Plataforma para el desarrollo de una Vacuna bivalente pediátrica contra

VIH-1 y M. tuberculosis.

J. Joseph et al.

Hospital Clínic de Barcelona-IDIBAPS/HIVACATUnitat de Recerca VIH/SIDA

Taller UITB 2011Taller UITB 2011Taller UITB 2011Taller UITB 2011Barcelona, 29Barcelona, 29Barcelona, 29Barcelona, 29----11111111----11111111

– Hospital Clínic de Barcelona / HIVACAT.

– MRC Human Immunology Unit, Weatherall Institute of Molecular Medicine, University of Oxford.

ESTUDIO COLABORATIVO ENTRE:

EDCTP:EDCTP:EDCTP:EDCTP: European and Developing European and Developing European and Developing European and Developing countries clinical trial partnership.countries clinical trial partnership.countries clinical trial partnership.countries clinical trial partnership.PedVacc:PedVacc:PedVacc:PedVacc: Development of an infant vaccine Development of an infant vaccine Development of an infant vaccine Development of an infant vaccine against motheragainst motheragainst motheragainst mother----totototo----child transmission of child transmission of child transmission of child transmission of HIVHIVHIVHIV----1 through breast milk.1 through breast milk.1 through breast milk.1 through breast milk.

rBCG:HIV: ¿de qué tipo de vacuna estamos hablando?

José Esparza MD, PhDBill & Melinda Gates Foundation, IAC 2004

Vector vacunal:Mycobacterium bovis

bacillus Calmette-Guérin BCG(I)

Ventajas del uso BCG como vector(I)• Perfil bioseguridad (desarrollado como vacuna

atenuada contra TB en 1920 por Calmette i Guérin ).

• Miles de millones de dosis administradas como vacunas frente a M. tuberculosis

• Producción en masa fácil y barata.• Bacteria Intracelular, reconocida por las Células

Dendríticas, Macrófagos,…

Ventajas del uso BCG como vector (II)

• Adyuvante Inmunopotenciador natural, por la composición de la pared celular.

• Induce inmunidad celular y humoral de larga duración• BCG recombinante se ha utilizado como vector vacunal frente a otras enfermedades.

• Utilizada como vacuna pedipedipedipediáááátricatricatricatrica, que se administra en las primeras semanas de vida.

• Forma parte del programa vacunal en la mayoría de países del mundo.

Vector vacunal: BCG(II)

A:A:A:A: The country currently has universal BCG vaccination program. B:B:B:B: The country used to recommend BCG vaccination for everyone, but currently does not. CCCC: The country never had universal BCG vaccination programs.Zwerling A, Behr MA, Verma A, Brewer TF, Menzies D, et al. (2011) The BCG World Atlas: A Database of Global BCG Vaccination Policies and Practices. PLoS Med 8(3): e1001012. doi:10.1371/journal.pmed.1001012

Map displaying BCG vaccination policy by country.

ADN BCG

Lys-

pJH222HIVA

multi-CTL epitope region

p24 p17

Pk Tag1 2 3

HIVA: Immunogen designed for a CTL response versus

HIV-1 Clade A.

BCG LysA-: BCG substrain Pasteur, Lys auxotrophic.

Plasmid DNA: pJH222HIVA

HIVA

Kan r

LysA

OriE

OriMpJH222HIVApJH222HIVA

Nuestro modelo vacunal: BCG.HIVA222

pJH222HIVA plasmid structure

HIVA protein expression

Inmunógeno: rBCG222HIVA

Modelo animal: BALB/c

Vía de Inoculación: Intraperitoneal

MVA INOC

WEEK 0 WEEK 14 WEEK 17

SACRIF.BCG INOC

VacunaciVacunaciVacunaciVacunacióóóón:n:n:n:primeprimeprimeprime----boost heterboost heterboost heterboost heteróóóólogologologologo

(dos vectores con el mismo inmun(dos vectores con el mismo inmun(dos vectores con el mismo inmun(dos vectores con el mismo inmunóóóógeno)geno)geno)geno)

IMMUNOGENICITY RESULTS

IFN-γ and TNF-α by ICSIn Vivo Killing Assay

rBCG isolated from vaccinated mice at 14 weeks p.v.

rBCG:HIVA in vivo stability

At 14 weeks p.v., 100% of the isolated colonies carried the pJH222HIVA plasmid

Pruebas de protección:

1) Naïve 2) BCG.p3) BCG.HIVA4) pTHr.HIVA DNA5) pTHr.HIVA DNA + BCG.p6) pTHr.HIVA + BCG.HIVA

