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PARTICIPACIÓN FUNCIONAL DE OsCPK13 Y miRNAs EN LAS RESPUESTAS

AL ENTORNO EN LAS PLANTAS DE ARROZ

MARCELO ALBORNO JOVER

TESIS DOCTORAL

Facultat de Biociències Universitat Autònoma de Barcelona

Doctorado en Biología y Biotecnología Vegetal

2015

TESIS DOCTORAL



Memoria presentada por:

MARCELO SEBASTIÁN ALBORNO JOVER

Para optar al grado de Doctor en Biología y Biotecnología Vegetal por la Universitat Autònoma de Barcelona

Departamento de Biología Animal, Biología Vegetal y Ecología Facultad de Biociencias

Trabajo realizado bajo la dirección de la Dra. María Coca López en el Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG).

Financiado por una beca de post-grado de ITAIPÚ Binacional (Paraguay) y por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT-Paraguay).

Barcelona, 2015

Dra. María Coca López Marcelo S. Alborno Jover Dra. Mercè Llugany Ollé Directora de la Tesis Autor Tutora de la Tesis

A mi equipo

“En la agricultura moderna no hay tiempo para que un agricultor escriba un poema o componga una canción”

Masanobu Fukuoka

AAgradecimientos Haber podido realizar este doctorado fue únicamente posible gracias al financiamiento del Gobierno de la República del Paraguay a través de las becas de post-grado de la hidroeléctrica ITAIPÚ Binacional (Paraguay-Brasil) y de las becas complementarias del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología del Paraguay (CONACYT).

El trabajo de tesis contó con la dirección y el apoyo incondicional de la Dra. María Coca López, quien ha confiado en mí para integrarme a su grupo de investigación y formar parte de los proyectos que tenía a su cargo. Por su predisposición permanente para guiarme en el camino de esta tesis.

Gracias principalmente a mis compañeros por la inmensa ayuda brindada en cada experimento, técnica, concepto… ustedes fueron fundamentales. Por el soporte en los momentos buenos y malos, por el hombro acogedor, por las palabras de aliento, por saber mostrarme mis errores, por ayudarme a corregirlos y por haber hecho que el proceso para llegar a este punto fuera mucho más ameno: Mire, Aarón, Cris, Mauricio, Pep, Lidi, Pat, Marcel, Rachel, Rosany, Sonia, Belén y tantos que pasaron por ahí a darme una mano y su amistad: Xiqui, Crina, Fredy, Marina, Saúl, Ares, María, Bia, Agnese, Elena, Pablito, Luis, Arnau, Lucio, Arni, Jose, María Corujo, Mariana, Briardo, Izar, Liecke, Remco, entre muchos otros.

A la Dra. Blanca San Segundo por brindarme su apoyo y ayuda en los temas tratados en esta tesis, de los que tanto conoce.

A toda la gente del CRAG: administrativos (Ma. José, Pablo, Mario), técnicos (Clara, Jordi, Maite, MaripazƗ), los servicios de informática (Iván), genómica (Sara), proteómica, radiactividad (Sami), imágenes (Montse, Ángel), secuenciación (Mercè) e invernaderos (Pilar, Mina, Eva, Albert, Alejandro) por la fundamental e invaluable ayuda prestada en la realización de los trabajos de esta tesis.

Gracias también a la Dra. Charlotte Poschenrieder, coordinadora del doctorado, por haberme brindado su ayuda en cada proceso durante estos años.

Existe un grupo de personas sin las cuales este proyecto de vida hubiese simplemente fracasado: mi familia paraguaya en Barcelona. Fueron el motor, el combustible y la vía de escape necesaria, para que hoy pueda finalizar con éxito esta etapa. Ellos fueron absolutamente indispensables: Fabi, Diego, Marce, Andre, Valentina, Pishi, Javier, Tami, Sol, Ferrán, María, Pila, Claudia, Karen, Marcelo, Noe.

Gracias a mi familia porque este es uno de los resultados de todo lo que ellos me enseñaron: Mamá Marta, Puchi, Luchi, los abuelos Ropi y Pi’ito, Papá Miguel, Jaz, tíos, tías, primos, primas y además también a mi nueva familia: Mami, Enrique, Maga, Samu, Enri y Marce.

A los amigos que me esperan en Paraguay, a ellos que siempre están: Robert, Migue, Ever, Osvaldo, Lelis, Oscar, Juan, Ale, Laurita, Piojo, Víctor, Ruth, Walter, Rorro, Pedrito, Luigi, Pesqui, Exte y tantos etcéteras.

A todos mis maestros, incluso aquellos de los que ni siquiera recuerdo su nombre, los que dejaron huellas indelebles en la mente, el alma y el corazón. La educación es la única vía para el desarrollo y ellos lo hacen posible.

Finalmente gracias a la piedra filosofal de mi vida: Fabi. Esta tesis en realidad es suya. Es suya por transmitir su fortaleza, por su constancia, por los ánimos, por las lágrimas, por levantarme, por los retos, por la decisiva voz que me decía que podía seguir, por cambiar mis paradigmas, por darme el último empujón, el imprescindible para que esto resulte, por Olivia, la combustión infinita del amor que fue la última pieza del rompecabezas que empezamos juntos casi a la par de esta tesis. Gracias por haberme regalado el título más importante incluso antes del examen.

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RResumen El arroz es uno de los cultivos más importantes del mundo, siendo el segundo cereal más

producido y el alimento fundamental de casi la mitad de la población humana. Año tras año, su producción es amenazada principalmente por enfermedades como la piriculariosis, causada por el hongo Magnaporthe oryzae, escasez de agua dulce en las áreas agrícolas debido al cambio climático que golpea con periodos de sequía extrema y la pérdida de nutrientes del suelo, como el fósforo. En este contexto, es cada vez más necesario mejorar los cultivos para hacerlos más productivos y mejor adaptados a las condiciones ambientales desfavorables. Conocer los procesos y los componentes que median la respuesta natural de la planta, así como la alteración de estos componentes puede afectar a otros procesos de adaptación al entorno y a los procesos de desarrollo de la planta, es importante para el diseño de estrategias de mejora del cultivo del arroz. En este trabajo se ha caracterizado la participación funcional de OsCPK13 en la respuesta de defensa y la fertilización fosfatada, y de los miRNAs osa-miR390, osa-miR397a, osa-miR397b y osa-miR1319a como componentes reguladores de la respuesta de defensa de la planta de arroz, y en la adaptación de la planta a condiciones de sequía. El trabajo se ha estructurado en dos capítulos.

El capítulo I se enfoca en la proteína OsCPK13, una proteína quinasa dependiente de calcio miembro de una familia multigénica cuyos componentes participan en la red de señalización que controla muchos aspectos de la biología de las plantas, desde procesos de desarrollo hasta las respuestas a estrés. Esta proteína se ha descrito previamente como un modulador positivo de la tolerancia a sequía y a estrés. Los estudios de esta tesis demuestran que OsCPK13 media la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS), causando un incremento en la susceptibilidad a la infección por el hongo M. oryzae. Además demuestran que tiene un papel positivo en la translocación de fosfatos a la parte aérea de la planta, y que su sobreacumulación deriva en una acumulación tóxica de fosfatos y serios defectos en el desarrollo vegetativo y reproductivo. Estos estudios demuestran que aunque podría ser una diana de mejora de tolerancia a sequía y salinidad, y crecimiento en condiciones deficientes de fosfato en el suelo, su acumulación debe estar finamente regulada para evitar efectos pleiotrópicos negativos.

El capítulo II se ha enfocado en la identificación y caracterización de miRNAs como reguladores de la respuesta de defensa. Mediante análisis de expresión global se han seleccionado 10 miRNAs regulados negativamente en respuesta a infección por M. oryzae, de los cuales se han caracterizado funcionalmente osa-MIR390, osa-MIR397a, osa-MIR397b y osa-MIR1319a e identificado sus dianas. Los resultados obtenidos demuestran que osa-miR390, osa-miR397b y osa-miR1319a son reguladores negativos de la resistencia a M. oryzae. Además se demuestra que osa-miR397a, el otro miembro de la familia de los miR397 de arroz, no participa en la respuesta de defensa frente a M. oryzae, y regula positivamente la tolerancia a sequía mostrando una especificidad funcional. Consistentemente, el gen OsLAC13, diana de los osa-miR397, que codifica una proteína lacasa, es un modulador negativo de la tolerancia a sequía. De entre todos los miRNAs estudiados, la estrategia basada en la disminución de los niveles de acumulación de osa-miR1319a parece ser la más eficaz para mejorar tanto la resistencia a la piriculariosis del arroz como la tolerancia a sequía, sin efectos aparentes en el desarrollo de la planta.

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FUNCTIONAL PARTICIPATION OF OsCPK13 AND miRNAs IN RESPONSE

TO THE ENVIRONMENT IN RICE PLANTS

AAbstract Rice is an important crop, the second most produced cereal and the staple food for more than

a half of the world population. Year by year, its production is threaten by diseases like the “blast disease”, caused by the pathogenic fungus Magnaporthe oryzae, shortage of freshwater in farming areas due to climate change that strikes with extreme dry seasons, and soil nutrient losses, like phosphorus. In this context, the crop improvement is critical, in order to achieve optimal yields under adverse environmental conditions. Elucidating the mechanisms and identifying the components that mediate natural rice defenses, as well as the interactions with plant development and the adaptation to the environment processes, are important factors to consider in the design of novel and efficient strategies for rice crop improvement. In this work, the contribution of the protein OsCPK13 as a signaling component of the rice immunity and to phosphate altered condition responses, and the participation of the miRNAs, osa-miR390, osa-miR397a, osa-miR397b and osa-miR1319a, as regulators of the rice defense and water stress responses has been characterized. This thesis is organized into two chapters.

Chapter I focuses on the OsCPK13, a isoform of the calcium dependent protein kinase family that function as signaling components in many aspects of plant biology, from developmental processes to stress responses. This protein has been previously described as a positive modulator of drought and salt stress tolerance. This thesis shows that OsCPK13 mediates the accumulation of reactive oxygen species (ROS) causing increased susceptibility to M. oryzae infection. Moreover, we demonstrate that OsCPK13 plays a positive role in the translocation of phosphates to the aerial part of plant, its overaccumulation leading to toxic phosphate levels in leaves, and serious defects in vegetative and reproductive development. These studies demonstrate that although OsCPK13 could be a good target for improving drought and salt tolerance, and growth in phosphate-deficient conditions, its accumulation must be tightly regulated to avoid negative pleiotropic effects.

Chapter II focuses on the identification and characterization of miRNAs as regulators of the defense response. Using global expression analysis, 10 miRNAs negatively regulated in response to M. oryzae infection have been selected. From these ten, osa-MIR390, osa-MIR397a, osa-MIR397b and osa-MIR1319a were functionally characterized and their targets identified. This thesis shows that osa-miR390, osa-miR397b and osa-miR1319a are negative regulators of M. oryzae resistance. Interestingly, the osa-miR397a, the other member of family of miR397, is not involved M. oryzae defense response but regulates drought tolerance, implying a functional specificity among members of a same miRNAs family. Consistently, the OsLAC13 gene, the target of osa-miR397, was identified as a negative modulator of drought tolerance. Among these miRNAs, the strategy based on reducing osa-miR1319a accumulation appears promising to improve both blast resistance and drought tolerance, without affecting plant performance.

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ÍÍndice

Contenido ..................................................................................................................................................................Página

Índice de figuras ..................................................................................................................................... XXI Índice de tablas .................................................................................................................................... XXIII Abreviaturas ............................................................................................................................................ XXV Introducción .................................................................................................................................................. 1 1. El arroz: más que un cereal....................................................................................................................... 3 2. Problemática en el cultivo del arroz ...................................................................................................... 8 2.1 Estrés biótico .......................................................................................................................................... 8 2.1.1 Dickeya dadantii y la podredumbre blanda ......................................................................................9 2.1.2 Fusarium verticillioides y el bakanae ..................................................................................................9 2.1.3 Magnaporthe oryzae y la piriculariosis ............................................................................................. 10 2.1.3.1 Características generales de M. oryzae ............................................................................................... 10 2.1.3.2 Ciclo infectivo de M. oryzae ................................................................................................................. 11 2.2 Estrés abiótico ....................................................................................................................................... 13 2.2.1 Sequía ................................................................................................................................................... 15 2.2.2 Deficiencia de fosfatos ....................................................................................................................... 16 3. Adaptación de las plantas a condiciones ambientales adversas...................................................... 16 3.1 El sistema de defensa de las plantas.................................................................................................. 17 3.1.1 Reconocimiento del agente agresor ................................................................................................ 17 3.1.2 Mecanismos moleculares implicados en la respuesta de defensa .............................................. 20 3.1.2.1 Flujo de calcio a través de la membrana plasmática ......................................................................... 20 3.1.2.2 Producción de especies reactivas de oxígeno..................................................................................... 22 3.1.2.3 Fosforilación reversible de proteínas ................................................................................................... 23 3.1.2.4 Regulación transcripcional .................................................................................................................. 24 3.1.2.5 Regulación post-transcripcional...........................................................................................................26 3.1.2.6 Acumulación de proteínas relacionadas con patogénesis .................................................................. 27 3.1.3 Hormonas reguladoras de las respuestas de defensa ................................................................... 28 3.1.3.1 Ácido salicílico ..................................................................................................................................... 28 3.1.3.2 Ácido jasmónico y jasmonatos ............................................................................................................29 3.1.3.3 Etileno ...................................................................................................................................................30 3.1.3.4 Otras hormonas reguladoras ............................................................................................................... 31 3.2 Respuestas de las plantas frente al estrés hídrico ........................................................................... 31 3.2.1 La señalización de las respuestas frente al estrés hídrico .............................................................. 33 3.3 Respuestas de las plantas frente a la deficiencia de fósforo ......................................................... 35 3.3.1 La señalización en la homeostasis de fosfatos ................................................................................ 36 4. Proteínas quinasas dependientes de calcio ......................................................................................... 37 4.1 Características de las proteínas CPKs de plantas ............................................................................. 38 4.2 CPKs en las respuestas de las plantas frente a estrés .................................................................... 40 5. MicroRNAs ................................................................................................................................................ 41 5.1 Biogénesis y modo de acción de los miRNAs .................................................................................. 41 5.2 MiRNAs en las respuestas de las plantas frente a estrés ............................................................... 43 6. Interacción de las respuestas al entorno reguladas por CPKs y miRNAs en las plantas de

arroz .......................................................................................................................................................... 44 Objetivos...................................................................................................................................................... 47

Índice

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Capítulo I: Caracterización funcional de OsCPK13 en la respuesta de defensa y la fertilización fosfatada en las plantas de arroz ................................ 51 AAntecedentes .............................................................................................................................................. 53 Resultados ................................................................................................................................................... 57 1. Caracterización de la expresión del gen OsCPK13 .............................................................................. 57 2. Estudio de la localización subcelular de la proteína OsCPK13 ......................................................... 61 2.1 Obtención de vectores para la expresión de OsCPK13 fusionado a proteínas fluorescentes .. 61 2.2 Localización subcelular de OsCPK13 ..................................................................................................62 3. Caracterización de las líneas transgénicas con expresión alterada del gen OsCPK13 .................. 65 4. Caracterización de OsCPK13 en la respuesta de defensa de la planta de arroz ........................... 68 4.1 Respuesta de OsCPK13 a infección por M. oryzae .......................................................................... 68 4.2 Fenotipo de líneas de expresión alterada de OsCPK13 frente a infección ................................. 70 4.3 Producción de especies reactivas de oxígeno en las líneas OsCPK13-ox .................................... 71 4.4 Análisis de expresión de genes relacionados con defensa en las líneas OsCPK13-ox ............... 76 5. Caracterización de OsCPK13 en respuesta a fertilización fosfatada ................................................78 5.1 Respuesta de OsCPK13 a diferentes condiciones de fertilización fosfatada ...............................79 5.2 Fenotipo radicular de las líneas de sobreexpresión de OsCPK13 ................................................. 80 5.3 Caracterización fenotípica de líneas de sobreexpresión de OsCPK13 en diferentes

condiciones de fertilización fosfatada .............................................................................................. 82 5.4 Acumulación de fósforo en líneas de sobreexpresión de OsCPK13 ............................................ 86 5.5 Expresión de genes relacionados con la homeostasis de fosfatos en las líneas OsCPK13-ox ..87 5.6 Expresión de OsCPK13 en líneas alteradas en la ruta de la homeostasis de fosfatos ............... 90 Discusión ...................................................................................................................................................... 93 Capítulo II: Identificación y caracterización de miRNAs de arroz implicados en la respuesta inmune y en la respuesta a estrés hídrico ......... 111 Antecedentes .............................................................................................................................................113 Resultados ................................................................................................................................................. 117 1. Selección de miRNAs con acumulación alterada durante la respuesta inmune de plantas de

arroz ......................................................................................................................................................... 117 2. Características de los miRNAs seleccionados .................................................................................... 120 3. Identificación de los tránscritos dianas de los miRNAs seleccionados ......................................... 124 3.1 Predicción bioinformática de dianas ............................................................................................... 124 3.2 Dianas validadas y descritas en la literatura................................................................................... 127 3.3 Validación de dianas por análisis de degradoma .......................................................................... 128 4. Análisis in silico de los promotores de los pre-miRNAs ...................................................................131 5. Acumulación de los miRNAs seleccionados en respuesta a infección por M. oryzae ................ 135 6. Generación de líneas transgénicas de arroz sobreexpresoras de los pre-miRNAs

seleccionados .......................................................................................................................................... 137 6.1 Construcción de vectores de expresión en plantas ....................................................................... 137 6.2 Análisis del procesamiento in vivo de los precursores en Nicotiana benthamiana ................ 139 6.3 Transformación de callos de arroz y caracterización genotípica de las líneas transgénicas

obtenidas .............................................................................................................................................. 140 6.4 Acumulación de los miRNAs en las líneas transgénicas de arroz generadas ........................... 144 7. Caracterización funcional de los miRNAs seleccionados ................................................................ 148 7.1 Caracterización de osa-MIR535 ......................................................................................................... 148 7.1.1 Validación de dianas de osa-MIR535 .............................................................................................. 148 7.2 Caracterización de osa-MIR390 en las respuestas de defensa y sequía ..................................... 149

Índice

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7.2.1 Validación de dianas de osa-MIR390 .............................................................................................. 150 7.2.2 Respuesta de osa-MIR390 y OsSIK1 frente a infección por M. oryzae ........................................ 150 7.2.3 Caracterización de líneas de Arabidopsis thaliana con acumulación diferencial de miR390

frente a infección .............................................................................................................................. 153 7.2.4 Caracterización de las líneas de sobreexpresión de osa-MIR390 frente a infección ................ 155 7.2.5 Caracterización de las líneas de sobreexpresión de osa-MIR390 en respuesta a sequía ......... 155 7.3 Caracterización de osa-MIR397 en las respuestas de defensa y sequía ..................................... 158 7.3.1 Validación de dianas de osa-MIR397 .............................................................................................. 159 7.3.2 Respuesta de osa-MIR397 y sus dianas frente a infección por M. oryzae .................................. 161 7.3.3 Caracterización de líneas de Arabidopsis thaliana con acumulación diferencial de miR397

frente a infección .............................................................................................................................. 165 7.3.4 Caracterización genotípica de líneas mutantes insercionales para osa-MIR397a y OsLAC13 . 167 7.3.5 Caracterización de las líneas de acumulación diferencial de osa-miR397 y su tránscrito diana

OsLAC13 frente a infección ............................................................................................................. 169 7.3.6 Respuesta de los osa-MIR397 y sus dianas frente a estrés hídrico ............................................. 171 7.3.7 Caracterización de las líneas de acumulación diferencial de osa-miR397 y su tránscrito diana

OsLAC13 frente a sequía .................................................................................................................. 172 7.3.8 Análisis de la producción de peróxido de hidrógeno en las líneas de acumulación diferencial

de osa-miR397 y OsLAC13 en respuesta a estrés hídrico ............................................................ 176 7.4 Caracterización de osa-MIR1319a en las respuestas de defensa y sequía ................................. 177 7.4.1 Validación de dianas de osa-MIR1319a ......................................................................................... 178 7.4.2 Respuesta de osa-MIR1319a y OsLTPL6 frente a infección por M. oryzae ................................. 178 7.4.3 Caracterización genotípica de líneas mutantes insercionales para osa-MIR1319a ................... 179 7.4.4 Caracterización de la línea de acumulación diferencial de osa-miR1319a frente a infección . 182 7.4.5 Análisis de la expresión de genes relacionados con defensa en la línea de acumulación

diferencial de osa-miR1319a ........................................................................................................... 184 7.4.6 Respuesta de los osa-MIR1319a y OsLTPL6 frente a estrés hídrico ............................................ 184 7.4.7 Caracterización de la línea de acumulación diferencial de osa-miR1319a frente a sequía ..... 185 7.4.8 Análisis de la producción de peróxido de hidrógeno en la línea de acumulación diferencial de

osa-miR1319a en respuesta a estrés hídrico ................................................................................. 187 DDiscusión .................................................................................................................................................... 191 Conclusiones ............................................................................................................................................ 209 Materiales y métodos ........................................................................................................................... 215 Materiales ................................................................................................................................................... 217 1. Bacterias .................................................................................................................................................. 217 2. Hongos .................................................................................................................................................... 217 3. Material vegetal ..................................................................................................................................... 217 4. Oligonucleótidos .................................................................................................................................... 219 5. Plásmidos, vectores y construcciones................................................................................................. 219 6. Anticuerpos ............................................................................................................................................. 219 7. Medios de cultivo ................................................................................................................................... 222 8. Soluciones y tampones ........................................................................................................................ 228 Métodos ...................................................................................................................................................... 232 1. Métodos generales ................................................................................................................................ 232 2. Obtención y análisis de ácidos nucleicos ........................................................................................... 232 2.1 Clonación de fragmentos de DNA en vectores plasmídicos y análisis de recombinantes ..... 232 2.1.1 Obtención de DNA plasmídico de bacterias ................................................................................. 232 2.1.2 Modificación de DNA: digestión por enzimas de restricción y ligación .................................... 232

Índice

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2.1.3 Clonación de fragmentos por recombinación homóloga mediante el sistema Gateway® .... 232 2.1.4 Purificación de DNA ......................................................................................................................... 233 2.1.5 Clonación de fragmentos de DNA por sistema T/A ..................................................................... 233 2.1.6 Preparación de células competentes de E. coli ............................................................................. 233 2.1.7 Preparación de células competentes de A. tumefaciens ..............................................................234 2.1.8 Transformación de células competentes bacterianas ..................................................................234 2.2 Extracción de DNA genómico vegetal ............................................................................................. 235 2.3 Extracción, manipulación y análisis de RNA de plantas ............................................................... 235 2.3.1 Extracción de RNA total de tejidos vegetales ............................................................................... 235 2.3.2 Electroforesis de RNA en geles de poliacrilamida ........................................................................ 236 2.3.3 Transferencia de RNA a un soporte inerte – Northern blot ......................................................... 237 2.3.4 Marcaje radiactivo y purificación de sondas ................................................................................. 237 2.3.5 Hibridación de membranas de RNA ............................................................................................... 238 2.3.6 Síntesis de cDNA ............................................................................................................................... 238 2.4 Amplificación de fragmentos de DNA por PCR ............................................................................. 239 2.5 PCR en tiempo real cuantitativa ...................................................................................................... 240 2.6 Secuenciación y análisis de DNA ..................................................................................................... 242 3. Obtención y análisis de proteínas .......................................................................................................243 3.1 Extracción de proteínas de tejidos vegetales .................................................................................243 3.2 Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida ....................................................................243 3.3 Transferencia de proteínas a un soporte inerte – Western blot ................................................. 244 3.4 Inmunodetección de proteínas........................................................................................................ 244 4. Crecimiento y manipulación de hongos patógenos ....................................................................... 245 4.1 Crecimiento de M. oryzae ................................................................................................................. 245 4.2 Crecimiento de F. verticillioides y P. cucumerina ......................................................................... 245 4.3 Obtención de suspensiones de esporas de hongos ..................................................................... 245 5. Crecimiento, manipulación, análisis y tratamiento de plantas ...................................................... 245 5.1 Esterilización superficial y germinación de semillas de arroz .................................................... 245 5.2 Esterilización superficial y germinación de semillas de Arabidopsis......................................... 246 5.3 Inoculación de plantas de arroz con agentes patogénicos ........................................................ 246 5.3.1 Infección con M. oryzae................................................................................................................... 246 5.3.2 Infección con F. verticillioides ......................................................................................................... 247 5.3.3 Inoculación con elicitores de M. oryzae ........................................................................................ 247 5.4 Infección de Arabidopsis con P. cucumerina ................................................................................ 248 5.5 Agroinfiltración de plantas de N. benthamiana ........................................................................... 248 5.6 Tratamiento de estrés hídrico en plantas de arroz ...................................................................... 249 5.7 Tratamientos de fertilización fosfatada en plantas de arroz ...................................................... 249 5.7.1 Tratamiento en tierra ....................................................................................................................... 249 5.7.2 Tratamiento en hidroponía ............................................................................................................. 250 5.8 Análisis histoquímico de la actividad GUS ..................................................................................... 250 5.9 Detección y análisis de la producción de ROS .............................................................................. 250 5.9.1 Análisis histoquímico para la detección de superóxido por tinción con NBT .......................... 250 5.9.2 Detección de ROS por fluorescencia de CM-H2DCFDA .............................................................. 251 5.9.3 Cuantificación del contenido de H2O2 ........................................................................................... 251 5.10 Análisis del contenido de fósforo en tejidos de plantas de arroz .............................................. 252 6. Obtención de líneas transgénicas de arroz ....................................................................................... 253 6.1 Inducción de callos embriogénicos ................................................................................................. 253 6.2 Transformación de callos embriogénicos mediada por A. tumefaciens .................................... 255 6.3 Selección de callos transformados y regeneración de plantas transgénicas ............................ 255

Índice

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7. Métodos informáticos ........................................................................................................................... 256 7.1 Bases de datos consultadas............................................................................................................... 256 7.2 Análisis de promotores ...................................................................................................................... 256 7.3 Tratamiento de secuencias y construcción de árboles filogenéticos ......................................... 257 BBibliografía .................................................................................................................................................259

Índice

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ÍÍndice de figuras


Figura 1. Los cereales que dominaron el mundo. .......................................................................................3 Figura 2. Producción mundial de arroz y su importancia económica....................................................... 4 Figura 3. Población pobre en las áreas de influencia de diferentes cultivos. ........................................... 5 Figura 4. La enfermedad de la piriculariosis: síntomas y ciclo infectivo. ................................................. 12 Figura 5. Respuestas del sistema inmune de las plantas. ......................................................................... 19 Figura 6. Procesos implicados en la respuesta de defensa. ...................................................................... 21 Figura 7. Señalización mediada por ABA en la respuesta frente a estrés hídrico. ................................. 34 Figura 8. Señalización de la homeostasis de fosfatos en arroz. ...............................................................37 Figura 9. Proteínas quinasas dependientes de calcio de plantas. ........................................................... 39 Figura 10. Biogénesis de miRNAs. ............................................................................................................... 42 Figura 11. Representación esquemática de las construcciones utilizadas en los estudios relacionados

con OsCPK13 ................................................................................................................................ 55 Figura 12. Expresión del gen OsCPK13 en diferentes estadíos y tejidos de las plantas arroz. ................ 58 Figura 13. Actividad del promotor de OsCPK13 en tejidos de arroz. ........................................................ 60 Figura 14. Esquema de la preparación de los vectores para la expresión en plantas de las proteínas de

fusión fluorescentes OsCPK13-YFP y OsCPK13-CFP. ................................................................. 63 Figura 15. Localización subcelular de OsCPK13. ......................................................................................... 64 Figura 16. Caracterización molecular de las líneas transgénicas OsCPK13-Ox y OsCPK13-Kd. ............... 67 Figura 17. Fenotipo de las plantas OsCPK13-Ox. ........................................................................................ 68 Figura 18. Acumulación de la proteína OsCPK13 en respuesta a infección por M. oryzae. .................... 69 Figura 19. Fenotipo frente a infección por M. oryzae de las plantas transgénicas de arroz con expresión

alterada de OsCPK13. .................................................................................................................. 72 Figura 20. Fenotipo de las plantas transgénicas de arroz OsCPK13-Kd frente a infección por F.

verticillioides y D. dadantii. ...........................................................................................................73 Figura 21. Producción de ROS en las hojas OsCPK13-Ox durante la respuesta de defensa a M. oryzae75 Figura 22. Expresión del gen de la peroxidasa OsPOX22.3 en las líneas OsCPK13-Ox. ........................... 76 Figura 23. Análisis de la expresión de genes relacionados con defensa en respuesta a infección por M.

oryzae en líneas de sobreexpresión de OsCPK13. ..................................................................... 78 Figura 24. Expresión de OsCPK13 en diferentes condiciones de fertilización fosfatada. ......................... 80 Figura 25. Fenotipo radicular de líneas de sobreexpresión de OsCPK13. ................................................. 82 Figura 26. Fenotipo de líneas OsCPK13-Ox crecidas en diferentes condiciones de fertilización fosfatada.

