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Pathfinder® Virus Herpes Simplex Tipos 1 y 2 25215 • 50 pruebas

Para la identificación y el tipaje del virus herpes simplex en las muestras clínicas directas y en los aislados de cultivos celulares.

ÍNDICE DE MATERIASGlosario........................................................................................................ 1

Campo de Aplicación................................................................................. 42

Resumen y Explicación.............................................................................. 42

Principio del Método.................................................................................. 43

Reactivos ................................................................................................... 43

Advertencias y Precauciones..................................................................... 45

Obtención y Tratamiento de las Muestras ................................................. 46

Procedimiento............................................................................................ 50

Control de Calidad ..................................................................................... 52

Interpretación de los Resultados ............................................................... 52

Límites de la Prueba .................................................................................. 54

Valores Previsibles ..................................................................................... 55

Características de las Especificaciones..................................................... 55

Referencias .............................................................................................. 159

2013/10

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CAMPO DE APLICACIÓNEl sistema de detección directa de los antígenos del virus herpes simplex(HSV) de tipos 1 y 2 Pathfinder® es una prueba por fluorescencia directaque permite identificar y tipar el virus herpes simplex en las muestrasclínicas directas y en los aislados de cultivos celulares. Es indispensableobtener simultáneamente una muestra clínica directa y una muestra paracultivar. En efecto, todas las muestras clínicas que resulten negativas oque produzcan un número insuficiente de células deben confirmarse conuna prueba de seguimiento sobre un aislado de cultivo celular.

RESUMEN Y EXPLICACIÓNEl diagnóstico en el laboratorio de una infección por HSV es importante enel tratamiento del paciente por diversos motivos. El diagnóstico específicode infección por herpes virus permite instaurar rápidamente un tratamientocon el agente antiviral más adecuado (1, 2, 3). Además de lasinformaciones que permiten orientar el tratamiento, el diagnósticoespecífico puede ser útil para prevenir una infección por HSV. En algunasmujeres embarazadas en las que la infección es activa en el momento delparto, la cesárea permite reducir el riesgo de transmisión del virus al reciénnacido (4).

El tipaje del HSV reviste una importancia potencial en el pronóstico, en laterapéutica y en la epidemiología. Las infecciones genitales por HSV Tipo 2(HSV-2) presentan un índice de recidiva más importante que lasinfecciones genitales por HSV Tipo 1 (HSV-1) (5). Además, el HSV-1 y elHSV-2 pueden responder de una forma diferente al tratamiento (6). Variosestudios epidemiológicos hacen pensar que podría existir una asociaciónentre la infección por HSV-2 y el cáncer de cuello de útero (7). Pero comoen otros estudios se han obtenido resultados contradictorios (8), senecesitarían investigaciones suplementarias para confirmar o invalidar estaasociación. El tipaje del HSV también podría ser importante en otrosestudios epidemiológicos de infección por virus herpes simplex.

En la actualidad, el método de identificación del HSV comúnmenteadmitido consiste en aislar el virus en un cultivo de células. Los métodosde cultivo celular aumentan la cantidad de virus, que inicialmente espequeña, pero necesitan de 1 a 7 días para completarse (9). Entre todoslos métodos de confirmación y de tipaje por cultivo, tenemos que citar losmétodos biológicos como la formación de placas en las célulasembrionarias de huevo de gallina (9), los métodos inmunológicos queutilizan antisueros dirigidos contra el HSV-1 y el HSV-2 (9) y el análisis conendonucleasas de restricción (10). El principal problema de las pruebasinmunológicas como la neutralización, la inmunofluorescencia y lainmunoperoxidasa es la reactividad cruzada que se observa en losantisueros policlonales clásicos. Aunque el análisis con endonucleasas derestricción constituye un método de tipaje fiable, esta prueba exige muchotiempo y una capacitación técnica considerable.

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Los recientes progresos en la producción de anticuerpos monoclonaleshan originado anticuerpos que presentan una gran especificidad frente alHSV-1 y al HSV-2. Los estudios clínicos han demostrado la eficacia deestos anticuerpos en el diagnóstico de las infecciones por HSV (11, 12). Elsistema de detección directa de los antígenos del virus herpes simplex(HSV) de tipo 1 y 2 Pathfinder® utiliza cuatro anticuerpos monoclonalesconjugados con fluoresceína para identificar y tipar el HSV en las muestrasclínicas directas y en los aislados de cultivos celulares. En esta prueba sefusionan la especificidad y la reproducibilidad de los anticuerposmonoclonales con la velocidad y la sencillez de una prueba porfluorescencia directa. La presunta identificación y tipaje del HSV es posibledentro de la hora siguiente a la recepción de una muestra clínica directa.Las muestras clínicas directas que resultan negativas o que producen unnúmero insuficiente de células deben confirmarse con una prueba deseguimiento por cultivo celular. Por tanto, es obligatoria la obtenciónconcomitante de una muestra clínica directa y de una muestra destinada alcultivo celular. Para el tipaje de los aislados de cultivo celular, este testofrece una alternativa sencilla y fiable al análisis con endonucleasas derestricción.

