REV. FECHA HOJA/S CAUSA DEL CAMBIO

01 17/08/04 1 a 5 Revisión completa y cambio de referencias a PG´s

02 04/04/06 Revisión completa

Realizado

Fdo.: Fco. Miguel Rguez. Peña

Fecha: 04/04/06

Revisado

Fdo.: Fco. Miguel Rguez. Peña

Fecha: 04/04/06

Aprobado

Fdo.: Juan Carlos Dominguez

Fecha: 04/04/06

LABORATORIO BIO 9000LABORATORIO BIO 9000LABORATORIO BIO 9000LABORATORIO BIO 9000

PROCEDIMIENTO PROCEDIMIENTO PROCEDIMIENTO PROCEDIMIENTO PE-M-10

PARA PARA PARA PARA LALALALA

DETERMINACION DE PSEDETERMINACION DE PSEDETERMINACION DE PSEDETERMINACION DE PSEUDOMONA UDOMONA UDOMONA UDOMONA

AERUGINOSA EN AGUASAERUGINOSA EN AGUASAERUGINOSA EN AGUASAERUGINOSA EN AGUAS

Rev. nº: 02Rev. nº: 02Rev. nº: 02Rev. nº: 02

Fecha de revisión: 04/04/06Fecha de revisión: 04/04/06Fecha de revisión: 04/04/06Fecha de revisión: 04/04/06

PE-M-10

PROCEDIMIENTO EPROCEDIMIENTO EPROCEDIMIENTO EPROCEDIMIENTO ESPECIFICOSPECIFICOSPECIFICOSPECIFICO

PARA PARA PARA PARA ELELELEL

DETERMINACION DE PSEDETERMINACION DE PSEDETERMINACION DE PSEDETERMINACION DE PSEUDOMONA UDOMONA UDOMONA UDOMONA

AERUGINOSA EN AGUASAERUGINOSA EN AGUASAERUGINOSA EN AGUASAERUGINOSA EN AGUAS

Rev. 02

Hoja 2 de 5

INDICE

1.-OBJETO

2.-ALCANCE

2.1.-Intervalo de trabajo

3.-REFERENCIAS

3.1.- Documentos utilizados para la elaboración de este PNT.

3.2.- Documentos a utilizar conjuntamente con este PNT.

4.-GENERAL

4.1.-Nivel de riesgo

4.2.-Control de calidad

5.-DESCRIPCION

5.1.-Equipos y materiales

5.2.-Preparación equipo

5.3.-Procedimiento

5.4.-Tratamiento de resultados

PE-M-10

PROCEDIMIENTO EPROCEDIMIENTO EPROCEDIMIENTO EPROCEDIMIENTO ESPECIFICOSPECIFICOSPECIFICOSPECIFICO

PARA PARA PARA PARA ELELELEL

DETERMINACION DE PSEDETERMINACION DE PSEDETERMINACION DE PSEDETERMINACION DE PSEUDOMONA UDOMONA UDOMONA UDOMONA

AERUGINOSA EN AGUASAERUGINOSA EN AGUASAERUGINOSA EN AGUASAERUGINOSA EN AGUAS

Rev. 02

Hoja 3 de 5

1.-OBJETO

Asegurar la calidad e integridad de los resultados obtenidos en el recuento de

Pseudomonas aeruginosa a partir de la técnica de filtración en membrana.

2.-ALCANCE

Determinación Pseudomonas aeruginosa en todo tipo de aguas (aguas potable, piscinas,

Pozos, manantiales, etc.) mediante la técnica de filtración en membrana.

2.1.-Intervalo de trabajo

Mediante la técnica de filtración en membrana es posible la determinación de los

Pseudomonas aeruginosa que posea una muestra (por muy alta o muy baja que fuera la

cantidad de éstos en el agua).

El nivel de detección de esta técnica es dependencia directa de la dilución de la muestra

(cantidad de agua filtrada).

3.-REFERENCIAS

3.1.-Documentos utilizados en la elaboración de este PNT.

- APHA-AWWA-WPCF (1989): Métodos Normalizados para el análisis de aguas

potables y residuales. Ed. Diaz de Santos, 17ºEdición. Madrid.

- Orden del 1 de Julio de 1987 por la que se aprueban los métodos oficiales de

Análisis Físico-Químicos para aguas potables de consumo público. BOE 163 de 9-7-

1987.

- PG-01: “Gestión, elaboración y control de los documentos del sistema de la

calidad”. Procedimientos Generales Bio 9000.

- PG-03: “Organización”

- R.D. 1138/1990 de 14 de Septiembre por el que se aprueba la reglamentación

Técnico Sanitaria para el abastecimiento y el control de la calidad de las aguas

potables de consumo público. BOE 226 de 20-09-1990.

3.2.-Documentos a utilizar junto a este PNT.