DesafDesafDesafDesafíííío subrogado con virus vaccinia que expresa HIVAo subrogado con virus vaccinia que expresa HIVAo subrogado con virus vaccinia que expresa HIVAo subrogado con virus vaccinia que expresa HIVA

InfecciInfecciInfecciInfeccióóóón conn conn conn con Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis

http://www.hindawi.com/journals/cdi/aip/516219/

Protocolo de vacunación

MVA INOC

WEEK 0 WEEK 14 WEEK 17

SACRIF.BCG INOC

Grupos1: (6 mice) BCG:HIVA + MVA:HIVA2: (6 mice) BCGwt + MVA:HIVA

Grupos1: (6 mice) BCG:HIVA + MVA:HIVA2: (6 mice) BCGwt + MVA:HIVA

Animales: Hembras BALB/C mice

Edad: 7 semanas (adultos)

7 días (recién nacidos)

Dosis:rBCGHIVA y BCGwt:..........106 cfuMVA:HIVA:.......................106 pfu

Vías inoculación:

rBCGHIVA/BCGwtAdultos:-Intradérmica (ID)-Subcutánea (SC)Recién Nacidos:-Subcutánea (SC)

MVA:HIVA-Intramuscular (IM)

Inducción de respuesta específica frente a VIH-1: ensayo ICS y CTL

IFN-γγγγ ICS, CD8+,

estimulación con P18I10

Respuesta citolítica “in vitro” frente a

VIH.Células diana pulsadas

con P18I10 0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

Adult I.D. Adult S.C. New born S.C.

% s

pec

ific

kill

ing

*********

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

Adult I.D. Adult S.C. Newborn S.C.

IFN

γγ γγ+

(%

CD

8 + T

-ce

lls)

*****

*

*

Inducción de respuesta específica frente a Mycobacterium:

ELISpot, esplenocitos, estimulación con PPD

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Adult S.C. Newborn S.C.

IFNγγ γγ s

fu/1

06 sp

len

ocy

tes

*

Vaccinated Newborn mice body weight growth curve

0

5

10

15

20

25

30

0 5 10 15 20 25

Age (weeks)

Bo

dy w

eig

ht

(gr)

rBCG:HIVA + MVA:HIVA

BCGwt + MVA:HIVA

rBCG:HIVA

MVA:HIVA

BCGwt

Naïve

Mean

MVA vacc.

BCG vacc.

Seguridad de la vacuna: evolución del peso corporal de los ratones

recién nacidos

MVA vacc.BCG vacc.

Vaccinated Newborn mice body weight growth curverBCG:HIVA + MVA:HIVA

BCGwt + MVA:HIVA

rBCG:HIVA

MVA:HIVA

BCGwt

Naïve

Desarrollo de un vector de refuerzo MVA recombinante que contiene inmunógenos de Mycobacterium (Ag 85A) para mejorar la respuesta inmune frente a Mycobacterium Tuberculosis en un programa de inducción-refuerzo con BCG.

MVA.HIVA MVA.HIVA MVA.HIVA MVA.HIVA vsvsvsvs MVA.HIVA.85AMVA.HIVA.85AMVA.HIVA.85AMVA.HIVA.85A

Priming Agents:Priming Agents:Priming Agents:Priming Agents:-BCG.HIVA401

BCG1331∆ureC::ΩpfoA-BCG.HIVA222

BCG Pasteur ∆lysA5

Boosting Agents:Boosting Agents:Boosting Agents:Boosting Agents:-Human Adenovirus serotype 5 (HAdV5.HIVA)-Ovine Atadenovirus serotype 7 (OAdV7.HIVA)-Modified Vaccinia Ankara Strain (MVA.HIVA)-Plasmid DNA (pTH.HIVA)-BCG.HIVA222 (BCG Pasteur ∆lysA5)

Desarrollo del vector vacunal BCG.HIVA222 kanminus

Incluído en el proyecto financiado por la EDCTP““““PedVacc: PedVacc: PedVacc: PedVacc: Development of an infant vaccine against motherDevelopment of an infant vaccine against motherDevelopment of an infant vaccine against motherDevelopment of an infant vaccine against mother----totototo----child transmission of HIVchild transmission of HIVchild transmission of HIVchild transmission of HIV----1 through breast milk.1 through breast milk.1 through breast milk.1 through breast milk.””””

