la

enfermedad de Alzheimer incluyen cambios neuroanatómicos. El examen microscópico muestra marañas neurofibrilares intracelulares que alteran el soma neuronal, ocupando gran parte del citoplasma con estructuras filamentosas de 10 nm de diámetro, que se encuentran enrolladas una sobre otra con una amplitud helicoidal de 800 nm formando filamentos helicoidales emparejados. En los vasos del hipocampo y la corteza, se observa la existencia de numerosas placas seniles neuríticas. Las placas neuríticas consisten en agrupamientos de axones degenerados y terminaciones dendríticas con un núcleo que contiene filamentos lineales extracelulares formados por el péptido β amiloide. El β amiloide consiste en un péptido de 38 a 42 aminoácidos plegado en β, que forma fibras insolubles de conformación plana derivadas de su propia polimerización.

En los depósitos amiloides de las placas seniles y en los vasos sanguíneos

de la corteza cerebral se encontró un fragmento β amiloide, cuya secuencia de aminoácidos proporcionó las bases para clonar el gen que expresa el β amiloide. Este gen codifica la proteína APP, que por proteolisis origina fragmentos de 38 a 42 aminoácidos, el β amiloide. En familias con enfermedad temprana se ha llegado a identificar un lugar en el brazo largo del cromosoma 21 en la región duplicada en el síndrome de Down, cercana al gen que codifica APP. La proteína APP es una glicoproteína del tipo 1 de la superficie celular, que contiene de 695 - 770 aminoácidos. Consiste en una estructura transmembrana con un dominio extracelular glicosilado y un dominio corto citoplasmático. La proteína APP se encuentra implicada en la señalización de la adhesión celular, crecimiento de neuritas y contacto sináptico. Las formas tempranas de la enfermedad afectan la expresión y el procesamiento de este precursor (Figura2) .

Capítulo 13

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Se han encontrado siete mutaciones en este gen, las cuales elevan la producción del β amiloide 1- 42, que conlleva las agregaciones fibrilares neurotóxicas. Sin embargo, en la mayoría de las familias con enfermedad de Alzheimer temprana, la enfermedad no se relaciona con el cromosoma 21 y estas mutaciones del gen que codifica la APP cuentan en menos del 1 % de los casos de enfermedad temprana. Un segundo lugar de mutación, en el cromosoma 14q, codifica la presenilina 1 (PS1), y se ha estimado que causa un 50% de los casos de enfermedad. Un tercer lugar de mutación, en el cromosoma 1, codifica la presenilina 2 (PS2), y apareció en dos familiares con enfermedad temprana familiar. Un cuarto lugar, en el cromosoma 19q, es importante en la enfermedad tardía. Un gen candidato en esta región codifica la apolipoproteína E, identificada por su papel en el transporte de colesterol. Aunque no se han encontrado mutaciones en el gen que codifica la apolipoproteína E, una de sus tres variantes genéticas la apoE4, aumenta el riesgo de enfermedad de Alzheimer. La aparición de la enfermedad de Alzheimer se adelanta 10 - 20 años en personas homozigóticas para los alelos de la apoE4.

Se ha confirmado que las PS (PS1 o PS2) son, al menos en parte,

esenciales para que la aspartil-proteasa γ-secretasa actúe sobre el APP en el proceso de liberación del β-amiloide. Los resultados dejan poca duda que las PS posean actividad γ-secretasa, ya que la ausencia de las PS elimina esta actividad. No obstante puede ser un co-factor necesario para su actividad. Recientes estudios atribuyen a la PS1 el papel de subunidad catalítica del complejo enzimático γ-secretasa.

La apolipoproteína E se produce predominantemente por los astrocitos y se

introduce en las neuronas a través del receptor de las lipoproteínas de baja densidad. Una vez dentro se une a las marañas neurofibrilares. Las tres isoformas de apolipoproteína E humana (apoE2, apoE3 y apoE4) varían en su afinidad por el β-amiloide. El alelo E3 es el que se encuentra más ampliamente distribuído. Los homocigotos apo E4 presentan un riesgo mayor que los apo E3 de contraer la enfermedad de Alzheimer temprana. Los homocigotos apoE2 son raros y se encuentran protegidos frente a la enfermedad de Alzheimer.

La identidad de otras proteínas indica que las placas seniles son

estructuras complejas que contienen diversas proteínas que incluyen el β-amiloide, la proteína tau, la ubiquitina, α1-antiquimotripsina, apolipoproteína E, presenilinas 1 y 2 y α2-macroglobulina. Se han encontrado deleciones en un gen

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candidato que codifica la α2-macroglobulina, un inhibidor de la proteasa sérica, en un 30 % de pacientes con enfermedad de Alzheimer. Otro gen que puede elevar la susceptibilidad a esta enfermedad, es el que codifica el receptor de las lipoproteinas de baja densidad, ya que este receptor se une a la apolipoproteina E y a la α2-macroglobulina.

La mayoría de las formas dominantes transmitidas por herencia de la

enfermedad de Alzheimer familiar de aparición temprana, están causadas por dos genes muy homólogos, el gen de la presenilina 1 en el cromosoma 14 y el de la presenilina 2 en el cromosoma 1, ambos son miembros de una familia genética evolutivamente muy conservada. El analisis de su secuencia predice que la PS1 (467 aminoácidos) y la PS2 (448 aminoácidos), son proteínas que contienen siete dominios transmembrana, una porción carboxiterminal y otra amino terminal corta compuesta por aminoácidos hidrofílicos. Se expresan por todo el cerebro y se localizan principalmente en el retículo endoplásmico, en el complejo de Golgi y en la membrana celular. Las mutaciones en las presenilinas, que producen la enfermedad de Alzheimer familiar, no afectan la codificación de las proteínas, sino que las alteraciones se verifican a nivel post-transcripcional. El mecanismo mediante el cual estas mutaciones promueven la degeneración neuronal no está del todo esclarecido, sin embargo, estudios in vitro e in vivo sugieren que actúan promoviendo la deposición del β amiloide particularmente la forma β amiloide 42. Se ha observado in vitro que la mutación en PS1-L286V (sustitución de leucina por valina en el codon 286) o la mutación PS2-N141L (sustitución de asparagina por isoleucina en el codon 141), elevan la susceptibilidad a la apoptosis. En un modelo de mutación de la PS1-E280A (sustitución de ácido glutámico por alanina), se ha demostrado que se altera el proceso proteolítico del APP a nivel de secretasas, lo que induce la superexpresión del β amiloide y la formación de placas. Se ha demostrado también que el estrés oxidativo y la elevación en el calcio intracelular, inducidos ambos por estímulos apoptóticos se encuentran exacerbados en células que expresan mutaciones en estos genes. Estas observaciones sugieren que las mutaciones en las PS1 y PS2, comparten mecanismos comunes que inducen la apoptosis por interacción con las neuronas sensibilizadas por el β-amiloide que, a su vez, promueve la generación de radicales libres y estrés oxidativo y alteran la homeostasis del calcio. Con estos datos se llega a la conclusión que la patología de la enfermedad de Alzheimer familiar (5% de los casos) se relaciona con la deposición de β amiloide, mutaciones en PS1, estrés oxidativo y la muerte celular.

Capítulo 13

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Se desconocen hasta el momento, los efectos celulares de las mutaciones en el gen del cromosoma 14 que codifica la presenilina1 y en el gen del cromosoma 1 que codifica la presenilina 2, pero en base a la estructura transmembrana de la secuencia de estas proteínas, se ha propuesto que las presenilinas pueden estar implicadas en el tráfico intracelular de proteínas tales como el APP. Alternativamente, estas proteínas pueden acoplarse a las proteínas G o actuar cono canales iónicos implicados en la homeostasis del calcio. Una serie de estudios independientes han llegado a proponer que las presenilinas contribuyen a la maduración de la proteína APP. Las mutaciones en el gen de la presenilina1 son responsables de las formas agresivas de aparición temprana de la enfermedad de Alzheimer que conducen a una elevada formación del las especies patogénicas del péptido β amiloide.

3. Producción del péptido β-amiloide, procesamiento del APP y

formación dependiente de nucleación Una de las características de la enfermedad de Alzheimer es la formación

en el cerebro de placas seniles neuríticas. El mayor componente de esas placas es el péptido β amiloide, producto de la proletolisis del APP. El gen que codifica al APP da lugar a cuatro formas alternativas o isoformas con 695, 714, 751 y 770 aminoácidos, todas ellas amiloidogénicas. El APP puede hidrolizarse en tres puntos por tres enzimas proteolíticos. La α-secretasa hidroliza al APP en la región del β amiloide, impidiendo con ello la formación del amiloide y segregando una proteína extracelular de 90 - 100 kDa. En un proceso alternativo el APP puede hidrolizarse en otros dos lugares diferentes; uno de ellos transmembrana (γ-secretasa) y el otro extracelular (β-secretasa), dando lugar al β-amiloide soluble, precursor de las placas amiloides. Por tanto, la formación del péptido β amiloide requiere de la actividad proteolítica de dos enzimas, la β-secretasa que hidroliza al APP en la zona aminoterminal y la γ-secretasa que verifica la hidrolisis en la zona carboxiterminal transmembrana (Figura 2).

El interes en el péptido amiloide se elevó al máximo al descubrirse una

mutación en el gen que codifica APP en una forma familiar de esta enfermedad. Esto llevó a creer que la acumulación de β-amiloide en forma de placas extracelulares como resultado del metabolismo alterado del precursor por mutación genética, trisomía 21 o factores ambientales, conducía a una cascada de eventos que incluían la propia maduración de la placa, la formación de marañas neurofibrilares en el interior de las neuronas, lesión neuronal y los

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sístomas clínicos de demencia. Tal lesión neuronal podía ser resultado de la neurotoxicidad directa del β

amiloide o de una sensibilización de las neuronas a la agresión excitotóxica, inducida por el β amiloide. En apoyo de estas teorías se demostró que una patología de características similares a la enfermedad de Alzheimer podía observarse en ratones transgénicos que sobreexpresaban la isoforma de 751 aminoácidos del precursor del β amiloide, el homólogo murino del APP y en aquellos que expresaban las mutaciones del APP. Desde este descubrimiento, se identificaron un número de casos de enfermedad de Alzheimer familiar causadas por las mencionadas mutaciones en un gen del cromosoma 14 que codifica la presenilina1 y en un gen del cromosoma 1 que codifica la presenilina 2.