...................................................................................................................................................... 84 Figura 27. Efectos fisiológicos causados por diferentes condiciones de fertilización fosfatada en líneas

de sobreexpresión de OsCPK13. ................................................................................................. 85 Figura 28. Acumulación de P en las líneas de sobreexpresión de OsCPK13............................................. 87 Figura 29. Expresión de genes relacionados con la homeostasis de fosfato en líneas de sobreexpresión

de OsCPK13. ................................................................................................................................. 89 Figura 30. Expresión de OsCPK13 en líneas alteradas en la ruta de homeostasis de fosfatos. ................ 91 Figura 31. Modelo propuesto para la regulación de la homeostasis de fosfatos mediada por OsCPK13

en condiciones de suficiencia de fosfatos. .............................................................................. 109 Figura 32. Esquema del proceso de obtención de genotecas para la secuenciación masiva de

pequeños RNAs en la plataforma Illumina Solexa®. .............................................................. 114 Figura 33. Esquema de la construcción de genotecas PARE. ................................................................... 115 Figura 34. Esquema experimental de la obtención de genotecas para la secuenciación masiva de

pequeños RNAs y de tránscritos degradados por miRNAs en la plataforma Illumina Solexa®. ..................................................................................................................................................... 116

Índice de figuras y tablas

- XXII -

Figura 35. Precursores de los miRNAs seleccionados por su respuesta frente a elicitores de M. oryzae ..................................................................................................................................................... 119

Figura 36. Perfiles de expresión de los miRNAs seleccionados en respuesta a tratamiento con elicitores de M. oryzae en hojas de arroz. ................................................................................................ 119

Figura 37. Localización genómica de los precursores osa-MIR1319a, osa-MIR1847 y osa-MIR5808. ..... 122 Figura 38. Sitio de corte de las dianas de los miRNAs seleccionados. .................................................... 130 Figura 39. Análisis de los promotores de los miRNAs seleccionados. ..................................................... 134 Figura 40. Acumulación de los miRNAs en respuesta a infección por M. oryzae en parte aérea de

plantas de arroz. ......................................................................................................................... 136 Figura 41. Esquema de la preparación de los vectores para la sobreexpresión de precursores de

miRNAs. ....................................................................................................................................... 138 Figura 42 Procesamiento in vivo de los precursores de los miRNAs seleccionados. ............................. 142 Figura 43. Análisis de la inserción del T-DNA en las líneas de arroz regeneradas a partir de la

transformación con los vectores de sobreexpresión de los precursores de los miRNAs seleccionados. ............................................................................................................................. 143

Figura 44. Análisis de la acumulación de los miRNAs en las líneas de arroz transgénicas. ................... 145 Figura 45. Análisis de acumulación de los tránscritos predichos como dianas para osa-miR535-5p en

las líneas transgénicas de arroz sobreexpresoras de osa-MIR535. ........................................ 149 Figura 46. Análisis de acumulación de los tránscritos predichos como dianas para osa-miR390-5p en

las líneas transgénicas de arroz sobreexpresoras de osa-MIR390. ......................................... 151 Figura 47. Acumulación de osa-miR390-5p y de tránscritos de su diana OsSIK1 en respuesta a infección

por M. oryzae en hojas de arroz. .............................................................................................. 152 Figura 48. Caracterización de las líneas MIM-miR390 de A. thaliana en respuesta a infección por P.

cucumerina. ................................................................................................................................. 154 Figura 49. Fenotipo de líneas de sobreexpresión de osa-MIR390 en respuesta a infección por M. oryzae.

..................................................................................................................................................... 156 Figura 50. Acumulación de osa-miR390-5p en plantas de arroz en respuesta a estrés hídrico. ........... 157 Figura 51. Fenotipo de las líneas osa-MIR390-Ox en respuesta a sequía. ............................................... 158 Figura 52. Análisis de las lacasas de arroz. ................................................................................................ 160 Figura 53. Análisis de acumulación de los tránscritos OsLAC26 y OsLAC12/13 en las líneas transgénicas

de arroz sobreexpresoras de osa-MIR397a y osa-MIR397b. .................................................... 162 Figura 54. Acumulación de osa-miR397b en respuesta a infección por M. oryzae en hojas de arroz. . 162 Figura 55. Acumulación de los osa-miR397 y sus tránscritos dianas en respuesta a infección por M.

oryzae en hojas de arroz. .......................................................................................................... 164 Figura 56. Caracterización de las líneas MIM-miR397 de A. thaliana en respuesta a infección por P.

cucumerina. ................................................................................................................................ 166 Figura 57. Análisis genotípico de las líneas de arroz mutantes insercionales del TRIM para osa-MIR397a

y OsLAC13. .................................................................................................................................. 168 Figura 58. Fenotipo de líneas de sobreexpresión de osa-MIR397b en respuesta a infección por M.

oryzae. ......................................................................................................................................... 170 Figura 59. Fenotipo de líneas mutantes en OsLAC13 y de activación de osa-MIR397a en respuesta a

infección por M. oryzae. ............................................................................................................. 172 Figura 60. Acumulación de osa-miR397 y los tránscritos de sus dianas OsLAC26 y OsLAC12/13 en

respuesta a estrés hídrico. ......................................................................................................... 173 Figura 61. Fenotipo de las líneas osa-MIR397a-Ac y OsLAC13-Kd en respuesta a sequía. ..................... 174 Figura 62. Tolerancia a sequía de las líneas osa-MIR397a-Ac y OsLAC13-Kd. ......................................... 174 Figura 63. Producción de peróxido de hidrógeno en las líneas osa-miR397a-Ac y OsLAC13-Kd en

condiciones de estrés hídrico. ................................................................................................... 177


- XXIII -

Figura 64. Acumulación del tránscrito OsLTPL6 en las líneas transgénicas de sobreexpresión de osa-MIR1319a...................................................................................................................................... 178

Figura 65. Acumulación de osa-miR1319a y de tránscritos de su diana OsLTPL6 en respuesta a infección por M. oryzae en hojas de arroz. ............................................................................................. 180

Figura 66. Análisis genotípico de las líneas de arroz mutantes insercionales del TRIM para osa-MIR1319a...................................................................................................................................... 181

Figura 67. Fenotipo de líneas mutantes osa-MIR1319a-Kd en respuesta a infección por M. oryzae. .... 183 Figura 68. Expresión de genes de defensa en respuesta a infección por M. oryzae en hojas de la línea

osa-MIR1319a-Kd. ....................................................................................................................... 185 Figura 69. Acumulación de osa-miR1319a y del tránscrito OsLTPL6 en respuesta a estrés hídrico ...... 186 Figura 70. Fenotipo de las líneas osa-MIR1319a-Kd en respuesta a sequía. ............................................ 187 Figura 71. Tolerancia a sequía de las líneas osa-MIR1319a-Kd. ............................................................... 188 Figura 72. Producción de peróxido de hidrógeno en la línea osa-MIR1319a-Kd en condiciones de estrés

hídrico......................................................................................................................................... 189 Figura 73. Protocolo de la reacción de stemloop RT. ............................................................................... 240 Figura 74. Condiciones generales para amplificación de fragmentos de DNA por PCR. ....................... 241 Figura 75. Protocolo de amplificación de fragmentos de cDNA por qPCR utilizando SybrGreen® de

Roche™. ....................................................................................................................................... 241 Figura 76. Validación de la técnica stemloop qRT-PCR mediante análisis Northern blot. ..................... 242 Figura 77. Esquema del proceso de transformación de arroz a partir de callos embriogénicos via A.

tumefaciens. ............................................................................................................................... 254

Índice de tablas


Tabla 1. Efectos de las condiciones ambientales en la producción de cereales. ................................... 14 Tabla 2. Clasificación de las proteínas PR. ............................................................................................... 28 Tabla 3. Expresión diferencial de genes OsCPK en respuesta a elicitores de M. oryzae. ......................53 Tabla 4. Selección de miRNAs reprimidos en respuesta al tratamiento con elicitores de M. oryzae. 118 Tabla 5. Características generales de los miRNAs seleccionados. ........................................................ 121 Tabla 6. Conservación en diferentes especies de los miRNAs seleccionados...................................... 123 Tabla 7. Predicción bioinformática de dianas de los miRNAs seleccionados. ..................................... 124 Tabla 8. Revisión de dianas descritas para los miRNAs seleccionados. ............................................... 128 Tabla 9. Tránscritos degradados por los miRNAs seleccionados en hojas de arroz en respuesta a

elicitores de M. oryzae. .............................................................................................................. 129 Tabla 10. Resumen de las dianas de los miRNAs seleccionados identificados in silico, descritas en la

literatura y en el análisis de la secuenciación del degradoma. ............................................... 130 Tabla 11. Elementos reguladores en los promotores de los miRNAs seleccionados. ........................... 133 Tabla 12. Resumen del análisis genotípico y de fertilidad de los eventos de transformación de arroz.

..................................................................................................................................................... 143 Tabla 13. Resumen de los niveles de acumulación de los miRNAs y la producción de semillas de las

líneas transgénicas de arroz. ..................................................................................................... 147 Tabla 14. Cebadores relacionados con clonaciones y genotipados. ...................................................... 219 Tabla 15. Sondas y cebadores de stemloop-RT. ...................................................................................... 220 Tabla 16. Cebadores para qRT-PCR. ........................................................................................................ 220 Tabla 17. Plásmidos, vectores y construcciones. ...................................................................................... 221


- XXIV -

- XXV -

AAbreviaturas ABA Ácido abscísico ABRE Elemento de respuesta a ABA Ac Activación amiRNA miRNA artificial APX Ascorbato peroxidasa BAK Quinasa asociada a BRI bHLH hélice-bucle-hélice básica BR Brasinosteroides BRI Insensible a brasinosteroides bZIP Cremallera de leucina básica CAD Dominio de activación de CPK CAT Catalasa CaM Calmodulina CaMK Quinasa dependiente de calmodulina CaMV Virus del mosaico de la coliflor CBL Calcineurin B CCaMK Quinasa dependiente de calcio y calmodulina cDNA DNA copia o complementario CFP Proteína fluorescente cian CFU Unidades formadoras de colonia CIPK Proteína quinasa interactora con CBL CML Similar a calmodulinas CPK/CDPK Proteína quinasa dependiente de calcio CRK Proteína quinasa relacionada con CPKs Ctrl Control cv cultivar DCL Proteínas del tipo tijera DNA Ácido desoxirribonucléico DREB Elemento de unión en respuesta a deshidratación EREBP Proteína de unión a elementos de respuesta a etileno ERF Factor de respuesta a etileno esp esporas ET Etileno ETI Inmunidad activada por efectores ETS Susceptibilidad activada por efectores Ev Empty vector-Vector vacío FT Factor de transcripción GA Ácido giberélico GFP Proteína fluorescente verde GPX Glutatión peroxidasa GST Glutatión-S-transferasa GUS β-glucuronidasa IPS/PSI Inducible por deficiencia de fosfatos hpi horas post infección HR Respuesta hipersensible IRRI Instituto Internacional de Investigación del Arroz JA Ácido jasmónico y jasmonatos JIN Insensible a jasmonatos Kd Knock-down LB Borde izquierdo LRR Repetición rica en leucinas LTP Proteína de transferencia de lípidos MAPK Proteína quinasa activada por mitógenos Mb Megabases

Abreviaturas

- XXVI -

miRNA microRNA mRNA RNA mensajero NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NBT Nitroazul de tetrazolio NH1 Homólogo de NPR1 Nos Nopalina sintasa NO Óxido nítrico NPR1 No expresor de proteínas PR O2- Ion superóxido O2-2 Ion peróxido OH- Radical hidroxilo Ox Over-expressor (sobreexpresor) pb pares de bases PCR Reacción en cadena de la polimerasa PAL Fenil-alanin liasa PAMP Patrones moleculares asociados a patógenos PAP Fosfatasa ácida púrpura Pi Fósforo inorgánico POX Peroxidasa PR Proteína relacionada con patogénesis pre-miRNA Precursor de miRNA pri-miRNA miRNA primario PRR Receptor de reconocimiento de patrones PP2C Fosfatasa 2C PT Transportador de fosfatos PTI Inmunidad activada por PAMPs qRT-PCR PCR en tiempo real cuantitativa R Resistente RB Borde derecho RBOH Homólogos de oxidasas de la respiración RdR6 RNA polimerasa dependiente de RNA RISC Complejo de silenciamiento inducido por RNA RLK/RPK Quinasas similares a receptores RLP Proteínas similares a receptores ROS Especies reactivas de oxígeno RNA Ácido ribonucleico RT-PCR PCR de retrotranscripción S Sensible SA Ácido salicílico SAR Resistencia sistémica adquirida SD Desviación estándar SEM Error estándar de la media SIK Quinasa inducida por estrés SOD Superóxido dismutasa SQD Sulfoquinovosil transferasa sRNA pequeño RNA siRNA sRNA de interferencia T-DNA DNA de transferencia TRIM Mutantes insercionales de arroz de Taiwán Ubi Ubiquitina UTR Región no traducida var variedad WAK Quinasa asociada a la pared celular Wt Wild type-Especie silvestre YFP Proteína fluorescente amarilla

Introducción

- 3 -

IIntroducción

1. El arroz: más que un cereal

Hace unos 7.000 años, grupos de personas alrededor de la tierra empezaron a

abandonar el estilo de vida nómada que había sido exitoso y universal durante milenios

para empezar a acumular y luego a cultivar e instalarse alrededor de parcelas de

cereales y pasturas para animales domesticados. Estos fueron los primeros eventos que

alteraron para siempre la historia de la alimentación humana. La agricultura lo cambió

todo y es el hábito humano que hizo posible el crecimiento linear de la población que

perdura hasta estos tiempos. De no haberse domesticado la producción de alimentos,

actualmente hubiésemos sido tan sólo unas pocas decenas de millones de personas en

todo el mundo. El nacimiento y el desarrollo inicial de la agricultura se constituyeron en

la primera revolución y evolución de la ciencia y la tecnología en la búsqueda de

mejores condiciones de vida y alimento.

En un momento de la historia de la humanidad, hace unos 5 milenios, el trigo

(Triticum aestivum) era el cereal que conquistaba el oriente próximo, mientras que en el

extremo oriente, otra de las cunas de la civilización, se cultivaba el arroz (Oryza sativa), y

en América el maíz (Zea mays). De este modo se establecía un eje de producción de

cereales que dominaba el mundo (Figura 1).

Figura 1. Los cereales que dominaron el mundo. Establecimiento de un eje productivo de cereales que alimentaba a la población mundial hace 5000 años, con tres cultivos cereales básicos en el planeta: maíz, trigo y arroz.

Introducción

- 4 -

A partir de ese punto inflexivo de la historia de la agricultura y hasta nuestros

días, los cereales son la fuente de alimentación humana más importante, proveyendo

aproximadamente la mitad de las calorías que toda la humanidad necesita para su

mantenimiento. Entre los cereales, el maíz es actualmente el de mayor producción a

nivel mundial con más de 1000 Mt, seguido por el arroz, del cual se han producido

aproximadamente 750 Mt en el año 2013 (Figura 2A).

0

200

400

600

800

1000

1200

Maíz Arroz Trigo Cebada Sorgo Avena

Prod

ucció

n (m

illone

s de

Tn)

Producción mundial de cereales 2013

Prod

ucció

n (b

illone

s de

US$) Producción (m

illones de t)

2000

1000

Producción mundial de mercancías 2012

0

200

100

0

Mercancía

Leche Arroz CarneVaca

CarneCerdo

CarnePollo

Trigo Soja Tomate Caña deAzúcar

Producción brutaIngresos

A

B

Figura 2. Producción mundial de arroz y su importancia económica. A. Posicionamiento de la producción del cultivo de arroz frente a otros cereales en el año 2013. B. Posicionamiento de la producción de arroz y su valor económico frente a otras mercancías de comercio agropecuario. Fuente: FAOSTAT (FAO, 2014/2015).

Introducción

- 5 -

El arroz se cultiva en más de 100 países del mundo y abarca desde los 40ºS

hasta los 53ºN de latitud, con un incremento de aproximadamente el 2,3% anual en la

producción mundial, siendo los asiáticos China (203 Mt), India (159 Mt), Indonesia (71

Mt), Bangladesh (51 Mt) y Vietnam (44 Mt) los mayores productores y abarcando el 90%

del total al año 2013 (FAOSTAT, 2015). Fuera del continente asiático, Brasil es el de

mayor producción con apenas unos 11 Mt, lo que demuestra el contraste entre Asia y el

resto del mundo. En toda Europa se producen actualmente unos 3 Mt, siendo los

mediterráneos Italia y España los principales productores con más de la mitad del total

continental, cultivándose también en Francia, Grecia y Portugal. El arroz ocupa además

el segundo lugar tanto en producción bruta como en ingresos, entre todas las

mercancías de comercio agropecuario a nivel mundial (Figura 2B), constituyéndose en

una importante fuente de ingresos para los países productores. Estos ingresos, sin

embargo, no parecen tener influencia en las más de 500 millones de personas que viven

en la zona de influencia del cultivo del arroz en gran parte de Asia, una cantidad

abrumadora de pobres de los cuales el arroz es el alimento fundamental de su dieta

(Figura 3).

AArroz

Población pobre en áreas dominadas por diferentes cultivos

Millones de personas

Trigo

Leguminosas

Maíz

Mijo

Sorgo

Sur de AsiaSudeste asiáticoEste de AsiaÁfrica sub-saharianaAmérica latina y Caribe

Figura 3. Población pobre en las áreas de influencia de diferentes cultivos. Se indica la cantidad de personas que vivían en condición de pobreza, correspondiente a un ingreso de menos de 1,25 US$/día, en el año 2005. Fuente: IRRI en «A bigger rice bowl», de The Economist.

Introducción

- 6 -

El arroz (O. sativa spp.) es una angiosperma monocotiledónea, forma parte de la

familia de las gramíneas (Poaceae) y ha evolucionado a partir de una hierba que se ha

diferenciado y adaptado para sobrevivir en las regiones húmedas de un continente

ancestral llamado Gondwana, hace más 130 millones de años. La separación tectónica de

ese continente dio forma a los continentes que hoy se conocen como Asia y África,

viéndose así también separada la evolución del arroz africano (O. glaberrima) y del arroz

común o asiático (O. sativa) (Smith & Dilday, 2003). Oryza sativa es una especie con 12

pares de cromosomas, diploide (2n=2x=24), posee un genoma pequeño, de

aproximadamente 390 Mb, unos 40.000 genes codificantes para proteínas, más del 50%

de secuencias repetitivas y 35% de transposones. Según lo que se conoce hasta hoy,

tiene uno de los genomas más pequeños entre los cultivos para alimentos, en

comparación, por ejemplo, con los genomas de otros cereales como T aestivum (15.000

Mb), Z. mays (2.300 Mb) y S. bicolor (730 Mb) (Ambrose & Purugganan, 2013; Zhang &

Wing, 2013). Existe un alto grado de colinearidad y sintenia entre el genoma del arroz y

los genomas de otros cereales.

El crecimiento de la planta de arroz está dividido en varias etapas de desarrollo

basado en caracteres morfológicos y fisiológicos que determinan principalmente los

estados de: germinación, macollado, elongación del tallo, formación de hoja bandera,

emergencia de panículas, floración y maduración (Moldenhauer & Gibbons, 2003). Su

morfología es similar a la de otras gramíneas, como los cereales y pasturas, cuyo tallo

está formado por unidades de brotes que constan de nodos e internodos. Sus hojas son

láminas unidas al tallo por una vaina basal enrollada en un cilindro que envuelve las

hojas de nueva formación. Posee raíces son fibrosas y cubiertas de pelos radiculares, con

una raíz principal y varias raíces secundarias que ayudan al soporte de la planta y al

aumento del área de búsqueda de nutrientes (Smith & Dilday, 2003). La planta del arroz

puede crecer bajo diferentes condiciones ambientales y prueba de ello es la enorme

dispersión de su cultivo a lo largo y ancho del planeta. Sin embargo, está mejor

Introducción

- 7 -

adaptada a los climas cálidos y húmedos, cultivadas preferentemente en parcelas con

suplemento permanente de agua o levemente inundadas, condiciones que mejoran la

producción, a pesar de que también se cultiva en climas extremos como zonas secas o

con inundaciones severas, características que hacen del arroz un cultivo muy adaptable.

El arroz asiático es el más cultivado a nivel mundial, y es una especie que se

divide en tres subespecies: O. sativa japonica, O. sativa javanica y O. sativa indica. La

subespecie indica posee granos largos y finos, es propia de regiones tropicales y

subtropicales de India y Tailandia y sensible a bajas temperaturas, mientras que la

subespecie javanica también tiene granos largos, pero gruesos y aristados, cultivándose

principalmente en las islas tropicales de Indonesia. La subespecie japonica se caracteriza

por tener granos redondos, siendo cultivada principalmente en regiones templadas y

subtropicales, especialmente en Japón y China, y tiene bastante tolerancia a bajas

temperaturas. Esta es además la subespecie más cultivada de Europa y en España,

donde actualmente es mayoritaria la variedad Gleba. La variedad japonesa Nipponbare

fue la primera en contar con el genoma secuenciado y con esta se ha realizado una

parte de los trabajos de esta tesis, además de la variedad taiwanesa Tainung67, ambas

de la subespecie japonica.

Además de su tremenda importancia económica y agrícola a nivel mundial, el

arroz es considerado como una planta modelo para investigación de genómica

funcional en monocotiledóneas, siendo la segunda especie vegetal que fue secuenciada.

El manejo y la manipulación de las plantas de arroz son relativamente sencillos y

actualmente se cuenta con una vasta información disponible. A esto se puede agregar

además un enorme banco de germoplasma disponible en el IRRI (International Rice

Research Institute); colecciones de mutantes como los del TRIM (Taiwan Rice Insertional

Mutants), los del Transposon Insertion Mutant Database, también del RMD (Rice Mutant

Database), del Rice Tos17 Insertion Mutant Database, entre otros; recursos de cDNA

como los clones de las bases del KOME (Knowledge-based Oryza Molecular Biological

Introducción

- 8 -

Enciclopedia); varias bases de datos de microarrays y otras herramientas bioinformáticas

disponibles para análisis de expresión de genes; y protocolos de transformación

altamente eficientes (Hiei et al., 1994).

Dada su importancia económica y social, y la facilidad de manejo como sistema

de estudio, esta tesis utiliza la planta de arroz para investigar los mecanismos

moleculares y componentes que regulan su adaptación al ambiente.

2. Problemática en el cultivo del arroz

A pesar de ser una planta particularmente adaptable a las condiciones del

ambiente, las plantas de arroz sufren de una diversidad de problemas en su cultivo, que

abarcan estreses abióticos como la salinidad de los suelos, temperaturas extremas,

problemas nutricionales e hídricos; además de estreses bióticos causados por insectos

plagas y enfermedades principalmente fúngicas y bacterianas. En términos biológicos, el

estrés implica una desviación de las condiciones normales de la fisiología y desarrollo

que pueden causar daños severos a la planta y en la producción de semillas (Pareek et

al., 2010). Las situaciones adversas que más afectan al cultivo de arroz y que conllevan

importantes pérdidas en las cosechas se detallan a continuación.

2.1 Estrés biótico

Este tipo de estrés es aquel que ocurre como consecuencia del daño causado en

la planta por otros organismos vivos como virus, bacterias, hongos, parásitos, insectos y

plantas. Entre estos organismos, las enfermedades causadas por hongos y bacterias son

las más importantes en el arroz, ya que se estima que las pérdidas en la producción de

arroz ocasionadas por enfermedades son entre un 20 y un 40%. El agente patógeno

principal del arroz es Magnaporthe oryzae, causante de la enfermedad de la

piriculariosis. Son también importantes y de gran incidencia las enfermedades causadas

por los hongos Rhizoctonia solani, que causa el añublo de la vaina del arroz o “sheath

Introducción

- 9 -

blight”; Fusarium verticillioides, conocida como “bakanae” o “foolish seedling” y

Helminthosporium oryzae, causante de la helmintosporiosis o “brown spot”. Las

enfermedades causadas por bacterias son muy importantes en las zonas de arroz

irrigado, como la bacteriosis vascular del arroz (rice bacterial blight), causada por

Xanthomonas oryzae, la podredumbre blanda o marchitamiento (soft rot, wilt disease),

que tiene como agente causal a Dickeya dadantii y el añublo bacterial de la panícula,

causado por Burkholderia glumae (De Datta, 1981; Goto, 1979; Ham et al., 2011; Mansfield

et al., 2012).

2.1.1 Dickeya dadantii y la podredumbre blanda

La enfermedad de la podredumbre blanda en arroz, causada por D. dadantii

(anteriormente Erwinia chrysantemi), fue notada inicialmente en Japón causando

amarillamiento de las hojas y un color negruzco y decaimiento de los macollos. Esta

bacteria se encuentra en los suelos y comienza la infección a través de la base del tallo,

provocando la podredumbre del pie de la planta, invadiendo después toda la planta,

provocando su muerte y causando pérdidas importantes (Goto, 1979; Mansfield et al.,

2012).