PRINCIPIO DEL MÉTODOEsta prueba utiliza anticuerpos monoclonales conjugados con fluoresceína(2 anti-HSV-1, 2 anti-HSV-2) para identificar y tipar el virus herpes simplex.Los anticuerpos anti-HSV-1 reaccionan con los polipéptidos cuyos pesosmoleculares son, respectivamente, 150.000 y 85.000 daltons. Uno de losanticuerpos anti-HSV-2 reacciona con los polipéptidos cuyos pesosmoleculares van de 43.000 a 50.000 daltons aproximadamente y el otroanticuerpo anti-HSV-2 reacciona con un polipéptido cuyo peso molecularaproximado es de 79.000 daltons. Al depositarlos en pocillos separados enun porta que contiene la muestra, los anticuerpos monoclonales dirigidoscontra el HSV-1 y el HSV-2 reaccionan con los antígenos virales en lascélulas infectadas. Los anticuerpos no unidos se eliminan en la etapa delavado. En el microscopio de fluorescencia, las células infectadas por elHSV presentan una fluorescencia verde manzana característica sobre unfondo con una contratinción roja.

REACTIVOSPara uso diagnóstico in vitro.

Reservado para uso profesional únicamente

Conservar los anticuerpos y los portas control entre 2 y 8°C.Conservar la solución salina de tampón fosfato entre 2 y 26°C.

Una vez abiertos, todos los reactivos son estables hasta la fecha decaducidad indicada en la etiqueta si se conservan a la temperaturaindicada y no muestran señales visibles de contaminación. Si se sospechaque el kit puede haber sido conservado o manipulado incorrectamente

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durante el transporte, realice la prueba utilizando sólo controles positivos ynegativos, y compruebe los resultados esperados.

1. Anticuerpo monoclonal anti-HSV-1, 2,5 mL2. Anticuerpo monoclonal anti-HSV-2, 2,5 mLCada frasco contiene 2,5 mL de anticuerpos múridos anti-HSV-1 o anti-HSV-2 conjugados con fluoresceína, así como una Contratinción Azul deEvans, seroalbúmina bovina, un inhibidor de la coloración no específica y0,1% de azida sódica. La suspensión líquida de anticuerpos está preparadaa la dilución de trabajo. Cualquier dilución suplementaria reducirá lasensibilidad de la prueba. Los signos de un posible deterioro del productoson los siguientes:

• Aspecto turbio o formación de precipitado en el frasco.• Alteración de la reactividad nominal frente a controles positivos y

negativos.3. Solución salina de tampón fosfato (PBS), pH 7,3 ± 0,10, 11,34 gm,

2 frascos, N° de Cat. 31098Cada frasco contiene 11,34 g de solución salina de tampón fosfatopreparada a partir de fosfato monosódico, de fosfato disódico y de clorurode sodio.

Disolver el contenido de un frasco en agua destilada para obtener unvolumen final de 1 litro. El PBS en polvo es estable indefinidamente si seconserva entre 2 y 26°C. Una vez reconstituida, la solución es establedurante 3 meses conservada entre 2 y 26°C. Los posibles signos dedeterioro son los siguientes:

• Modificación del pH.• Aspecto turbio que puede indicar una contaminación microbiana.

NOTA: No utilizar reactivos después de la fecha de caducidad ni reactivosprocedentes de otros fabricantes.

Materiales Bio-Rad adicionales requeridos1. Portas Controles Pathfinder®, 5 portas, N° de Cat. 12000150

Cada porta presenta un pocillo que contiene células Vero infectadas porel HSV-1 (cepa F(1) de la American Tissue Culture Collection (ATCC)),otro pocillo con células infectadas por el HSV-2 (cepa MS de la ATCC) ydos pocillos con células Vero no infectadas. Se ha demostrado que elprocedimiento de fijación utilizado para obtener estos portas inactiva alHSV. Antes de cada prueba, sacar un porta control de la nevera.Equilibrar el porta a temperatura ambiente en su embalaje original. Unsigno de posible deterioro es la alteración de la reactividad nominalfrente a los anticuerpos anti-HSV.

PRECAUCIÓN: Manipular los portaobjetos sujetándolos por los bordes.No presionar sobre la superficie de la bolsa de aluminio.

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2. Medio de montaje Pathfinder®, 2,75 mL, N° de Cat. 30693Cada frasco contiene 2,75 mL de una solución tampón Tris-glicerol queincluye un agente que retarda el fotoblanqueado y conservantes. Lossignos de un posible deterioro incluyen la modificación de la reactividadprevisible con los controles positivo y negativo y una intensificación delfondo verde en los portas control.

La formula del Pathfinder® Mounting Medium fue desarrolladoespecÍficamente para completar los anticuerpos fluorescentes del grupoPathfinder®. Para obtener resultados optimales, este medio se tiene queusar en caso de evalución directa de muestars clÍnicas o de aislados decultivos celulares con el kit Pathfinder®.

Materiales Bio-Rad opcionales1. Pathfinder® HSV DFA Collection Slides (90 portas), N° de Cat. 30494

2. Anticuerpo monoclonal anti-HSV-1, 5 mL, N° de Cat. 30490

3. Anticuerpo monoclonal anti-HSV-2, 5 mL, N° de Cat. 30491

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Reactivos que contienen azida sódicaATENCIÓN—Las suspensiones de anticuerpos contienen 0,1% de azidasódica (NaN3).

La azida sódica puede reaccionar con las tuberías de plomo o cobre paraformar azoturos metálicos altamente explosivos. Para evitar lasacumulaciones de estos azoturos en las cañerías, enjuagar las tuberías conabundante agua mientras se eliminan estos líquidos por el desagüe. Paramás información, por favor consulte el Manual editado (SafetyManagement No. CDC-22) por los CDC (Centers for Disease Control) (13).Desechar los residuos del producto y el envase de acuerdo con todas lasnormativas locales, regionales, nacionales e internacionales aplicables.