Figura 2. Diagrama que muestra la proteína precursora del β-amiloide (APP). Se

muestran los sitios de rotura por las secretasas α, β y γ. La acción secuencial de la secretasa β y la secretasa γ origina el péptido β amiloide. Los números se refieren al aminoácido donde se verifica la rotura en la variante de precursor de 770 aminoácidos

El procesamiento del precursor APP y sus alteraciones juegan un papel

importante en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer, por varias razones:

(i) Receptores del glutamato. La estimulación de los receptores

metabotrópicos del glutamato puede acelerar la rotura del APP mediante la generación de diacilglicerol y activación de la proteína quinasa C. De esta forma se generan derivados solubles no amiloidogénicos. Por ello, la activación de los receptores del glutamato inhibe la apoptosis neuronal inducida por el péptido β-amiloide. Como las neuronas glutamaérgicas en la corteza y el

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hipocampo están lesionadas en la enfermedad de Alzheimer, la producción del amiloide en estas regiones puede encontrarse elevada por deficiencia de la neurotransmisión glutamaérgica.

(ii) Activación transcripcional del gen que codifica al APP. El péptido

β-amiloide puede acumularse también en cerebro de pacientes afectados con síndrome de Down, que poseen copias extra de los genes del cromosoma 21 que codifica al APP, y esta debe ser la causa que estos indivíduos padezcan la enfermedad de tipo temprano. La superexpresión de este gen puede ser un factor que contribuya al procesamiento aberrante de esta proteína precursora.

(iii) Superexpresión del APP y deficiencias en el metabolismo energético.

El promotor del gen APP contiene elementos de respuesta al choque térmico, sugiriéndose que la expresión de este gen puede tener un papel de respuesta a la lesión. Algunos componentes de las placas amiloides se han identificado como proteínas de respuesta al estrés. Otra hipótesis sugiere que la superexpresión del gen APP causa anormalidades mitocondriales estructurales y disminuye la actividad del complejo IV de la cadena de transporte electrónico. Alternativamente, los inhibidores del metabolismo oxidativo energético elevan notablemente la rotura proteolítica del APP y predisponen a una producción incrementada del β-amiloide en cerebro con enfermedad de Alzheimer

El amiloide se ha definido como un agregado fibroso de proteínas

insolubles con afinidad por rojo Congo y tioflavina T. Los procesos de agregación proteica ordenada se verifican por vías de polimerización dependientes de nucleación. Ejemplos de esta agregación son tan diversos como la formación de microtúbulos, el ensambaje de la cubierta de los virus, la formación de flagelos y la formación de fibrillas en células falciformes. Estos procesos se caracterizan por:

(a) una fase lenta de nucleación en la cual la proteína sufre una serie de

reacciones desfavorables de asociación, que van a dar lugar a un núcleo oligomérico ordenado,

(b) una fase de crecimiento en la que el núcleo crece rápidamente para formar grandes polímeros y,

(c) una fase de estabilidad en la cual el agregado y el monómero se encuentran en equilibrio.

Las características típicas de la polimerización dependiente de nucleación

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son las siguientes: 1. no ocurre agregación a concentraciones proteicas por debajo de una

concentración crítica; 2. a concentraciones proteicas que exceden muy poco la concentración

crítica, existe un lapso de tiempo antes de que se verifique la polimerización; y,

3. durante este lapso de tiempo la adición de un núcleo exógeno o gérmen, da lugar a una inmediata polimerización.

En un modelo típico de polimerización, el polímero no se detecta hasta que

la concentración de monómero excede un nivel crítico. Por debajo de este nivel predomina la concentración del monómero, pero a medida que se eleva va predominando la del polímero, mientras que la del monómero permanece. El fenómeno de concentración crítica refleja la cooperatividad de la formación del núcleo, lo que implica una serie de equilibrios desfavorables, aunque sea muy favorable la constante de equilibrio, que caracteriza la fase de crecimiento (Kg >> Kn) (Figura 3).

Figura 3. El modelo más simple de mecanismo dependiente de la nucleación muestra una

serie de equilibrios de asociación desfavorable proteína - proteína (Kn) que origina un núcleo inestable, seguido de una serie de equilibrios favorables (Kg) que culminan en la formación de la fibrilla. La concentración crítica resulta del cambio entre ambos equilibrios (Harper 1997).

La concentración crítica es equivalente a la constante de equilibrio del

crecimiento (Kg) y describe la solubilidad de la proteína en condiciones normales. Las consecuencias fisiológicas de este mecanismo de agregación

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ordenada que sigue a la vía dependiente de la nucleación, significa que la concentración de proteína y el tiempo son dos factores importantes en la determinación del estado de agregación. Como la concentración intrínseca crítica del β-amiloide medida in vitro puede ser 3 o 4 órdenes de magnitud superior a la encontrada in vivo, ha de tener lugar un mecanismo de supersaturación local, para que el núcleo de β-amiloide se forme y crezca. La supersaturación se puede retrasar, retrasandose así el proceso al cual la proteína está normalmente expuesta. En estas condiciones un débil incremento en la concentración del β-amiloide puede inducir una inmediata agregación. Han de tenerse en cuenta al menos otras dos variables, resultantes de las características del mecanismo dependiente de la nucleación:

(1) El tiempo durante el cual la proteína está localmente supersaturada, es

crítico. La liberación de la proteína del estado supersaturado antes de la formación del núcleo, puede ocurrir en los momentos inicales y eso explica por qué no se forma la placa de amiloide en condiciones normales. Sin embargo, si la dilución del β-amiloide ocurre después de la nucleación la agregación continuará. Aunque la formación de la fibrilla amiloide esté lejos de su concentración crítica, la lentitud de su desagregación permite que la fibrilla sea irremediablemente atrapada o fijada con la formación de la placa amiloide. Las moléculas endógenas pueden ejercer efectos que retrasen la desagregación, aceleren la fijación o ambas cosas. Es también importante identificar los mecanismos de supersaturación local, que favorecen la nucleación. Una vez que estos mecanismos sean identificados será importante conocer los factores que controlan la duración de la supersaturación local. Alguno de estos factores es sensible al envejecimiento, el mayor factor de riesgo para la enfermedad de Alzheimer (Figura 4).

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Figura 4. La formación del amiloide in vivo implica la supersaturación local para que

ocurra la formación de la placa. Esta etapa es parte de un proceso celular normal que se prolonga anormalmente en la enfermedad de Alzheimer. La duración del estado supersaturado debe ser lo suficiente corta para que la nucleación no tenga la posibilidad de ocurrir (flecha A). Si este tiempo se prolonga en la enfermedad entonces se producirá la nucleación (flecha B) (Harper 1997).

(2) El otro mecanismo se basa en que la formación de amiloide se

desencadene por internalización de una fibrilla preformada (núcleo exógeno), en un compartimento supersaturado, lo cual induce una inmediata agregación. En el caso de la agregación del β-amiloide en la enfermedad de Alzheimer, las fibrillas internalizadas actuan como núcleos de polimerización del amiloide recientemente producido. Alternativamente fibrillas de componente no β-amiloide pueden inducir la polimerización heterogénea del β-amiloide, tal y como se indica en la Figura 5.

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Figura 5. La polimerización del β−amiloide promovida por núcleo exógeno tiene que

verificarse en un medio localmente supersaturado. El núcleo exógeno puede ser homogéneo (gris) o heterogéneo (negro) (Harper 1997).

4. Proteína tau, microtúbulos y formación de marañas

neurofibrilares La proteína tau es una proteína neuronal localizada mayoritariamente en el

axón, y en menor grado en los cuerpos celulares y está casi ausente en las dendritas. Se encuentra asociada a microtúbulos y su presencia no es esencial para el desarrollo debido a la redundancia funcional y a la presencia de otras proteínas asociadas a microtúbulos. Sin embargo, en situaciones patológicas, tau puede hiperfosforilarse y ensamblarse consigo misma de manera aberrante (Figura 6). Estas modificaciones conducen a alteraciones neurológicas, principalmente demencias que se conocen con el nombre de taupatias.

Los microtúbulos son componentes esenciales del citoesqueleto celular y

tienen una gran importancia en la formación de los axones y dendritas y de sus contactos específicos. Son responsables de la formación y mantenimiento de la morfología celular y de sus conexiones específicas. Las proteínas asociadas a

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los microtúbulos contribuyen a la estabilidad de éstos, a la regulación de su dinamismo, y son esenciales para su funcionamiento.

Las proteínas tau son una de las dos clases principales de proteínas

asociadas a microtúbulos que se encuentran en cerebro. Por unión simultánea a diversas moléculas de tubulina no polimerizadas, estas proteínas aceleran el proceso de nucleación en la polimerización de la tubulina. Las proteínas tau modificadas se encuentran implicadas en la formación de las marañas neurofibrilares de la enfermedad de Alzheimer. La molécula de tau comprende cuatro dominios: región aminoterminal, dominio rico en prolina, región unida a los microtúbulos (tubulina) y dominio carboxiterminal.

Figura 6. Esquema que muestra la formación de filamentos helicoidales apareados y

marañas neurofibrilares. Cuando la proteína tau no está unida a microtúbulos puede sufrir la fosforilación y la formación de filamentos helicoidales, que se agregan para formar las marañas neurofibrilares. Tanto la formación de filamentos helicoidales como la despolimerización de los microtúlulos ocasionan disfunción neuronal y muerte de las neuronas. (Ávila et al., 2004)

La región aminoterminal contiene secuencias ácidas y su tamaño es

variable. Esta región se encuentra implicada en la unión a cationes (metales). Contiene un motivo KKXK, que se ha propuesto como sitio de unión a la

Capítulo 13

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heparina. La región rica en prolina, contiene una gran cantidad de residuos con capacidad para ser fosforilados, algunos de ellos seguidos de un residuo de prolina y otros dentro de los motivos PPXXP y PXXP, que son secuencias relacionadas con las interacciones de tau y proteínas con dominios SH3. Esta región rica en prolina desempeña una misión importante de unión a los microtúbulos. La región de unión a los microtúbulos contiene copias de una repetición de 31-32 residuos similares, pero no idénticos, que contiene una secuencia conservada de 18 aminoácidos ácidicos y una menos conservada de 13-14 residuos, conocida como la región inter repeticiones. Esta región posee un sitio adicional de unión a la heparina, y se ha identificado un motivo presente en la proteína serpina. La proteína tau muestra una estructura plegada al azar con una forma terciaria no globular. Sin embargo, se ha propuesto una estructura en lámina beta en la región de unión a los microtúbulos. Finalmente, la región carboxiterminal de la proteína tau presenta también una región rica en prolina con residuos que pueden fosforilarse y una región ácida hacia el COOH terminal. Además, esta región contiene un motivo parecido al de la subunidad β de la piruvato deshidrogenasa (VVSPWNS).