2.1.2 Fusarium verticillioides y el bakanae

F. verticillioides es un hongo ascomiceto filamentoso cuyo ataque en plantas de

arroz causa la enfermedad del “bakanae”, pero que también puede ser causada por

otras especies como F. fujikuroi y F. proliferatum (Wulff et al., 2010). Este hongo está

presente en los suelos y normalmente comienza la infección sistemática de la planta a

través de las raíces. Las semillas también son comúnmente atacadas, muchas veces

impidiendo su germinación o afectando la plántula recién emergida provocando una

elongación anormal, causada por las giberelinas (hormonas vegetales de crecimiento)

producidas por el hongo, coloración verde pálida y tallos delgados. En los casos en los

que la planta logra sobrepasar el estadio de plántula, las plantas llegan prematuramente

Introducción

- 10 -

al estadio de macollado (De Datta, 1981). La importancia del bakanae radica en que la

mayoría de las plantas afectadas mueren antes de producir panículas, causando grandes

pérdidas en el cultivo.

2.1.3 Magnaporthe oryzae y la piriculariosis

El principal problema biótico con el que se enfrenta el arroz a nivel mundial es la

piriculariosis, una de las enfermedades más devastadoras en su cultivo. Esta enfermedad

fue descrita por primera vez en el año 1637 en China y se la llamó “enfermedad de la

fiebre del arroz”. En los últimos años se ha verificado una serie de epidemias de

piriculariosis, causante de multimillonarias pérdidas en los grandes productores de arroz

como China, Corea, Japón y Vietnam, haciendo de M. oryzae un enemigo de la

seguridad alimentaria mundial (Wilson & Talbot, 2009).

2.1.3.1 Características generales de M. oryzae

Magnaporthe oryzae (Couch) es un hongo ascomiceto filamentoso en su forma

telomorfa, especie previamente conocida como Magnaporthe grisea (Hebert) pero que

fue diferenciada como una nueva especie, separándola de esta última por análisis

filogenéticos y rango de huéspedes. Mientras la rama filogenética M. oryzae puede

infectar arroz, mijo (Eleusine spp.) y especies herbáceas de los géneros Setaria, Lolium y

Eragostis, la rama M. grisea sólo es capaz de infectar únicamente especies del género

Digitaria (Couch & Kohn, 2002). El estado anamorfo de M. oryzae es la especie

Pyricularia oryzae (Cooke), cuyo género dio nombre a la enfermedad derivada en arroz.

En las últimas décadas, M. oryzae se ha convertido además en un organismo

modelo para el estudio y la investigación de enfermedades en plantas causadas por

hongos, principalmente por su importancia económica pero también por la facilidad en

su manipulación experimental y que comparte características asociadas a otros

patógenos de cereales, como la formación de apresorios y la invasión intercelular

Introducción

- 11 -

(Wilson & Talbot, 2009). Hace 10 años que se dispone de su genoma completo (Dean et

al., 2005), contándose además con bases de datos de mutantes y protocolos de

transformación y mutagénesis eficientes.

El patógeno M. oryzae ataca todos los estados de desarrollo de la planta de

arroz, infectando principalmente las hojas de la planta de arroz, aunque también se ha

visto que puede infectar tallos, nudos, panículas e incluso raíces (Campos-Soriano & San

Segundo, 2009; Dufresne & Osbourn, 2001; Sesma & Osbourn, 2004; Wilson & Talbot,

2009). La infección en panículas no es la más frecuente pero es, sin embargo, la más

devastadora, afectando directamente los órganos reproductivos de la planta, causando

la pérdida total de la producción de granos (Wilson & Talbot, 2009). Los síntomas

característicos de esta enfermedad se muestran en las Figura 4A-B.

2.1.3.2 Ciclo infectivo de M. oryzae

El ciclo infectivo de M. oryzae en arroz fue estudiado principalmente en hojas,

por ser el más frecuente, y se presenta en el esquema de la Figura 4C. La infección por

M. oryzae se inicia cuando un conidio tricelular, se adhiere a la superficie cuticular

hidrofóbica del tejido foliar mediante un adhesivo mucilaginoso secretado por el

compartimento apical de la espora durante la hidratación (Wilson & Talbot, 2009).

Desde el mismo extremo apical se desarrolla un tubo germinativo que crece sobre la

superficie hasta diferenciarse en una estructura especializada y determinante para la

penetración del tejido: el apresorio, que se forma en respuesta a la superficie

hidrofóbica de la hoja (Ebbole, 2007; Khang et al., 2010; Rebollar & López-García, 2013;

Wilson & Talbot, 2009). El apresorio posee una pared celular rica en quitina, con una

capa de melanina entre la pared y la membrana celular, esencial para la turgencia de la

estructura y que actúa también como barrera del flujo de solutos. Esa turgencia genera

una fuerza mecánica que empuja a la punta de penetración, recién formada en la base

del apresorio, hacia dentro de la hoja. Luego de la penetración, las hifas se ramifican a

Introducción

- 12 -

través del tejido foliar, resultando en la invasión y posteriormente en la enfermedad

(Wilson & Talbot, 2009).

Figura 4. La enfermedad de la piriculariosis: síntomas y ciclo infectivo. A. Aspecto del campo de cultivo de arroz atacado por el hongo Magnaporthe oryzae, causante de la enfermedad de la piriculariosis. (Imagen tomada de: International rice blast conference - http://irbc2013.riceblast.snu. ac.kr/) B. Observación microscópica de las lesiones típicas causadas por M. oryzae en las hojas de arroz infectadas. C. Ciclo infectivo de M. oryzae en tejidos foliares de arroz. Adaptado de Wilson & Talbot (2009).

AA

B

C

Introducción

- 13 -

Este hongo es considerado como un hemibiótrofo muy efectivo. Presenta un

crecimiento inicial biotrófico, en el cual las hifas colonizan los tejidos vivos de la planta y

crecen dentro de las células rodeadas de la membrana plasmática invaginada. En este

estado el hongo desvía los nutrientes de las células vivas del huésped mediante las hifas

bulbosas invasivas, estructuras especializadas para ese propósito, y que son análogas a

los haustorios presentes en los hongos biótrofos. La invasión se da por medio de los

plasmodesmos, a través de los cuales las hifas del hongo se hacen camino para la

colonización de las células adyacentes (Kankanala et al., 2007; Wilson & Talbot, 2009).

Una vez invadida la nueva célula, la célula inicial pierde viabilidad y esto define a la

estrategia de M. oryzae como hemibiótrofa y secuencial, ya que en cada nueva célula

invadida se repite el proceso biotrófico (Kankanala et al., 2007). En las células inviables el

hongo pasa a un estado necrotrófico, causando muerte celular en los tejidos infectados

del huésped. El estado necrótrofo es cuando comienzan a notarse los síntomas típicos,

en forma de pequeñas lesiones necróticas romboidales. En estas lesiones ocurre la

esporulación en condiciones de alta humedad, que se traduce en un crecimiento

grisáceo del hongo, y las esporas son dispersadas generalmente por el agua de lluvia o

el viento en el campo de cultivo (Wilson & Talbot, 2009).

Al igual que todos los seres vivos, las plantas se encuentran expuestas al ataque

de organismos patógenos, como M. oryzae lo es para el arroz, ante los cuales deben

defenderse y adaptarse, para lo cual han desarrollado un complejo sistema para su

defensa.

2.2 Estrés abiótico

Se entiende como estrés abiótico a aquella alteración en el entorno que tiene un

efecto negativo sobre las plantas, que está causado por factores no vivos y que ocurren

naturalmente en un campo de cultivo (Pareek et al., 2010). Entre estos factores se

pueden considerar: intensidad de la luz solar, radiaciones, vientos fuertes, temperaturas

extremas, sequías, inundaciones, textura y cambios en el pH del suelo, baja

Introducción

- 14 -

disponibilidad o exceso de nutrientes y otros compuestos en el suelo. Estos factores

muchas veces son inevitables en un ambiente natural y tienen una incidencia muy fuerte

en el crecimiento de las plantas, las cuales por su naturaleza sésil son incapaces de evitar

los efectos de las fluctuaciones ambientales. Por consiguiente, las plantas dependen

principalmente de mecanismos internos para adaptarse y tolerar estos cambios (Slater et

al., 2008).

A menudo, muchos factores abióticos influyen simultáneamente sobre un cultivo

y pueden llegar a causar grandes pérdidas en las cosechas. El impacto del estrés

abiótico en la producción agrícola se puede cuantificar según el potencial productivo

que tiene un cultivo y la producción media a nivel mundial. Se estima que alrededor del

70% de las pérdidas en la producción agrícola en el mundo son causadas por estreses

abióticos (Bray et al., 2000). En la Tabla 1 se muestran las pérdidas ocasionadas debido a

las condiciones ambientales inadecuadas para los cereales más importantes en el

mundo, observándose que en el arroz existen pérdidas de más del 50%, lo que implica

que millones de personas en el mundo dejan de acceder a este alimento debido al

estrés abiótico en el campo. Entre los factores abióticos que más influyen en la

producción se encuentran la sequía y el estrés nutricional, que incluye la baja

disponibilidad de fosfatos en los suelos a nivel mundial, que son los que se estudiaron

en esta tesis.

Tabla 1. Efectos de las condiciones ambientales en la producción de cereales. Se indican los cereales más importantes (a) y el promedio de rendimiento a nivel mundial en el año 2013 (b) en comparación con el país que ha obtenido el mejor promedio de rendimiento en el mismo año (c) y el cálculo del porcentaje del promedio potencial perdido debido, principalmente, a su cultivo en condiciones ambientales inadecuadas (d). Fuente: FAOSTAT, 2015.

Cultivo aa Rendimiento mundial b Mejor rendimiento c Potencial perdido dMaíz 5.499,701 24.857,143 (San Vicente) 77,9%Arroz 4.485,875 10.217,665 (Australia) 56,1%Trigo 3.268,295 9.105,327 (Nueva Zelanda) 64,1%Cebada 2.929,079 8.325,180 (Bélgica) 64,8%Sorgo 1.475,243 84.375,000 (Emitatos Árabes) 98,3%Avena 2.441,844 7.228,464 (Irlanda) 66,2%

Introducción

- 15 -

2.2.1 Sequía

En el sentido estricto, el estado de estrés abiótico en una planta es relativo a su

fisiología, por lo que una condición de estrés para una especie podría ser óptima para

otra. Un ejemplo claro es el arroz, que es una planta semiacuática, cuyo cultivo se da

mejor en parcelas inundadas, condiciones que no son propicias para el crecimiento de

otras especies, sin embargo, esto también significa un problema para el arroz debido a

que exige grandes cantidades de agua para su cultivo. Un suministro adecuado de agua

es uno de los factores más importantes en la producción del arroz. Existen zonas de Asia

tropical en las que el arroz sufre tanto de deficiencia como de exceso de agua, debido a

las lluvias irregulares y las diferencias en la geografía del terreno (De Datta, 1981).

La diferencia entre la entrada y la salida del agua en la planta se conoce como el

balance hídrico. Cuando este balance es negativo debido a que la pérdida de agua por

transpiración supera a la absorción por las raíces, la planta ingresa en un estado de

déficit hídrico ocasionando marchitez de la planta, que puede ser temporal o

permanente. Para que el déficit hídrico no ocasione la muerte de la planta, la humedad

de los suelos no debe disminuir del punto de marchitez permanente (PMP). Cuando los

suelos se encuentran en capacidad hídrica de campo, las plantas crecen con turgencia y

mantienen un balance hídrico por encima del déficit, pero en el PMP las plantas ya no

extraen agua del suelo y no pueden recuperarse de la pérdida hídrica, provocando la

situación extrema de la muerte de la planta. Sin embargo, pequeños cambios en el

balance hídrico de la planta también pueden tener efectos severos como: deficiencias en

el desarrollo, cambios en la arquitectura radicular y serios defectos en la fertilidad,

influyendo directamente en la producción (De Datta, 1981; Pareek et al., 2010).

Particularmente, el arroz es especialmente susceptible a la falta de agua durante la etapa

reproductiva, retrasando la floración, reduciendo la fertilidad del polen y afectando al

llenado del grano, lo que conlleva consecuencias graves en la productividad del cultivo

(De Datta, 1981).

Introducción

- 16 -

2.2.2 Deficiencia de fosfatos

La deficiencia de este elemento es de las más limitantes en la producción de los

cultivos. Este mineral es asimilable por las plantas en forma de fosfato como radical libre

(PO4-3). Sin embargo, el problema de la acidificación de los suelos provoca que se

encuentre retenido en forma de sales insolubles de aluminio, hierro y calcio, no

asimilables por las plantas e incluso pudiendo ser tóxicas, por lo que la disponibilidad de

fósforo asimilable en los suelos es limitada (Pareek et al., 2010). Actualmente, existe una

gran preocupación por la pérdida de fertilidad de los suelos del mundo y la creciente

necesidad de fertilización para obtener una buena producción, implicando un mayor

costo para la agricultura. Además, la fuente de fósforo es finita y no renovable, siendo

cada vez más costosa su extracción (Cordell et al., 2009), por lo que la búsqueda de

variedades más productivas en suelos deficientes en fosfato o estrategias alternativas

que favorezcan la asimilación de fosfato por la planta, son cada vez más necesarias.

3. Adaptación de las plantas a condiciones ambientales adversas

Considerando la demanda actual y el incremento previsto de la población

mundial, será necesario aumentar la producción del cultivo del arroz para garantizar la

seguridad alimentaria. Tomando en cuenta la limitación de agua y de tierra cultivable, la

escasez de fertilizantes y la necesidad de evitar el uso de pesticidas y fungicidas tóxicos,

se hace necesario el desarrollo de estrategias de producción de mejor rendimiento en

condiciones adversas y menos agresivas con el medio ambiente. El estudio de los

procesos de adaptación de las plantas a su entorno, los mecanismos moleculares que

rigen estos procesos adaptativos y los componentes implicados, puede proporcionar un

conocimiento muy relevante en el diseño de nuevas estrategias para la mejora. En los

últimos años se han realizado avances significativos en el entendimiento de cómo las

plantas se defienden del ataque de patógenos y cómo se adaptan a condiciones de

Introducción

- 17 -

deficiencia de agua y de nutrientes. A continuación se hará un breve resumen del

conocimiento que se tiene al respecto.

3.1 El sistema de defensa de las plantas

Las plantas han desarrollado un sistema defensivo complejo y eficiente, a pesar

de enfrentarse a múltiples organismos potencialmente dañinos, son pocos los que

llegan a causar enfermedad en la naturaleza. Además de una defensa pasiva basada en

la existencia de barreras físicas (como la presencia de la cutícula) y químicas (como la

acumulación de compuestos tóxicos para los microorganismos), las plantas muestran

una defensa activa desencadenada ante la detección del patógeno. A diferencia de los

animales, las plantas no poseen un sistema inmunitario circulatorio si no que todas las

células tienen capacidad defensiva. La evolución de los mecanismos de defensa de la

planta es muy dinámico, ya que también los patógenos desarrollan nuevas estrategias

para sobrepasar las barreras y respuestas, estableciendo así una relación

planta/patógeno que está en constante adaptación. En la Figura 5 se muestra un

modelo adaptado de los modelos de Jones & Dangl (2006) y de Pritchard & Birch (2014)

de la interacción entre las estrategias de ataque del patógeno y los mecanismos

moleculares de la defensa activa desarrollados por la planta.

3.1.1 Reconocimiento del agente agresor

Esta defensa activa se diferencia en dos estrategias, según el reconocimiento y la

interacción de la planta con el patógeno: la defensa basal y la defensa específica. La

defensa basal está definida por Jones & Dangl (2006) como aquella respuesta molecular

que es activada por un patógeno virulento en huéspedes susceptibles y es también

conocida como resistencia general inducida o de no-huésped (non-host resistance). Esta

respuesta rápida y débil se activa y ocurre inicialmente a nivel de una única célula

cuando entra en contacto con el organismo y ciertas moléculas comunes presentes en

los organismos patógenos, denominadas PAMPs (Pathogen-associated molecular

Introducción

- 18 -

patterns) y también conocidos como elicitores, son reconocidas por los receptores PRRs

(Pattern recognition receptors), desencadenando la inmunidad denominada PTI (PAMP-

triggered immunity) (Nürnberger & Brunner, 2002). Los PRRs presentes en la pared

celular son proteínas muy sensibles y específicas, las cuales reconocen epítopos

conservados en los PAMPs a concentraciones subnanomolares, como es el caso de los

22 aminoácidos N-terminales de la flagelina (flg22), componentes estructurales de los

flagelos de las bacterias, que son reconocidos por la proteína FLS2 de Arabidopsis

(Boller & He, 2009; Chisholm et al., 2006; Gómez-Gómez & Boller, 2000). En hongos, el

PAMP más común es la quitina de la pared celular, que es reconocida por la proteína

CERK1 (Petutschnig et al., 2010). Los patrones reconocidos por los PRRs son dominios

muy conservados en los PAMPs y generalmente tienen funciones estructurales o

enzimáticas importantes para los microorganismos, por lo que los PRRs están

especializados en el reconocimiento de patrones que difícilmente presenten mutaciones

(Boller & He, 2009; Jones & Dangl, 2006). La detección de PAMPs comunes a una gran

cantidad de microorganismos brinda a la planta una respuesta general e inespecífica

frente a un amplio rango de patógenos. Además de los PAMPs, las plantas también son

capaces de reconocer compuestos derivados de la acción de los microorganismos sobre

la propia planta, o elicitores endógenos conocidos como DAMPs (Damage-associated

molecular patterns) o MIMPs (Microbe induced molecular patterns).

Mediante la respuesta de defensa basal o PTI, la planta es capaz de evitar la

progresión de los patógenos incompatibles con el huésped. Sin embargo, existen

patógenos capaces de sobrepasar la defensa basal de las plantas mediante la

producción y secreción de una colección de proteínas efectoras, estableciéndose una

relación compatible entre el patógeno y la planta (Chisholm et al., 2006). Esos efectores

producidos únicamente por patógenos específicos del huésped son los responsables de

la susceptibilidad de la planta denominada ETS (Effector-triggered susceptibility). Los

efectores secretados a la célula vegetal por el patógeno tienen como funciones:

Introducción

- 19 -

interferir con las respuestas de defensa mimetizando proteínas de la planta y promover

la pérdida de nutrientes en su favor, entre otras (Jones & Dangl, 2006).

Por su parte, y para protegerse de la acción de los efectores microbianos, las

plantas producen otro tipo de receptores, las proteínas de resistencia o proteínas R que

reconocen esos efectores y desencadenan una respuesta más fuerte, sostenida y

específica, denominada ETI (Effector-triggered immunity) conocida también como

resistencia específica o de huésped (host-resistance) (Boller & He, 2009; Chisholm et al.,

2006; Dangl & Jones, 2001). Los patógenos específicos son capaces de seguir

produciendo diferentes efectores que ayudan a sobrepasar los mecanismos del

huésped, ocasionando ETS y pudiendo activar nuevas respuestas ETI en la planta,

siguiendo así un modelo dinámico (Jones & Dangl, 2006; Pritchard & Birch, 2014). Las

proteínas R poseen dominios conservados del tipo LRR (repeticiones de leucinas), que

reconocen directa o indirectamente los efectores del patógeno y los inactivan (Boller &

He, 2009; Chisholm et al., 2006; Dangl & Jones, 2001). El reconocimiento del patógeno

durante la ETI va acompañado habitualmente de la respuesta hipersensible (HR) que se

caracteriza por la muerte celular programada en el sitio de infección, con el objetivo de

Figura 5. Respuestas del sistema inmune de las plantas. Representación gráfica del funcionamiento del sistema inmune de las plantas adaptado según el modelo de zig-zag descrito por Jones y Dangl (2006) y el modelo dinámico descrito por Pritchard y Birch (2014).

PTI ETS ETI ETS ETI

Umbral de HR

Umbral de Resistencia

Ampl

itud

de la

def

ensa

Alta

BajaPAMPs

PRRs

Calosa

Efectores delpatógeno Proteínas R

Efectores delpatógeno

Proteínas R

Pared celular

Introducción

- 20 -

evitar su progreso a otras partes de la planta y limitar el crecimiento del patógeno

(Jones & Dangl, 2006).

3.1.2 Procesos asociados a la respuesta de defensa

El reconocimiento del ataque del patógeno inicia una serie de reacciones que

desencadenan la respuesta de defensa en la planta. Entre las primeras reacciones

defensivas se incluyen el flujo de iones, la acumulación de especies reactivas de oxígeno

(ROS) y óxido nítrico (NO). Estas primeras reacciones van seguidas de la señalización y

amplificación de la respuestas mediada por la producción de hormonas y procesos de

fosforilación de proteínas, que llevan a la respuestas más tardías que incluyen la

fortificación de la pared celular con la producción de calosa, la reprogramación

transcripcional para la expresión de los genes de defensa, la producción de compuestos

antimicrobianos (como fitoalexinas) y las producción de proteínas relacionadas con

patogénesis (PRs). Estos procesos forman parte de una compleja red de respuestas de la

planta frente a la infección que se detalla en la Figura 6 y se explican en los siguientes

apartados.

3.1.2.1 Flujo de calcio a través de la membrana plasmática

Pequeños aumentos en la concentración de calcio citosólico ocurren en

respuesta a diferentes estímulos, como frente al reconocimiento de PAMPs, debido a la

entrada de calcio tanto desde las paredes celulares como desde los organelos,

activando la señalización mediada por calcio (Reddy et al., 2011; Steinhorst & Kudla,

2013). Los iones de calcio (Ca+2) son segundos mensajeros universales y los más

versátiles en la transducción de señales percibidas en las células eucariotas,

especialmente en respuesta a factores bióticos (Batistič & Kudla, 2012; Reddy et al., 2011;

Schulz et al., 2013). Los cambios en la concentración de Ca+2 son muy dinámicos y

dependiendo del estímulo pueden ser más o menos intensas, duraderas y fluctuantes

(McAinsh & Pittman, 2009). Las concentraciones normales de Ca+2 citosólico se

Introducción

- 21 -

encuentran en el orden de los nanomoles, siendo tóxicos niveles excesivamente altos,

mientras que en la pared celular y en los organelos se encuentra en el orden de los

milimoles. Este equilibrio en su homeostasis se mantiene a través de ciertos canales

transportadores de Ca+2, que en las plantas son inespecíficos, ya que también permite el

flujo de otros cationes (Batistič & Kudla, 2012; McAinsh & Pittman, 2009; Reddy et al.,

2011; Steinhorst & Kudla, 2013).

La respuesta a cambios en la concentración de Ca+2 citosólico está mediada y

decodificada por diferentes tipos de proteínas sensoras y transductoras de la señal,

entre las que se encuentran las proteínas con dominios de unión a Ca+2 (EF hand

proteins), como: la familia de proteínas calmodulinas (CaM y CML), el complejo de

proteínas calcineurinas-B/interactoras de CBL (CBL/CIPK) y las proteínas quinasas

PAMPs Patógeno

Efectores

Ca+2

CPKs MAPKKK

MAPKK

MAPK

RLKs

CaMsCIPKs

NNúcleo

Citoplasma

ApoplastoROS

Pared celular

HR

NADPH-oxRBOHs

SODs, APXsPOXs, CATs

WRKYs yotros FTs

PRs

Proteínas R SAJAET

otras

mRNAs

miRNAs

siRNAs

RNAsDNAs

exógenos

PRRs

Figura 6. Procesos implicados en la respuesta de defensa. Representación gráfica de los componentes moleculares implicados en las respuestas de defensa de las plantas frente a patógenos.

Introducción

- 22 -

dependientes de calcio (CPK) (Batistič & Kudla, 2012; Reddy et al., 2011; Steinhorst &

Kudla, 2013). El grupo de proteínas CPKs se describe con más detalle en un apartado

específico, por su relevancia en este trabajo de tesis.

3.1.2.2 Producción de especies reactivas de oxígeno

El reconocimiento del patógeno inicia la rápida producción de especies reactivas

de oxígeno o ROS (Reactive oxygen species) en forma bifásica: la primera inespecífica y

transitoria, que ocurre a los pocos minutos de la interacción en la respuesta PTI; la

segunda fase corresponde a una producción sostenida de ROS que desencadena la

respuesta ETI en la interacción con patógenos compatibles, generalmente finalizando

con una muerte celular programada por HR (Torres, 2010). Estas moléculas se producen

principalmente en el apoplasto, pero también en varios compartimentos subcelulares,

poco después del reconocimiento del patógeno siendo una de las respuestas más

tempranas en el intento de prevenir la penetración y restringir el crecimiento (Mellersh

et al., 2002; Torres, 2010; Vargas et al., 2012; Wojtaszek, 1997; Zurbriggen et al., 2010).

Las ROS son moléculas inestables y tóxicas entre las que se encuentran: el

peróxido de hidrógeno (H2O2), los iones superóxido (O2-), los iones peróxido (O2-2) y los

radicales hidroxilo (OH-) (Perez & Brown, 2014; Torres, 2010). La producción de ROS se

da principalmente por el sistema de las NADPH-oxidasas y los RBOHs (Respiratory burst

oxidase homologues) ubicados en la membrana plasmática, que catalizan la producción

de superóxido, utilizado para la formación de otras ROS (Apel & Hirt, 2004; Perez &

Brown, 2014; Torres, 2010).

Existe un conflicto entre la necesidad de producción de ROS tanto para hacer

frente al patógeno como para la señalización de las respuestas, y la toxicidad que tienen

estas moléculas para la propia planta. Estas moléculas causan daño celular por su acción

en la oxidación de lípidos y proteínas, y en la degradación de ácidos nucleicos (Apel &

Hirt, 2004; Perez & Brown, 2014). El mantenimiento del equilibrio en la homeostasis de

Introducción

- 23 -

ROS en las células está muy controlado a través de la regulación de su producción y de

mecanismos detoxificadores enzimáticos y no enzimáticos. La producción de

compuestos antioxidantes como: antocianinas, ascorbatos, carotenoides, tocoferoles,

flavonoides y glutatión, forman parte de las estrategias no enzimáticas basadas en el

secuestro de las ROS para evitar el daño en las células vegetales. Los mecanismos

detoxificadores enzimáticos se basan en la inducción de genes codificantes para

enzimas catalíticas de ROS como las superóxido dismutasas (SOD), peroxidasas (APX,

POX, GPX), catalasas (CAT) y glutatión-S-transferasas (GST) (Apel & Hirt, 2004; Perez &

Brown, 2014). Las reacciones de detoxificación de O2- por las SODs generan una gran

cantidad de H2O2 en la célula, que es capaz de reaccionar con metales, generando altas

cantidades de radicales OH-. Las catalasas y peroxidasas son capaces de detoxificar esas

cantidades excesivas de peróxido de hidrógeno, estableciéndose así reacciones en

cadena para completar la detoxificación efectiva de las ROS en las células (Apel & Hirt,

2004; Perez & Brown, 2014).