La Hoja de Datos de Seguridad está disponible en bio-rad.com y previapetición.

Portas controlesEl procedimiento de fijación utilizado para obtener estos portas controlesPathfinder® inactiva al HSV. No obstante, estos portas se tienen quemanipular y eliminar tal como materiales potencialmente infecciosos.

H303: Puede ser nocivo por ingestión. H313: Puede ser nocivo en contacto con la piel.

P312: Llamar a un CENTRO DE INFORMACION TOXICOLOGICA o a un médico en caso de malestar.

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MuestrasDurante la obtención y el tratamiento de muestras procedentes depacientes, suponga que son capaces de transmitir agentes infecciosos, noobstante su origen, tratamiento o autorización previa. Manipular talesmuestras con precauciones universales, siguiendo prácticas adecuadasestablecidas por trabajo en el laboratorio clínico. Utilizar las PrecaucionesEstándares y Universalesprecauciones universales; manipular estosreactivos, toda la sangre y las muestras humanas como si fueran capacesde transmitir enfermedades infecciosas, en un laboratorio con seguridadbiológica de nivel 2, aplicando las directrices vigentes de seguridadbiológica en laboratorios microbiológicos y biomédicos17 de los CDC/NIH,Manual de bioseguridad de laboratorio18 de los WHO o pautasequivalentes. El almacenaje y la eliminación de estas sustancias y losrecipientes correspondientes deben realizarse según las normas ydirectrices locales.

Aislamiento del virusSólo pueden intentar aislar el HSV los laboratorios que tengan experienciaen métodos de cultivo celular para el aislamiento de virus.

OBTENCIÓN Y TRATAMIENTO DE LAS MUESTRASLa obtención de las muestras es una etapa crítica en la identificación y eltipaje del virus herpes simplex. El personal encargado de obtener lasmuestras de HSV deberá poseer la formación adecuada para minimizar elriego de muestras insuficientes. Más adelante se incluye el procedimientorecomendado para obtener muestras sobre lesiones orales, genitales,cutáneas o cervicales. Para más información sobre la obtención demuestras, consultar una obra de referencia sobre las técnicas utilizadas envirología (9).

ATENCIÓN: Respetar los procedimientos de seguridad biológicahabituales durante la obtención y el tratamiento de las muestras deHSV. Todas las muestras y todo el material con el que entren encontacto deberán considerarse como potencialmente infeccioso, y seeliminarán según los procedimientos adecuados. Emplear undesinfectante adecuado para realizar la descontaminación. Nopipetear con la boca. Evitar la producción de vapores. Para másinformación sobre la prevención de infecciones en el laboratorio,consultar la referencia 14.

Obtención de muestras (lesiones orales, genitales, cutáneas o cervicales) - muestras clínicas directas y muestras destinadas a cultivo

Material necesario pero no suministrado1. Aguja estéril de calibre 27 (para abrir una vesícula oral, genital o cutánea

o para retirar la costra de una lesión seca).

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2. Tampones estériles (para eliminar el pus de una lesión ulcerada).

3. Material para la obtención de muestras

• Tampones estérilesUtilizar tampones que no inhiban la replicación del HSV o elcrecimiento del cultivo celular. Evitar utilizar tampones de alginato decalcio porque pueden inhibir la replicación del HSV (15).

• Medio de transporte, 0,5 - 1 mLUtilizar un medio de transporte que no inhiba la replicación del HSVni la proliferación de las células en cultivo.

• Portas de microscopio de vidrioUtilizar portaobjetos que respondan a las siguientes especificaciones: • diámetro de los pocillos – 7 a 10 mm; • distancia mínima entre los pocillos – 5 mm; • número de muestras por porta – una. En los portas de vidrio planos, crear dos pocillos con cera o uninstrumento de grabado en vidrio.

• Acetona de calidad HPLCConservar en un recipiente de vidrio.

• Recipiente para transportar las muestras hasta el laboratorio

• Caja para portaobjetos de microscopio estándar, para conservar losportas

Procedimiento para obtener las muestrasNota: Obtener las muestras con precaución evitando contaminar la zonade obtención.

1. Con un rotulador para vidrio, etiquetar el porta anotando el nombre o elnúmero de identificación del paciente. Depositar el porta sobre unasuperficie plana.

2. Exponer la base de la lesión siguiendo las instruccionescorrespondientes que se incluyen a continuación. No alterar la base dela lesión. Desechar el tampón o la aguja en una caja especial parabiomateriales peligrosos.

NOTA: Las muestras obtenidas sobre lesiones vesiculares sonpreferibles a las procedentes de lesiones ulceradas o secas, porqueel título viral disminuye al ir evolucionando la lesión.

• Lesión vesicular – Abrir las lesiones cervicales con un tampón estéril.Abrir las lesiones orales, genitales o cutáneas con una aguja estérilde calibre 27.

• Lesión ulcerada – Eliminar el pus con un tampón estéril.• Lesión seca – Separar la costra de la lesión con una aguja estéril.

3. Obtener de la zona infectada una muestra destinada al cultivo celular yuna muestra clínica directa.

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NOTA: Evitar provocar el sangrado al frotar la base de la lesión conel tampón estéril. Los anticuerpos presentes en el suero puedenbloquear los sitios de unión de los anticuerpos antivirales o inhibirla replicación del virus en el cultivo celular.

Obtención de la muestra destinada a cultivo celularFrotar la base de la lesión con un tampón estéril, y sumergirinmediatamente el tampón en un medio de transporte adecuado para elcultivo celular.