- IT-07: "Instrucción para la realización de filtración de membrana"

- IT-10: "Instrucción para la realización de una galería API"

- PE-EQ-15: “Procedimiento para el funcionamiento, mantenimiento y control de la

bomba de vacío”.

- IT-01: "Procedimiento para la preparación de medios de cultivo".

- IT-08: Instrucción para la realización de la prueba de la Oxidasa.

PE-M-10

PROCEDIMIENTO EPROCEDIMIENTO EPROCEDIMIENTO EPROCEDIMIENTO ESPECIFICOSPECIFICOSPECIFICOSPECIFICO

PARA PARA PARA PARA ELELELEL

DETERMINACION DE PSEDETERMINACION DE PSEDETERMINACION DE PSEDETERMINACION DE PSEUDOMONA UDOMONA UDOMONA UDOMONA

AERUGINOSA EN AGUASAERUGINOSA EN AGUASAERUGINOSA EN AGUASAERUGINOSA EN AGUAS

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Hoja 4 de 5

- Ver la ficha de elaboración de los medios de cultivo indicada por el fabricante

4.-GENERAL

4.1. Nivel de Riesgo.

Siempre que se trabaje con bacterias o productos portadores de ellas, hay que trabajar

con guantes y extremando las medidas de precaución, ya que algunas podrían tener un

carácter patógeno.

4.2.-Control de calidad

Periódicamente se realizan controles positivos:

Control positivo: A partir de una cepa patrón (de la Colección Española de Cultivos

Tipos) de Pseudomonas aeruginosa se realiza una solución en medio acuoso. Se hace un

recuento de ufc/ml mediante siembra en placas de Pseudomona agar a partir dilución en tubos.

En función de éste se seleccionan los tamaños de la muestra a filtrar. Se incuban las placas y

se procede al cálculo de recuperación de Pseudomonas aeruginosa del medio.

Periódicamente se realizan análisis de intercomparación, que el laboratorio se encarga

de contratar.

5.-DESCRIPCION

5.1.-Material y Equipos

-Equipo de filtración

-Bomba vacío

-Pinzas de filtración

-Filtros de 0.45µm

-Agua destilada estéril

-Medio Pseudomona Agar en placas de 60mm.

-Mechero Bunsem

-Muestra de agua.

5.2.-Preparación de la muestra

Antes de proceder a la filtración de la muestra hay que seleccionar el tamaño de la

muestra.

Un volumen ideal de muestra es el que proporciona alrededor de 50 colonias de

Pseudomonas aeruginosa y no más de 200 colonias de todos los tipos. El agua potable se

analiza filtrando100-500 ml o más, o bien muestras duplicadas de volúmenes más pequeños,

por ejemplo, analizar dos muestras de 50 ml o cuatro de 25 ml. Las demás aguas se analizarán

PE-M-10

PROCEDIMIENTO EPROCEDIMIENTO EPROCEDIMIENTO EPROCEDIMIENTO ESPECIFICOSPECIFICOSPECIFICOSPECIFICO

PARA PARA PARA PARA ELELELEL

DETERMINACION DE PSEDETERMINACION DE PSEDETERMINACION DE PSEDETERMINACION DE PSEUDOMONA UDOMONA UDOMONA UDOMONA

AERUGINOSA EN AGUASAERUGINOSA EN AGUASAERUGINOSA EN AGUASAERUGINOSA EN AGUAS

Rev. 02

Hoja 5 de 5

filtrando tres volúmenes distintos (diluidos o no), en función de la densidad bacteriana que se

espere. Cuando se filtren menos de 20 ml (diluidos o no), se añadirán alrededor de 10 ml de

agua estéril al embudo antes de la filtración. Se aumenta con ello el volumen del agua, lo que

ayuda a obtener una dispersión uniforme de la suspensión bacteriana en la totalidad de la

superficie filtrante efectiva.

5.3.-Procedimiento

Proceder tal y como se describe en IT-07 (Filtración de membrana)

Una vez realizada la filtración colocad el filtro sobre una placa de Pseudomona e

incubarla a 42ºC durante 48 horas.

5.4.-Tratamiento de resultados

Recuento:

A las 24 horas ± 2 h se cuentan como presuntamente positivas de Pseudomonas

aeroginosa, aquellas colonias de verde, cremosas y con emisión de fluorescencia.

Verificación de colonias sospechosas:

Se procede a la realización de una galería de pruebas bioquímicas API. (IT-10)

Calculo de la densidad de Pseudomonas aeruginosa:

Comúniquese la densidad de Pseudomonas aeruginosa como el total de Pseudomonas

aeruginosa por 100 ml. Calcúlese el recuento utilizando filtros de membrana que tengan 20-

80 colonias de Pseudomonas aeruginosa y no más de 200 colonias de todos los tipos por

membrana, y aplicando la siguiente ecuación:

Colonias Pseudomonas aeruginosa/100 ml = Colonias de P.aeruginosa contadas x 100

ml de muestra filtrados