Además de cumplir funciones directas frente al patógeno, a concentraciones

bajas dentro de la célula, las ROS actúan como moléculas señalizadoras de la respuesta

de defensa pudiendo: modificar algunas proteínas sensibles al equilibrio redox como las

fosfatasas, participar en la transducción de señales mediante la detección de cambios en

la concentración de ROS por proteínas MAPK, activar factores de transcripción y, por lo

tanto, también regular la expresión de genes de defensa (Apel & Hirt, 2004; Baxter et al.,

2014; Steinhorst & Kudla, 2013). Así, las moléculas ROS suponen un componente con un

papel dual de protección directa y señalización en las respuestas de defensa.

3.1.2.3 Fosforilación reversible de proteínas

La cascada de señalización de la respuesta de defensa mediada por fosforilación

reversible de proteínas mediada por proteínas quinasas se inicia generalmente con el

reconocimiento de los PAMPs por los PRR en la membrana plasmática en la respuesta

PTI. Este proceso molecular es una de las respuestas más rápidas en la señalización de la

Introducción

- 24 -

defensa de la planta y es uno de los más utilizados en la señalización celular. El estado

de fosforilación de una proteína puede alterar su actividad, su localización subcelular, su

interacción con sus sustratos y su estabilidad.

La mayoría de los PRR son proteínas con dominios extracelulares LRR que

pueden bien tener además un dominio intracelular quinasa, y son llamadas proteínas

quinasas receptoras (RPK o RLK), o bien estar asociadas a proteínas quinasas activadas

por mitógenos (MAPK) (Boller & He, 2009; Tena et al., 2011). Esta respuesta puede ser

seguida por una serie de fosforilaciones de proteínas MAPK que forman una cascada

muy importante en la transducción de las señales en la defensa de la planta (Boller &

He, 2009; Gao et al., 2008). Así también otras vías en la transducción de señales de

defensa por fosforilación incluyen a las quinasas del tipo SNF1 (SnRK), las relacionadas

con brasinosteroides (BIK, BRI, BAK) y las particularmente interesantes proteínas

dependientes de Ca+2 (CPKs, CIPKs, CaMs), las cuales forman una red de transducción

de señales híbrida entre la detección del calcio intracelular y la fosforilación de proteínas

(Boller & He, 2009; Chinchilla et al., 2007; Tena et al., 2011; Xue-Fei et al., 2012). Estas vías

de señalización por fosforilación de proteínas lleva finalmente a la expresión diferencial

de genes, por lo que son especialmente importantes en la respuesta de defensa (Boller

& He, 2009; Gao et al., 2008; Romeis et al., 2001; Tena et al., 2011).

3.1.2.4 Regulación transcripcional

La activación de la respuesta de defensa resulta en la acumulación diferencial de

ciertos factores de transcripción (FT) cuya función es la reprogramación transcripcional

para favorecer la expresión de genes relacionados con las respuestas de defensa. Los FT

son las proteínas encargadas de la regulación de la expresión de genes, ya sea

activando o reprimiendo la transcripción, mediante mecanismos de reconocimiento de

secuencias promotoras específicas, en este caso relacionadas con la defensa de la planta

frente a patógenos. Los más estudiados e importantes en las respuestas de defensa son

Introducción

- 25 -

principalmente los del tipo WRKY, pero también lo son algunos del tipo AP2/ERF, bZIP

MYB, y bHLH.

La familia de FT del tipo WRKY es una de las más grandes en plantas y forman

parte de una red importante de señalización que modulan diversos procesos, entre los

que se encuentran las respuestas de defensa (Rushton et al., 2010; Singh et al., 2002).

Estos FT son del tipo dedo de zinc (zinc-finger) y reconocen los sitios del tipo cajas W

(C/TTGACC/T, W-box) en las secuencias promotoras de numerosos genes relacionados

con defensa, teniendo un papel pivotante en la regulación de la defensa (Eulgem &

Somssich, 2007; Singh et al., 2002). La expresión de varios genes WRKY está regulada

durante la respuesta de defensa (Lai et al., 2008; Shimono et al., 2007). Muchos FT del

tipo WRKY forman parte de la cascada de señalización de la defensa mediada por las

MAPK (Singh et al., 2002).

Los FT del tipo AP2/ERF, entre los que se encuentra OsEREBP, que son de

respuesta a etileno, también fueron ampliamente estudiados por su implicancia en la

defensa (Girardi et al., 2013; Oñate-Sánchez et al., 2007; Pré et al., 2008; Singh et al.,

2002). Los del tipo bZIP que incluyen los TGA/OBF, responsables de la expresión de

ciertos genes relacionados con defensa como los PR-1 y GST (Chen & Singh, 1999; Lebel

et al., 1998; Singh et al., 2002). Los FT a menudo interactúan con algunos cofactores,

como es el caso del cofactor OsNH1, homólogo del NPR1 (Non-expressor of PR1) de

Arabidopsis, que actúa en conjunto con FTs del tipo TGA, siendo mediadores de la

expresión de los genes de defensa relacionados con la señalización por ácido salicílico

(Dong, 2004). Algunos FT del tipo MYB fueron asociados a la regulación de la expresión

de genes implicados en la defensa (Wang & Irving, 2011; Zhang et al., 2012), y para los

bHLH se sabe que algunos participan en la respuesta de la planta en interacciones con

micorrizas y que el microRNA miR393, que se induce en respuesta a flagelina, tiene

como diana a un miembro bHLH (Campos-Soriano et al., 2012; Mendoza-Soto et al.,

2012; Ruiz-Ferrer & Voinnet, 2009). La regulación de genes de defensa mediada por FT

Introducción

- 26 -

es clave en la respuesta de defensa de las plantas, luego de la cual ocurre otro nivel en

la regulación de genes que se da post-transcripcionalmente.

3.1.2.5 Regulación post-transcripcional

La regulación de la expresión génica a nivel post-transcripcional por

silenciamiento de RNAs está mediada por pequeños RNAs (sRNAs) y proporciona un

control fino de la expresión de genes relacionados con la respuesta inmune de la planta.

Este es un mecanismo presente en eucariotas, capaz de interferir en la acumulación de

proteínas implicadas en los diversos procesos fisiológicos de la planta como el

desarrollo, metabolismo y respuestas de defensa. Los componentes implicados en este

sistema de regulación génica son los sRNAs, que incluyen dos clases: los pequeños

RNAs de interferencia (siRNAs) y los microRNAs (miRNAs). Estos pequeños RNAs tienen

19-25 nt de longitud y son complementarios a secuencias de sus tránscritos dianas. Los

sRNAs son dirigidos a sus dianas complementarias mediante una compleja maquinaria

de enzimas que en plantas guían principalmente el corte del tránscrito y en algunos

casos su inhibición traduccional (Voinnet, 2009).

El silenciamiento génico de virus mediado por siRNAs fue inicialmente el

paradigma de las interacciones entre patógenos y la regulación post-transcripcional. Sin

embargo, siguen aumentando las evidencias de que los sRNAs tienen un papel

importante en la regulación post-transcripcional no sólo de RNAs externos sino también

de la misma planta. En este contexto, los miRNAs son los reguladores post-

transcripcionales principales de los genes implicados en defensa frente a patógenos, y

se tratan con detalle en un apartado especial, por su importancia en esta tesis. Sin

embargo, también existen evidencias del papel de los siRNAs en la respuesta de defensa

no sólo frente a virus sino también en interacciones con bacterias y hongos (Baldrich et

al., 2014; Katiyar-Agarwal et al., 2006; Voinnet, 2008). Los siRNAs también actúan en el

silenciamiento de T-DNAs transferidos a la planta en infecciones con Agrobacterium

Introducción

- 27 -

tumefasciens (Dunoyer et al., 2006). La regulación post-transcripcional es una vía

fundamental para la acumulación diferencial de proteínas relacionadas con la defensa

de la planta en condiciones de infección.

3.1.2.6 Acumulación de proteínas relacionadas con patogénesis

Las proteínas relacionadas con patogénesis o PRs (Pathogenesis-related proteins)

son aquellas cuya acumulación se ve incrementada en respuesta a la infección por

patógenos y que han sido implicadas en la defensa activa de la planta pudiendo tener

funciones en la restricción del desarrollo del patógeno y de su crecimiento en los tejidos

de la planta (Datta & Muthukrishnan, 1999; van Loon et al., 2006). Se han descrito 17

grupos de proteínas PR en plantas, diferenciadas según su actividad biológica, las cuales

se listan en la Tabla 2.

En arroz se han identificado los grupos de proteínas PR-1, PR-2, PR-3, PR-4, PR-

5, PR-6, PR-8, PR-10, PR-15 y PR16, y algunos de los genes de estos grupos son

utilizados como marcadores de la respuesta de defensa de la planta, como: OsPR1a y

OsPR1b (PR-1); OsPR5 (PR-5); OsPBZ1 y JIOsPR10 (PR-10) (Campos-Soriano et al., 2012;

Datta et al., 1999; Gómez-Ariza et al., 2007; Hou et al., 2012; Jwa et al., 2001; Mitsuhara et

al., 2008; Quilis et al., 2008; Zhu et al., 2006). También se pueden citar a las peroxidasas

como OsPOX22.3 (PR-9) y las proteínas de transferencia de lípidos o LTPs (PR-14). Varias

de las PRs están reguladas por las vías de señalización mediada por hormonas, como

por ácido salicílico (SA), como el caso de los grupos PR-1, PR-2 y PR-5, y por ácido

jasmónico (JA) y etileno (ET) como los grupos PR-3, PR-4, PR-12 y PR-13, aunque la

regulación de la expresión de estos genes puede ser mucho más compleja (van Loon et

al., 2006).

Introducción

- 28 -

3.1.3 Hormonas reguladoras de las respuestas de defensa

Las fitohormonas tienen un papel fundamental en la señalización de la respuesta

de defensa, siendo las más importantes y sobre las que se han realizado más estudios: el

ácido salicílico (SA), el ácido jasmónico y jasmonatos (JA), y etileno (ET). Otras hormonas

como el ácido abscísico (ABA), ácido giberélico (GA), brasinosteroides (BR) y auxinas

también han sido relacionadas con ciertas respuestas de defensa (Bari & Jones, 2009).

3.1.3.1 Ácido salicílico

El ácido salicílico (SA) es una hormona de naturaleza fenólica que es crítica para

la señalización de la respuesta inmune de la planta generalmente frente a patógenos

biótrofos y hemibiótrofos, así como en el establecimiento y la señalización de la

resistencia sistémica adquirida (SAR), una condición de la planta que otorga resistencia

sistémica frente a la infección después de haberse producido la activación del sistema

de defensa por el ataque de patógenos en algún tejido de la planta (De Vleesschauwer

Tabla 2. Clasificación de las proteínas PR. Familias de proteínas PR (a) según la clasificación de Van Loon et al. (2006) mostrando el ejemplo de una proteína típica de la familia y la especie vegetal en la que se encuentra (b) y sus funciones descritas (c).

Familia a Miembro típico b Propiedades y funciones cPR-1 PR1a – N. tabacum DesconocidasPR-2 PR2 – N. tabacum β-1,3-glucanasasPR-3 P,Q – N. tabacum Quitinasas del tipo I, II, IV, V, VI, VIIPR-4 R – N. tabacum Quitinasas del tipo I, IIPR-5 S – N. tabacum Tipo taumatinasPR-6 Inhibidor I - Solanum lycopersicum Inhibidor de proteasasPR-7 P69 – S. lycopersicum EndoproteasasPR-8 Quitinasa - Cucumis sativus Quitinasas tipo IIIPR-9 Peroxidasa formadora de lignina – N. tabacum PeroxidasasPR-10 PR1 - Petroselinum crispum Tipo ribonucleasasPR-11 Quitinasa clase V – N. tabacum Quitinasas tipo IPR-12 Rs-AFP3 - Raphanus sativus DefensinasPR-13 THI2.1 – A. thaliana TioninasPR-14 LTP4 – H. vulgare Proteínas de transferencia de lípidosPR-15 OxOa – H. vulgare Oxalato-oxidasasPR-16 OxOLP – H. vulgare Tipo oxalato-oxidasasPR-17 PRp27 – N. tabacum Desconocidas

Introducción

- 29 -

et al., 2013; Wang & Irving, 2011). En los tejidos de arroz, el SA se encuentra

principalmente en forma de ácido libre y en condiciones normales tiene un contenido

alto llegando a concentraciones de 8-37 μg/g de peso fresco, cuando otras especies

vegetales tienen unos 50 ng/g. La alta concentración basal de SA en arroz podría actuar

como antioxidante, previniendo que las células sufran daño oxidativo en un eventual

ataque de patógenos (De Vleesschauwer et al., 2013).

El SA está implicado en la señalización de la producción de ROS y por lo tanto

en la homeostasis redox, además de inducir la producción de catalasas, peroxidasas e

hidrolasas (De Vleesschauwer et al., 2013; Wang & Irving, 2011). La señalización mediada

por SA lleva a la muerte celular programada por HR, evitando que la infección por

biótrofos pueda progresar (Yang et al., 2013). Esta señalización además se ha visto

implicada en la acumulación de la proteína OsNH1 (AtNPR1), el cofactor de FTs del tipo

TGA que median la expresión de varios genes de defensa, específicamente PRs que

pueden otorgar resistencia a patógenos biótrofos bacterianos y fúngicos. Otra vía de

señalización mediada por SA es la del FT WRKY45, que también regula la expresión de

varios genes relacionados con defensa, incluidas varias PRs (Bari & Jones, 2009; De

Vleesschauwer et al., 2013; Yang et al., 2013).

3.1.3.2 Ácido jasmónico y jasmonatos

El ácido jasmónico y los jasmonatos (JA), principalmente metil-jasmonato, son

moléculas derivadas de lípidos, sintetizados a partir del ácido linolénico, que actúan

como reguladores cruciales en la defensa de las plantas, siendo predominantemente

efectivos contra insectos y patógenos necrótrofos (De Vleesschauwer et al., 2013; Wang

& Irving, 2011; Yang et al., 2013). Muchos estudios muestran que los niveles de JA

aumentan localmente en el sitio de la infección, y que aplicaciones exógenas de JA

inducen la expresión de genes de defensa (Bari & Jones, 2009). A pesar de que se ha

reportado que existe un posible antagonismo entre las vías de señalización mediada por

SA y por JA, en arroz se ha visto que el JA es también un activador de la resistencia a

Introducción

- 30 -

patógenos biótrofos y hemibiótrofos como M. oryzae y X. oryzae (De Vleesschauwer et

al., 2013).

La vía de señalización mediada por JA está integrada por tres proteínas

componentes principales, que contienen los dominios del tipo JA-ZIM de unión a JA,

que son: COI1, una ubiquitina-ligasa requerida para la degradación de proteínas; JAR1,

una aminoácido-sintetasa responsable de la conjugación del JA con isoleucina, la cual

actúa como molécula señalizadora de la respuesta; y JIN1/MYC2, un FT implicado en la

regulación de la expresión de varios genes de defensa (Bari & Jones, 2009; De

Vleesschauwer et al., 2013; Wang & Irving, 2011; Yang et al., 2013).

3.1.3.3 Etileno

El etileno (ET) es una fitohormona gaseosa conocida hace muchos años por su

participación en la maduración frutal, pero que también se ha visto su implicancia en las

vías de señalización de las respuestas de defensa, principalmente actuando como

sinérgico en la vía del JA contra patógenos necrótrofos (De Vleesschauwer et al., 2013;

Yang et al., 2013).

En arroz se ha documentado que el ET exógeno puede proveer protección

frente a M. oryzae y R. solani y que esta hormona se produce en las etapas tempranas

de la infección por estos hongos, coincidiendo con una muerte celular programada por

HR y una inducción de genes de defensa (Yang et al., 2013). Se ha visto también que el

ET es un regulador negativo de la resistencia frente a X. oryzae. Los datos y estudios

realizados sobre el papel que juega el ET en la respuesta de defensa de arroz, lo ubican

como un regulador de esas respuestas, aunque sus funciones en cada interacción

dependen del estilo de vida del patógeno y la biología de la infección (De

Vleesschauwer et al., 2013).

Introducción

- 31 -

3.1.3.4 Otras hormonas reguladoras

Comparados con el SA, JA y ET, el papel que juegan otras hormonas en la

inmunidad innata de las plantas de arroz está mucho menos estudiado. En el caso del

ABA, se han reportado casos de que puede actuar tanto como regulador positivo como

negativo de la resistencia a enfermedades, aunque predominan los casos en los que el

ABA regula negativamente la respuesta de defensa, incluso suprimiendo la defensa

basal frente a X oryzae y M. oryzae. El ABA probablemente cumple roles que dependen

según la interacción, tal como se ha observado para el ET (De Vleesschauwer et al.,

2013). El GA se ha relacionado como un regulador de la degradación de proteínas

DELLA, las cuales se ha visto que incrementan la resistencia a patógenos necrótrofos y

susceptibilidad a biótrofos, aparentemente modulando el balance SA:JA en favor del JA,

por lo que el GA es un antagonista de la señalización del JA (De Vleesschauwer et al.,

2013; Yang et al., 2013). Así también se han relacionado a las auxinas con la regulación

negativa de la respuesta de defensa. Muchos patógenos producen auxinas durante la

infección, estimulando la susceptibilidad de la planta (Yang et al., 2013). Además, el SA

se ha implicado en la represión de la señalización por auxinas. Los BRs son hormonas

que se han visto implicadas en la respuesta de defensa, ya que los receptores de BRs

ubicados en la membrana plasmática de la célula median la respuesta de defensa e

interaccionan con algunos PRRs, como el FLS2, para activar el PTI. El receptor de BRs,

OsBAK1, es también un receptor de PAMPs y media la respuesta de defensa frente a M.

oryzae (Yang et al., 2013). La regulación de la respuesta de defensa mediada por

hormonas juega un papel importante y la intercomunicación entre ellas es una compleja

red de vías de señalización que debe ser controlada por la planta en condiciones de

infección.

3.2 Respuestas de las plantas frente al estrés hídrico

Cuando la humedad de los suelos se mantiene baja durante cierto tiempo, la

extracción de agua por las raíces y el transporte de agua a través de la planta se

Introducción

- 32 -

reducen, produciéndose una situación de déficit hídrico. El parámetro utilizado para

determinar el estado hídrico de las células y tejidos de la planta es el contenido relativo

de agua o potencial hídrico (Ψ). El potencial hídrico tiene un concepto similar al de las

corrientes eléctricas, en la cual la corriente fluye desde los compartimientos con

potencial alto hacia los de bajo potencial. Así, el agua fluye a través de la planta desde el

suelo, que tiene alto potencial hídrico, hacia la atmósfera, con bajo potencial hídrico. Así,

cuando el potencial hídrico del suelo va disminuyendo debido a la sequía, se crea un

déficit en el flujo de agua desde las raíces hacia las hojas. Los factores determinantes en

la pérdida de potencial hídrico son: la concentración de solutos (potencial osmótico) y la

presión física entre los límites de las células (turgencia). La pérdida de potencial hídrico

puede generar además una concentración de iones tóxicos como el Na+ y el Cl- en la

célula (Pareek et al., 2010; Slater et al., 2008).

Esta condición requiere una respuesta de la planta, que incrementa la eficiencia

en la extracción de agua por las raíces y simultáneamente reduce la transpiración para

disminuir el potencial hídrico de las hojas y mantener el gradiente que posibilite el flujo

de agua. La transpiración en las plantas ocurre a través de los estomas y es necesaria

para disipar la energía recibida en forma de radiación solar y temperatura del ambiente.

En condiciones de disminución de potencial hídrico en las hojas, se pierde la turgencia

entre las células (marchitez), produciéndose el cierre estomático para reducir la

transpiración. El cierre estomático provoca una reducción en la conductancia de los

estomas, causando un aumento de la temperatura de la planta y una reducción de la

asimilación fotosintética y del crecimiento. Las plantas pueden mantener la turgencia de

las células reduciendo el potencial osmótico en un proceso llamado ajuste osmótico,

mediante la producción de solutos compatibles llamados “osmolitos” u

“osmoprotectores” como manitol, prolina, glicin-betaina, entre otros (Slater et al., 2008).

Además frente al estrés hídrico se producen proteínas del tipo LEA (Late embryogenesis

Introducción

- 33 -

abundant), las cuales actúan protegiendo a las células del daño por estrés abiótico

(Wang et al., 2014).

3.2.1 La señalización de las respuestas frente al estrés hídrico

En las plantas, la ruta de señalización en la adaptación frente a la sequía (Figura

7) comienza generalmente con cambios en la concentración de Ca+2 intracelular debido

al estrés, y con la detección del estrés osmótico causado por la pérdida de potencial

hídrico en la célula. La vía de señalización mediada por cambios de Ca+2 se inicia

mediante la activación de proteínas del tipo CaMs, CIPKs y CPKs, las cuales detectan

esos cambios y transducen esas señales fosforilando y activando proteínas MAPKs,

siendo específicamente en arroz la vía del OsMPK1 y OsMEK2 (Shanker et al., 2014).

Por otra parte, frente al estrés osmótico es activada la vía de señalización

mediada por hormonas, en la cual el ABA es considerada la hormona más importante,

teniendo un papel determinante en el cierre de estomas para evitar la deshidratación. El

ABA se comienza a acumular en respuesta al bajo potencial hídrico de las células. La

señalización mediada por ABA se inicia con la detección de los cambios de

concentración de esta hormona mediante receptores del tipo PYR, PYL y RCAR, que se

unen formando un complejo de inactivación de fosfatasas PP2C. Estas fosfatasas son

reguladores negativos de la respuesta a estrés hídrico y están encargadas de inactivar

proteínas de regulación de apertura de estomas como el canal de aniones SLAC1 y la

quinasa OST1, además de inactivar también a proteínas quinasas del tipo SnRK2 (Pizzio

et al., 2013; Shanker et al., 2014). Estas quinasas, junto con las MAPKs componentes de la

vía de señalización mediada por Ca+2, son responsables de la acumulación de proteínas

protectoras del tipo LEA y osmolitos, además de la expresión de genes relacionados con

sequía ABRE (ABA-responsive elements), como los factores de transcripción del tipo NAC

bZIP AP2/ERF, que son reguladores de la expresión de genes del tipo DREBs

(Dehydration-responsive binding element) (Shanker et al., 2014; Wang et al., 2014; Ye et

al., 2012; Zhang et al., 2014a).

Introducción

- 34 -

Como se ha mencionado anteriormente, las moléculas ROS forman parte

importante en la señalización por estrés biótico, pero también son producidas durante el

estrés hídrico a través de la vía del NADPH-oxidasa y las RBOHs. Una producción

excesiva de ROS en condiciones de sequía causa la peroxidación de lípidos de la

membrana provocando su disrupción por daño oxidativo, aunque se ha visto que en

respuesta a estrés hídrico, pequeños cambios en el contenido de ROS podrían cumplir

funciones señalizadoras del estrés, desencadenando las respuestas adaptativas. Durante

la respuesta frente al estrés hídrico las plantas también producen detoxificadores de

ROS como SODs, CATs, POXs, APXs y GSTs para protegerse del daño oxidativo en la

membrana celular (Cruz de Carvalho, 2008; Shanker et al., 2014).

Osmolitos

Ca+2

CPKs

MAPKs

CaMsCIPKs

Núcleo

ROS

NADPH-oxRBOHs

SODs, APXsPOXs, CATs

ABREsDREBs

ABALEAs

Canales de iones

ESTRÉS HÍDRICO

DISMINUCIÓN DELPOTENCIAL HÍDRICO

PYRPYL PP2C

Activación de SnRK2

ESTRÉS OSMÓTICO

Peroxidación de lípidosDisrupción de la membrana

RCAR

Figura 7. Señalización mediada por ABA en la respuesta frente a estrés hídrico. Representación gráfica de las respuestas en la señalización mediada por ABA frente a déficit hídrico, adaptado según el modelo de Shanker et al. (2014).

Introducción

- 35 -

3.3 Respuestas de las plantas frente a la deficiencia de fósforo

El fósforo está implicado en el suministro y transferencia de energía para todos

los procesos bioquímicos de la planta; es parte integral de ácidos nucleicos y

fosfolípidos; y puede unirse a proteínas modificando su función y activación (De Datta,

1981; Pareek et al., 2010). Su deficiencia en las plantas genera síntomas visiblemente

graves como: cambios morfológicos en la arquitectura radicular, floración y madurez

retardada, limitado número de macollos, bajo crecimiento, hojas estrechas y cortas,

necrosis y muerte de las hojas viejas, coloración rojiza o violácea en las hojas por

producción de antocianinas, entre los principales (De Datta, 1981).

Las plantas responden ante el bajo contenido de fosfatos en el medio y para

hacer frente al déficit nutricional ocurren, principalmente en las raíces, alteraciones

moleculares, fisiológicas y en el desarrollo. El crecimiento y la división celular se

detienen, los procesos metabólicos disminuyen y se inducen los mecanismos de

detoxificación de ROS, debido a la disminución de fuentes de energía para la fijación de

CO2 y la alta producción de electrones libres que pueden interaccionar con el oxígeno y

formar moléculas ROS (Hernandez & Munne-Bosch, 2015; Pareek et al., 2010). Se

producen cambios en la expresión de ciertos genes codificantes para proteínas que

cumplen funciones en la detección, absorción, movilización y translocación del nutriente.

Para facilitar la movilización y reutilización del fosfato retenido en fuentes orgánicas y

para mantener la homeostasis se induce la producción de fosfatasas y transportadores

de fosfatos de alta afinidad (Pareek et al., 2010). Mantener un control fino de la

homeostasis de fosfatos es indispensable para que la planta pueda sobrellevar los

efectos de la deficiencia, aunque también es posible que la planta sufra de los excesos

de este nutriente en sus tejidos, situación que tuvo una gran importancia en este trabajo

de tesis, aunque a nivel de campo es menos frecuente (De Datta, 1981; Jones, 1998).

Introducción

- 36 -

3.3.1 La señalización en la homeostasis de fosfatos

La señalización de las respuestas de las plantas de arroz frente a la deficiencia de

fosfatos y la regulación de su homeostasis se detalla en la Figura 8. Los reguladores

principales de estas respuestas son los factores de transcripción tipo MYB: OsPHR1 y

especialmente OsPHR2, ambos homólogos de AtPHR1 de Arabidopsis, los cuales

controlan y regulan la expresión de los genes PSI (Pi-starvation inducible) que contienen

motivos PBS1 en su secuencia promotora (PHR-binding sequence).