Obtención de la muestra clínica directaa. Frotar vigorosamente la base de la lesión con un segundo tampón

estéril. La muestra clínica directa debe contener células infectadasprocedentes de la base de la lesión.

b. Enrollar apretado el tampón y colocarlo sobre los 2 pocillos del portade vidrio, teniendo cuidado de que ambos pocillos queden cubiertospero sin sobrepasar el perímetro. No frotar el tampón dentro de lospocillos para evitar una deformación excesiva de las células.

c. Examinar el porta a simple vista para comprobar la correctaextensión de las células. Si los pocillos no se ven opacos, repetir laetapa 3b. Desechar el tampón en un recipiente especial parabiomateriales peligrosos.

d. Dejar secar al aire la muestra durante 5 a 10 minutos. Si la muestrano está totalmente seca, las células pueden separarse del portadurante la fijación.

e. Aclarar el porta con 0,5 mL de acetona y dejar que el disolvente seevapore completamente.

4. Enviar las muestras al laboratorio para su inmediato tratamiento.Durante el transporte, evitar exponer las muestras a temperaturasextremas. Si no es posible efectuar el tratamiento durante las siguientes4 horas, seguir las siguientes instrucciones de conservación:

a. Colocar el porta que contiene la muestra directa en una caja paraportas de microscopio. La muestra destinada al cultivo celular y elporta que tiene la muestra directa pueden conservarse entre 2 y 8°Cdurante un máximo de 24 horas.

b. Para una conservación de más larga duración:• Congelar la muestra destinada al cultivo celular a -70°C. Evitar las

congelaciones-descongelaciones repetidas. No conservar la muestradestinada a cultivo celular a -20°C.

• El porta que tiene la muestra directa puede conservarse en una cajapara portas a - 20°C durante un tiempo máximo de 72 horas.

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Tratamiento de las muestras destinadas al cultivo celular

Material necesario pero no suministrado1. Línea de células adecuada

• Utilizar una línea de células sensibles a las infecciones por HSV – porejemplo, fibroblastos diploides humanos, células primarias de riñónde conejo, células de riñón embrionario humano o células renales demono (células Vero).NOTA: La elección de la línea de células puede influir en lasensibilidad del aislamiento del HSV en cultivo celular.

2. Cultivos celulares control

• Control negativo – cultivo celular inoculado sólo con el medio detransporte.

• Controles positivos – cultivos celulares inoculados con cepas deHSV-1 y de HSV-2 conocidas. Las cepas de HSV-1 y de HSV-2destinadas a la preparación de los controles están disponibles en laATCC, ATCC.org.

Ver el capítulo Control de Calidad para más información sobre loscultivos celulares control.

3. Otros aparatos y equipos para el cultivo de células – medios de cultivo,tubos de cultivo, etc.

4. Pipetas Pasteur

5. Centrifugadora que alcance hasta 500 X G

6. Portas de microscopio de vidrio

Ver el capítulo anterior para las especificaciones.

7. Cubeta de tinción o cubeta Coplin para la fijación de portas

8. Acetona fría (2-8°C)

9. Cajas para portaobjetos de microscopio estándar, para guardar los portas

Procedimiento para la preparación de los portas con los aislados de cultivo celularNOTA: Tratar de la misma manera las muestras obtenidas de lospacientes y los cultivos celulares control.

1. Aislar el HSV de un cultivo celular siguiendo un método establecido (9).

2. Cuando la infección alcance un efecto citopático (CPE) 2-3+, eliminar elmedio de cultivo del tubo por decantación y remplazarlo por 1,0 mL desolución salina de tampón fosfato (PBS).

3. Separar las células del tubo con una pipeta Pasteur de vidrio.

4. Centrifugar la suspensión de las células obtenida a 500 X G durante 5minutos.

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5. Aspirar o decantar el sobrenadante y resuspender el precipitado decélulas en 50 μL de PBS.

6. Etiquetar el porta paciente/control. Transferir volúmenes iguales a 2pocillos del porta y dejar secar completamente al aire durante 10 a 20minutos (el tiempo de secado efectivo depende de la temperatura y dela humedad de la habitación.) Si la muestra no está seca, las célulaspueden separarse del porta durante la fijación.

7. Examinar el porta a simple vista para comprobar la correcta extensiónde las células. Los pocillos deben verse opacos.

8. Fijar el porta durante 10 minutos en una cubeta llena de acetona fría(2-8°C). Dejar secar el porta al aire.

9. Realizar la prueba lo antes posible. Si fuera necesario, conservar elporta durante un tiempo máximo de 24 horas entre 2 y 8°C o 72 horas a-20°C.

PROCEDIMIENTOMaterial suministrado1. Anticuerpo monoclonal anti-HSV Tipo 1

2. Anticuerpo monoclonal anti-HSV Tipo 2

3. Solución salina de tampón fosfato (PBS)

Material necesario pero no suministrado1. Portas control HSV Pathfinder® – Laboratorios Bio-Rad, N° de Cat.

12000150

2. Medio de montaje Pathfinder® – Laboratorios Bio-Rad, N° de Cat. 30693

3. Agua destilada o desionizada

4. Cultivos celulares control – únicamente necesarios para realizar laprueba en aislados de cultivo. Preparados como se describe en elcapítulo Obtención y tratamiento de las muestras.