La modificación de tau por fosforilación disminuye su afinidad por los

microtúbulos y afecta a su capacidad para agregarse o interaccionar con otras proteínas. Su localización intracelular es citoplasmática. La localización de la proteína tau en el cerebro de enfermos de Alzheimer es notablemente anormal y puede contribuir a la disfunción neuronal. En enfermedad de Alzheimer, la proteína tau y los neurofilamentos, se transforman en filamentos helicoidales apareados tau positivos. Esto va unido a un cambio post-traduccional en la proteína por hiperfosforilación catalizada por una serie de proteína quinasas. La fosforilación está íntimamente ligada al estrés oxidativo a través de la vía MAPK y de la activación del NFκB. Las neuronas piramidales del hipocampo que sufren la degeneración muestran mayores niveles de carbonilos libres, aductos de peróxidos lipídicos y nitrotirosina. La proteína tau in vitro es un sustrato para una multitud de proteína quinasas, entre las que se incluyen la CAM quinasa II, la caseína quinasa II y las PKA, ERK2 y GSK3. La quinasa dependiente de ciclina 5 en conjunción con su activador específico de neuronas p35 (cdk5/p35), es otra proteína quinasa implicada en la hiperfosforilación de tau. La rotura proteolítica de la unidad reguladora p35 por la calpaina, produce p25 que se acumula en el cerebro de los enfermos de Alzheimer. Esta rotura proteolítica se induce por el péptido β-amiloide en neuronas corticales. Otra proteína quinasa implicada en la fosforilación de tau en la enfermedad de Alzheimer es la MARK, que fosforila preferentemente los motivos KXGS en

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los dominios de unión a los microtúbulos. La MARK fosforila la proteína tau en la serina 262, aunque también pueden ser fosforiladas las serinas en 293, 324 y 356. De hecho, parece ser que la fosforilación de la serina 262 es un evento inicial que contribuye a la disfunción de tau y a la formación de filamentos helicoidales apareados tau positivos y a las marañas neurofibrilares. Los filamentos helicoidales están fosforilados al menos en 19 sitios de los cuales 9 tienen un motivo serina-treonina-prolina (figura 7).

Una consecuencia significativa de la hiperfosforilación de la proteína tau,

en la enfermedad de Alzheimer, es la disminución de la capacidad de unirse a los microtubulos y promover su ensamblaje. La proteína tau hiperfosforilada contribuye a una desestabilización del entramado microtubular, a la alteración del transporte axonal y por último a la formación de marañas neurofibrilares y a la muerte celular. Es suficiente la fosforilación de tau en pocos sitios dentro de las regiones de unión a los microtúbulos (ser262, ser356 y en menor grado ser293 y ser324), para disminuir su capacidad de unión a los microtubulos. Otro hecho interesante es que la proteína tau hiperfosforilada es mucho más resistente a la degradación por la calpaina, una proteasa activada por calcio. Esto puede ser resultado de la autoasociación de la proteína tau que ocurre en todos los dominios de unión a los microtubulos, por lo cual se reduce la accesibilidad de la calpaina a estos sitios. La autoasociación de la proteína tau se potencia cuando el ambiente está más oxidado. Otra consecuencia significativa de la mayor agregación de tau en un medio oxidado es la glicación (adición no enzimática de azucares reductores a una proteína). Esto ocurre sobre residuos de lisina y da origen a las bases de Schiff. Los filamentos helicoidales apareados de tau glicados e hiperfosforilados muestran una capacidad de unión a los microtubulos todavía menor que la de la proteína tau soluble hiperfosforilada pero no glicada. El entrecruzamiento oxidativo hace a las proteínas más resistentes a ser eliminadas por proteolisis al inhibir la actividad del proteosoma. Por tanto, el entrecruzamiento oxidativo puede contribuir de manera significativa al acúmulo de conjugados de ubiquitina en las marañas neurofibrilares. Se han detectado niveles elevados de ubiquitina en muchas enfermedades degenerativas.

La polimerización de la proteína tau se verifica en presencia de una

elevada concentración de proteína. Una serie de factores favorecen la polimerización tales como: la desaminación con formación de isoaspartato, los sulfoglicosaminoglicanos (facilitan en ensamblaje) y la oxidación con implicación de metales.

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Figura 7. Estructura de la proteína Tau y mecanismos que conducen a su fosforilación,

autoensamblaje de tau fosforilada, formación de filamentos helicoidales emparejados (PHF) y marañas neurofibrilares (NTF). CKII, caseina quinasa; cdk5, quinasa dependiente de ciclina 5; GSK3, glucógeno sintasa quinasa 3; MAPK, proteína quinasa activada por mitógenos; PDPK, proteína quinasas dirigidas a prolina; no PDPK, proteína quinasas no dirigidas a prolina; PIN1, prolil isomerasa (carabina); PKA, proteína quinasa A; PKC, proteína quinasa C; PP1 y PP2A, proteína fosfatasas; TMAO, N-oxi-trimetilamina; WNT, ligando que se une al receptor Frizzled e inicia una cascada de reacciones. (Sánchez, Alvarez-Tallada y Ávila, 2001)

Estudios de la polimerización de tau inducida por

sulfoglicosaminoglicanos han indicado que la región más pequeña necesaria para que tau pueda agregarse está presente en el motivo de unión a la tubulina.

La acumulación de las marañas neurofibrilares sucede de una forma

ordenada con seis etapas de evolución en la destrucción de la corteza cerebral comenzando por la corteza transentorrinal y entorrinal hasta llegar a la isocorteza. En la enfermedad de Alzheimer la patología de tau se realiza con la fosforilación de la proteína, la pérdida de la capacidad de unión a los microtúbulos y la formación de marañas neurofibrilares. La fosforilación de tau se eleva en presencia de:

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• proteína quinasas dirigidas a prolina, como la GSK3, que fosforilan principalmente la región rica en prolina y la región C-terminal;

• proteína quinasas no dirigidas a prolina, como la PKA y la PKC, que fosforilan la región de unión a los microtúbulos; y

• las MAP quinasas y otras quinasas (caseina quinasa) que fosforilan la región N-terminal.

Figura 8. A: Fosforilación y ensamblaje de Tau. Tau puede ser fosforilada por diferentes

quinasas. La GSK3 (glucógeno sintasa quinasa 3) juega un papel importante en la fosforilación. La actividad GSK3 se regula por factores extracelulares como la insulina, β-amiloide, WNT, etc, o por fosforilación de otras quinasas tales como proteína quinasa A (PKA). Por otro lado, la desfosforilación se realiza por diferentes fosfatasas, aunque la PP2A (proteína fosfatasa) parece jugar un papel importante y está regulada por una variedad de factores intracelulares. B: la proteína Tau fosforilada puede ensamblarse en presencia de HNE (hidroxinonenal) derivado de la oxidación de los ácidos grasos (peroxidación). Otros factores que facilitan la polimerización incluyen mutaciones específicas que aparecen en Tau de pacientes de Parkinson con demencia frontotemporal ligada al cromosoma 17 (FTDP-17), la presencia de sGAG (sulfoglicosaminoglicanos), otros polianiones y acidos grasos (Avila et al., 2004, modificado).

La hiperfosforilación de tau afecta a la estructura y función de la molécula,

aumenta la resistencia a la proteolisis y disminuye la afinidad por los

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microtúbulos, favoreciendo la dimerización de tau y su interacción con otras proteínas. Estos cambios en la fosforilación de tau se observan en otras enfermedades, las taupatías, como resultado de isquemia cerebral, apoptosis o estrés celular.

Lesiones neurofibrilares tau positivas, que se forman en el interior de las

células nerviosas de la corteza cerebral y del hipocampo y de dendritas apicales y distales, son las que se relacionan con la demencia. Las células nerviosas van degenerando y mueren debido a esas lesiones neurofibrilares. Las lesiones aparecen como marañas neurofibrilares en las células nerviosas. En las neuritas anormales aparecen, a veces, asociadas a las placas amiloides.

Los filamentos tau sufren glicación y oxidación no enzimática que van a

dar lugar a los productos terminales de glicación avanzada (AGE). La formación de los AGE ocurre cuando las proteínas de vida larga, ricas en lisina, (como tau), se encuentran frente a elevadas concentraciones de aldosas o fosfato de aldosas. En los filamentos de proteína tau se encuentran presentes AGE modificados y productos Amadori helicoidales. Como consecuencia de la glicación la proteína tau genera ROS y estrés oxidativo en neuronas, lo que conduce a la activación de la transcripción vía NFκB. Cuando el estrés oxidativo deriva de elevados niveles de ROS, ocasiona lesión y muerte celulares, sin embargo, concentraciones moderadas de ROS afectan a las vías señalizadoras. De esta manera, el NFκB se activa por las ROS y las ROS, generadas por la proteína tau, inician el mecanismo que origina la traslocación al núcleo del complejo p50/p65. También como consecuencia de la glicación, la proteína-tau ejerce impacto sobre la expresión de genes neuronales, especialmente de citoquinas. Se ha observado la activación transcripcional de la interleuquina 6 (IL-6) en el lugar NFκB del promotor IL-6.