Son varios los genes regulados ya sea directa o indirectamente por OsPHR2,

incluyendo: OsIPS1/2 (Inducible in phosphate starvation); los miRNAs osa-MIR399 y osa-

MIR827; varios genes OsSPXs; transportadores de fosfatos OsPTs; fosfatasas OsPAPs y

otros recicladores de fosfatos como OsSQD2 (Wu et al., 2013). El factor de transcripción

OsPHR2 regula negativamente la expresión de la ubiquitina-ligasa OsPHO2 a través de

la activación de osa-MIR399, que tiene como diana al tránscrito OsPHO2. Esta

ubiquitina-ligasa regula la acumulación del transportador de fosfatos de baja afinidad

OsPT2 y el transportador inespecífico OsPHO1, los cuales se han visto implicados en la

translocación de fosfatos a la parte aérea. El transportador OsPT6 de alta afinidad se ha

relacionado principalmente con la absorción de fosfatos. Además de esta vía indirecta

en la activación del transportador OsPT2, su expresión también está regulada

directamente por los motivos PBS1 presentes en su promotor. Los OsSPXs son

reguladores negativos de la expresión de genes PSI a través de la supresión de OsPHR2,

y junto a su regulador negativo osa-MIR827, son claves en la autorregulación de la

cascada de señalización (Hu & Chu, 2011; López-Arredondo et al., 2014; Wu et al., 2013).

Se desconocen aún los mecanismos de detección que regulan las respuestas de

las plantas frente a la deficiencia de fosfatos. Tampoco se han descrito los elementos de

señalización implicados en la transducción de señales, como el papel del Ca+2 y las

Introducción

- 37 -

proteínas quinasas que pudieran estar implicadas frente a la deficiencia de este

nutriente.

4. Proteínas quinasas dependientes de calcio

Las CPKs constituyen componentes esenciales en múltiples procesos de

señalización en plantas, no solo como mediadores de la respuesta a condiciones

ambientales adversas, sino también en los procesos del desarrollo y reproducción. Esto

es porque estas proteínas tiene la particularidad de combinar en una única cadena

polipeptídica un dominio de detección de Ca+2 y un dominio quinasa, lo que les confiere

la capacidad de detectar cambios en los niveles de Ca+2 y transducir rápidamente esas

señales en forma de fosforilación de proteínas. Teniendo en cuenta que tanto el Ca+2

como la fosforilación de proteínas son mensajeros secundarios en múltiples procesos de

transducción de señales en eucariotas, se entiende la versatilidad de este grupo de

proteínas. La familia de proteínas CPKs forma parte de la superfamilia de serin-treonin

quinasas CDPK-SnRK, conformada además por las quinasas relacionadas con CPKs

DETECCIÓN DE LADEFICIENCIA DE Pi

Pi

OsPHO2

OsIPS1/2

miR399

Núcleo

Genes PSI

PBS1

OsPHR2

OsPAPsOsSQD2

Liberación deP orgánico

OsPTs

OsSPXs

miR827

Figura 8. Señalización de la homeostasis de fosfatos en arroz. Representación gráfica de las respuestas de la planta de arroz frente a la deficiencia de fósforo para mantener la homeostasis de fosfatos, adaptado según el modelo de Wu et al. (2013).

Introducción

- 38 -

(CRKs), quinasas fosfo-enol-piruvato carboxilasa (PPCKs), quinasas relacionadas con

PPCKs (PEPRKs), quinasas dependientes de calmodulina (CaMKs), quinasas dependientes

de Ca+2 y calmodulina (CCaMKs) y las quinasas SnRKs (Hrabak et al., 2003). Se ha

propuesto que las CPKs han evolucionado a partir de la fusión de las CaMKs y las

calmodulinas (Liese & Romeis, 2013), lo que hace de las CPKs unas moléculas proteicas

híbridas, incrementando la eficiencia de las respuestas en organismos sésiles como las

plantas.

4.1 Características de las proteínas CPKs de plantas

Las CPKs de plantas forman una familia multigénica, de estructura y secuencias

muy conservadas, consistente en 3 dominios claramente diferenciados (Figura 9A): un

dominio N-terminal variable, un dominio serin-treonin quinasa y un último dominio

referido comúnmente como el dominio de activación de CPK (CAD). El dominio CAD

consta de dos sub-dominios: el dominio de autoinhibición, y el dominio de unión a Ca+2

homólogo a la calmodulina (Hrabak et al., 2003; Klimecka et al., 2007; Liese & Romeis,

2013; Schulz et al., 2013). El dominio N-terminal es altamente variable y puede contener

sitios de miristoilación o palmotilación. La adición de los grupos miristoilos o palmitoilos

a las proteínas CPKs determina su anclaje a membranas celulares. Las CPKs poseen un

bucle de activación en el dominio quinasa conservado que contiene residuos acídicos,

no siendo necesaria la fosforilación de la quinasa para estar activa (Ye et al., 2009). El

dominio calmodulina tiene generalmente cuatro motivos de unión a Ca+2 del tipo “EF-

hand” que actúan en pares y se unen al dominio autoinhibidor (pseudosustrato),

inhibiendo la actividad quinasa cuando no existen concentraciones adecuadas de Ca+2

para su activación (Liese & Romeis, 2013; Ye et al., 2009).

Esta familia multigénica posee 31 miembros en arroz y 34 en Arabidopsis,

divididos en 4 subgrupos en cada especie (Figura 9B), no existiendo mayores diferencias

entre monocotiledóneas y dicotiledóneas, lo que indica que esta familia tiene funciones

Introducción

- 39 -

esenciales en el desarrollo de las plantas (Ray et al., 2007). Las CPKs se expresan en la

mayoría de los tejidos vegetales y algunas de ellas muestran expresión diferencial frente

a condiciones específicas de crecimiento (Ye et al., 2009). Estas características han

puesto en consideración que pueda existir una diferenciación en las funciones para cada

CPK (Harmon et al., 2000). Existen CPKs que cumplen funciones en la germinación, en

respuesta a fotoperiodo, elongación del tubo polínico, desarrollo de pelos radiculares,

división celular, muerte celular programada, desarrollo de semillas y diversos estreses

(Klimecka et al., 2007; Ray et al., 2007).

Figura 9. Proteínas quinasas dependientes de calcio de plantas. A. Representación gráfica de la estructura general de las proteínas CPKs. B. Árbol filogenético de proteínas CPKs de A. thaliana (At) y O. sativa (Os, negrita), mostrando los 4 grupos filogenéticos (I a IV) y los sub-grupos (Ia, Ib, IIa y IIIa) correspondientes a su similaridad en los patrones de expresión, según Ray et al. (2007).

BB

A

N-terminal Serin-treonin quinasa Dominio de activación

Mir/Pal Bucle de activación Autoinhibidor

Dominios deunión a Ca+2

Introducción

- 40 -

4.2 CPKs en las respuestas de las plantas frente al estrés

Se ha visto que las CPKs responden a los cambios en el Ca+2 intracelular en

condiciones de estrés abiótico, desencadenando la señalización de las respuestas. Las

CPKs tienen funciones en la señalización por ABA, flujo de iones, cambios metabólicos,

alteraciones en la expresión de genes, y han sido relacionadas generalmente como

reguladores positivos de las respuestas de las plantas a estrés abiótico. Así, en

Arabidopsis se han visto CPKs que median la expresión de genes relacionados con ABA

en la respuesta frente a factores abióticos, como AtCPK4, AtCPK7, AtCPK10 AtCPK11 y

AtCPK30. Otras, como AtCPK3, AtCPK6, AtCPK21 y AtCPK23, inducen la expresión de

canales de flujo de iones (Schulz et al., 2013). En arroz se han encontrado CPKs como

OsCPK4, OsCPK7 y OsCPK13, directamente relacionadas con la tolerancia a estrés

abiótico como sequía, salinidad y frío. Otras CPKs de arroz también se han relacionado

con estrés abiótico por su inducción (OsCPK10, OsCPK12, OsCPK15 y OsCPK21) o

represión (OsCPK1) en las respuestas frente a factores abióticos (Abbasi et al., 2004;

Campo et al., 2014; Ray et al., 2007; Saijo et al., 2000).

Como ya se ha mencionado, la interacción de las plantas con microorganismos

ocasiona cambios en la concentración del Ca+2 citosólico, situación que activa las CPKs

implicadas en este proceso. La proteína OsCPK18 se ha visto implicada en el proceso

simbiótico del arroz con micorrizas (Campos-Soriano et al., 2011) y en cuanto a la

respuesta de defensa frente a patógenos, se han encontrado varias proteínas CPKs

relacionadas con la señalización de este proceso. En Arabidopsis la proteína AtCPK1

cumple un papel importante durante la respuesta de defensa frente a la infección

fúngica (Coca & San Segundo, 2010). En arroz se descrito que la proteína OsCPK10 (Fu et

al., 2013) y la OsCPK4 (Bundó & Coca, 2015) median la resistencia a M. oryzae, mientras

que la proteína OsCPK12 (Asano et al., 2012) confiere susceptibilidad a este patógeno del

arroz. Por otra parte, se ha visto que las RBOHs, responsables de la producción de ROS,

son posibles interactoras de proteínas CPKs, por lo que las CPKs podrían además tener

Introducción

- 41 -

implicancia en la red de señalización por ROS en las respuestas de defensa (Gao et al.,

2014; Kimura et al., 2012; Perez & Brown, 2014; Steinhorst & Kudla, 2013).

5. MicroRNAs

Los miRNAs podrían representar otro elemento fundamental en la regulación de

la adaptación de las plantas a condiciones ambientales adversas. Los miRNAs son

pequeños RNAs endógenos, no codificantes para proteínas, que tienen un papel crucial

en la expresión de genes a nivel de regulación post-transcripcional. El modo de acción

de estas moléculas en esta regulación se da a través de interacciones específicas y

complementarias con secuencias del mRNA diana, guiando la degradación del tránscrito

por corte o mediante represión traduccional. Los miRNAs de plantas son de 20-24 nt de

longitud y tienen una alta complementariedad con sus dianas. Estos miRNAs de plantas

regulan la expresión de genes codificantes para: factores de transcripción, proteínas de

respuesta a estrés, proteínas relacionadas con el crecimiento, desarrollo y fisiología,

entre otras (Eldem et al., 2013; Rogers & Chen, 2013; Voinnet, 2009). Hasta ahora han

sido descritos 713 miRNAs maduros en arroz, distribuidos en 592 pre-miRNAs

(www.mirbase.org - Kozomara & Griffiths-Jones, 2014). En general, el origen de estos

miRNAs es un gen MIR traducido para formar un tránscrito primario (pri-miRNA) y

después procesado a un precursor de miRNA (pre-miRNA) que tiene la particularidad de

formar una estructura en forma de horquilla, a partir del cual se genera el miRNA

maduro. Este complejo proceso de biogénesis se detalla en el siguiente apartado.

5.1 Biogénesis y modo de acción de los miRNAs

El proceso canónico de biogénesis de los miRNAs maduros en plantas (Figura

10) se inicia, generalmente a partir de genes MIR, los cuales poseen su propia unidad

transcripcional y están localizados en regiones “intergénicas” por todo el genoma, esto

es, en regiones no codificantes para proteínas. Estos genes MIR codifican un tránscrito

primario (pri-miRNA) por medio de la RNA polimerasa II (PolII), estabilizados por una

Introducción

- 42 -

metilguanosina (met) en el extremo 5’ y una cola poliadenilada (polyA) en el extremo 3’

(Rogers & Chen, 2013). La mayoría de los genes MIR poseen su propio promotor y en

Arabidopsis y arroz se ha visto que en esa región promotora se encuentran cajas de

inicio de la transcripción del tipo TATA y elementos de regulación de la expresión de

unión a diversos tipos de factores de transcripción como del tipo MYB, cajas W, MYC,

entre otros (Zhao & Li, 2013).

Todavía en el núcleo, estos pri-miRNA son procesados a un precursor de miRNA

(pre-miRNA) cuando son cortados cerca de la base de la estructura de horquilla

(stemloop) que forma el pre-miRNA, por el complejo formado por las proteínas: de tipo

Dicer (DCL), de unión a RNAs de doble cadena HYL (HYL/DRB), del tipo TOUGH (TGH) y

del tipo dedo de zinc SERRATE (SE). Después de la escisión del pre-miRNA en forma de

stemloop, estos son procesados nuevamente por el complejo de proteínas DCL-HYL-

TGH-SE para formar un dúplex entre el miRNA maduro y su secuencia parcialmente

complementaria (Rogers & Chen, 2013). Estos dúplex primeramente son estabilizados

Figura 10. Biogénesis de miRNAs. Representación gráfica de la biogénesis y el procesamiento de miRNAs en plantas. Adaptado de Voinnet (2009) y Rogers & Chen (2013).

Núcleo

Citoplasma

Pared celular

mRNA diana

Gen MIR

RNA Pol II pri-miRNAmet

polyATATA

SETGH

HYL1 DCL

pre-miRNASE

TGHHYL1 DCL

HEN1CH3

CH3

Dúplex miRNA

HASTY

CH3CH3

SQNHSP90

AGO

ComplejoRISC

CorteRepresión traduccional

DesestabilizaciónMetilación de DNA

SQNHSP90

AGO

Introducción

- 43 -

por metilación mediante la proteína HEN1, para después ser exportados al citoplasma

con la ayuda de proteínas HASTY (Voinnet, 2009). Una vez en el citoplasma, el miRNA

maduro es separado de la secuencia parcialmente complementaria, cargándose en el

complejo enzimático RISC (RNA-induced silencing complex), del cual forman parte

central las proteínas AGO, así como también las proteínas de choque térmico 90

(HSP90) y del tipo SQUINT (SQN). Este complejo RISC guía al miRNA hacia su diana

complementaria que es generalmente degradada por corte del tránscrito, aunque

también pueden ocurrir otros tipos de silenciamiento como la inhibición traduccional,

desestabilización del tránscrito diana, o unión a DNA complementario en el núcleo para

guiar la metilación (Rogers & Chen, 2013).

Los miRNAs en plantas pueden originarse además de regiones intrónicas,

regiones no traducidas (UTRs) o exones. Específicamente en arroz se ha descrito que

sólo el 35% de los miRNAs proceden de regiones intergénicas mientras que el 65%

están ubicados en regiones intragénicas, esto es, dentro de genes codificantes para

proteínas (Zhao & Li, 2013). La regulación de estos miRNAs ubicados en regiones

intragénicas sigue siendo un problema abierto, aunque se sabe que muchos de ellos

pueden tener su propia regulación y que otros podrían depender de la regulación de los

genes que los contienen (Marsico et al., 2013; Yang et al., 2012).

5.2 MiRNAs en las respuestas de las plantas frente a estrés

Los miRNAs de plantas tienen un papel importante en un amplio rango de

procesos fisiológicos y en los últimos años se han incrementado las evidencias sobre su

rol crucial en las respuestas de las plantas frente a diversos estreses. Así, estos

reguladores de la expresión génica se han visto implicados en estreses abióticos como:

sequía, frío, salinidad, deficiencias nutricionales; en estreses bióticos como en respuesta

a: nemátodos, hongos y bacterias; e implicados en las rutas de señalización por

hormonas (Baldrich et al., 2014; Curaba et al., 2014; Eldem et al., 2013; Khraiwesh et al.,

2012; Ruiz-Ferrer & Voinnet, 2009). En muchas especies vegetales se han estudiado

Introducción

- 44 -

miRNAs implicados en las respuestas frente a estrés, especialmente en Arabidopsis pero

también en otras con gran importancia en la agricultura como el maíz, arroz, caña de

azúcar, trigo, cebada, algodón, soja y otros (Ferreira et al., 2012; Gupta et al., 2014;

Hackenberg et al., 2013a; Li et al., 2011a; Liu et al., 2012b; Sunkar et al., 2008; Tang et al.,

2012b; Wu et al., 2014; Zhu et al., 2013).

Específicamente en arroz, se han encontrado miRNAs asociados a la respuesta

frente a sequía (Zhou et al., 2010), estrés oxidativo (Li et al., 2011b), respuesta de defensa

frente a M. oryzae (Baldrich et al., 2015; Li et al., 2013a) y recientemente se ha descrito un

nuevo miRNA (osa-miR7965) implicado directamente en la resistencia de las plantas de

arroz a la piriculariosis, mediante la regulación de su diana, un tránscrito específico del

gen OsNramp6 (Campo et al., 2013). Este avance en la investigación sobre el papel que

juegan los miRNAs en las respuestas de las plantas, principalmente arroz, frente a estrés

indica la importancia que podrían tener estos reguladores en la mejora de los cultivos.

6. Interacción de las respuestas al entorno reguladas por CPKs y miRNAs en las

plantas de arroz

Como hemos resumido, las plantas han desarrollado sofisticados mecanismos

de respuesta a la gran variedad de estímulos ambientales a los que están expuestas,

tanto bióticos como abióticos, ante los cuales tienen que adaptarse y sobrevivir. Sin

embargo, estos procesos no ocurren aisladamente, las plantas se ven sometidas

simultáneamente a diferentes estreses. Además el estrés afecta también a los procesos

de desarrollo de las plantas. Entender cómo interaccionan los distintos procesos de

señalización celular tiene gran interés y relevancia por su aplicación práctica en la

biotecnología de plantas. El interés de este trabajo se centra en estudiar cómo la

modificación de componentes mediadores de la respuesta de defensa de la planta de

arroz frente a patógenos puede afectar la adaptación a otros estreses ambientales,

como la sequía, y el desarrollo y la productividad de la planta. Con este propósito y en

Introducción

- 45 -

base a resultados previos en el grupo de investigación, se ha seleccionado una proteína

CPK y miRNAs como reguladores de los procesos de señalización celular para estudiar

las respuestas de las plantas de arroz a su entorno.

Introducción

- 46 -

Objetivos

- 49 -

OObjetivos

El objetivo general de esta tesis es la caracterización funcional de la proteína

OsCPK13 y algunos miRNAs en la respuesta de defensa de las plantas de arroz frente al

hongo M. oryzae y frente a otras condiciones adversas del entorno. Específicamente, en

el transcurso de la realización de los trabajos relacionados a OsCPK13 y su papel en la

respuesta de defensa, se han encontrado evidencias de que esta proteína podría ser

responsable de la acumulación de fósforo en la parte aérea de la planta de arroz, por lo

se propuso caracterizarla frente a diferentes condiciones de fertilización fosfatada.

Además, luego de la selección de los miRNAs con los cuales se decidió trabajar por su

posible implicancia en la respuesta inmune del arroz, se caracterizó su participación frente

a estrés hídrico. La tesis se ha estructurado en dos capítulos, uno enfocado en OsCPK13 y

el otro en los miRNAs, cuyos objetivos específicos han sido los siguientes:

Capítulo I:

1. Caracterización funcional de OsCPK13 en la respuesta de defensa de arroz.

2. Caracterización funcional de OsCPK13 frente a fertilización fosfatada en plantas

de arroz.

Capítulo II:

1. Identificación y selección de miRNAs con acumulación alterada durante la

respuesta inmune de arroz.

2. Identificación de las dianas de los miRNAs seleccionados.

3. Caracterización de los perfiles de acumulación de los miRNAs seleccionados

durante la respuesta de defensa y frente a estrés hídrico.

4. Caracterización funcional de los miRNAs osa-miR390, osa-miR397 y osa-miR1319a

en la respuesta inmune y frente a estrés hídrico en plantas de arroz.

Objetivos

- 50 -

Capítulo I

CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DEL GEN OsCPK13 EN LA RESPUESTA DE DEFENSA

Y LA FERTILIZACIÓN FOSFATADA EN LAS PLANTAS DE ARROZ

Capítulo I: OsCPK13 en defensa y fertilización fosfatada

- 53 -

AAntecedentes

Con el objetivo de identificar genes que potencialmente participen en la respuesta

de defensa de la planta de arroz, previamente se realizó en el grupo de investigación un

análisis transcriptómico global mediante micromatrices (o microarrays) de hojas de arroz,

que habían sido tratadas con elicitores del hongo fitopatógeno M. oryzae (Campo et al.,

2013). Entre los genes diferencialmente expresados en respuesta al tratamiento con

elicitores se identificaron varios genes CPKs. En la Tabla 3 se muestran los genes OsCPKs

que presentaron cambios de expresión significativos a los 30 minutos y a las 2 horas del

tratamiento. Entre los genes identificados se encuentra el gen OsCPK13

(LOC_Os04g49510) que muestra un incremento de 1,55 veces a las 2 horas de tratamiento

con elicitores. Teniendo en cuenta que la respuesta a elicitores fúngicos en plantas es

normalmente muy rápida (en el orden de minutos luego del tratamiento) (Coca & San

Segundo, 2010; Denoux et al., 2008), se podría inferir que la inducción de OsCPK13 es más

bien una respuesta tardía.

Tabla 3. Expresión diferencial de genes OsCPK en respuesta a elicitores de M. oryzae. Análisis microarrays (GeneChip® rice genome array de Affymetrix™) de hojas de arroz cultivar Nipponbare sometidas al tratamiento con elicitores de M. oryzae durante 30 minutos o 2 horas (Campo et al., 2013). (a) Cambio de expresión génica (tratamiento con elicitores vs tratamiento con solución control). (b) Valor estadístico de la probabilidad de falsos positivos. Sólo se indican en la tabla los genes OsCPK con que muestran cambios de expresión significativos (criterio: FC ≥ 1.2; p ≤ 0.05).

Expresión diferencial de genes OsCPK en respuesta a elicitores de M. oryzae

Gen Locus FC: Cambio een la expresión a p-valor b

30 m

in

OsCPK3 LOC_Os01g61590 +1,28 0,047OsCPK4 LOC_Os02g03410 +1,23 0,027OsCPK5 LOC_Os02g46090 +1,56 0,000OsCPK10 LOC_Os03g57540 +1,32 0,031OsCPK18 LOC_Os07g22710 +1,16 0,043OsCPK24 LOC_Os11g07040 +1,20 0,022

2 hs

OsCPK4 LOC_Os02g03410 +,194 0,000OsCPK13 LOC_Os04g49510 +1,55 0,010OsCPK22 LOC_Os09g33910 +1,16 0,043OsCPK27 LOC_Os12g30150 +1,27 0,004

Antecedentes

- 54 -

Estos cambios en la expresión del gen OsCPK13 sugieren que podría estar

implicado en la defensa ante el ataque por patógenos, además de su ya descrita

participación en la adaptación de las plantas de arroz a sequía, salinidad y frío (Saijo et al.,

2000). Por este motivo se decidió caracterizar funcionalmente el gen OsCPK13 mediante

aproximaciones de ganancia y pérdida de función. Para ello se utilizaron líneas

transgénicas de arroz transformadas con vectores de expresión en plantas diseñados para

la sobreexpresión de OsCPK13 (ganancia de función) y silenciamiento de OsCPK13

mediante la sobreexpresión de un microRNA (miRNA) artificial (pérdida de función).

Estas líneas estaban disponibles al comienzo de este trabajo de tesis doctoral. Se

habían generado en el fondo genético de la variedad Nipponbare de arroz (O. sativa ssp.

japonica cv. Nipponbare) vía Agrobacterium. Las líneas generadas habían sido

transformadas con las construcciones que se presentan en la Figura 11. Se habían

obtenidos líneas para la expresión del cDNA OsCPK13 bajo el control del promotor fuerte

y constitutivo del gen Ubiquitin (Ubi) del maíz (Figura 11A). También líneas portadoras de

una construcción para la expresión de un miRNA artificial (amiRNA) cuya diana es el

tránscrito de OsCPK13 (región 3´ no traducida, 3’ UTR). El amiRNA está basado en el

precusor osa-MIR528 y se diseñó usando la herramienta informática Web MicroRNA

Designer (WMD3- http://wmd3.weigelworld.org). La expresión del amiRNA está también

bajo el control del promotor Ubi y terminador Nos (Figura 11B). Como controles se

disponían de líneas transgénicas transformadas con un vector que contenía el promotor

Ubi y terminador Nos, pero sin ningún gen bajo su control (Figura 11C); o con el vector

vacío (pCAMBIA1300) simplemente con el gen de selección (Figura 11D). El gen de

selección contenido en la región del T-DNA de todas las construcciones confiere

resistencia al antibiótico higromicina.

También se disponía de líneas transgénicas portadoras de una construcción

diseñada para estudiar la expresión del promotor OsCPK13. Estas líneas habían sido

generadas en la variedad de arroz Ariete (O. sativa ssp japonica cv. Ariete), y contenían la


- 55 -

construcción mostrada en la Figura 11E. La construcción contiene la región promotora del

gen OsCPK13 (2 kb antes del inicio de la transcripción) fusionada transcripcionalmente al

cDNA del gen reportero de la β-glucuronidasa (GUS) y el terminador Nos.

Figura 11. Representación esquemática de las construcciones utilizadas en los estudios relacionados con OsCPK13. A. Vector de sobreexpresión de OsCPK13. Construcción que contiene el cDNA completo del gen OsCPK13 (AK061881) bajo el control del promotor del gen Ubiquitin1 de maíz (Ubi prom) y el terminador del gen de la Nopalina Sintasa (Nos-t). B. Vector de expresión de un miRNA artificial cuya diana es el mRNA OsCPK13. La construcción contiene un precursor artifical de miRNA basado en osa-MIR528 y diseñado con el programa bioinformático Web MicroRNA Designer (WMD3- http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi). El precursor está bajo el control del promotor Ubi y el terminador Nos. C. Vector vacío con el promotor de Ubi y el terminador Nos. D. Vector vacío solo con el gen de selección. E. Vector diseñado para el análisis de expresión del promotor OsCPK13 que dirige la expresión del gen reportero de la β-glucuronidasa (GUS). Todos los vectores contienen además dentro del T-DNA el gen de resistencia a higromicina (hptII) bajo el control del promotor y el terminador 35S del CaMV. Las construcciones A-D se encuentran insertas dentro del plásmido pCAMBIA1300 y la construcción E dentro del plásmido pCAMBIA1391Z.

Ubi prom Nos-tOsCPK13pC1300 hptII

LB RB

35S prom 35S-t

Ubi prom Nos-t

miROsCPK13

pC1300 hptII

LB RB

35S prom 35S-t

miR*OsCPK13

pre-MIR-OsCPK13

OsCPK13 prom Nos-tGUSpC1391Z hptII

LB RB

35S prom 35S-t

AA

B

E

Ubi prom Nos-tpC1300 hptII

LB RB

35S prom 35S-t

pC1300 hptII

LB RB

35S prom 35S-t

C

D

Antecedentes

- 56 -

Estas plantas transgénicas disponibles en el grupo se utilizaron como

herramientas para abordar los estudios desarrollados en este trabajo de tesis doctoral con

relación a la caracterización del gen OsCPK13 y su rol en las respuestas de defensa de las

plantas de arroz y ante la fertilización fosfatada.


- 57 -

RResultados

1. Caracterización de la expresión del gen OsCPK13

Para caracterizar la función del gen OsCPK13, es importante conocer su patrón

de expresión. Con este fin se realizó un análisis de expresión génica consultando los

datos disponibles en las bases de datos, un análisis mediante RT-PCR cuantitativa en

tiempo real (qRT-PCR) en tejidos foliares y radiculares y un estudio de la actividad del

promotor.

Se ha realizado una búsqueda en la plataforma bioinformática de base de datos

Genevestigator (http://www.genevestigator.com) sobre la expresión génica de OsCPK13

en diferentes tejidos y estadíos de la planta de arroz. Los datos obtenidos a partir de los

análisis de microarrays publicados muestran que OsCPK13 se expresa en todos los

estadíos de desarrollo de la planta, aunque los niveles de expresión son inferiores

durante la floración (Figura 12A); y que también mantiene un nivel de expresión similar

en los distintos órganos de la planta, como en las raíces, hojas e inflorescencias (Figura

12B).