5. Cámara de humidificación

6. Matraz de plástico

7. Cubeta Coplin o cubeta para el aclarado de los portas

8. Agitador magnético (optativo)

9. Cubreobjetos, 24 mm x 60 mm – Laboratorios Bio-Rad, N° de Cat.102610

10.Microscopio de fluorescencia – Para visualizar las muestras coloreadascon isotiocianato de fluoresceína, utilizar un sistema de filtros con unalongitud de onda de excitación de 480-490 nm y una longitud de ondade emisión igual o superior a 510 nm. El tipo y el estado de los filtros asícomo las características de la fuente luminosa puede afectar a laintensidad de la reacción fluorescente.

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Modo operativo1. Preparar la solución salina de tampón fosfato siguiendo las

instrucciones de la página 44.

2. Sacar los portas de los pacientes y de los controles de la nevera o delcongelador. Dejar que los portas paciente y control-cultivo celularalcancen la temperatura ambiente en sus embalajes de almacenamiento(5-10 minutos). Equilibrar el porta control Pathfinder® a temperaturaambiente dejándolo en su bolsa original (5-10 minutos).NOTA: En el capítulo Control de Calidad del prospecto se recomiendarealizar los controles adecuados junto con los ensayos de las muestrasclínicas directas y de los aislados de cultivo celular. Ver página 52.

3. Sacar los portas paciente y control de sus recipientes dealmacenamiento. El primer pocillo de cada porta se etiqueta como HSV-1 y el segundo como HSV-2. Sacar el porta control Pathfinder® de suenvase. Colocar todos los portas en la cámara de humidificación.

4. Depositar una gota (unos 30 μL) de anticuerpo monoclonal anti-HSV-1en el primer pocillo y una gota de anticuerpo monoclonal anti-HSV-2 enel segundo pocillo del porta paciente y del porta control. Depositar unagota del anticuerpo monoclonal correspondiente en los dos pocillos delporta control Pathfinder®. Comprobar que cada pocillo quedatotalmente recubierto de anticuerpos.NOTA: El hecho de combinar los anticuerpos anti-HSV-1 y anti-HSV-2en un pocillo reduce la sensibilidad del ensayo.

5. Cerrar la cámara de humidificación e incubar los portas a temperaturaambiente durante 30 minutos. No dejar que los anticuerpos se sequenen los portas.

6. Aclarar cuidadosamente los portas con PBS. No echar el PBSdirectamente sobre los pocillos, sino más arriba de ellos de forma que lasolución se extienda bien.

7. Lavar los portas durante 10-15 minutos en una cubeta Coplin o unacubeta llena de PBS. Cambiar la solución tampón una vez durante estaoperación. Agitar la cubeta con cuidado varias veces o utilizar unagitador magnético.

8. Sacar los portas del PBS y dejar escurrir brevemente colocándolossobre papel absorbente. Depositar 3 a 4 gotas de medio de montajesobre cada porta. Colocar el cubreobjetos con precaución y eliminar lasburbujas de aire con mucho cuidado.

NOTA: Utilizar exclusivamente el medio de montaje Pathfinder® de losLaboratorios Bio-Rad, N° de Cat. 30693.

9. Examinar los portas en el microscopio de fluorescencia con aumento de100 a 400 X. Si fuera necesario, conservar los portas en oscuridad entre

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2 y 8°C. El examen de los portas se efectuará obligatoriamente en las 24horas siguientes a su preparación.

CONTROL DE CALIDADEnsayo de las muestras clínicas directasEn cada serie de portas de muestras directas se incluirá un porta controlPathfinder® para controlar las especificaciones del test de fluorescencia ydel microscopio.

Ensayo de los aislados de cultivo celularEn cada serie de pruebas HSV efectuada en aislados de cultivo celular,incluir un porta control Pathfinder® y un control negativo. El porta controlPathfinder® permite verificar las especificaciones del test de fluorescenciay del microscopio. El control de cultivo negativo sirve para examinar laposible contaminación del cultivo de células y ayuda en la interpretación delos resultados del paciente.

Para cada nuevo lote de células o de anticuerpos anti-HSV, evaluar dosportas control de cultivo positivo – uno que contenga células infectadaspor el HSV-1, y otro con células infectadas por el HSV-2. Estos portaspermiten comprobar las especificaciones del sistema de cultivo celular yofrece los siguientes controles, que facilitan la interpretación de losresultados:

• Controles positivos para el HSV-1 y el HSV-2.• Control de la especificidad tipológica de los anticuerpos monoclonales

(las células infectadas por el HSV-1 no deben colorearse con elanticuerpo anti-HSV-2 y viceversa).

NOTA: Los controles de cultivo celular ayudan en la interpretación delos resultados de la prueba por las siguientes razones:

• Permiten visualizar una reacción positiva y negativa en la línea celularespecífica utilizada para las muestras paciente.

• La preparación de los portas a partir de los cultivos control y paciente esidéntica.

Para la descripción detallada de las reacciones de los controles, ver elcapítulo Interpretación de los resultados de este prospecto. Repetir elensayo si los controles no muestran la reactividad apropiada.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOSEn primer lugar examinar los portas control. Si éstos presentan unareactividad adecuada, examinar los portas paciente. Repetir el ensayo silos portas controles no reaccionan correctamente. Los resultados positivosy negativos se describen de manera detallada a continuación.

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NOTA: La contratinción Azul de Evans tiñe las células no infectadas yel fondo de las células infectadas en rojo. La coloración verde mate encélulas completas es no específica. No tener en cuenta la coloraciónde los residuos extracelulares.