5. Especies activas de oxígeno y enfermedad de Alzheimer Las ROS se forman como subproductos de la respiración y metabolismo

oxidativo en todos los organismos aerobios. El oxígeno es necesario para todas las células aerobias para generar energía, pero tiene el inconveniente de generar pequeñas cantidades de especies reactivas que pueden causar lesiones en las macromoléculas. El estrés oxidativo se refiere a las consecuencias citopatológicas del desequilibrio entre la generación de ROS y la capacidad de la célula para defenderse de ellos.

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Una hipótesis unificada propone que los procesos oxidativos intervienen, a nivel individual o sinérgico, en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. Las evidencias de estrés oxidativo en cerebro de estos enfermos proceden de estudios que demuestran peroxidación lipídica, elevación de los carbonilos proteicos y en la tasa de oxidación del DNA mitocondrial. El estrés oxidativo da lugar a compuestos reactivos derivados de los lipoperóxidos, tales como el malondialdehido (MDA) y el 4-hidroxinonenal (4-HNE), los cuales inducen un espectro de modificaciones en las proteínas por entrecruzamiento o no. El estrés oxidativo interviene en la formación de las neurofibrillas, ya que se han encontrado proteínas oxidadas en dichas formaciones intracelulares (Figura 9). Las pruebas evidentes de estrés oxidativo en la enfermedad de Alzheimer se basan en los siguientes aspectos:

1. elevada vulnerabilidad del cerebro a la oxidación debido al elevado

requerimiento de oxígeno y a los bajos niveles de GSH 2. evidencias post mortem en zonas cerebrales de enfermos de Alzheimer

de elevada concentración de productos finales de oxidación, elevados niveles de proteínas modificadas por oxidación (AGE), de aumentos en la oxidación del DNA y de lípidos de membrana y modificaciones oxidativas en las marañas neurofibrilares.

3. procesos inflamatorios en áreas del cerebro afectadas por enfermedad

de Alzheimer, 4. generación directa o indirecta de ROS por los agregados de β-

amiloide. El mecanismo mediante el cual el β-amiloide causa degeneración neuronal

permanece aún poco claro y una teoría que emerge cada vez con más fuerza es que el β amiloide se encuentra en casos de microambientes de estrés oxidativo. Inicialmente se demostró que el propio péptido β amiloide era capaz de promover toxicidad en células nerviosas en cultivo. En dicha toxicidad se encontraba implicada la generación de ROS y estrés oxidativo, ya que se ha observado que la vitamina E protegía a las células de sufrir lesión. Posteriormente se encontró que también el β amiloide generaba ROS en medio acuoso, por un mecanismo dependiente del oxígeno, pero independiente de metales y que el β amiloide era un iniciador muy poderoso de la peroxidación lipídica. El peróxido de hidrógeno (H2O2) media la toxicidad del β amiloide y

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además este péptido induce la actividad del factor de transcripción NFκB a través de estrés oxidativo. Se ha observado, también, que la catalasa y los reactivos que inhiben las flavina oxidasas bloquean la producción de H2O2 y la toxicidad del β amiloide.

Figura 9. Mecanismo que conduce a la muerte neuronal en enfermedad de Alzheimer. Las

ROS promueven la peroxidación de los ácidos grasos poliinsaturados de la membrana y la formación de aldehidos tales como malondialdehido y 4-hidroxinonenal (HNE), que son capaces de alterar las ATPasas de membrana y elevar el calcio intracelular que inicia una cascada de eventos que a su vez generan ROS y muerte de la neurona (Martín 1999, modificado).

Como se comentó con anterioridad, los AGE son una familia de productos

complejos que surgen por modificación post traduccional de las proteínas y se deben a la reacción de los azúcares reductores con los grupos amino de las proteínas, vía la reacción de Maillard. Aunque los AGE se han estudiado principalmente por su implicación en la diabetes, está cada vez más claro que la glicación de las proteínas ocurre in vivo en indivíduos no diabéticos. El estrés oxidativo, además, incrementa la frecuencia de autooxidación de los lípidos insaturados de la membrana, inducida por el radical hidroxilo y la fragmentación de los lípidos hidroperóxidos resultantes, mediada por metales reducidos, y libera aldehidos reactivos que pueden modificar las proteínas de una manera similar a lo que ocurre en los AGE. Estas modificaciones ejercen un mayor efecto en proteínas ricas en lisina con neutralización de su carga y la consiguiente alteración de las interacciones electrostáticas entre proteínas y ocasionalmente con entrecruzamientos intra e intermoleculares.

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Aunque la formación de AGE o la situación de estrés oxidativo pueden individualmente conllevar a modificaciones patológicas de las proteínas neuronales, estos dos factores juntos pueden actuar de manera sinérgica y acelerar la alteración de las proteínas.

La formación de aductos y la evolución de los AGE, se acelera en

presencia de oxígeno en un proceso denominado glicoxidación (glicación y oxidación). La condensación de azúcares reductores con los grupos amino de las proteínas y el subsiguiente reordenamiento en la reacción de Amadori, antes citada, conduce a un equilibrio entre el enediol y la enolamina que puede catalizar la reducción, dependiente del NADPH, del O2 a anión superóxido. Tal acción redox origina lesión en los lugares específicos de la proteína donde se inserta el azúcar, y un ejemplo de esto es que las proteínas glicadas contienen invariablemente modificaciones oxidativas. Además, la glicación de los lípidos de las membranas puede ser el mecanismo iniciador de la peroxidación lipídica. La evidencia de este panorama es que el malondialdehido (MDA), producto de la peroxidación lipídica, cuya concentración se encuentra elevada en las marañas neurofibrilares, se induce por los AGE en líneas celulares en cultivo. En resumen, la modificación de proteínas por oxidación, glicación y los productos de la peroxidación lipídica pueden tener lugar por mecanismos aditivos y sinérgicos.

Se ha revelado un incremento significativo en la oxidación de proteínas en

el polo frontal y occipital de humanos ancianos normales comparados con controles jóvenes. Otras regiones del cerebro revelaron que el contenido en carbonilos proteicos se incrementa en cerebelo de pacientes con enfermedad de Alzheimer en un 42% en el hipocampo y en un 37% en el lóbulo parietal inferior, cuando se establecieron comparaciones con controles sanos de la misma edad. Estos y otros estudios han demostrado que en cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer las proteínas están más oxidadas que en controles sanos y se encuentran en mayor proporción en regiones que contienen alteraciones histopatológicas severas. La oxidación del DNA es tres veces superior en el DNA mitocondrial en la corteza parietal, mientras que el DNA nuclear muestra incrementos menores aunque significativos.

En la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer han de considerarse

diversas vías que promueven el estrés oxidativo. En primer lugar, se ha observado que el hierro, elemento que cataliza la generación de las ROS (reacción de Fenton), se encuentra en concentraciones más elevadas de lo normal en las neuronas que acarrean marañas neurofibrilares. Dicho incremento

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origina modificaciones en las proteínas cuya reacción con azúcares reductores se encuentra catalizada por iones metálicos. En segundo lugar, la microglia se activa e incrementa el número de sus células en enfermedad de Alzheimer y representa una de las mayores fuentes de radicales libres. En tercer lugar, el aluminio se encuentra también en concentraciones elevadas en neuronas que poseen marañas neurofibrilares, y este elemento se sabe que ejerce un efecto estimulador sobre la peroxidación lipídica inducida por hierro. Además, las alteraciones en la membrana que se observan en neuronas y neuritas en degeneración, quizás como resultado de la peroxidación lipídica, conducen a un influjo de calcio que puede desestabilizar el citoesqueleto y activar enzimas específicos. Una nueva hipótesis respecto a los radicales libres y la enfermedad de Alzheimer, propone que los fragmentos del β amiloide forman espontáneamente radicales libres de péptidos por un mecanismo independiente de metales, e induce la acumulación de ROS en cultivos de neuronas y sinaptosomas. (Figura 9).

La hipótesis del estrés oxidativo en la enfermedad de Alzheimer se basa en

lo siguiente: 1. La neurotoxicidad del β amiloide mediada por peróxidos y por

peroxidación de los lípidos de la membrana, que conduce a la muerte celular.

2. El β amiloide recluta y activa las células de la microglia (células inflamatorias) las cuales, a su vez, generan grandes cantidades de ROS.

Algunos inhibidores de proteasas (α1-tripsina, trombina, catepsinas B y D)

se encuentran en asociación con las lesiones patológicas de la enfermedad de Alzheimer y este desequilibrio proteolítico se ha hecho también responsable de muchas de las características de esta enfermedad. Tal desequilibrio puede originarse debido a la inactivación de la α1-antitripsina, que surge de la oxidación de la metionina del centro activo, en un mecanismo patogénico similar al descrito en el enfisema.

Existe una asociación estrecha entre los elevados niveles de enzimas

antioxidantes, superóxido dismutasa y hemooxigenasa y las anormalidades en el citoesqueleto que aparecen en la enfermedad de Alzheimer. Aparentemente, las neuronas normales no muestran incrementos en los marcadores antioxidantes, lo que parece indicar que existe una estrecha relación entre las anormalidades del citoesqueleto y el estrés oxidativo. Esta observación hace pensar en una

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respuesta de la célula frente al estrés oxidativo, aunque la elevación de la actividad superóxido dismutasa puede no ser necesariamente protectora si no va acompañada de un incremento concomitante de la catalasa. La oxidación enzimática del hemo por la hemooxigenasa-1 para generar la biliverdina, un potente antioxidante, indica también una respuesta celular al estrés oxidativo, ya que este enzima se induce por estrés oxidativo y por choque térmico. Se han detectado incrementos en la inmunoreactividad a la hemooxigenasa en neuronas con marañas neurofibrilares y en astrocitos de cerebros con enfermadad de Alzheimer. Por otro lado, esta reacción da lugar a la producción estequeométrica de monóxido de carbono que posee propiedades neurotransmisoras que han de considerarse por sus posibles efectos farmacológicos

5.1. Estrés oxidativo y muerte celular. Excitotoxicidad del glutamato, El estrés oxidativo se ha asociado con ambas formas de muerte celular,

apoptosis y necrosis. El estrés oxidativo puede inducir la necrosis ya que la agresión de las ROS a los lípidos puede alterar los gradientes iónicos de membrana y producir ruptura de la membrana plasmática y lisis celular. Por ejemplo, las neuronas de una línea celular hipotalámica, sufren necrosis al exponerse al sulfóxido de sulfoximina, un agente que depleciona el GSH. Las neuronas corticales cuando se cultivan en medio pobre en cisteina, aminoácido precursor del GSH, mueren por apoptosis. La inhibición de la superóxido dismutasa induce también la apoptosis. La lesión oxidativa del DNA es uno de los desencadenantes de la apoptosis. El DNA oxidado produce la activación de un enzima nuclear, la poli (ADP-ribosa) polimerasa, que se encuentra involucrada en la reparación del DNA. La proteolisis de esta enzima impide su acción en los lugares de lesión del DNA.