El análisis de expresión del gen OsCPK13 realizado en este trabajo mediante

qRT-PCR muestra una acumulación de tránscritos similar en la parte aérea y en las raíces

de plantas arroz jóvenes de 14 días (Figura 12C). Los niveles de acumulación son

ligeramente más altos en raíces en comparación con la parte aérea de la planta, aunque

las diferencias no son significativas. Estos resultados indican que el gen se expresa tanto

en la parte aérea como en la raíz de plantas jóvenes de arroz, estadío del desarrollo de

mayor susceptibilidad a la infección por el hongo patógeno M. oryzae.

El análisis in silico del promotor del gen OsCPK13 en las plataformas

bioinformáticas PlantCARE (Lescot et al., 2002) y PLACE (Higo et al., 1999) muestra la

presencia de elementos regulatorios en cis (Figura 13A). Se han encontrado varios

Resultados

- 58 -

elementos de respuesta a patógenos (ACAGT, GCCGCC), a elicitores (CTGACC, ACCTCC)

y a las hormonas de defensa SA (TAGTCTTCTC) y JA (AACGTG). También se encontraron

varias cajas de respuesta a deshidratación y ABA (CAGTTG, CTTACGTGC, GCCGAC, entre

otros), y a frío (CCGAAA), situaciones ambientales en las que ya se había probado la

implicancia de gen OsCPK13 (Saijo et al., 2000). No se han encontrado elementos

regulatorios relacionados con la respuesta a fosfatos.

El estudio de la actividad del promotor del gen OsCPK13 se realizó utilizando las

líneas transgénicas portadoras de la construcción promOsCPK13:GUS, que expresan el

gen marcador GUS bajo el control del promotor de OsCPK13. La expresión del gen GUS

puede ser visualizada mediante un ensayo histoquímico. El mismo consiste en la

Figura 12. Expresión del gen OsCPK13 en diferentes estadíos y tejidos de las plantas arroz. Datos de la expresión del gen OsCPK13 (LOC_Os04g49510) en diferentes estados del desarrollo (A) y en diferentes tejidos (B) de la planta de arroz. Datos e imágenes tomadas de la base de datos Genevestigator (www.genevestigator.com). Los niveles de expresión representan la intensidad de señal obtenidos para la sonda específica de OsCPK13 (Os.282.2.S1_a_at) en los análisis de micromatrices publicados (rice genome array de Affymetrix™). C. Análisis mediante qRT-PCR de tejidos radiculares y aéreos (hojas + tallos) de al menos 3 plantas de arroz (cv. Nipponbare) crecidas durante 14 días en medio hidropónico nutritivo Yoshida en condiciones controladas de luz y temperatura. Se muestran los valores de expresión media del gen OsCPK13 (LOC_Os04g49510) frente al gen de referencia OsUbi1 (LOC_Os06g46770). Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Los datos son representativos de 3 réplicas experimentales.

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

Raíces Parte aérea

Expr

esió

n re

lativ

a

OsCPK13

A

B

C

Estado dedesarrollo

Número de muestras

LOC_Os04g49510

Núm

ero

de

mue

stras

LOC_

Os0

4g49

510


- 59 -

degradación del sustrato X-Gluc a un compuesto de color azul, mediante la acción de la

enzima β-glucuronidasa, codificada por el gen GUS. La tinción azul permite determinar

la localización espacial de la actividad del promotor en la planta. El ensayo se realizó

utilizando plantas T3 homocigotas de 14 días crecidas en cultivo hidropónico. Los

resultados se muestran en la Figura 13B-D, donde se observa la tinción azul marcadora

de la presencia de la enzima β- glucuronidasa tanto en la parte aérea como en las raíces

de las plantas. En la parte aérea se pudo ver que existen diferencias notorias de tinción

entre tejidos de nueva formación y tejidos viejos. Como se muestra en la Figura 13B, las

hojas antiguas no muestran tinción azul, indicador de la ausencia de la enzima

(izquierda), a diferencia de las hojas jóvenes (derecha). Este patrón de tinción se ha visto

en la mayoría de las muestras analizadas. Las hojas jóvenes son las más vulnerables al

ataque por patógenos y es en ellas donde el promotor OsCPK13 se expresa

preferencialmente. Aparentemente, en tejidos radiculares, la expresión del gen GUS por

parte del promotor de OsCPK13 es mayor en las puntas de las raíces (Figura 13C). Esta

distribución de la tinción azul en raíces guarda similitud con los resultados observados

en tejidos foliares, ya que las puntas radiculares son los tejidos más jóvenes. Se resalta

que en cortes transversales de raíces se observa actividad β-glucuronidasa

específicamente en los haces vasculares (Figura 13D).

Los resultados obtenidos muestran que el promotor OsCPK13 es funcionalmente

activo tanto en raíces como en hojas de plántulas de arroz a niveles similares. Estos

resultados se corresponden con la expresión transcripcional de OsCPK13 previamente

observada (Figura 12C). La actividad promotora se observa con más intensidad,

principalmente en tejidos de nueva formación y en tejidos vasculares.

Resultados

- 60 -

Figura 13. Actividad del promotor de OsCPK13 en tejidos de arroz. A. Elementos regulatorios encontrados en la secuencia de la región promotora de OsCPK13. Se tomaron las secuencias de los 1500 pb antes del inicio de la transcripción y la secuencia de 5’UTR del gen OsCPK13. Las secuencias se analizaron en las plataformas en bioinformáticas en línea PlantCARE y PLACE. Sólo se indican los elementos relacionados con las respuestas en las que OsCPK13 ya ha sido descrita (sequía, frío) y aquellos relevantes para los estudios realizados en este trabajo (defensa y fosfatos). B-D. Ensayos de actividad β-glucuronidasa en plantas de arroz portadoras de la construcción promOsCPK13:GUS:tNos. Fotos de hojas viejas (izquierda) y jóvenes recién emergidas (derecha) (B), de raíces enteras (C) y de un corte transversal de raíz (D) de plantas de 14 días crecidas en medio hidropónico nutritivo Yoshida en condiciones controladas de luz y temperatura, donde se observa la tinción en haces vasculares. Datos representativos de 3 réplicas biológicas. Fotos tomadas con el estereomicroscopio acoplado a una cámara digital. La barra de escala corresponde a 500 μm.

DDefensa Sequía Frío

Pathogen responsiveness

SA responsiveness

DcMYB1 binding in response to elicitor treatment

WRKY proteins binding site wounding and elicitor-respsonsiveness

ABA-responsive element

MYB binding site in response to drought

Dehydration responsiveelement (DREB)

Low-temperature-responsive element

-1500bp

OsCPK13

5’ UTR

+390bp

B C DpromOsCPK13:GUS:tNos

A


- 61 -

2. Estudio de la localización subcelular de la proteína OsCPK13

La localización subcelular de una proteína es un importante determinante de su

función. Es por ello que para caracterizar funcionalmente OsCPK13 es relevante conocer

su localización, para lo cual se realizó un estudio de la localización subcelular de la

proteína OsCPK13 en ensayos de expresión transitoria de proteínas de fusión

fluorescentes y visualización mediante microscopía confocal.

2.1 Obtención de vectores para la expresión de OsCPK13 fusionado a proteínas fluorescentes

Para llevar a cabo los estudios de expresión transitoria se prepararon vectores

de expresión en planta basados en los plásmidos pGWB541 y pGWB544, amablemente

cedidos por el Dr. Nakagawa (Nakagawa et al., 2007). Estos vectores permiten la

expresión de proteínas de fusión a las proteínas fluorescentes CFP (Cian Fluorescent

Protein) y YFP (Yellow Fluorescent Protein), respectivamente. La expresión de las fusiones

está dirigida por el promotor constitutivo CaMV35S. El sistema de clonación de estos

vectores está basado en la tecnología Gateway®. Se ha optado por este tipo de clonaje

por ser relativamente rápido y por tener una alta eficiencia, debido a que permite

seleccionar sólo las células de E. coli cepa DH5α que hayan incorporado el plásmido

recombinado, ya que los plásmidos no recombinados contienen el gen letal ccdB.

Ambas construcciones para la producción de proteínas fusión se realizaron con

la proteína fluorescente en posición C-terminal de OsCPK13, para evitar posibles

interferencias con las señales de miristoilación localizadas en el dominio N-terminal de

OsCPK13. La secuencia de la proteína OsCPK13 se analizó utilizando la plataforma

bioinformática Myristoylator (http://web.expasy.org/myristoylator/) que mostró la

presencia de un potencial sitio de miristoilación (MGNACGG, en la posición 2 de la

proteína, Figura 14) con un puntaje de 0,96 con una alta confianza de probabilidades de

ocurrencia. La miristoilación de proteínas es determinante de su anclaje a membranas y

Resultados

- 62 -

de la correcta localización subcelular, como se ha demostrado para otras proteínas CPKs

(Asai et al., 2013; Campos-Soriano et al., 2011; Coca & San Segundo, 2010). Por lo tanto,

esta disposición es más favorable para mostrar la correcta localización de la proteína

OsCPK13.

En la Figura 14 se muestra un esquema del proceso seguido para la obtención

de las construcciones. En primer lugar se obtuvo el cDNA codificante para la proteína

OsCPK13 por retrotranscripción de una población de mRNAs de raíces de plántulas de

arroz de 30 días crecidas en cultivo hidropónico. La amplificación del cDNA se realizó

con cebadores específicos diseñados para eliminar el codón de parada e introducir las

secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción en los extremos 5’ (BamHI) y

3’ (XhoI). El producto de amplificación se clonó por T/A en un vector de transición

(pGEM-TEasy®, Promega™), para luego clonarlo en un vector pENTR3C de tecnología

Gateway® por los sitios de restricción BamHI y XhoI. El vector pENTR3C contiene

secuencias de recombinación homóloga attL que permitió clonar mediante una reacción

de recombinación LR de Gateway® en los vectores pGWB541 y pGWB544 que

contienen los sitios de recombinación attR (Nakagawa et al., 2007). La identidad de las

secuencias de los vectores así obtenidos, especialmente en la zona de fusión, fue

verificada mediante secuenciación. De esta forma se obtuvieron los vectores de

expresión en plantas de las proteínas OsCPK13-CFP y OsCPK13-YFP.

2.2 Localización subcelular de OsCPK13

El estudio de la localización subcelular de OsCPK13 se realizó en el sistema de

expresión transitoria basado en la infiltración de células foliares de Nicotiana

benthamiana con una suspensión de células de A. tumefaciens portadoras de los

vectores con las construcciones codificantes para las proteínas de fusión fluorescentes

(pGWBOsCPK13YFP o pGWBOsCPK13CFP). Se agroinfiltraron hojas jóvenes de N.

benthamiana mutante en el gen RdR6. La proteína RdR6 (RNA-dependent RNA

polymerase 6) está implicada en el silenciamiento génico de RNAs exógenos (Schwach et


- 63 -

al., 2005). Así, estas plantas tienen bloqueada la maquinaria de silenciamiento y

permiten la expresión de transgenes. Luego de 48 horas de la agroinfiltración se analizó

la localización de las proteínas fusión bajo microscopía confocal. Imágenes

representativas de los resultados obtenidos se muestran en la Figura 15.

Figura 14. Esquema de la preparación de los vectores para la expresión en plantas de las proteínas de fusión fluorescentes OsCPK13-YFP y OsCPK13-CFP. Amplificación por PCR del cDNA OsCPK13 sin incluir el codón de parada e incorporando los sitios de restricción indicados. Clonación del producto de PCR en el vector pGEM-T mediante el sistema de clonación T/A. Clonación del fragmento de restricción BamHI-XhoI del pGEM-T:OsCPK13 en el vector intermedio pENTR3C. Clonación mediante recombinación entre pENTR3C:OsCPK13 a los vectores pGWB541 y pGWB544 para generar los vectores: pGWBOsCPK13-CFP y pGBOsCPK13-YFP. En ambos vectores, la expresión de los genes codificantes de las proteínas de fusión OsCPK13-CFP o OsCPK13-YFP está dirigida por promotor 35S. Se muestra en detalle la secuencia N-terminal de OsCPK13 correspondiente al sitio de miristoilación de la proteína predicho en la plataforma bioinformática Myristoylator (Score: 0,96). Nos: nopalina sintasa; hpt: gen de resistencia a higromicina; 35S: promotor del virus del mosaico del coliflor; Spc: gen de resistencia a espectinomicina.

OsCPK13 cDNA

BamHI

XhoI

pGEM-Teasy®

OsCPK13 cDNA

BamHI XhoI pENTR3C

OsCPK13 cDNA

BamHI XhoI

attL1 attL2

pGWB541 (CFP)/544 (YFP)

attR1 attR2RB LB

Cmr ccdBP35S Nos-t Nos-PNos-t hptCFPYFP

Spcr

Amplificación PCR

Clonación T/A

Clonación por restricción

Clonación Gateway® LR

pGWBOsCPK13(CFP/YFP)

RB LB

35S prom Nos-tOsCPK13 hpt Nos promNos-tCFP/YFP

Spcr

MGNACGG

Mir

Resultados

- 64 -

Las imágenes muestran que la fluorescencia tanto de la proteína OsCPK13-YFP

(Figura 15A) como de la OsCPK13-CFP (Figura 15C) se localiza en la periferia celular,

probablemente coincidiendo con la membrana plasmática, y claramente diferente de la

localización citoplasmática de la YFP (Figura 15B) y de la CFP (Figura 15D). Para confirmar

que esta localización se corresponde con la membrana plasmática, hojas agroinfiltradas

con el vector pGWBOsCPK13CFP se trataron con una solución de FM4-64®, un

compuesto fluorescente lipofílico que se adhiere a la membrana plasmática (Van

Leeuwen et al., 2007). Las imágenes muestran que la fluorescencia de FM4-64 (en rojo)

colocaliza con la fluorescencia de la proteína OsCPK13-CFP (azul) (Figura 15C), indicando

que la proteína OsCPK13 se localiza en la membrana plasmática.

Figura 15. Localización subcelular de OsCPK13. Imágenes de microscopía confocal secciones simples en un solo plano que muestran la localización subcelular de proteínas fusión OsCPK13-YFP y OsCPK13-CFP en células foliares de N. benthamiana RdR6. Las células fueron transformadas transitoriamente mediante agroinfiltración de células de A. tumefaciens portadoras de los vectores pGWBOsCPK13YFP (A), pGWBOsCPK13CFP (C) y vectores de expresión constitutiva de YFP (B) y de CFP (D). Las imágenes fueron tomadas 48 horas después de ser agroinfiltradas. A. Imágenes del canal de transmisión (panel izquierdo), de fluorescencia en el canal amarillo (panel central), y de superposición de ambos canales (panel derecho) B. Imagen de superposición del canal de transmisión y de fluorescencia en el canal amarillo. C. Imágenes de fluorescencia en el canal azul (panel izquierdo), de fluorescencia en el canal rojo (panel central), y de superposición ambos canales. En este caso la hoja fue además infiltrada con el compuesto fluorescente FM4-64 (rojo) marcador de membrana plasmática a una concentración 5 μM durante 5 min. D. Imagen de fluorescencia en canal azul. Las barras de escala corresponden a 10 μm (A-C), 5 μm (D).

AA

C

OsCPK13-YFP

OsCPK13-CFP FM4-64®

YFP

CFP

B

D

-CFP


- 65 -

3. Caracterización de las líneas transgénicas con expresión alterada del gen

OsCPK13

Al inicio de este trabajo se disponía de plantas transgénicas de arroz que habían

sido transformadas con una construcción diseñada para la sobreexpresión de OsCPK13

(OsCPK13-Ox) o con una construcción diseñada para silenciar la expresión de OsCPK13

mediante la expresión de un amiRNA (OsCPK13-Kd). Estas líneas no habían sido

caracterizadas molecularmente, y por tanto antes de usarlas para la caracterización

funcional de OsCPK13 era necesario determinar los niveles de expresión de OsCPK13 y

de acumulación de la correspondiente proteína.

La acumulación de tránscritos de OsCPK13 se analizó en hojas de plantas adultas

de 90 días de las líneas OsCPK13-Ox y controles. Se tomaron muestras para la síntesis de

cDNA a partir de la población de mRNAs de los tejidos foliares. La cuantificación de la

expresión se realizó mediante qRT-PCR utilizando cebadores específicos para la región

5’ del tránscrito de OsCPK13. Los resultados dan cuenta de que todas las líneas

OsCPK13-Ox analizadas presentan mayor expresión de OsCPK13 a nivel transcripcional,

comparadas con la variedad silvestre (Wt) y líneas del vector vacío (Ev) (Figura 16A).

Por análisis Northern blot y utilizando una sonda específica para el tránscrito del

gen OsCPK13 (fragmento correspondiente a la región N-terminal de la proteína) se

examinaron los niveles de acumulación en las líneas OsCPK13-Kd. Estas líneas expresan

un miRNA artificial específico frente a las secuencias 3’ UTR del mRNA OsCPK13 (Figura

16B). Según se muestra en la Figura 16C, estas líneas tienen disminuidos los niveles de

acumulación del transcrito OsCPK13 en comparación con las líneas transformadas con el

vector vacío y las plantas silvestres no transformadas.

Por otra parte, se crecieron plántulas de las líneas de expresión diferencial de

OsCPK13 y controles durante 7 días en condiciones de esterilidad in vitro y bajo

condiciones controladas de luz y temperatura. Se tomaron muestras de tejido radicular

Resultados

- 66 -

para la extracción de proteínas totales y se realizó un análisis Western blot para evaluar

los niveles de acumulación de la correspondiente proteína. Para la detección de la

proteína OsCPK13 se utilizó un anticuerpo específico para la región N-terminal,

previamente producido en conejos. Los niveles de acumulación de la proteína OsCPK13

tanto en las líneas de ganancia como de pérdida de función, se corresponden con la

expresión transcripcional observada. Las líneas OsCPK13-Ox presentan niveles más altos

de la proteína OsCPK13 mientras que las líneas OsCPK13-Kd acumulan menos, en

comparación con las líneas controles transformadas con el vector vacío o sin transformar

(Figura 16D).

Los resultados obtenidos con estos análisis confirman que las líneas OsCPK13-Ox

sobreexpresan eficientemente OsCPK13 y acumulan niveles más altos de la

correspondiente proteína, mientras que las líneas OsCPK13-Kd son efectivas en el

procesamiento y degradación de los tránscritos de OsCPK13 y presentan niveles de

acumulación más bajos de la correspondiente proteína.

No se han observado efectos aparentes en el fenotipo de las plantas de las

líneas OsCPK13-Ox ni OsCPK13-Kd, crecidas en condiciones de hidroponía o en tierra

durante 30 días, comparadas con la variedad silvestre no transformada y líneas

transgénicas del vector vacío. En este trabajo se pudieron obtener T3 homocigotas de

las líneas OsCPK13-Kd, sin embargo, no fue posible para las líneas OsCPK13-Ox. Las

plantas que sobreexpresan OsCPK13 en homocigosis tienen un fenotipo letal. Es

necesario mencionar que las plantas adultas de estas líneas hemicigotas presentan un

fenotipo de “lesion mimic” en las hojas adultas principalmente (Figura 17). Estas lesiones

surgen espontáneamente y no son debidas a infección por patógenos ni a respuestas a

condiciones de luz (datos no mostrados). Esta observación fue determinante para iniciar

los estudios de respuesta a fertilización fosfatada que se describirá más adelante. En

este trabajo, por lo tanto, se han utilizado líneas T3 hemicigotas de estas líneas.


- 67 -

Figura 16. Caracterización molecular de las líneas transgénicas OsCPK13-Ox y OsCPK13-Kd. A. Análisis de la expresión de OsCPK13 (LOC_Os04g49510) mediante qRT-PCR en las plantas de arroz no transformadas (WT), transformadas con el vector vacío (EV) y sobreexpresoras de OsCPK13 (OsCPK13-Ox). Los números indican líneas independientes. Las muestras se tomaron de hojas jóvenes de plantas de 90 días crecidas en tierra bajo condiciones controladas de luz, temperatura y humedad. La expresión del gen OsUbi1 (LOC_Os06g46770) fue utilizada como referencia. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Los resultados son representativos de 2 réplicas experimentales B. Esquema del mRNA OsCPK13 indicando el fragmento utilizado como la sonda en la hibridación por Northern blot y el sitio de corte del miRNA artificial. C. Northern blot de plantas de las líneas OsCPK13-Kd. La membrana fue hibridada con una sonda específica para el tránscrito OsCPK13. D. Acumulación de la proteína OsCPK13 analizada por Western blot. Cantidades equivalentes de extractos proteicos de fracciones enriquecidas en membrana obtenidas de raíces de plantas de 7 días crecidas en cultivo in vitro en medio MS sólido de las líneas indicadas, se separaron mediante SDS-PAGE (10% A/B). Las proteínas se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y se inmuno-detectaron utilizando anticuerpos específicos frente al dominio N-terminal específico para la proteína OsCPK13. La reacción se detectó mediante quimioluminiscencia. El panel inferior corresponde a la tinción con rojo Ponceau (Rubisco) como control de carga.

0,000

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

#6 #11 #1 #6 #18 #23 #24

Wt Ev OsCPK13-Ox

Expr

esió

n re

lativ

a

OsCPK13

Wt

#1 #6 #18

#23

#24

#28Ev

OsCPK13-Ox OsCPK13-Kd

#4 #8 #22

75 kD

50 kD

OsCPK13 - 61 kD

Tinción Ponceau

A B

OsCPK13

CargaRNA

D

5’ UTR OsCPK13 CDS 3’ UTR

ATGOsCPK13-Kd

C

Sonda OsCPK13

Resultados

- 68 -

4. Caracterización de OsCPK13 en la respuesta de defensa de la planta de arroz

4.1 Respuesta de OsCPK13 a infección por M. oryzae

Las respuestas de las plantas frente a elicitores fúngicos son aproximaciones

para predecir lo que ocurre frente al reconocimiento del hongo fitopatógeno cuando

inicia el proceso infectivo. Sin embargo, en tal caso, las respuestas de la planta no van

más allá del reconocimiento de los PAMPs y el desencadenamiento de la respuesta PTI.

Las respuestas específicas frente al proceso infectivo, como las respuestas ETI, no

ocurren cuando la planta es expuesta a elicitores. Por lo tanto, el sistema ideal para

observar estas respuestas, es el de la interacción directa de la planta con el agente

patógeno. En este trabajo se caracterizó la respuesta de OsCPK13 frente a la infección

por M. oryzae.

Se realizaron ensayos de infección de plantas de arroz mediante la inoculación

de suspensiones de esporas del aislado Guy11 de M. oryzae y se tomaron muestras de la

parte aérea de esas plantas y de plantas controles no inoculadas. Por análisis Western

blot se analizaron los niveles de acumulación diferencial de la proteína OsCPK13 en

respuesta a infección por M. oryzae, utilizando para la detección un anticuerpo

Figura 17. Fenotipo de las plantas OsCPK13-Ox. Aparición de lesiones necróticas espontáneas en las hojas. A. Apariencia fenotípica de plantas adultas de las líneas OsCPK13-Ox crecidas en tierra en invernadero y bajo condiciones controladas de luz, temperatura y humedad. B. Detalle de las lesiones espontáneas observadas en las hojas viejas de plantas adultas OsCPK13-Ox.

AA B


- 69 -

específico para la región N-terminal de la proteína. Los resultados muestran que

aparentemente esta proteína sufre pocos cambios en su acumulación en respuesta a

infección por este patógeno, excepto a las 24 horas post-infección (Figura 18A). Se

realizó la cuantificación de la intensidad de las bandas específicas para OsCPK13

mediante el programa informático de análisis de imágenes MultiGauge v2.0 y se pudo

constatar una acumulación mayor de OsCPK13 luego de 24 horas de iniciada la infección

por M. oryzae, comparada con las condiciones control (Figura R18B). Estos resultados

podrían indicar que OsCPK13 tiene una respuesta tardía en respuesta a infección por M.

oryzae.

Figura 18. Acumulación de la proteína OsCPK13 en respuesta a infección por M. oryzae. A. Análisis mediante Western blot de cantidades equivalentes de extractos proteicos de fracciones enriquecidas en membrana, obtenidas de la parte aérea (hojas y tallos) de plantas de arroz (Nipponbare) inoculadas con una solución de esporas de M. oryzae Guy11 (105 esporas/ml) (I) o con agua estéril (C). Las muestras fueron tomadas a los diferentes tiempos indicados post-inoculación. Muestras de plantas de la línea sobreexpresoras de OsCPK13 #28 se incluyeron como control positivo. La inmunodetección se realizó con anticuerpos específicos frente a la región N-terminal de OsCPK13 a una dilución 1/1000 y revelado quimoluminiscente. B. Cuantificación de la intensidad de la banda mediante análisis de imágenes utilizando el programa Multi Gauge de Fuji™ v2.0, relativa a la banda de tinción con rojo Ponceau (Rubisco) utilizada como referencia de carga.

75 kD

50 kD

61 kD OsCPK13

OsCPK13-Ox #28C I C I C I C I C I

3 hpi 6 hpi 12 hpi 24 hpi 48 hpi

Tinción Ponceau

A

B

0

1

2

3

4

5

6

3 6 12 24 48

Acum

ulac

ión

rela

tiva

Tiempo (horas post-infección)

OsCPK13

Control

Infectado

Resultados

- 70 -

4.2 Fenotipo de líneas de expresión alterada de OsCPK13 frente a infección

La proteína OsCPK13 se ha visto acumulada en plantas de arroz tratadas con M.

oryzae, y este hecho puede indicar que altos niveles de la misma podrían ser necesarios

para que las plantas puedan defenderse ante el ataque del patógeno. Las plantas de las

líneas de ganancia (OsCPK13-Ox) y pérdida (OsCPK13-Kd) de la función de OsCPK13

representan herramientas idóneas para la caracterización funcional de esta proteína en

la respuesta de defensa de las plantas de arroz. Por ello se decidió analizar el fenotipo

de estas líneas frente a infección por el patógeno de arroz M. oryzae.

Los ensayos de infección se realizaron con plantas enteras crecidas en tierra,

aunque debido a que las líneas OsCPK13-Ox eran hemicigotas, hubo que seleccionarlas

creciéndolas en cultivo in vitro en presencia del antibiótico (higromicina) cuya resistencia

está codificada en el T-DNA durante 7 días y después trasplantarlas a tierra. En paralelo

se cultivaron los controles del vector vacío y las líneas OsCPK13-Kd. Las plantas fueron

inoculadas con el aislado FR13 de M. oryzae incompatible con el cultivar Nipponbare de

arroz. La inoculación se realizó por aspersión de una suspensión de esporas a una

concentración de 105 esp/ml utilizando un aerógrafo a 2 atm de presión, a razón de 10

plantas por línea crecidas en una misma maceta. Las plantas se mantuvieron tras la

inoculación en condiciones controladas de alta temperatura y humedad, y la progresión

de la enfermedad se evaluó visualmente hasta los 7 días. En ese momento se

cuantificaron las lesiones desarrolladas en la penúltima hoja emergida de cada planta

mediante análisis de imágenes utilizando el programa Assess v2.0.