Resultados positivosUna muestra positiva presentará una fluorescencia verde manzanaespecífica. Las células infectadas por el HSV-1 normalmente manifiestanuna coloración del citoplasma. En las células infectadas por el HSV-2, elcitoplasma, el núcleo o los dos pueden colorearse según el estadio delciclo infeccioso. Cuando las células infectadas (por los dos tipos de HSV)son redondeadas, la coloración puede parecer nuclear porque elcitoplasma recubre el núcleo. El perfil de coloración no constituye, por sísolo, un indicador del tipo de HSV. La interpretación de positividad y detipaje debe confirmarse con el aspecto de una reacción de fluorescenciaespecífica con uno de los anticuerpos monoclonales. Una coloración noespecífica puede traducirse por una fluorescencia no celular, o por unacoloración amarilla o blanca más que verde manzana.

Muestra control positivaSegún el modo de preparación de los portas control, pueden aparecerdiferencias morfológicas entre las células. Las células que se cultivansobre un cubreobjetos o en un pocillo de porta (como en el caso de loscontroles Pathfinder®) aparecerán generalmente alargadas. Las célulasobtenidas de cultivos por frotamiento y colocadas sobre un porta (losportas de cultivo control) normalmente aparecerán redondeadas. Para queuna muestra control positiva se pueda aceptar, se deben poder observar almenos 10 células con fluorescencia específica por campo cuando seobserva al microscopio con pocos aumentos.

Muestra paciente positivaUna muestra paciente que contenga una o varias células (células epitelialesno superficiales o células de cultivo) que presenten una fluorescencia verdemanzana específica en el pocillo HSV-1 y/o el pocillo HSV-2 se consideracomo positiva. También son posibles las infecciones mixtas, en las que seencuentran a la vez células infectadas por el HSV-1 y células infectadaspor el HSV-2. Para excluir la posibilidad de una contaminación cruzada,colocar los aislados de cultivo celular sobre dos portas distintos antes deensayar cada anticuerpo.

Resultados negativosLas muestras negativas no presentan ninguna fluorescencia específica.Las células se teñirán con la contratinción. Las muestras que no tengan unnúmero suficiente de células epiteliales no superficiales o de células decultivo se considerarán como insuficientes y no se interpretarán.

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Resultados de los controles negativosUna muestra control negativa aceptable debe contener al menos 50 célulaspor pocillo y no presentar ninguna fluorescencia específica. Los portas quecontienen menos de 50 células no permiten determinar un resultadonegativo para el HSV. La coloración no específica del porta debe sermínima.

Muestras paciente negativasPara que se pueda aceptar, una muestra directa debe contener al menos10 células epiteliales no superficiales. Una muestra de cultivo aceptabledebe contener al menos 50 células por pocillo. Estas muestras seconsiderarán como negativas para el HSV si los dos pocillos HSV-1 y HSV-2 contienen un número de células suficiente para dar un resultadointerpretable y siempre que ninguno manifieste fluorescencia específica. Esnormal que se observe un cierto grado de coloración no específica de lascélulas o de los residuos celulares.NOTA: Las muestras clínicas directas que sean negativas o que notengan un número suficiente de células deben confirmarse con unaprueba de seguimiento con cultivo celular.

LÍMITES1. Si los anticuerpos se secan sobre el porta durante la incubación, la

interpretación puede ser difícil y los resultados no válidos.

2. El ensayo de las muestras con uno de los dos anticuerpos no excluye laposibilidad de una infección por el HSV del otro tipo. Por tanto, lasmuestras deben ensayarse con los dos anticuerpos.

3. La coloración de fondo no específica de las muestras paciente puededeberse a la formación de una película sobre el porta de vidrio o a laabsorción de agua por la acetona que sirve como fijador. Las posiblessoluciones son las siguientes:• Aclarar los portas de vidrio en la acetona (5-10 minutos) y secarlos

bien antes de usar, o utilizar los portas de vidrio que se suministranen la caja de obtención de muestras Pathfinder®.

• Efectuar un ensayo con una botella nueva de acetona que,inmediatamente, debe cerrarse herméticamente.

4. No se conocen las especificaciones de esta prueba sobre las muestraspaciente obtenidas durante o después de un tratamiento antiviral.

5. Un porta preparado a partir de una muestra clínica directa puede tenerun número insuficiente de células para identificar el HSV. Llegado elcaso, habría que aislar el virus en un cultivo celular y ensayar lafluorescencia de un aislado de cultivo celular para poder identificar ytipar el virus. Las siguientes etapas son críticas en la obtención y en lapreparación de las muestras:• Obtener las muestras de las lesiones vesiculares recientes.

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• Frotar la base de la lesión con la suficiente fuerza como para noobtener células epiteliales no superficiales.

• Enrollar el tampón utilizado para la obtención en los pocillos del portaapretando lo suficiente para obtener una buena extensión de lascélulas.

6. El éxito del aislamiento del HSV en un cultivo celular depende del rigorcon el que se obtengan, transporten y preparen las muestras.Únicamente deberían intentar el aislamiento del HSV los laboratorioscon experiencia en protocolos de cultivo celular destinados alaislamiento de virus. Un resultado de cultivo negativo no excluye laposibilidad de que efectivamente el paciente sea portador de unainfección por HSV. El resultado de esa prueba se interpretaráconsiderando el cuadro clínico del paciente y otros resultados de losanálisis biológicos.