Es muy poco lo que se conoce acerca de los factores específicos que

determinan los mecanismos mediante los cuales el estrés oxidativo puede ser el mediador de la apoptosis de las neuronas. Sin embargo, se sabe que estos procesos juegan un papel importante en el fenotipo celular, la ubicación de la lesión oxidativa y la intensidad de la agresión. Si esta última es elevada el resultado es necrosis, y si es baja se produce la apoptosis.

La vulnerabilidad selectiva de los sistemas neuronales es una de las

características notables de las alteraciones degenerativas dependientes de la edad. En el mecanismo que desencadena la muerte neuronal interviene el estimulo excesivo de los receptores ionotrópicos del glutamato. El glutamato y

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los aminoácidos acídicos relacionados son los mayores neurotransmisores excitatorios en el cerebro y pueden ser utilizados por el 40% de las sinapsis. De esta manera, existen dos mecanismos convergentes, el estrés oxidativo y la activación excesiva de los receptores ionotrópicos del glutamato. Ambos representan procesos secuenciales que interaccionan proporcionando una vía final común para la vulnerabilidad celular en cerebro. La amplia distribución de los procesos que regulan el estrés oxidativo y median la transmisión glutamaérgica, puede explicar la variedad de alteraciones en las que los dos mecanismos se encuentran implicados.

Existen tres subtipos de receptores ionotrópicos del glutamato que se

denominan en base a sus agonistas: el N-metil-D-aspartato (NMDA), el quiscualato/ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA) y el ácido kaínico (KA). El clonaje de los genes que codifican los polipéptidos que forman los diversos receptores del glutamato, revela una gran heterogeneidad molecular, diversidad farmacológica, y variación biofísica. El cambio post transcripcional de los mRNA transforma los receptores no NMDA de tal forma que permiten el paso al Ca2+ y mantienen sólo el Na+ circulante (Figura 10).

Figura 10. Excitotoxicidad del glutamato y receptores α-hidroxi-glutamaérgicos

ionotrópicos. Vías intracelulares que contribuyen al estrés oxidativo en neuronas. PLA2 = fosfolipasa A2; PL = fosfolípidos; AA = ácido araquidónico; PKC, proteína quinasa C; NO, óxido nítrico; NOS, óxido nítrico sintasa; O2

.-, radical superóxido; OONO-, peroxinitrito; SOD, superóxido dismutasa.

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La excitotoxicidad se refiere a la excesiva activación de los receptores ionotrópicos del glutamato que conlleva a la muerte celular. La excitotoxicidad es importante en la degeneración neuronal después de agresiones agudas como hipoxia, isquemia y trauma y juega un papel importante en las enfermedades neurodegenerativas. Aunque el influjo del sodio a través de los canales iónicos dependientes del glutamato, puede mediar formas agudas de degeneración neuronal, el calcio también es crítico a la hora de intervenir en la muerte celular inducida por activación de los receptores NMDA y no NMDA.

Es un hecho aceptado que el estrés oxidativo se encuentra involucrado en

la muerte celular por excitotoxicidad. Después de la activación de los receptores NMDA y KA, el número de radicales libres se eleva y se registran alteraciones oxidativas en los lípidos. Los eventos ligados a los receptores del glutamato, pueden activar vías intracelulares generadoras de radicales libres, desacoplantes del transporte electrónico mitocondrial, que deprimen los sistemas antioxidantes. Además, los mismos radicales libres pueden elevar la liberación del glutamato o disminuir su eliminación de las crestas sinápticas, lo que conlleva a una elevación de la concentración de glutamato en la hendidura sináptica. Esto conduce a un círculo vicioso que se perpetúa a si mismo, en el cual la activación de los receptores del glutamato produce una elevación en la tasa de ROS, la cual origina una posterior activación de los receptores del glutamato.

La pérdida de las neuronas del hipocampo por apoptosis es una

característica prominente de la enfermedad de Alzheimer. Un factor que contribuye a la susceptibilidad de la muerte celular prematura surge de los efectos citotóxicos de la deposición del β amiloide en los lugares cercanos a la degeneración neuronal. Al mismo tiempo, las neuronas que sufren apoptosis generan especies tóxicas derivadas del β-amiloide. La patogénesis de la enfermedad de Alzheimer implica la formación y deposición del β-amiloide, que ocurre como consecuencia genética (15% de los casos) o de otros factores (85% de los casos), lo cual provoca la activación parcial de las vías apoptóticas en neuronas susceptibles. Las células sensibilizadas producen, a su vez, elevadas cantidades del β amiloide, lo que lleva a exacerbar un ciclo que culmina en la pérdida neuronal progresiva. Durante la apoptosis la caspasa-3, además de intervenir en la rotura del DNA dando lugar a la apoptosis, actúa sobre el APP y lo hidroliza. El lugar predominante de acción proteolítica de la caspasa es en el dominio citoplasmático del APP y ocurre principalmente en las neuronas del hipocampo, en condiciones de excitotoxicidad aguda o lesión

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cerebral isquémica. La hidrólosis del APP por la caspasa influye en la formación del β amiloide. Por tanto, la caspasa tiene un doble papel: proteolisis del APP con la consiguiente elevación del β amiloide y apoptosis y muerte neuronal

5.2 Transporte electrónico mitocondrial Entre las vías intracelulares específicas que directa o indirectamente

contribuyen al estrés oxidativo en las enfermedades degenerativas se encuentran: el transporte electrónico mitocondrial, la xantina oxidasa, la activación de las células de la microglia y las vías asociadas al óxido nítrico (NO), el metabolismo del ácido araquidónico y la activación de proteasas. Entre ellas juega el papel más importante el transporte electrónico mitocondrial por ser la mitocondria la fuente intracelular primordial en la generación de ROS. La dispersión de electrones a lo largo de la cadena electrónica, genera ROS. Esta producción se eleva en presencia de factores que estimulan la respiración, tales como concentraciones bajas de sustratos dependientes del NAD+, succinato, ADP y oxígeno. Las mitocondrias son críticas en amortiguar el calcio intracelular y el secuestro mitocondrial del calcio puede desacoplar la respiración y producir acidosis metabólica. Está demostrado que las mitocondrias intactas producen ·OH cuando se exponen a concentraciones patológicas de calcio y ADP.

Las mitocondrias son importantes en la inducción del estrés oxidativo por

excitotoxinas. La activación de los canales iónicos dependientes del glutamato pone a la mitocondria en un doble peligro de generar ROS:

(a) la despolarización de las membranas, activa el metabolismo oxidativo

neuronal, con el objeto de proporcionar el ATP necesario que ha de utilizarse en las bombas de sodio;

(b) al elevarse el calcio intracelular, el secuestro de dicho elemento desacopla la respiración mitocondrial.

La elevada generación de ROS puede lesionar proteínas, lípidos y DNA,

lo que conlleva a una posterior producción de ROS, unida a un descenso en los niveles energéticos de la mitocondria. Existen evidencias que demuestran que las deficiencias en el metabolismo energético mitocondrial pueden causar neurodegeneración. Tambien se ha demostrado que la excitotoxicidad se encuentra involucrada en la muerte celular inducida por descensos de la energía

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mitocondrial La reducción de los depósitos de energía celular causan variaciones en el

potencial de membrana, lo cual elimina el bloqueo por Mg2+ de los receptores NMDA, permitiendo la activación persistente del estos receptores por el glutamato endógeno. En apoyo a esta hipótesis está el hecho demostrado que los antagonistas del glutamato aminoran la muerte neuronal inducida por toxinas mitocondriales. Estas y otras evidencias posteriores, sugieren que las ROS generadas por la cadena de transporte electrónico y/o por vías intracelulares ligadas a la activación del receptor del glutamato, son la causa de la degeneración de las neuronas.

5.3. Daño oxidativo al DNA y mutaciones en el DNA mitocondrial Son muchas las evidencias que apoyan un papel para la lesión oxidativa al

DNA en el envejecimiento y en las enfermedades neurodegenerativas incluyendo la enfermedad de Alzheimer. El ataque al DNA por las ROS, particularmente por el radical hidroxilo, da origen a roturas de la cadena DNA–DNA, entrecruzamientos DNA-proteína y formación de más de 20 bases modificadas por aductos. Además los subproductos insaturados α, β-aldehídicos de la peroxidación lipídica, el 4-hidroxinonenal y la acroleína, interaccionan con las bases del DNA y producen aductos exocíclicos. La modificación de las bases por interacción directa con las ROS o con aldehidos origina mutaciones y síntesis proteica alterada. Algunos estudios sobre estas bases modificadas por aductos en cerebro de enfermos de Alzheimer muestran elevadas concentraciones de 8-hidroxiguanina, 8-hidroxiadenina, 5-hidroxicisteína y 5-hidroxiuracilo, un producto de la degradación de la citosina, en DNA nuclear y DNA mitocondrial aislado de regiones vulnerables de cerebro. También se han detectado incrementos de guanina modificada por aductos acroleína en el hipocampo de pacientes con enfermedad de Alzheimer. Por otro lado, los mecanismos de reparación por excision de bases muestran una disminución en la reparación de la 8-hidroxiguanina en las regiones vulnerables del cerebro. También se han encontrado niveles elevados de 8-hidroxiguanina, 8-hidroxiadenina y 5,6-diamino-5-formamidopirimidina en DNA nuclear y mitochondrial aislado de regiones vulnerables de cerebro de pacientes con desequilibrios cognitivos débiles, la manifestación clínica más temprana de la enfermedad de Alzheimer, lo que sugiere que el daño oxidativo al DNA es un evento temprano en la enfermedad y no es un mero fenómeno secundario.