En la Figura 19 se muestran los resultados obtenidos. Se presentan imágenes

representativas de las lesiones desarrolladas en las hojas de las líneas analizadas. Todas

las hojas desarrollan las lesiones típicas del quemado del arroz a diferencia de las hojas

de la variedad resistente-R (O. sativa var. Saber). Estas lesiones son mayores y más

abundantes en las hojas de las plantas OsCPK13-Ox y comparables a las desarrolladas en

la variedad de arroz sensible-S (O. sativa var. Maratelli). Las hojas de las líneas OsCPK13-


- 71 -

Kd en cambio tienen un aspecto bastante similar al de las controles sin transformar

(Nipponbare) o las transformadas con el vector vacío. La cuantificación del área

lesionada mediante análisis de imágenes muestra un incremento significativo en la

incidencia de lesiones en las líneas OsCPK13-Ox, mientras que las líneas OsCPK13-Kd no

difieren significativamente de las controles sin transformar y de las transformadas con el

vector vacío. Estos resultados indican que la sobreexpresión del gen OsCPK13 confiere

una mayor susceptibilidad a la infección por M. oryzae en plantas de arroz. Su

silenciamiento, sin embargo, no tiene efectos visibles en el desarrollo de la infección por

M. oryzae. Tampoco se han visto diferencias visibles en el fenotipo de las líneas

OsCPK13-Kd en respuesta a infección por F. verticillioides ni por la bacteria fitopatógena

D. dadantii comparadas con la variedad silvestre (Figura 20). La ausencia de fenotipo

frente a ataque por patógenos podría ser el reflejo de que a pesar de que las líneas

OsCPK13-Kd son efectivas en la regulación post-transcripcional de OsCPK13, otro

miembro de la amplia familia CPK puede estar supliendo sus funciones ante la falta de la

correspondiente proteína.

4.3 Producción de especies reactivas de oxígeno en las líneas OsCPK13-Ox

Uno de los procesos fisiológicos más importantes en respuesta a agentes

patógenos es la producción de especies reactivas de oxígeno (Reactive oxygen species-

ROS), como son el peróxido de hidrógeno (H2O2) e iones superóxido (O2-) (Perez &

Brown, 2014). Las moléculas ROS pueden ser tóxicas para el patógeno, provocar la

respuesta hipersensible e impedir la propagación del patógeno, así como pueden ser

moléculas señalizadoras de la respuesta de defensa en la planta. Sin embargo, pueden

también causar daño a las células vegetales, especialmente en las membranas (Apel &

Hirt, 2004; Zurbriggen et al., 2010). Puesto que se había observado que las líneas

OsCPK13-Ox desarrollaban lesiones espontáneas en las hojas, similares a la respuesta

hipersensible, y este fenotipo ha sido asociado en la literatura a la alteración de la

Resultados

- 72 -

producción de ROS (Chen et al., 2013b) se analizó la producción de ROS durante la

respuesta de defensa de estas plantas.

Figura 19. Fenotipo frente a infección por M. oryzae de las plantas transgénicas de arroz con expresión alterada de OsCPK13. A. Imágenes representativas de las lesiones causadas por la infección con M. oryzae aislado FR13 en hojas de diferentes líneas OsCPK13-Ox, OsCPK13-Kd, transformadas con el vector vacío (Ev) y controles no transformados (Wt, Nipponbare). Como controles de la infección se incluyó una variedad de arroz resistente R (O. sativa var. Saber) y una susceptible S (O. sativa var. Maratelli). Se muestra siempre la penúltima hoja emergida a los 7 días post-inoculación con una suspensión de esporas a concentración de 105 esporas/ml. B. Promedio del porcentaje del área foliar lesionada debido a la infección por M. oryzae. Cuantificación del área de lesión realizada por análisis de imágenes con el programa informático Assess v2.0., de al menos 10 hojas por línea. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) de al menos 6 réplicas biológicas. Letras diferentes corresponden a una diferencia significativa según análisis de ANOVA (p<0,05). Los datos mostrados son de un ensayo independiente representativo de dos réplicas experimentales.

LLíneas OsCPK13-OxLíneas Control

Líneas OsCPK13-Kd

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Porc

enta

je d

e ár

ea le

siona

da

Incidencia de lesiones a

abb

b b

c

A

B

#6

#24

#28

#1

Wt

Ev

R

S

#22

#4

#8


- 73 -

Para ello se realizó un ensayo de visualización de la producción de ROS en

respuesta al tratamiento con elicitores de M. oryzae, basado en el marcaje fluorescente

de las moléculas ROS con el compuesto marcador CM-H2DCFDA (Plancot et al., 2013). El

marcaje se hizo con hojas de plantas de 21 días infiltradas con una solución de CM-

H2DCFDA y tratadas con elicitores de M. oryzae a una concentración de 300 μg/ml o

con agua estéril como control durante 30 minutos. Los resultados obtenidos se

muestran en la Figura 21A, donde se observa que las hojas de las de las líneas OsCPK13-

Ox muestran una intensa fluorescencia en condiciones controles, antes del tratamiento

con elicitores, a diferencia de las líneas transformadas con el vector vacío y las no

WWt

OsCPK13-Kd #4

A

OsCPK13-Kd #8

OsCPK13-Kd #22

Fusarium verticillioides B Dickeya dadantii

Wt

OsCPK13-Kd #4

OsCPK13-Kd #8

OsCPK13-Kd #22

Wt OsCPK13-Kd #4

OsCPK13-Kd #8 OsCPK13-Kd #22

Figura 20. Fenotipo de las plantas transgénicas de arroz OsCPK13-Kd frente a infección por F. verticillioides y D. dadantii. A. Imágenes representativas de la infección causada por F. verticillioides en semillas de diferentes líneas OsCPK13-Kd y controles no transformados (Wt, Nipponbare). Las semillas fueron infectadas in vitro y mantenidas en condiciones de alta humedad y temperatura. Las imágenes fueron tomadas después de 7 días de la inoculación de cada semilla con 50 μl de una suspensión de esporas a concentración de 104 esporas/ml. B. Plantas de diferentes líneas OsCPK13-Kd y líneas controles no transformadas crecidas durante 7 días después de que las semillas hayan sido inoculadas in vitro con 50 μl de una suspensión de células de D. dadantii

aislado AC4150 a una concentración de 104 CFU/ml. Resultados de un único experimento.

Resultados

- 74 -

transformadas. Estas últimas muestran un claro aumento de la fluorescencia tras el

tratamiento con elicitores, sin llegar a fluorescer tan intensamente como las líneas

OsCPK13-Ox. Estos resultados indican que la producción de ROS está alterada en las

plantas que acumulan más proteína OsCPK13.

Se realizó además un ensayo específico para visualizar los radicales superóxido

en respuesta infección con M. oryzae. En este ensayo la tinción ROS se realizó con NBT

(Nitro blue tetrazolium) que forma un precipitado violáceo. El ensayo se realizó

igualmente en hojas de plantas de 21 días crecidas en tierra, pero en este caso la

infección se realizó localmente con esporas de M. oryzae aislado Guy11 (105 esp/ml) en

hojas cortadas que se mantuvieron en medio MS al 100% de humedad para favorecer la

infección. Como control se usaron plantas tratadas con agua estéril y mantenidas en las

mismas condiciones. Los resultados se muestran en la Figura 21B. Igualmente a lo

observado con la sonda fluorescente, se detectó tinción con NBT en las hojas OsCPK13-

Ox en condiciones no infectadas, pero no en las líneas controles de la variedad silvestre

o transformada con el vector vacío. En estos controles se observa la tinción en las hojas

infectadas. La infección con esporas de M. oryzae supone un incremento en la

producción de O2- en todas las líneas, las cuales tienen niveles similares de tinción.

La gráfica de la Figura 21C muestra la cuantificación del área de tinción con NBT

en las hojas, y se puede ver que la sobreexpresión de OsCPK13 otorga una producción

significativamente superior de O2- en condiciones basales sin infectar, mientras que la

infección supone un incremento de la detección de esta molécula ROS en todas las

líneas, llegando a contenidos similares.


- 75 -

Figura 21. Producción de ROS en las hojas OsCPK13-Ox durante la respuesta de defensa a M. oryzae. A. Imágenes de microscopía de fluorescencia de hojas de plantas de 21 días de diferentes líneas de sobreexpresión de OsCPK13 (OsCPK13-Ox) y controles (Wt y Ev), infiltradas con una solución de CM-H2DCFDA (10 μM), y tratadas con agua estéril (Control) o con una solución de elicitores de M. oryzae a una concentración de 300 μg/ml, 30 minutos después de tratamiento. Las barras de escala corresponden a 200 μm. B. Imágenes de campo claro tomadas con lupa estereoscópica de hojas de las mismas plantas que en A pero inoculadas localmente con discos de papel embebidos en agua estéril (Control) o en una solución de esporas de M. oryzae (aislado Guy11, 105 esp/ml) a las 72 horas post inoculación. Los resultados son representativos de al menos 3 réplicas biológicas. Las barras de escala corresponden a 5 mm. C. Porcentaje del área foliar con producción de iones superóxido (O2

-) detectado en el análisis histoquímico por NBT en (B) en tejido foliar de las líneas OsCPK13-Ox y las líneas control silvestre (Wt) y del vector vacío (Wt) infectados o sin infectar. Cuantificación realizada mediante el programa informático de análisis de imágenes Assess v2.0 de 3 líneas OsCPK13-Ox y al menos 3 hojas por línea. Las barras de erros corresponden al error estándar de la media (SEM) de al menos 3 réplicas biológicas. El asterisco indica diferencias significativas con las líneas controles según análisis de ANOVA (*p<0,05).

Cont

rol

Elici

tore

sWWt OsCPK13-Ox #24 OsCPK13-Ox #28EvA

B

Control

10^5 esp/ml

Wt OsCPK13-Ox #24 OsCPK13-Ox #28Ev

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Wt Ev OsCPK13-Ox Wt Ev OsCPK13-Ox

Control Infección

PPorc

enta

je d

el á

rea

folia

r en

dete

cció

n N

BT Producción de O2-

*

C

Resultados

- 76 -

Se cuantificó la expresión de la peroxidasa OsPOX22.3, la cual ha sido descrita

como implicada en la respuesta de defensa ante patógenos (Gómez-Ariza et al., 2007) y

además se sabe que estas enzimas están relacionadas con la detoxificación de H2O2 en

la célula. Por qRT-PCR se analizó la expresión de OsPOX22.3 en hojas jóvenes de plantas

de las líneas estudiadas, crecidas durante 90 días en condiciones de invernadero. Se ha

encontrado que los tránscritos de OsPOX22.3 se acumulan a niveles más altos en las

líneas OsCPK13-Ox, con valores significativamente diferentes respecto a los cuantificados

en las líneas control Wt y Ev (Figura 22). Los altos niveles de expresión de este gen

podrían ser debidos a la necesidad de detoxificar la acumulación excesiva de H2O2.

Los resultados referentes a la producción de ROS en las líneas OsCPK13-Ox

sugieren que estas plantas tienen un desbalance en la acumulación de especies reactivas

de oxígeno, y que esta característica fenotípica podría influir en el fenotipo que

presentan estas líneas frente a M. oryzae.

4.4 Análisis de expresión de genes relacionados con defensa en líneas OsCPK13-Ox

Nuestros resultados indican que la sobreexpresión de OsCPK13 aumenta la

susceptibilidad frente a la infección por M. oryzae, por lo que se propuso analizar si la

Figura 22. Expresión del gen de la peroxidasa OsPOX22.3 en las líneas OsCPK13-Ox. Análisis de expresión mediante qRT-PCR del gen OsPOX22.3 (LOC_Os07g01370) en hojas de líneas OsCPK13-Ox (3 líneas independientes), líneas transformadas con vector vacío (Ev, 2 líneas independientes) y plantas no transformadas (Wt) relativo al gen OsUbi1 (LOC_Os06g46770) de arroz. Las muestras se tomaron a partir de al menos 3 plantas por línea crecidas en tierra durante 90 días en condiciones controladas de luz, temperatura y humedad. Los resultados son representativos de dos ensayos independientes. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. El asterisco indica que existen diferencias significativas según análisis de ANOVA (*p<0,05).

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

Expr

esió

n re

lativ

a

OsPOX22.3

*


- 77 -

acumulación incrementada de esta CPK influye en las respuestas de defensa de la planta

de arroz. Para ello se analizó la expresión de genes implicados en distintas rutas de

señalización de defensa en las líneas OsCPK13-Ox infectadas con M. oryzae.

Las plantas de líneas OsCPK13-Ox y controles se inocularon mediante aspersión

con una suspensión de esporas de esporas del aislado incompatible Guy11 de M. oryzae

y se tomaron muestras de la parte aérea de las plantas a diferentes tiempos después de

la inoculación. En esta cinética de infección, se han cuantificado por qRT-PCR los niveles

de expresión transcripcional de genes relacionados con las rutas de señalización por

ácido salicílico (SA), etileno (ET) y ácido jasmónico (JA). Se analizó la cinética de

expresión de OsPR1a (Pathogenesis-related 1a), marcador de la activación de respuestas

de defensa ante la infección por patógenos, producto de la señalización mediada por

SA; OsPR5 (Pathogenesis-related 5), una thaumatina relacionada con patogénesis;

OsJAmyb (JA-related MYB transcription factor) factor de transcripción relacionado con la

vía de señalización mediada por JA y OsEREBP (Ethylene responsive element binding

protein), un factor de transcripción de respuesta a ET (Campos-Soriano et al., 2012).

Como se presenta en la Figura 23, todos los genes analizados mostraron

inducción en respuesta a la infección por M. oryzae, principalmente a las 12 horas de

iniciada la inoculación, tanto en las líneas control como en las sobreexpresoras de

OsCPK13. Sin embargo, no se han encontrado diferencias de expresión entre las líneas

OsCPK13-Ox y los controles del vector vacío o sin transformar (Ev y Wt). Estos resultados

indican, al menos en lo que respecta a los genes marcadores analizados y en las

condiciones experimentales utilizadas de este trabajo, que el fenotipo de susceptibilidad

observado en las líneas OsCPK13-Ox no se debe a una alteración de las vías de

señalización por SA, JA o ET. No obstante, para comprobar que estas vías no están

alteradas, quizás deberían llevarse a cabo análisis de otros marcadores de las rutas,

incluso en otras condiciones de infección u estado fisiológico de las plantas.

Resultados

- 78 -

5. Caracterización de OsCPK13 en respuesta a fertilización fosfatada

Se conoce que la proteína OsCPK13 está implicada en la respuesta a varios tipos

de estreses, principalmente abióticos (salinidad, sequía, frío) y en esta tesis se ha

establecido su implicancia en respuestas a estrés biótico. Además de la versatilidad

funcional de OsCPK13 en la planta de arroz, el hecho de que esta proteína se haya

Figura 23. Análisis de la expresión de genes relacionados con defensa en respuesta a infección por M. oryzae en líneas de sobreexpresión de OsCPK13. Cinética de la expresión de genes relacionados con defensa en la parte aérea de plantas de 21 días crecidas en tierra e inoculadas por aspersión con esporas de M. oryzae Guy11 (105 esporas/ml). El análisis de expresión se realizó mediante qRT-PCR de los genes OsPR1a (LOC_Os07g03710), OsPR5 (LOC_Os03g46070), OsJAmyb (LOC_Os11g45740) y OsEREBP (LOC_Os09g26420) tomando como gen de referencia el gen OsUbi1 (LOC_Os06g46770). Las barras de error representan la desviación estándar (SD). Cada muestra corresponde a un grupo al menos 3 plantas de líneas controles (Wt y una línea Ev) y OsCPK13-Ox (3 líneas independientes, líneas #18, #24 y #28) tomadas a los diferentes tiempos indicados luego de realizar la inoculación.

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

0 6 12 24

OsEREBP

Ctrl OExOsCPK13

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

0 6 12 24

OsPR5

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

0 6 12 24

OsJAmyb

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

0,450

0 6 12 24

OsPR1aEx

pres

ión

rela

tiva

Expr

esió

n re

lativ

a

Tiempo (horas post-infección) Tiempo (horas post-infección)OsCPK13-Ox


- 79 -

encontrado localizada muy específicamente en tejidos de los haces vasculares en raíces

y a nivel subcelular en membrana plasmática, ha puesto en consideración que podría

tener también implicaciones en transporte de nutrientes o en vías de señalización

relacionadas.

Plantas adultas de las líneas OsCPK13-Ox a menudo presentaban lesiones de

quemaduras en las hojas o “lesion mimic”, a diferencia de plantas silvestres o líneas del

vector vacío. Estos síntomas fueron evaluados y los mismos no se debían a infección por

patógenos ni estaban relacionados con respuestas a condiciones de luz. Sin embargo, se

podían corresponder a deficiencia o toxicidad por exceso de algún nutriente, entre ellos

el fósforo. Además, en este trabajo se ha visto que la actividad β-glucuronidasa guiada

por el promotor de OsCPK13 está localizada principalmente en tejidos foliares de nueva

formación, lo cual se corresponde con la característica móvil de este nutriente. Las

plantas son capaces de translocar el fósforo desde tejidos antiguos a los nuevos

conforme avanza el estado fisiológico (Mahler, 2004). Estos datos proporcionaron ciertas

pistas sobre la implicancia de esta proteína en la homeostasis de fosfatos en la planta.

Se realizaron entonces estudios de OsCPK13 y su relación con la fertilización fosfatada,

según los objetivos propuestos en este trabajo de tesis.

5.1 Respuesta de OsCPK13 a diferentes condiciones de fertilización fosfatada

Como primera aproximación para establecer la relación de este gen con la

respuesta a fosfatos, se ha evaluado la expresión transcripcional de OsCPK13 bajo

diferentes condiciones de fertilización fosfatada. Para esto, se crecieron plantas silvestres

de arroz durante 30 días en medio hidropónico nutritivo Yoshida para arroz en

condiciones controladas de luz, temperatura y humedad. Se aplicaron tres diferentes

condiciones de fosfatos en el medio: suficiencia (condiciones normales del medio

Yoshida), deficiencia (10% de las fuentes de fosfato suficientes) y exceso (10X de

fosfatos). Se extrajeron muestras de raíces para la síntesis de cDNA a partir de la

población de mRNAs y se cuantificó la expresión transcripcional de OsCPK13 por qRT-

Resultados

- 80 -

PCR. Los resultados obtenidos dan cuenta que los niveles de acumulación

transcripcional fueron generalmente más altos en condiciones de fosfatos excesivos,

comparados con las condiciones normales de suficiencia del nutriente (Figura 24). La

expresión de OsCPK13 se vio inducida en condiciones de exceso de fosfatos en la

mayoría de ensayos realizados. Sin embargo, es necesario mencionar que en ciertas

ocasiones se ha visto inducción también en condiciones de deficiencia del nutriente. Esta

situación podría ser un reflejo de la implicancia de OsCPK13 en la regulación fina de la

homeostasis de fosfatos, tanto en deficiencia como en exceso, y no cuando la planta

crece en condiciones normales de contenido del mineral. Estos resultados indican que la

proteína OsCPK13 podría cumplir un papel en la respuesta de las plantas de arroz a la

fertilización fosfatada.

5.2 Fenotipo radicular de líneas de sobreexpresión de OsCPK13

El contenido de fosfatos disponible en el medio de crecimiento de las plantas

influye en la arquitectura radicular que estas desarrollan en respuesta a esa condición.

Así, en condiciones de deficiencia de fosfatos las plantas amplían el área de búsqueda

Figura 24. Expresión de OsCPK13 en diferentes condiciones de fertilización fosfatada. Expresión de OsCPK13 (LOC_Os04g49510) en raíces de plantas silvestres de arroz (O. sativa var. Nipponbare) crecidas en diferentes condiciones de fosfatos. La cuantificación se realizó por qRT-PCR utilizando el gen OsUbi1 (LOC_Os06g46770) como referencia. Se muestran los valores medios de 3 réplicas técnicas y las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Las muestras corresponden a plantas de 30 días crecidas en cultivo hidropónico en condiciones controladas de luz, temperatura y humedad. P deficiente: solo un 10% de contenido normal de fosfatos; P suficiente: condiciones normales de contenido de fosfatos, medio Yoshida; P excesivo: 10X de contenido normal de fosfatos. Cada muestra corresponde a un grupo de raíces de al menos 3 plantas. Los resultados son representativos de tres ensayos independientes. Los asteriscos indican diferencias significativas por análisis de ANOVA (**p<0,01).

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

P deficiente P suficiente P excesivo

Expr

esió

n re

lativ

a

OsCPK13 **


- 81 -

del nutriente en el suelo en tres dimensiones mediante la exploración de mayor

profundidad en el suelo (alargamiento de la raíz principal) y de áreas colindantes a la

raíz principal (aumento del número de raíces secundarias). Esto último ayuda además a

aumentar el área de absorción, lo que incrementa las probabilidades de tomar del suelo

el nutriente escaso (Niu et al., 2013; Ticconi & Abel, 2004). Se propuso entonces analizar

el fenotipo radicular de las líneas de sobreexpresión de OsCPK13 e intentar relacionarlo

con una posible alteración en la homeostasis de fosfatos de esas líneas.

Para evaluar el fenotipo de las raíces, se crecieron plantas de líneas OsCPK13-Ox

y líneas control silvestre y del vector vacío durante 7 días en condiciones normales de

contenido de fosfatos sobre medio MS sólido, manteniendo controladas la esterilidad,

luz y temperatura. Luego de este tiempo, se cuantificaron las raíces secundarias y se

midió la longitud de la raíz principal de cada planta. En el análisis fenotípico se encontró

que las líneas sobreexpresoras de OsCPK13 eran visiblemente más cortas que las líneas

control (Figura 25A), lo que se correspondía con los datos cuantitativos de la longitud de

la raíz principal, observándose diferencias significativas entre las líneas OsCPK13-Ox y la

variedad silvestre y líneas del vector vacío (Figura 25B). Además, las plantas de las líneas

sobreexpresoras de OsCPK13 desarrollan significativamente más raíces secundarias que

las líneas controles (Wt y Ev) (Figura 25C).

Los resultados revelan que las líneas OsCPK13-Ox tienen un desarrollo radicular

que mimetiza al que presentan las plantas frente a deficiencia de fosfatos en el medio.

Creciendo en condiciones normales y suficientes de fosfatos, estas plantas desarrollan

un mayor número de raíces secundarias. Sin embargo, la raíz principal en plantas

sobreexpresoras de OsCPK13 es más corta que en las plantas silvestres. Según estos

resultados, se podría inferir que las raíces de las plantas OsCPK13-Ox son incapaces de

detectar de manera efectiva la situación de la fertilización fosfatada en el medio.

Resultados

- 82 -

5.3 Caracterización fenotípica de líneas de sobreexpresión de OsCPK13 en diferentes condiciones de fertilización fosfatada

Anteriormente se había mencionado que las plantas adultas de las líneas

OsCPK13-Ox a menudo desarrollaban lesiones espontáneas en las hojas y que las

mismas no eran debidas a infección por patógenos, sino más bien recordaba a síntomas

Figura 25. Fenotipo radicular de líneas de sobreexpresión de OsCPK13. A. Imágenes representativas de la apariencia de raíces de plantas silvestres (Wt), del vector vacío (Ev) y de líneas sobreexpresoras de OsCPK13 (OsCPK13-Ox) crecidas en condiciones normales. B. Longitud promedio de la raíz principal de las plantas. C. Número promedio de raíces secundarias. Los gráficos representan los promedios de mediciones de 3 réplicas biológicas y 6 líneas independientes de OsCPK13-Ox. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Los asteriscos indican diferencias significativas por análisis de ANOVA (**p<0,01). Las plantas se crecieron durante 7 días en medio MS sólido en condiciones controladas de luz y temperatura. Los resultados son representativos de dos ensayos independientes.

WWt OsCPK13-OxEv

A

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Long

itud

(cm

)

Raíz principal

0

1

2

3

4

5

6

Núm

ero

de ra

íces s

ecun

daria

s por

pla

nta

Raíces secundariasB

**

**C

OsCPK13-Ox OsCPK13-OxWt EvWt Ev


- 83 -

por toxicidad de algún nutriente. Tampoco se habían podido obtener líneas

homocigotas, por lo que se podría decir que la acumulación excesiva de la proteína

OsCPK13 en plantas de arroz conlleva severos efectos en el desarrollo.

Para investigar si se trataba de un problema de toxicidad de algún nutriente, y

dado que ciertos indicios apuntaban al fosfato, se evaluó el crecimiento de las plantas

OsCPK13-Ox en condiciones de suficiencia y deficiencia de fosfato. Las plantas de las

líneas OsCPK13-Ox y las control silvestre y vector vacío, se crecieron durante 120 días en

tierra en condiciones controladas de luz, temperatura y humedad, bajo condiciones

normales de fertilización fosfatada. Estas condiciones corresponden a suficiencia de

fosfatos en el medio, conteniendo el sustrato un abono de liberación lenta y una

fertirrigación nutritiva. Las plantas OsCPK13-Ox así crecidas desarrollaron lesiones

necróticas en las hojas y mostraron menor crecimiento en comparación con las líneas

controles (Figura 26A). En cambio cuando las plantas se cultivaron en condiciones de

baja fertilización fosfatada, que corresponde al sustrato con abono de liberación lenta y

a la fertirrigación nutritiva desprovista de fuente fosfatada, se observó que las líneas

OsCPK13-Ox ya no desarrollan lesiones espontáneas y muestran un crecimiento

comparable al de las líneas control (Figura 26B).

En paralelo se analizaron otros parámetros fisiológicos como indicadores del

crecimiento durante la fase vegetativa, tales como el número de hojas e hijuelos, así

como la producción de panículas y semillas como indicadores de la fase reproductiva.

Los resultados dan cuenta de que la sobreexpresión de OsCPK13 tiene fuerte incidencia

en el desarrollo y fisiología de la planta tanto en la fase vegetativa como en la

reproductiva, provocando una disminución significativa en la producción de hojas,

hijuelos, panículas y semillas bajo condiciones suficientes de fertilización fosfatada, en

comparación con los controles de las líneas Wt y Ev (Figura 27A). Estos resultados

tomados en conjunto sugieren que las plantas sobreexpresoras de OsCPK13 presentan

toxicidad debida al fosfato, y que son sensibles a una concentración normal de este

Resultados

- 84 -

nutriente en el medio. Se podría decir que para estas plantas es suficiente una baja

fertilización fosfatada para su crecimiento normal y sin efectos tóxicos que influyan en su

desarrollo.