7. Ver el capítulo Características de las especificaciones de este prospectopara los datos referentes a la sensibilidad de la prueba en las diferentessituaciones de obtención de muestras. Los datos que permitiríanrecomendar el uso de esta prueba en otras situaciones no son aúnsuficientes.

8. No se conocen las implicaciones clínicas de la utilización de esta pruebasobre muestras procedentes de pacientes asintomáticos.

9. Esta prueba permite detectar los HSV no viables (negativos en cultivo) olos antígenos del HSV en las muestras clínicas directas.

10. No utilizar los resultados obtenidos con la muestra clínica directa comoúnica herramienta de diagnóstico si se prevé una cesárea. Debenprevalecer los resultados del cultivo (cuando estén disponibles) y eljuicio clínico del especialista.

VALORES PREVISIBLESVer las Partes 1a, 1b, y 2a del capítulo Características de lasespecificaciones. Los valores previsibles pueden variar según la poblaciónde pacientes ensayada.

CARACTERÍSTICAS DE LAS ESPECIFICACIONES1. Identificación del HSV

Comparación de los reactivos anti-HSV de Pathfinder® con los mét-odos de cultivo celulara. Muestras clínicas directas

Los estudios internos realizados por dos investigadores independ-ientes han permitido evaluar la capacidad de los reactivos Path-finder® para identificar las muestras clínicas directas. En el estudiohan participado dos centros independientes de los Estados Uni-dos, una clínica de la Costa Oeste y una clínica metropolitana delCentro-Oeste especializada en las enfermedades de transmisión

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sexual. Las muestras para este estudio se obtuvieron en un hospi-tal pediátrico del Este. Las muestras se obtuvieron de adultos y deniños que presentaban lesiones que sugerían una infección porHSV.Los investigadores obtuvieron las muestras de cada paciente y lasenviaron al laboratorio para cultivar y para preparar comomuestras clínicas directas. Los investigadores independientestrataron y evaluaron los portas directos y realizaron los cultivos delas muestras obtenidas en sus respectivos centros. Las muestrasdirectas procedentes del hospital pediátrico del Este se prepara-ron y evaluaron en el mismo hospital; el hospital pediátrico realizólos cultivos de estas muestras.Para los cultivos celulares todos los investigadores utilizaron fibro-blastos humanos. Para confirmar los resultados de cultivo positi-vos, se prepararon unos portas a partir de los cultivoscorrespondientes (efecto citopático 2-3+) y se ensayaron para elHSV con reactivos fluorescentes. Los investigadores independien-tes consideraron los cultivos celulares como HSV-negativos enausencia de efecto citopático característico tras 7 días de incu-bación. El hospital pediátrico observó los cultivos durante unmínimo de 14 días antes de dar resultado negativo.En la Tabla 1 se resumen los resultados por investigador. De las165 muestras directas obtenidas para el estudio, pudieron interp-retarse 145. Las 20 muestras restantes se descartaron debido aun número insuficiente de células (de las muestras excluidas, 17resultaron positivas en cultivo y 3 negativas en cultivo). El porcen-taje de muestras insuficientes varió de un investigador a otro (6% -16%), lo que subraya la importancia de la etapa obtención de lasmuestras y de la preparación de los portas. Respecto a lasmuestras que podían interpretarse, los reactivos Pathfinder® pre-sentaron una sensibilidad y una especificidad globales de 80% yde 98%, respectivamente, en comparación con los métodos decultivo celular.

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Table 1 - Identificación del HSV en las muestras clínicas directas Resultados por investigador

La Tabla 2 presenta los resultados en función del sexo del paciente yde la zona de la lesión. Con estos datos no se observa ningunadiferencia significativa de sensibilidad o de especificidad para laslesiones genitales entre los hombres y las mujeres.Table 2 - Identificación del HSV en las muestras clínicas directas Resultados en función del sexo del paciente y del sitio de la lesión

Nota: Los cálculos utilizados en las Tablas 1 y 2 se basan en la comparación conel cultivo celular tomado como método de referencia.

b. Aislados de cultivo celular• Los investigadores A y B evaluaron la capacidad de los reactivos

Pathfinder® para identificar el HSV en los aislados de cultivocelular. Ver Parte 1a de Características de especificaciones para ladescripción detallada de las zonas de estudio, de las poblacionesde pacientes y de los métodos de cultivo celular. Los aislados decultivo celular procedían principalmente de lesiones genitales yanales.

VP FP FN VNInsuffisant

No. (%) TotalReactivos Pathfinder® + + - -Cultivo celular + - + -Investigador A 34 0 6 18 11 (16%) 69Investigador B 21 1 6 18 3 (6%) 49Interno 26 0 8 7 6 (13%) 47Total 81 1 20 43 20 165Sensibilidad = VP = 80% Especificidad = VN = 98%

VP + FN VN + FPNOTA: VP = verdadero positivo, FP = falso positivo, FN = falso negativo, VN = verdadero negativo

Zona de la lesión hombre mujer

Valor predicho

Sensibilidad Especificidad Positivo Negativo

VP VN VP VNVP + FN VN + FP VP + FP VN + FN

Genital 69 79% 95% 97% 67%38/48 20/21 38/39 20/30

Genital 43 81% 100% 100% 67%25/31 12/12 25/25 12/18

Anal 8 3 71% 100% 100% 67%5/7 4/4 5/5 4/6

Otras 10 11 86% 100% 100% 78%12/14 7/7 12/12 7/9

Desconocida 1Total 88 57

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• Los investigadores prepararon cultivos positivos y negativos parael HSV y, posteriormente, ensayaron esos portas con los reactivosPathfinder® para identificar el HSV. Los cultivos celulares seconsideraban como HSV-positivos si desarrollaban un efectocitopático característico en los 7 días siguientes a la inoculacióncon una muestra sospechosa de contener HSV; los cultivos seconsideraban negativos cuando había ausencia de efectocitopático tras 7 días de cultivo. Los resultados que se presentanen la Tabla 3 muestran que los reactivos Pathfinder® obtenían unasensibilidad y una especificidad del 100% en comparación con losmétodos de cultivo celular.