La parte del proyecto de nuestro grupo de investigación era:- Desarrollo de la cepa BCG.HIVA222 libre de resistencias a

antibióticos: BCG.HIVA222kanminus.- Caracterización de la cepa BCG.HIVA222kanminus y

demostración de su inmunogenicidad y seguridad.

Eliminación de la resistencia a la kanamicina del plásmido

pJH222HIVA

Kan r

Eliminación del gen de la resistencia a la kanamicina mediante un proceso de “represor titration”, realizado por Cobra Inc

ADN BCGLys-

Transformación de BCG Pasteur Lys-

BCG.HIVABCG.HIVABCG.HIVABCG.HIVA222222222222

BCG.HIVABCG.HIVABCG.HIVABCG.HIVA222222222222kanminuskanminuskanminuskanminus

pJH222HIVAkanminuspJH222HIVAkanminus

HIVA

LysA

ADN BCG Lys-

pJH222HIVAkanminus

OriEOriM

pJH222HIVA pJH222HIVA kanminuskanminus

CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA DE LA CEPA BCG.HIVA222kanminus (I)

Identificación del plásmido pJH222HIVA kanminus por digestión

con enzimeas de restricción.

Demostración por PCR de la presencia de la secuencia codficante para HIVA en la Matriz de Siembra de

BCG.HIVA222kanminus (carril 3), comparado con la banda obtenida de la cepa BCG.HIVA222 con resistencia

a kanamicina (carril 6).

CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA DE LA CEPA BCG.HIVA222kanminus (II)

ADN BCG Lys-

pJh222HIVA kanminus

Confimación de la cepa BCG de Mycobacterium bovis mediante ensayo

GenoType® MTBC (Hain Lifescience GmbH).

Confirmación de la subcepa Pasteur de BCG por Multiplex PCR, descrito por

Bedwell et al. Vaccine. 2001, 19:2146-51.

CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LA CEPA BCG.HIVA222kanminus (I)

• AUXOTROFIA PARA LISINA DE LA CEPA BCG Pasteur.

• PRESENCIA DEL GEN DE COMPLEMENTACION DE SÍNTESIS DE LISINA EN EL PLASMIDO.

• AUSENCIA DE RESISTENCIA A KANAMICINA.

Demostración por dot-blot de la síntesis del polipéptido codificado por

la secuencia de HIVA en BCG.HIVA222kanminus (Clon10)

DEMOSTRACIÓN DE LA INMUNOGENICIDAD DE

BCG.HIVA222kanminus EN BALB/c

2x106 cfuADULTOS: 7 semanas, vía IDNEWBORN: 7 días, vía SC

106 pfuVía IM

Specific HIVA immune response by ICS staining in BALB/c mice inoculated with

BCG.HIVA222kanminus+MVA.HIVA

00,10,20,30,40,50,6

Adult Newborn Naïve

%C

D8+

T- c

ells

p

rod

uci

ng

IFN

-γ (P

18I1

0 st

imu

latio

n)

Specific BCG immune response by ELISpot in BALB/c

mice inoculated with BCG.HIVA222kanminus+MVA.HIVA

0

50

100

150

200

Adult Newborn Naïve

sfu

/10

6 sp

len

oc

yte

s

(PP

D s

tim

ula

tio

n)

DEMOSTRACIÓN DE LA SEGURIDAD DE BCG.HIVA222kanminus EN BALB/c

Seguimiento de la evolución del peso corporal de los ratones adultos y recién nacidos durante el desarrollo de la prueba.

CONCLUSIONES- Se ha caracterizado genética y fenotípicamente

BCG.HIVA222kanminus.

- Se ha demostrado la inmunogenicidad y seguridad de BCG.HIVA222kanminus en ratones BALB/c adultos y recién nacidos.

- El modelo desarrollado permitiria avanzar en la realización de ensayos clínicos.

- El uso de inmunógenos contra M. tuberculosis en el virus de refuerzo (MVA.HIVA.Ag85A) aumenta la respuesta inmune frente a TB.

- BCG.HIVA222 es un buen vector de inducción con vectores de refuerzo distintos a MVA.HIVA: HAdV5.HIVA, OAdV7.HIVA.

- BCGHIV+MVAHIV se podria utilizar como vacuna bivalente pediatrica contra TB y VIH.

Human Immunology Unit in the Weatherall Institute of Molecular

Medicine

(University of Oxford)

Dr. Tomás Hanke

Dr. Eung Jun-Im

Dr. Maximilian Rosario

Dr. Richard Hopkins

Sevicio de Animalario del IDIBELL (Bellvitge)

Joana Visa