El cerebro necesita producir grandes cantidades de ATP a través de la

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fosforilación oxidativa mitocondrial. En tejido cerebral con enfermedad de Alzheimer se ha demostrado que existe un desacoplamiento parcial de esta vía, y también una reducción sustancial en la actividad citocromo c oxidasa en la corteza cerebral, lo cual se relaciona con la formación de las marañas neurofibrilares. En el mecanismo responsable de estas alteraciones a nivel de la fosforilación oxidativa mitocondrial, han de estar implicadas mutaciones en el DNA mitocondrial, las cuales causan severas deficiencias en la cadena de transporte electrónico, que van a dar lugar a fenotipos degenerativos tales como la sordera sensorineural, ataxia, cardiomiopatía y la propia enfermedad de Alzheimer. Se ha demostrado que existe un incremento en las mutaciones del DNA mitocondrial, que aparece en una serie de tejidos del organismo, entre los que se incluye el cerebro, y se ha observado que este acúmulo de mutaciones se encuentra acelerado en casos de enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, no está claro el papel de estas mutaciones en la patogénesis de esta enfermedad, ya que no parecen ser la causa primaria, aunque pueden contribuir a su inicio.

Figura 11. Estrés oxidativo y enfermedad de Alzheimer. Esquema que muestra las

interacciones de las especies reactivas de oxígeno, las placas seniles y las marañas neurofibrilares. βA, beta amiloide; cdc5, quinasa dependiente de ciclina; p35 activador específico de neuronas que por acción de la calpaína produce p25; cdc5/p35 complejo, es otra proteína quinasa implicada en la fosforilación de tau; ROS, especies reactivas de oxígeno; PKC, proteína quinasa C, ERK2, quinasa activada por señales extracelulares; Src virus del sarcoma de Rous; RTK, receptor tirosina quinasa.

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6. Procesos inflamatorios, microglia y óxido nítrico El cerebro se ha considerado como privilegiado desde el punto de vista

inmunológico. La existencia de una barrera hemato-encefálica, la ausencia de drenage linfático convencional y su insólita respuesta al tejido trasplantado, han reforzado este concepto. Tampoco el cerebro muestra dolor e hinchazón típicos de otros tejidos periféricos. Sin embargo, se ha observado, por medios histoquímicos y de biología molecular, que el cerebro posee un sistema inmuno endógeno muy activo y que en casos de patologías cerebrales, la inflamación crónica juega un papel importante en la muerte neuronal progresiva en muchas enfermedades degenerativas. Estos descubrimientos han llevado a proponer que la medicación antiinflamatoria podría ser una terapia adecuada para retrasar el progreso degenerativo. El sistema inmune del cerebro, como el de otros tejidos está diseñado como mecanismo de defensa para eliminar extraños invasores y eliminar resíduos. Cualquier proceso de inflamación crónica puede lesionar el tejido sano, y el cerebro, en lugar de ser el órgano privilegiado inmunológicamente, al que antes aludíamos, puede más bien ser particularmente vulnerable ya que las neuronas como células postmitóticas, no pueden ser fácilmente reemplazadas. La microglia, el sistema cerebral representativo de macrófagos y fagocitos, juega un papel clave en la neurodegeneración.

Es un hecho demostrado en el shock séptico, como también en otras

patologías del sistema nervioso central (CNS), que cantidades excesivas de citoquinas tales como el factor de necrosis tumoral α (TNFα), la interleuquina 1 (IL1), ROS y NO, se encuentran implicadas en la la enfermedad de Alzheimer. También se sabe, y se ha citado anteriormente, que son varias las vías de generación de ROS en el CNS: (1) la cadena de transporte electrónico mitocondrial; (2) el estallido respiratorio de las células de la microglia activa; (3) la xantina oxidasa; (4) la autooxidación de las catecolaminas; (5) el metabolismo de los eicosanoides, etc. De todas estas vías juega un importante papel la que se refiere a la producción de ROS por el sistema fagocitario en el CNS. Los macrófagos y monocitos infiltrados unidos a las células de la microglia residentes, pueden generar grandes cantidades de anión superóxido, peróxido de hidrógeno y NO. La existencia de la microglia en cerebro formada por leucocitos que se generan fuera del CNS, fue descubierta por Del Rio Ortega en 1932. Las células de la microglía se generan en la médula ósea, después entran en la circulación como monocitos y migran al cerebro durante la última fase de la vida embrionaria, estableciendo allí su residencia permanente.

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Las células de la microglia son una de las principales fuentes de ROS, las cuales actúan sobre las macromoléculas celulares, originando la lipoperoxidación de las membranas, modificaciones oxidativas de las proteínas, y rotura de las cadenas del DNA. La activación de la microglia en las patologías cerebrales da lugar a lesión neuronal y neurodegeneración. De manera similar a lo que ocurre con los macrófagos de otros tejidos, cuando se activan liberan un gran número de productos secretorios que producen inflamación y lesiones subletales o letales al CNS. Estos productos son citoquinas, factores de coagulación factores del complemento, derivados del ácido araquidónico, proteasas, ROS y NO·. Como ciertas áreas del cerebro son ricas, tanto en microglia como en hierro, el radical superóxido producido por las primeras, puede actuar sobre la ferritina obligándola a liberar el hierro. El hierro liberado en forma bivalente (Fe2+), se combina con el peróxido de hidrógeno para formar el peligroso radical el ·OH, que iniciará múltiples lesiones celulares. La microglia activa produce también grandes cantidades de NO· que puede reaccionar con el radical superóxido para formar peroxinitrito (OONO-), un poderoso oxidante que oxida los grupos SH de las proteínas, los lípidos, proteínas y DNA. El peroxinitrito no actúa por sí solo sino a través de su descomposición en la cual libera el radical ·OH.

La modulación de la generación de radical superóxido puede ayudar a

preservar los niveles fisiológicos de ROS que son necesarios para que la microglia ejerza su función defensiva en cerebro y los antioxidantes fisiológicos como la SOD pueden, en un momento determinado, ser incapaces de prevenir la formación rápida de peroxinitrito en las patologías cerebrales donde la formación de NO· es muy elevada. Aunque el tratamiento con antioxidantes es ciertamente un tratamiento potencial para combatir la elevada generación de ROS por la microglia activa, el reducir la generación de las ROS específicamente inhibiendo el sistema oxidasa dependiente de NADPH del estallido respiratorio, ha de ser útil en aquellas condiciones en las que la microglia sea la fuente principal de ROS. Se espera que la combinación de estos dos procedimientos terapéuticos: antioxidantes e inhibidores de la NADPH oxidasa puedan mejorar aquellas patologías cerebrales en las que se encuentran implicadas la microglia y la generación de ROS.

Las evidencias de reacción crónica inflamatoria en la enfermedad de

Alzheimer y en otras enfermedades degenerativas, las han proporcionado los elevados niveles de citoquinas inflamatorias y sus receptores en células cerebrales. Se han detectado interacciones de dichas citoquinas y los componentes de las placas seniles. Se cree que cualquier agresión, complicada

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quizás por alteraciones genéticas, causa una lesión neuronal inicial con la deposición de resíduos que la microglia puede encontrar dificiles de digerir. Las células de la microglia se activan e inician su cascada de reacciones. Los productos tóxicos segregados conllevan a una mayor muerte celular, la cual, incita a la reacción inflamatoria. Esta reacción es una fuerza autodestructiva en la cual el ataque fagocítico lesiona irreversiblemente a las expectantes neuronas. Se desencadena un círculo vicioso de agresiones que se sostiene por las células gliales localizadas. Todo el cúmulo de evidencias de reacciones crónicas inmunes en cerebro con Alzheimer ha llevado a proponer que el tratamiento con agentes antiinflamatorios puede hacer más lento el desarrollo de la enfermedad o retrasar su aparición. Es importante tener en cuenta que esta terapéutica es diferente de los intentos para reemplazar la pérdida de actividad colinérgica con fármacos como la tacrina, o los encaminados a estimular el metabolismo cortical con nootrópicos. Tales terapias no intentan retrasar la destruccion de las neuronas corticales, lo cual es la mayor causa del deterioro mental. Se ha propuesto un tratamiento antiinflamatorio unido a antioxidantes, vitamina E, estrógenos, selegilina y una mezcla de mesilatos ergoloides. Los fármacos antiinflamatorios y la nicotina se aplican por sus efectos neuroprotectores o amplificadores de neurotransmisores. También se propone el tratamiento con tacrina unida a la desferroxamina, quelante del hierro y aluminio, como antioxidante.

En la enfermedad de Alzheimer, las células de la microglia aparecen

arracimadas sobre las placas neuríticas. Estas células fagocíticas cuando se asocian con las placas muestran una elevada actividad que se detecta por la intensa inmunoreactividad debida a las citoquinas, la cual se relaciona con el estado de activación de estas células. La microglia en su estado activo produce radical superóxido y NO·, principales mediadores de la neurotoxicidad. La inducibilidad de la expresión de la Mn-superóxido dismutasa, en la vecindad de las placas amiloides, da buena cuenta de la elevada producción del radical superóxido en estas células.

Se han identificado interacciones del β amiloide con la membrana celular,

que pueden explicar como el β amiloide lesiona las neuronas y las células endoteliales vasculares y activan las células de la microglía. Estas últimas pueden internalizar microagregados de β-amiloide, vía un receptor scavenger y pueden degradar el β-amiloide adicionado a un medio de cultivo. Ello hace pensar, que la incorporación del β-amiloide por la microglia, vía ese receptor, puede jugar un papel en el aclaramiento del amiloide, que se produce

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continuamente en cerebro de enfermos de Alzheimer. Este receptor no se expresa en los astrocitos, neuronas o estructuras asociadas a los vasos. En casos de enfermedad de Alzheimer existe una elevada expresión de este receptor en las células activas de la microglia en la vecindad de las placas amiloides, Receptores scavengers de la clase A median la adhesión de las microglias a superficies cubiertas de fibrillas de amiloide lo que conduce a la producción de ROS y a la inmovilización celular. Las células de la microglía se adhieren a la fibrilla de amiloide mediante sus receptores scavengers de la clase A, quizás en un intento de eliminarlas del medio extracelular. La elevada densidad de los ligandos del receptor scavenger, presentes en esos depósitos amiloides causa la inmovilización de las células de la microglia que se ponen en contacto con ellas, y las inducen a segregar citoquinas, ROS y especies nitrogenadas que lesionan a las células vecinas. En otro tipo de experimentos se ha evidenciado que el β-amiloide se une a un receptor de membrana RAGE (receptor de AGE) en la superficie de neuronas, células endoteliales vasculares y de la microglia. Esta unión desencadena reacciones que generan estímulos oxidativos citotóxicos que pueden enfocar sus efectos sobre estas células.