Table 3 - Identificación del HSV en los aislados de cultivo celular

2. Tipaje del HSV

a. Comparación de los resultados del tipaje entre las muestrasclínicas directas y los aislados de cultivo celularLos dos investigadores independientes mencionados en la Parte 1ade este capítulo tiparon muestras clínicas directas y aislados decultivo celular positivo (efecto citopático 2-3+) con reactivosPathfinder®. La Tabla 4 presenta los resultados del tipaje de lasmuestras clínicas directas positivas y de los cultivos celularespositivas. Los resultados obtenidos en las muestras clínicas directasconcuerdan en un 98% con los obtenidos en los aislados de cultivocelular. De los 49 aislados HSV-2-positivos, 45 procedían de lesionesgenitales y 4 de lesiones anales. Los 6 aislados HSV-1-positivoprocedían de lesiones genitales (5) y anales (1).Table 4 - Tipaje del HSV en muestras clínicas directas y aislados de cultivo celular

* No se excluye un error del técnico en el tratamiento del porta con la muestra clínica directa o del porta con el aislado de cultivo celular.

Método por cultivo celular

Positif Négatif

Reactivos Pathfinder® Positivo 70 0

Negativo 0 41

Método por cultivo celular

HSV-1 HSV-2

Muestra clínica directaHSV-1 5 0

HSV-2 1* 49

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b. Comparación de los reactivos Pathfinder® y del análisis conendonucleasas de restricciónEn otro estudio diferente, los Laboratorios Bio-Rad y un investigadorindependiente, C, tiparon 69 aislados HSV-positivos utilizando elanálisis con endonucleasas de restricción y por fluorescencia directacon reactivos Pathfinder®. Las muestras utilizadas para el estudioeran aislados clínicos cultivados en células Vero (células renales demono) o en células WI-38 (fibroblastos humanos) hasta que lascélulas presentaban un efecto citopático 3+. Los investigadores deBio-Rad utilizaron una versión modificada del método de Lonsdale(10), mientras que el laboratorio independiente utilizó un método deanálisis con endonucleasas de restricción descrito por Arens ySwierkosz (16).La Tabla 5 presenta los resultados de este estudio. Para el tipaje delos aislados positivos para el HSV-1 y el HSV- 2, la concordanciaentre el análisis por endonucleasas de restricción y los reactivosPathfinder® fue del 100%.

Table 5 - Tipaje del HSV con reactivos Pathfinder® y por análisis con endonucleasas de restricción

3. Reactividad cruzada

Los anticuerpos monoclonales anti-HSV Pathfinder® no presentaronreactividad cruzada con las líneas de células utilizadas para aislar elHSV. Con la excepción de Staphylococcus aureus (cepa Cowan), losanticuerpos no reaccionaron con los organismos empleados paraensayar la reactividad cruzada. Las líneas de células ensayadas eranlíneas Vero (células renales de mono), HEp-2 (células epitelialeshumanas), y WI-38 (fibroblastos humanos). La Tabla 6 incluye la lista delos organismos ensayados.

Análisis con endonucleasas de restricción

HSV-1 HSV-2

Reactivos Pathfinder®

HSV-1 40 0

HSV-2 0 29

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Table 6 - Organismos en los que se ha estudiado la reactividad cruzada

1La muestra procedía de una línea P3HR-1 transformada por EBV.2Los siguientes elementos hacen pensar que la reactividad cruzada que seconstata entre la cepa Cowan de Staphylococcus y los anticuerposmonoclonales anti-HSV no afecta a los resultados de la prueba:

• Con la eliminación del pus de las lesiones antes de obtener la muestrase deberían conseguir muestras que no contuvieran o contuvieranpocos Staphylococcus aureus.

• Aunque esté presente, el Staphylococcus aureus, que es una célulabacteriana, debería distinguirse fácilmente de una célula de mamíferoinfectada por el HSV.

Anticuerpo monoclonal anti-HSV-1

Anticuerpo monoclonal anti-HSV-2

Organismo Número de aislados Reactividad Número de

aislados Reactividad

Virus herpéticos

Cytomegalovirus 10 Negativo 6 NegativoVaricella Zoster Virus 3 Negativo 10 Negativo

Virus de Epstein Barr (EBV)1 1 Negativo 1 Negativo

Contaminantes habituales de los cultivos celulares

Mycoplasma orale 1 Negativo 1 NegativoMycoplasma salivarium 1 Negativo 1 NegativoMycoplasma arginini 1 Negativo 1 NegativoMycoplasma hyorheinis 1 Negativo 1 NegativoAcoleplasma laidlarvii 1 Negativo 1 Negativo

Otros organismos

Candida albicans 1 Negativo 1 NegativoCandida parapsilosis 1 Negativo 1 NegativoMycoplasma hominis 1 Negativo 1 NegativoChlamydia trachomatis 1 Negativo 1 Negativo

Staphylococcus aureus2 1 Positivo 1 Positivo

(cepa Cowan)

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Revised October 2013 506654