En la enfermedad de Alzheimer las células activas de la microglía son la

conexión entre la deposición del β-amiloide y la degeneración neuronal. Una respuesta respiratoria inducida en la microglía por el amiloide, puede ser otra de las fuentes de equivalentes oxidativos que hay que considerar en relación con las alteraciones proteicas asociadas a las placas. Se han propuesto otros mecanismos para explicar la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer, en los cuales las células de la microglía activadas por el β-amiloide producen una gran cantidad de NO y pueden causar la muerte celular. La capacidad de los inhibidores de la NOS (óxido nítrico sintasa) y de la hemoglobina como atrapadora del NO, de interferir la cascada de reacciones que conducen a la muerte celular, asignan un papel clave para el NO en estos procesos.

Como las células de la microglía activas, se encuentran alrededor de las

placas amiloides, es lógico pensar que estas placas han de ser sitios de inflamación crónica. Se ha descrito que el β-amiloide puede activar la microglía y desencadenar la producción de mediadores proinflamatorios y citotóxicos. Entonces el β-amiloide intensifica la liberación de IL-1 por la microglía y potencia la secreción de citoquinas por los astrocitomas activados por la IL-1β. Se ha descrito también un efecto sinérgico entre el β-amiloide y el interferón γ (IFN γ) en el desencadenamiento de la producción de intermediarios reactivos de nitrógeno y TNFα por la microglia.

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7. Antioxidantes y de neuroprotección Aunque esta enfermedad fué descrita por primera vez hace más de cien

años (Alzheimer, 1907), la patogénesis no está aún totalmente esclarecida. Se han emitido numerosas hipótesis, entre las que cabe destacar: la deficiencia de neurotransmisores/acetilcolina, la deficiencia del metabolismo energético, la cascada del β amiloide y el estrés oxidativo

Son muchas las evidencias obtenidas por histopatología clásica y por

biología molecular, que apoyan el concepto que la lesión molecular infligida por las ROS, juega un papel en la muerte celular asociada a la enfermedad de Alzheimer. Al descubrirse que la vitamina E protege a las neuronas de las reacciones tóxicas asociadas a esta enfermedad, ha hecho que se traslade a la clínica el tratamiento con esta vitamina, la cual se ha observado que actúa retrasando los acontecimientos patológicos y puede ser un medio beneficioso en pacientes con un grado moderado de enfermedad de Alzheimer.

En estudios histopatológicos de la enfermedad de Alzheimer, se han

encontrado muchas signos de reacciones oxidativas. Uno de los responsables de la creación del microambiente oxidativo en las células nerviosas es el β amiloide de las placas seniles en las áreas cerebrales afectadas por la enfermedad. La neurotoxicidad del β amiloide se debe a que genera H2O2, el cual llevará a la peroxidación de los lípidos de la membrana y de aquí a la lisis de las neuronas. Como se indicó anteriormente, la vitamina E, agente lipofílico atrapador de radicales libres, al igual que los estrógenos, protegen a las neuronas de la toxicidad oxidativa del β-amiloide y de otros agentes oxidativos. Aunque los antioxidantes actúan en las neuronas como protectores inespecíficos, ya que no se conoce que tengan un objetivo en la secuela de acontecimientos patológicos que conducen a la enfermedad de Alzheimer, su efectividad está demostrada y es necesario profundizar en su actividad para que su aplicación en clínica resulte más efectiva. Es un hecho indiscutible que cada vez se conocen con más detalle las respuestas celulares a la agresión oxidativa que conducen a la muerte celular. Por ello, interesa investigar cómo los antioxidantes antes citados interfieren con vías de transducción de señales que modifican los programas genéticos. El estudio de los mecanismos moleculares de neuroprotección mediada por antioxidantes, puede llevarnos al descubrimiento de otros más específicos o de mejorar la aplicación clínica, preventiva o terapéutica, de los ya conocidos.

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Para la transferencia de señales extracelulares las células utilizan las vías de transducción y los factores de transcripción nucleares. El NFκB ha sido el primer factor de transcripción descubierto que responde directamente al estrés oxidativo inducido por ROS. Este factor, fue identificado inicialmente como una proteína linfoide específica, que se une al gen κ del intensificador intrónico de la cadena ligera y aparece como una proteína heterodimérica. Como se ha visto que la mayoría de estímulos que inducen la actividad del NFκB inducen también la formación de ROS, este factor de transcripción ha ganado interés por jugar un papel en la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas asociadas al estrés oxidativo. Además, las neurotoxinas como el amiloide y el glutamato activan el NFκB. Más interesante aún, el haloperidol, un fármaco neuroléptico frecuentemente utilizado en casos de psicosis, induce la actividad de enlace al DNA y la actividad transcripcional del NFκB en células del hipocampo. La preincubación de estas células con vitamina E, bloqueó casi por completo la actividad del NFκB, sugiriéndose que este factor ha de jugar algún papel en la muerte celular inducida por el haloperidol. Estos y otros resultados han llevado a la conclusión de que la acción protectora de los antioxidantes puede reflejarse a dos niveles: (1) atrapando los radicales libres y preveniendo la peroxidación lipídica, y (2) suprimiendo la activación de factores de transcripción implicados en la muerte celular de las neuronas inducida por estrés oxidativo.

Recientemente ha recibido un gran interés la propiedad neuroprotectora de

los cannabinoides como medio de mitigar los sintomas neurodegenerativos. Ciertos cannabinoides ejercen efecto protector frente a los deletereos efectos del β amiloide y son capaces de reducir la fosforilación de tau. La propensión de los cannabinoides de reducir el estrés oxidativo y la neurodegeneración provocados por el β amiloide, y la estimulación de la neurogénesis con la expresión de neurotropina, son propiedades interesantes que pueden ser beneficiosas en el tratamiento de la enfermedad. El Δ9-tetrahidrocannabinol inhibe la acetilcolinesterasa y limita la amiloidogénesis lo cual producirá mejoría en la transmisión colinérgica y retrasará la progresión de la enfermedad. Los receptores de cannabinoides CB2 se asocian con la microglia activa localizada dentro de la placa, por lo que se sugiere que tal receptor puede ser un objetivo prometedor para la enfermedad, merced a su capacidad para frenar la cascada neuroinflamatoria característica de la enfermedad. Los agonistas CB2 ofrecen la ventaja de no presentar efectos psicoactivos, pero presentan efectos colaterales tales como la inmunosupresión. Por tanto, los cannabinoides ofrecen facetas múltiples para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer al

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proporcionar neuroprotección y reducir la neuroinflamación, con simultáneo apoyo a los mecanismos intrínsecos de reparación al aumentar la expresión de neurotropina e intensificando la neurogénesis.

8. Estrategias terapéuticas En los últimos años se ha realizado un esfuerzo considerable dirigido hacia

el descubrimiento de la causa de la enfermedad de Alzheimer, con la esperanza de encontrar un tratamiento farmacológico eficiente e inocuo. De acuerdo con todo los anteriormente expuesto, las estrategias terapéuticas que han permitido con mayor o menos éxito en un principio, hacer frente a esta enfermedad se basaron en el estrés oxidativo (Figura 11), la inflamación y la deficiencia de neurotransmisores colinérgicos.

Entre las varias hipótesis para explicar el desarrollo y etiología de la

enfermedad de Alzheimer, la hipótesis del estrés oxidativo fue una de las más convincentes, pues hoy no se duda de la implicación de las ROS en las enfermedades neurodegenerativas. Por ello que en muchas investigaciones se haya estudiado el papel de los antioxidantes como agentes neuroprotectores. Entre los antioxidantes, se propuso que la vitamina E y los estrógenos poseían acción protectora y actúaban retrasando los signos de la enfermedad. Otro grupo de antioxidantes estudiado fueron los quelantes del hierro debido a que la eliminación de este elemento evitaba la formación de ROS e inhibía la peroxidación lipídica. La administración sostenida de desferroxamina, quelante del hierro trivalente, a enfermos de Alzheimer, retrasó la progresión de la enfermedad.

La inflamación es otro de los síntomas de la enfermedad de Alzheimer

producida principalmente por la activación de la microglia y la muerte neuronal. Se observó que la administración de antiinflamatorios no esteroideos podía retrasar la progresión de la enfermedad. El principal efecto de estos antiinflamatorios era disminuir la actividad de las ciclooxigenasas, lo cual inhibía la síntesis de protaglandinas o aminoraba la excitotoxicidad del glutamato y con ello la generación de ROS. También se describió que las células de la microglia activadas inducían cascadas de transducción de señales que producen la liberación transitoria del calcio y la activación de la PKC. La toxicidad producida en estas reacciones podría evitarse por tratamientos con inhibidores específicos dirigidos hacia enzimas de estas vías de transducción de señales unida a la respuesta inflamatoria.

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Un gran número de observaciones han apoyado la hipótesis que la deficiencia en acetilcolina puede ser la causa de la iniciación de la enfermedad de Alzheimer. La inervación colinérgica en esta enfermedad se encuentra reducida en áreas del cerebro implicadas en el procesamiento de la información. La disminución de colina acetil transferasa1, enzima encargado de síntetizar acetilcolina, se relaciona con el número de placas de β-amiloide y con la función cognoscitiva en los pacientes de Alzheimer. Por ello, se han desarrollado diversas estrategias para elevar la neurotransmisión colinérgica, tales como: precursores de la acetilcolina, intensificadores de la liberación de la acetilcolina, inhibidores de la acetilcolinesterasa y agonistas del receptor. Entre todos ellos los inhibidores de la colinesterasa se han considerado los más prometedores, a pesar de que la tacrina (tetrahidro aminoacridina), el primer inhibidor de la colinesterasa registrado y aprobado para el tratamiento (comercializado en España en 1998), posee problemas de tolerabilidad debido a su marcada hepatotoxicidad.

Los inhibidores de la colinesterasa son, en el momento presente, el

tratamiento más utilizado en estos pacientes. Como la enfermedad de Alzheimer es una patología heterogénea, el rango de las respuestas es variable y el tratamiento individualizado. El aumento de la función colinérgica con perfiles favorables respecto a los efectos colaterales, puede crear una mejora potencial de la memoria y la cognición. A la acción de los inhibidores de la colinesterasa se han unido una serie de fármacos antiinflamatorios y antioxidantes como los estrógenos, el α-tocoferol y el ginkho biloba.

Los medicamentos, denominados antidemenciales, principalmente

utilizados, la tacrina, el donopezilo (Aricept) y la rivastigmina (Exelon y Prometax), además de muchos otros como la galantamina (Reminyl), el metrifonato, la fisostigmina y la eptastigmina, pueden frenar algo la evolución de la enfermedad, porque elevan la disponibilidad del neurotransmisor acetilcolina en el cerebro. Otros, como la memantina, un antagonista del receptor de NMDA del glutamato, normaliza la transmisión de señal afectada del glutamato. Otros en investigación, entre los que se encuentra el desarrollo de una vacuna contra el Alzheimer, que produce una sensibilización inmunológica al β-amiloide (AN1792), no han sido todo lo esperanzadores que cabría esperar, por producir en algunos pacientes meningoencefalitis. También la aplicación de células madre adultas, tal como ofrece el XCell-Center, no puede garantizar a los pacientes una mejoría del cuadro de la enfermedad.

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Los fármacos aprobados hasta la fecha sólo tratan el síntoma de la debilidad de memoria y ofrecen una mejora moderada cuya duración no llega a los dos años, pero ninguno de estos fármacos puede cambiar el curso de la enfermedad. La búsqueda de medicamentos capaces de desacelerar el deterioro se centra hoy en la placa. En algunos casos, laboratorios farmacéuticos como Wyeth, están haciendo pruebas en seres humanos con varios tratamientos que intentan anular la causa biológica del Alzheimer. El laboratorio Essne tiene como principal compuesto un anticuerpo sintético que desarrolló junto a la firma irlandesa Elan, que ataca al β-amiloide.

En el 8th International Springfield Symposium sobre Avances en la

terapia del Alzheimer, que se presentó en Montreal en 2004, se presentaron resultados alentadores, con datos positivos, sobre el uso de un nuevo medicamento en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Se trataba del Alzhemed (tramiprosato), producto de la investigación de los laboratorios canadienses Neurochem, con el que, según los datos presentados, 9 pacientes de un total de 11 con enfermedad de Alzheimer leve, se estabilizaron y mejoraron su función cognitiva. A diferencia de los tratamientos actuales, que no tratan más que los síntomas de la enfermedad, Alzhemed actúaba sobre la causa que produce la enfermedad. Diseñado para cruzar la barrera hematoencefálica, Alzhemed es un antagonista del β-amiloide. Previene la formación y deposición de amiloide en el cerebro y así modifica el curso de la enfermedad. Los efectos colaterales más frecuentes son gastrointestinales, nauseas, vómitos y diarrea. El tramiprosato desgraciadamente fracasó en la demostración de eficacia en pruebas clínicas de la fase III de mejora cognitiva a largo plazo y en Noviembre de 2007, Neurochem anunció que interrumpía su desarrollo como medicamento. Aunque la prueba de la fase III se interrumpió, todos los pacientes que completaron esta prueba clínica continuaron recibiendo el tramiprosato hasta la conclusión del estudio. De acuerdo con Neurochem, Alzhemed no estará a disposición de los participantes de las investigaciones interrumpidas en las pruebas europeas.

Respecto a Alzhemed el rechazo del FDA a las pruebas preclínicas III se

debe a que se ha demostrado que solo una pequeña cantidad de Alzhemed alcanza el cerebro de los pacientes más receptivos que sufren de esta misteriosa enfermedad, lo que ha clasificado las pruebas como no concluyentes respecto a la eficacia. Como el término no concluyente es relativo, ya que el FDA ha comunicado que no aprobará Alzhemed como medicamento a menos que Neurochem vuelva a repetir las pruebas, lo cual supone un elevado coste. Ante esta situación Neurochem ha considerado que los resultados han sido lo

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bastante concluyentes como para actuar dando a Alzhemed un nuevo nombre, Vivimind, y una nueva misión como "nutraceutico". Un nutracéutico es un producto "natural" tal como los omega-3, ginkgo biloba o multivitaminas, que presentan efectos beneficiosos, a pesar de carecer de evidencias sólidas. Vivimind, como producto natural diseñado para proteger la memoria, comercializado por Neurochem, saldrá al mercado en breve.

Otra de las últimas esperanzas son los llamados moduladores de la γ

secretasa, complejo aspartil-proteasa, dependiente de la PS1, que genera β-amiloide, de 38 a 42 aminoácidos. En la carrera por hallar una terapia para el Alzheimer se han probado fármacos que inhibían completamente la actividad de la γ-secretasa, pero resultaron excesivamente tóxicos. La inhibición total de una enzima provoca efectos colaterales no deseados, porque estos catalizadores actúan sobre muchos sustratos y tienen funciones biológicas necesarias. Kukar et al han estudiado el funcionamiento de los GSM (γ-secretase modulators). Mediante varios experimentos in vitro, han observado que estos compuestos no se unían al complejo enzimático γ-secretasa, ni a un receptor, sino al APP y han conseguido la disminución selectiva del β-amiloide de 42 amino ácidos con moléculas pequeñas moduladoras de la γ- secretasa. Los GSM, familia de fármacos antiinflamatorios no esteroideos, a la que pertenecen compuestos tan conocidos como el ibuprofeno, son capaces de unirse al precursor del β-amiloide, el APP, e impedir con ello la formación del β-amiloide. Los GSM inhiben la síntesis del β-amiloide largo, bloquean su unión y aumentan la producción de β-amiloide corto e inhiben también la agregación. La diferencia con otros tratamientos, es que los GSM son una estrategia terapéutica hacia la causa que origina el mal de Alzheimer, la acumulación y agregación del péptido β-amiloide. Los GSM están en la actualidad en estudio, a punto de entrar en la última fase de los ensayos clínicos. Los ensayos con uno de estos fármacos, el tarenflurbil (Flurizan de Myriad) se encuentran en fase III, y pronto se harán públicos los resultados de la primera parte, en la que participaron 1.600 pacientes.

9. Conclusiones Las evidencias presentadas a lo largo de esta revisión sugieren que las

modificaciones en las proteínas que se acumulan en la enfermedad de Alzheimer por efecto de las ROS, azúcares, y productos de la peroxidación lipídica, juegan un papel directo en la etiología y patogénesis de la enfermedad. Por tanto, además del perfil patogenético comunmente aceptado en la enfermedad de Alzheimer, que incluye hiperfosforilación, genotipo de

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apolipoproteína E y mutaciones del precursor de la proteína β amiloide, deben añadirse ahora mecanismos estocásticos de lesión y entrecruzamiento proteicos inducida por glicación y oxidación. Además, todas estas hipótesis son importantes para el estudio de aspectos específicos en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer y por tanto, han de ser considerados en cualquier modelo de la enfermedad. Para dar más énfasis a esto último, hay que recordar que la enfermedad de Alzheimer es una condición patológica relacionada con la edad, con una incidencia que va paralela a situaciones celulares de estrés oxidativo y a formación de modificaciones proteicas debidas a la glicación y a derivados de lipoperóxidos.

Otros factores además el estrés oxidativo y la glicación, pueden iniciar la

enfermedad de Alzheimer por alteración de las proteínas amiloide y del citoesqueleto neuronal, de una manera que las predisponga hacia una lesión permanente. Esta interpretación es importante si se considera que la variación en la susceptibilidad a estas complicaciones podría explicarse por variaciones en la competencia antioxidante. Además, será interesante observar alguna conexión entre la enfermedad de Alzheimer y alteraciones en el metabolismo de la glucosa o desequilibrios en la destoxificación de radicales libres. En cualquier caso sería conveniente profundizar sobre el uso terapéutico de agentes neutralizadores de los radicales libres y quelantes de iones metálicos sobre la enfermedad de Alzheimer.

10. Abreviaturas AGE, productos terminales de glicosilación avanzada; AMPA, α-amino-3-

hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico; APP, proteína precursora del beta amiloide; Cdk2, quinasa dependiente de ciclina; CKII, caseína quinasa II; CNS, sistema nervioso central; ERK2, quinasa inducida por señales extracelulares; FTDP-17, demencia frontotemporal ligada al cromosoma 17; GSK3, glucogeno sintasa quinasa 3; GSH, glutation reducido; GSM, modulador de la gamma secretasa; GTP, guanosina trifosfato; HNE, hidroxinonenal; IL-6, interleuquina 6; INFγ, interferón gamma; IP3, inositol trifosfato; MAC, complejo de ataque a la membrana; MAPK, proteína quinasa inducida por mitógenos; MDH, malondialdehido; NADPH, nicotinamida adenina dinucleótido reducido; NFκB, factor nuclear kappa B; NFT, marañas neurofibrilares; NMDA, N-metil D-aspartato; NO·, óxido nítrico; NOS, óxido nitrico sintasa; PS, presenilina; PDPK, proteína quinasa dirigida a prolina; PLA2, fosfolipasa A2; OONO-, peroxinitrito; PHF, filamentos helicoidales;

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PIN1, prolil isomerasa (carabina); PKA, proteína quinasa A; PKC, proteína quinasa C; PP1 y PP2, proteína fosfatasas; ROS, especies reactivas de oxígeno; sGAG, sulfoglicosaminoglicanos; SOD, superóxido dismutasa; TMAO, N-oxi trimetilamina; TNFα, factor de necrosis tumoral alfa; WNT, ligando que se une al receptor Frizzled.

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