Figura 26. Fenotipo de líneas OsCPK13-Ox crecidas en diferentes condiciones de fertilización fosfatada. Apariencia de plantas de arroz de 120 días de líneas sobreexpresoras de OsCPK13 (OsCPK13-Ox) comparadas con líneas transformadas con el vector vacío (Ev) y sin transformar (Wt) crecidas en invernaderos en condiciones controladas de luz, humedad y temperatura y bajo fertilización normal suficiente de fosfatos (A) y en condiciones de baja fertilización de fosfatos (B). Detalle mostrando las lesiones espontaneas desarrolladas en las hojas de las plantas OsCPK13-Ox. El fenotipo observado es representativo de dos experimentos independientes.

OOsCPK13-Ox Ev Wt

OsCPK13-Ox Ev Wt

B

A


- 85 -

El efecto de la toxicidad del fosfato fue mucho más notorio al observar el

crecimiento de las plantas OsCPK13-Ox en condiciones de deficiencia comparadas con

las condiciones de suficiencia de fosfatos, siendo esta última condición un contenido

excesivo del nutriente para estas plantas (Figura 27B). En esas condiciones se vio

AA

0

20

40

60

80

100

120

140

P deficienteP suficiente

NNúm

ero

de se

milla

s por

pla

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Semillas OsCPK13-OOx

0

1

2

3

4

5


NNúm

ero

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lant

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0

1

2

3

4

5


NNúm

ero

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lant

a

Panículas OsCPK13-Ox

B

*

*0

1

2

3

4

5

6

7


NNúm

ero

de h

ojas

por

pla

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Hojas OsCPK13-Ox

0

50

100

150

200

250

300

Núm

ero

de se

milla

s por

pla

nta

SSemillas

*

0

1

2

3

4

5

6

7

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9N

úmer

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hoj

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or p

lant

aHojas

*

OsCPK13-OxCtrl0

1

2

3

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Núm

ero

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ijuel

os p

or p

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a

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0

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6

Núm

ero

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anícu

las p

or p

lant

a

Panículas

*

*

OsCPK13-OxCtrl OsCPK13-OxCtrl OsCPK13-OxCtrl

Figura 27. Efectos fisiológicos causados por diferentes condiciones de fertilización fosfatada en líneas de sobreexpresión de OsCPK13. A. Promedio del número de hojas, hijuelos, de panículas y semillas de las líneas OsCPK13-Ox en comparación con líneas control (Ctrl), que agrupa a las líneas transformadas con el vector vacío (Ev) y las líneas silvestres (Wt), en condiciones de suficiencia de fosfato (fertilización fosfatada normal). Se monitorizaron al menos 3 plantas de 7 líneas independientes OsCPK13-Ox y 2 líneas Ev. B. Promedio del número de hojas, hijuelos, panículas y semillas de las líneas OsCPK13-Ox en diferentes condiciones de fertilización fosfatada. P suficiente: abono de liberación lenta en el sustrato + fertirrigación normal; P deficiente: abono de liberación lenta en el sustrato + fertirrigación desprovista de fuentes de fosfatos. Las barras de error corresponden al error estándar de la media (SEM). Los asteriscos indican diferencias significativas por análisis de ANOVA (*p<0,05).

Resultados

- 86 -

severamente afectada la producción de panículas y semillas (indicadores reproductivos)

en comparación con las deficientes de fosfatos, demostrando que la sobreexpresión de

OsCPK13-Ox provoca cambios fisiológicos en la planta de arroz relacionados con una

menor tolerancia al contenido de fosfato en el medio.

5.4 Acumulación de fósforo en líneas de sobreexpresión de OsCPK13

El fenotipo de toxicidad de fosfato en las líneas OsCPK13-Ox nos llevó a analizar

el contenido en fosfatos de estas plantas. Este se analizó en hojas nuevas y raíces de

plantas de varias líneas OsCPK13-Ox y de la variedad silvestre (Nipponbare), crecidas en

tierra en condiciones controladas de invernadero durante 120 días, bajo dos condiciones

de fertilización fosfatada: deficiencia y suficiencia de fosfatos. Los resultados se muestran

en la Figura 28. No se observan diferencias significativas en el contenido de P en raíces

entre las líneas OsCPK13-Ox y los controles, pero sí se ve un claro aumento en el

contenido cuando las plantas se crecen en suficiencia de fosfato (Figura 28A). En hojas

se observa un incremento significativo del contenido de fósforo en condiciones de

suficiencia de fosfatos en las líneas OsCPK13-Ox en comparación las líneas controles no

transformadas. Este contenido de fosfatos en el medio de crecimiento es excesivo para

las plantas OsCPK13-Ox. Los valores del contenido de este mineral llegan hasta una

concentración de 2,5% de P en tejidos foliares, cuando los niveles normales están entre 1

y 1,5% (Figura 28B). La acumulación excesiva de fósforo en las hojas podría tener un

efecto tóxico y ser determinante en los defectos fisiológicos que presentan las plantas

OsCPK13-Ox. Esto podría indicar que las plantas OsCPK13-Ox tienen alterada la

absorción y la translocación del nutriente a la parte aérea de la planta, favorecida por el

mayor desarrollo radicular.


- 87 -

5.5 Expresión de genes relacionados con la homeostasis de fosfatos en las líneas

OsCPK13-Ox

Para evaluar si existen alteraciones en la ruta de señalización por fosfatos en las

líneas OsCPK13-Ox, se realizó la cuantificación de los niveles de expresión transcripcional

de algunos de los genes relacionados con la homeostasis de fosfatos en plantas de

arroz.

Estos estudios de expresión génica se realizaron con plantas en el mismo estadío

de desarrollo y cultivadas en las mismas condiciones en las que se determinó el

contenido de fósforo. Los genes estudiados y cuantificados por qRT-PCR fueron dos

Figura 28. Acumulación de P en las líneas de sobreexpresión de OsCPK13. Contenido de P en raíces (A) y en hojas (B) de plantas de las líneas de sobreexpresión de OsCPK13 (OsCPK13-Ox) comparado con la variedad silvestre no transformada (O. sativa var. Nipponbare, Wt) condiciones de fertilización fosfatada deficientes (abono de liberación lenta + fertirrigación desprovista de fuentes de fosfatos) y en suficiencia de fosfatos (abono de liberación lenta + fertirrigación normal). El contenido de P se determinó en raíces y hojas de plantas de 120 días crecidas en tierra en condiciones controladas de luz, temperatura y humedad. Los valores corresponden al promedio de al menos 3 plantas Wt y de 3 plantas de 3 líneas independientes OsCPK13-Ox. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). El asterisco indica diferencias significativas según análisis de ANOVA (*p<0,05). Los resultados son correspondientes a un ensayo experimental representativo de dos réplicas independientes.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

Wt OsCPK13-Ox Wt OsCPK13-Ox

P deficiente P suficiente

mg

P/10

0 m

g PS

Contenido de P en raíces

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Wt OsCPK13-Ox Wt OsCPK13-Ox

P deficiente P suficiente

Contenido de P en hojas*

A B

Resultados

- 88 -

factores de transcripción (OsPHR1 y OsPHR2), dos transportadores de fosfatos (OsPT2 y

OsPT6), una E3 ubiquitina-ligasa (OsPHO2) y una fosfatasa (OsPAP10), los cuales

muestran cambios de expresión génica en respuesta a la disponibilidad de fosfatos en el

medio de cultivo. Los resultados obtenidos en este análisis se recogen en la figura 29.

Los niveles de expresión de los factores de transcripción no se encuentran alterados en

las plantas OsCPK13-Ox, con lo que se podría inferir que si OsCPK13 tuviera una función

en esta ruta, sería por debajo de la señalización por OsPHR1 y OsPHR2. El gen OsPHO2

tiene una acumulación transcripcional significativamente mayor en OsCPK13-Ox en

relación con la variedad silvestre. La proteína OsPHO2 es una E3 ubiquitina-ligasa que

reprime la acumulación del transportador OsPT2, uno de los responsables de la

translocación del fosfato desde las raíces a la parte aérea de la planta (Ai et al., 2009). En

las líneas de sobreexpresión de OsCPK13, sin embargo, se ha visto que la expresión de

OsPT2 también se encuentra inducida.

Según estos resultados se puede inferir que la inducción de OsPHO2 podría

deberse a un mecanismo de autorregulación, en el intento de disminuir los niveles de

acumulación del transportador. Tampoco deberían descartarse otros mecanismos de

regulación que influyan sobre OsPHO2 en estas líneas, por lo que se sugieren trabajos

posteriores sobre la implicancia de esta CPK en la ruta de señalización por fosfatos. A

partir de estos resultados se podría deducir que OsCPK13 cumple sus funciones en la

cascada de señalización de fosfatos por encima de OsPT2, regulando su expresión

positivamente. No se observaron diferencias en las líneas OsCPK13-Ox en comparación

con la línea control, en la expresión del transportador OsPT6, que ha sido descrito como

uno de los responsables de la absorción de fosfatos en las raíces (Ai et al., 2009). Así

también se ha visto que el gen de la fosfatasa OsPAP10 se expresa a niveles

significativamente más bajos en las líneas de sobreexpresión de OsCPK13 comparadas

con la línea silvestre. Las fosfatasas son enzimas que hidrolizan y liberan grupos fosfatos

a partir de moléculas orgánicas y los hacen disponibles para su reutilización nutritiva en


- 89 -

la célula, por lo que normalmente se inducen en respuestas por falta de fosfatos en el

medio (Panigrahy et al., 2009). Posiblemente la baja acumulación de esta enzima es

consecuencia del contenido excesivo de fosfatos en las plantas. Las líneas OsCPK13-Ox

tienen alterados ciertos procesos fisiológicos y moleculares relacionados con la

homeostasis de fosfatos, como son el transporte (OsPT2), la ubiquitinación de proteínas

(OsPHO2) y la reutilización de fosfatos (OsPAP10), por lo que OsCPK13 podría cumplir

funciones en esa ruta de señalización.

Figura 29. Expresión de genes relacionados con la homeostasis de fosfato en líneas de sobreexpresión de OsCPK13. Análisis de expresión génica mediante qRT-PCR en raíces de 3 plantas de 120 días de líneas OsCPK13-Ox (al menos 3 líneas independientes) y de al menos 3 plantas silvestres Nipponbare (Wt) crecidas en condiciones controladas de luz, temperatura y humedad y con suficiente fertilización fosfatada. Los genes analizados fueron los de los factores de transcripción OsPHR1 (LOC_Os03g21240) y OsPHR2 (LOC_Os07g25710); de los transportadores de fosfato OsPT2 (LOC_Os03g05640) y OsPT6 (LOC_Os08g45000); de la ubiquitina-ligasa OsPHO2 (LOC_Os05g48390); y de la fosfatasa OsPAP10 (LOC_Os01g56880). La expresión del gen OsUbi1 (LOC_Os06g46770) fue utilizada como referencia. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Asteriscos indican diferencias significativas según análisis de ANOVA (*p<0,05).

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

OsPHR1 OsPHR2 OsPHO2 OsPT2 OsPT6 OsPAP10

Expr

esió

n re

lativ

a

Wt

OExOsCPK13

*

*

*

OsCPK13-Ox

Resultados

- 90 -

5.6 Expresión de OsCPK13 en líneas alteradas en la ruta de homeostasis de fosfatos

Con el fin de intentar elucidar el sitio que ocupa la proteína OsCPK13 en la

cascada de señalización de la ruta del fosfato, se ha pensado analizar la expresión de

este gen en ciertas líneas de arroz que tienen alterada esta ruta en puntos específicos.

Para este propósito se contaba con líneas sobreexpresoras de miRNAs que han

sido descritos como reguladores post-transcripcionales de dos componentes

importantes de la ruta. El miRNA osa-miR399 regula negativamente a OsPHO2 y osa-

miR827 tiene como diana de corte al tránscrito de OsSPX1 (Hu et al., 2011; Lin et al.,

2010). Se propuso entonces analizar si en alguna de estas líneas sobreexpresoras (osa-

MIR399-Ox y osa-MIR827-Ox) se observaban alteraciones en la expresión de OsCPK13 e

intentar relacionar los cambios con su ubicación reguladora por debajo de estos

componentes en la cascada de señalización.

En raíces de plantas adultas de las líneas osa-MIR399-Ox y osa-MIR827-Ox se

evaluó la expresión transcripcional de OsCPK13 en comparación con sus respectivas

variedades silvestres. No se encontraron diferencias significativas en la expresión de este

gen en ninguna de las líneas sobreexpresoras de estos miRNAs comparadas con su

respectivo control silvestre (Figura 30).

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en relación a OsCPK13 y su posible

rol en la ruta de señalización de fosfatos, se podría decir que esta proteína cumple una

función en esta vía y que se encuentra por encima del transportador de fosfatos de

translocación a parte aérea OsPT2. La sobreexpresión de los miRNAs osa-miR399 y osa-

miR827 no tiene incidencia en la expresión de OsCPK13, lo que sugiere que podría ser

parte de la cascada de señalización por encima de estos reguladores. La función

específica que cumple la proteína OsCPK13 está por definir, por lo que deberían llevarse

a cabo más estudios con el fin de caracterizarla en la ruta de señalización de fosfatos. Se


- 91 -

han realizado además análisis de interacción proteína-proteína entre OsCPK13 y OsPT2,

sin lograr obtener resultados concluyentes.

Figura 30. Expresión de OsCPK13 en líneas alteradas en la ruta de homeostasis de fosfatos. Expresión de OsCPK13 en raíces de plantas de 120 días de líneas de sobreexpresión de los miRNAs cuyas dianas son genes relacionados con fosfatos osa-miR399 (osa-miR399-Ox) y osa-miR827 (osa-miR827-Ox) comparadas con líneas control de las variedades silvestres O. sativa var. Tainung67 (fondo genético de osa-miR399-Ox) y var. Nipponbare (fondo genético de osa-miR827-Ox) crecidas en condiciones normales y controladas de luz, temperatura y humedad. Cuantificación realizada por RT-PCR en tiempo real cuantitativa. La expresión del gen OsUbi1 (LOC_Os06g46770) fue utilizada como referencia. Las barras de error representan la desviación estándar (SD). Los valores corresponden al promedio de 3 diferentes líneas independientes. Resultados de un único experimento.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35W

t

osa-

MIR

399-

Ox

Wt

osa-

MIR

827-

Ox

Expr

esió

n re

lativ

a

OsCPK13

Resultados

- 92 -


- 93 -

DDiscusión

En el primer capítulo de este trabajo se ha caracterizado la proteína OsCPK13 y su

funcionalidad en las respuestas de defensa de las plantas de arroz y frente a la fertilización

fosfatada. Nuestros estudios confirman que esta isoforma de la familia CPK de arroz,

participa funcionalmente en varias cascadas de señalización, además de la ya descrita en

respuesta a estreses abióticos, salinidad, sequía y frío (Saijo, et al., 2000); modula el

mantenimiento de la homeostasis de fosfatos y la respuesta inmune frente al patógeno

de arroz M. oryzae. Estos resultados sugieren que a pesar de que se había propuesto una

diversificación de las proteínas CPKs que explicara la complejidad de esta familia

multigénica de tal manera que cada isoforma mediase una señal (Harmon et al., 2000),

parece ser que algunas CPKs podrían participar en varias cascadas de señalización a la

vez. Según los resultados, podría ser que OsCPK13 medie en la interacción de la

señalización a varios estreses abióticos y bióticos para orquestar la respuesta apropiada

para la planta, lo que resulta interesante teniendo en cuenta que la planta se ve

normalmente sometida a varios estreses de manera simultánea.

Estudio de la función de OsCPK13 mediante aproximaciones de ganancia y

pérdida de la función

Para caracterizar la función del gen OsCPK13, es importante conocer su patrón de

Los estudios funcionales se han realizado utilizando líneas transgénicas de arroz que

sobreexpresan el gen OsCPK13 y líneas transgénicas de silenciamiento de la expresión del

gen OsCPK13 mediante la expresión de un miRNA artificial (amiRNA). La caracterización

molecular de las plantas transgénicas muestra la acumulación constitutiva de la proteína

OsCPK13 en las líneas sobreexpresoras, mientras que se observa la disminución en la

acumulación de la proteína en las líneas de silenciamiento. Estos datos indican que el

amiRNA expresado es eficiente en el silenciamiento post-transcripcional del gen OsCPK13,

y valida la estrategia para el estudio funcional de genes candidatos (Warthmann et al.,

Discusión

- 94 -

2008). A pesar de ello, en nuestros estudios no hemos podido observar cambios

fenotípicos en las líneas de silenciamiento. Este resultado podría explicarse, bien debido

a redundancia génica o bien a compensación génica como se ha sugerido para otros

genes cuya pérdida de función no conlleva cambios fenotípicos aparentes (Lloyd &

Meinke, 2012). Esta explicación resulta plausible en el caso del gen OsCPK13 por tratarse

de una familia multigénica con 31 miembros en arroz, los cuales están muy conservados

tanto estructuralmente como a nivel de secuencia (Wan et al., 2007). También es posible

que ante la baja expresión de un gen de esta familia, otra CPK pueda suplirla en sus

funciones. No podemos descartar que realmente OsCPK13 no esté implicada

funcionalmente en la inmunidad de la planta de arroz por la ausencia de fenotipo en

ensayos de infección con los patógenos M. oryzae, F. verticillioides y D. dadantii. No se ha

analizado el fenotipo de estas líneas en condiciones de crecimiento con niveles de fosfato

alterado. Saijo y colaboradores (2000) sí describieron que las líneas con niveles reducidos

de OsCPK13 son menos tolerantes a salinidad que las líneas silvestres, confirmando así su

implicación en las respuestas a estrés salino.

Los estudios con las líneas de sobreexpresión tienen que tomarse con precaución,

porque en este caso se expresa de forma constitutiva el gen, acumulándose la proteína

en tejidos o momentos que en condiciones normales no estaría, eso puede provocar

interacciones con proteínas con las que normalmente no se encontraría, y conllevar a

interpretaciones erróneas sobre la función de la proteína. De todas formas, la estrategia

de sobreexpresar un gen para estudiar su función ha sido ampliamente usada y aceptada

en la literatura. Así se ha estudiado la función de otras proteínas quinasa de arroz, tales

como las proteínas receptores quinasa OsSIK1 (Ouyang et al., 2010) y OsSIK2 (Chen et al.,

2013a), la proteína quinasa Pstol1 (Gamuyao et al., 2012), la proteína quinasa asociada a

pared celular OsWAK1 (Li et al., 2009) o proteínas CIPK (Xiang et al., 2007), incluyendo

OsCPKs (Asano et al., 2012; Campo et al., 2014; Wei et al., 2014). Incluso también así se ha

caracterizado funcionalmente el gen OsCPK13 frente a distintos estreses abióticos como


- 95 -

frío, salinidad y sequía, utilizando líneas de sobreexpresión del gen bajo el control del

promotor constitutivo 35S del CaMV (Saijo et al., 2000).

En nuestro estudio las plantas transgénicas acumulan la proteína OsCPK13

completa con su dominio regulador de unión a calcio intacto, por lo que a priori la

proteína debe estar en estado basal inactivo y solo será activada ante un incremento de

los niveles de calcio. Así, la activación de la señalización mediada por OsCPK13 solo se

producirá en las líneas sobreexpresoras ante el estímulo desencadenante de la respuesta.

Este tipo de sobreexpresión es diferente a la de otros trabajos en los que se ha producido

una forma constitutiva activa de CPKs u otras quinasas, que supone una señalización

constitutiva (Dubiella et al., 2013; Kobayashi et al., 2007). Por tanto, la acumulación de la

proteína completa no conlleva una activación constitutiva, aunque tal vez sea más

temprana su inducción ante el estímulo, por estar ya presente la proteína en condiciones

basales, lo que podría conferir cierta ventaja y conllevar menos efectos pleiotrópicos a la

planta. Aun así, no se pudieron obtener líneas homocigotas sobreexpresoras de OsCPK13

y las líneas hemicigotas producen con el tiempo lesiones necróticas espontáneas en las

hojas y muestran serios defectos en el desarrollo y en la producción de las semillas. Estos

datos muestran que la sobreexpresión de OsCPK13 conlleva efectos no deseables en la

planta de arroz. El trabajo de Saijo et al. (2000) no hace alusión al desarrollo de lesiones

necróticas y los estudios sólo se realizaron en la generación T1, aún segregante, y no se

refieren a la producción de líneas homocigotas. Además, en ese trabajo la expresión del

cDNA OsCPK13 está bajo el control del promotor CaMV35S, que es menos fuerte que el

promotor ZmUbi1 usado en nuestros estudios. Tal vez, las diferencias se deban solo a una

menor carga génica y a una menor sobreexpresión del gen. El mismo fenotipo de lesiones

espontáneas sí se observa en las plantas transgénicas de sorgo sobreexpresoras de

OsCPK13, también bajo el control del promotor ZmUbi1, así como problemas de fertilidad

(Mall et al., 2011). Estas lesiones, al igual que en nuestros estudios, se desarrollan en las

hojas más viejas, tejido donde no se expresa OsCPK13 en condiciones normales, como

muestran nuestros ensayos de actividad GUS guiada por el promotor OsCPK13.

Discusión

- 96 -

Aparentemente la acumulación de la proteína OsCPK13 en hojas viejas provoca el

desarrollo de lesiones necróticas, sugiriendo que este fenotipo está asociado a la

expresión constitutiva y no tanto a una función normal de la proteína. Además todo ello

muestra que los niveles de acumulación de una proteína reguladora, como es OsCPK13,

han de estar finamente regulados, y que cambios pequeños pueden conllevar

consecuencias graves para el desarrollo y la fertilidad de la planta de arroz.

En conjunto, nuestros estudios con las líneas de sobreexpresión y silenciamiento

del gen OsCPK13 representan una aproximación útil para investigar la función de esta

proteína, siempre tomando en consideración que la proteína se está acumulando de

manera constitutiva pero manteniendo su regulación por calcio.

Caracterización de OsCPK13 en la inmunidad de la planta de arroz

Este trabajo ha mostrado que existe una inducción lenta del gen OsCPK13 en

respuesta a elicitores, lo que se corresponde con la acumulación tardía de la proteína en

respuesta a infección por el hongo fitopatógeno de arroz M. oryzae. El proceso infectivo

de M. oryzae comienza con la germinación de las esporas y la formación de apresorios en

la superficie de las de las hojas, que ocurre dentro de las primeras 6 horas, para comenzar

la colonización de los tejidos entre 12 y 24 horas después (Campos-Soriano et al., 2013;

Rebollar & López-García, 2013; Talbot, 2003; Valent & Chumley, 1991). Después de un

desarrollo inicial biótrofo dentro de las células vivas, el hongo cambia su estrategia

invasiva al modo necrótrofo provocando la muerte celular del huésped, lo que ocurre

entre 1 y 3 días luego del inicio de la infección. (Horbach et al., 2011; Kankanala et al., 2007;

Park et al., 2009; Wilson & Talbot, 2009). La proteína OsCPK13 se acumula tardíamente

entre las 24 y las 48 horas del inicio de la infección, coincidiendo con el cambio al

crecimiento necrotrófico del hongo, sugiriendo que OsCPK13 podría desempeñar su

función en esta etapa.


- 97 -

En general, la regulación transcripcional de los genes CPKs se ha asociado a su

participación en la respuesta al agente inductor, aunque no siempre se dispone de los

estudios funcionales (Klimecka et al., 2007). La acumulación de la proteína OsCPK13 en

respuesta a infección, en principio hace suponer que la planta la produce como una

respuesta en la defensa, en el intento de evitar que progrese la infección. Dado el caso,

es lógico pensar que la sobreexpresión del gen OsCPK13 en las plantas de arroz otorgaría

resistencia frente a M. oryzae. Por el contrario, las líneas OsCPK13-Ox resultaron ser

sensibles al desarrollo de la enfermedad e incluso se ha visto mayor incidencia de lesiones

que en plantas de arroz de la variedad sensible Maratelli.

Este fenotipo podría estar asociado a la acumulación constitutiva de ROS

observada en las hojas de las líneas OsCPK13-Ox, probablemente ligado a la expresión

constitutiva del gen peroxidasa OsPOX22.3. Las peroxidasas asociadas a la pared celular,

incluida la proteína OsPOX22.3, se han visto implicadas en la producción de ROS durante

la respuesta de defensa (Baxter et al., 2014). Estas enzimas además cumplen funciones de

detoxificación de peróxido de hidrógeno cuando existe una producción excesiva de esta

molécula en las células. Esta situación indica una posible desregulación de la producción

de ROS en estas líneas. La acumulación de ROS es una de las primeras respuestas de

defensa (Torres, 2010). Las moléculas ROS cumplen un papel importante en la inducción

de la respuesta hipersensible por muerte celular localizada (HR) para evitar la propagación

del patógeno, además de actuar como moléculas señalizadoras (Barna et al., 2012; Perez

& Brown, 2014). La acumulación de ROS en los tejidos vegetales está relacionada, en

general, con la resistencia ante el ataque por patógenos biótrofos y susceptibilidad a la

infección por necrótrofos (Barna et al., 2012). M. oryzae es considerado un hongo

hemibiótrofo, con un crecimiento inicial biotrófico que cambia a necrotrófico provocando

muerte celular en los tejidos de la planta (Wilson & Talbot, 2009). La hipersensibilidad de

las plantas OsCPK13-Ox frente a la infección por el hongo M. oryzae podría estar ligada a

la producción descontrolada de ROS en los tejidos foliares, siendo incapaces de

defenderse ante la fase necrótrofa del patógeno.

Discusión

- 98 -

Nuestros estudios muestran que la expresión de genes de defensa no está

alterada en las líneas OsCPK13-Ox, al menos para los genes analizados y en plántulas

jóvenes, estado del desarrollo en el que se realizaron los ensayos de infección. Entre los

genes analizados se incluyeron genes codificantes para proteínas relacionadas con

patogénesis de la ruta de señalización mediada por SA, tales como OsPR1a y OsPR5, y

genes reguladores (factores de transcripción) de la respuesta de defensa de la vía del JA

y del ET como OsJAmyb y OsEREBP, respectivamente. Se observó que las líneas OsCPK13-

Ox muestran una acumulación basal y un perfil de inducción durante la respuesta de

defensa similar al de líneas no transformadas. Estos datos sugieren que la expresión

constitutiva de OsCPK13 no altera la señalización de los genes de defensa mediados por

las rutas del SA, JA o ET. Además se sugiere que el fenotipo de hipersensibilidad a la

infección por M. oryzae de las líneas OsCPK13-Ox no es debido a un bloqueo de la

respuesta de defensa.

La producción excesiva de ROS en las líneas OsCPK13-Ox podría ser un factor

influyente en la formación de las lesiones necróticas observadas en las hojas de las líneas

OsCPK13-Ox. Lesiones similares se han descrito previamente en mutantes de arroz con

alteraciones en la expresión de la peroxidasa OsPOX22.3 (Wu et al., 2008) y en el

metabolismo y producción de ROS (Chen et al., 2013b; Liu et al., 2012a). En la literatura, el

fenotipo de lesiones necróticas causado por una desregulación de la muerte celular

programada se ha relacionado frecuentemente con la HR que ocurre en respuesta a

infección por patógenos y en arroz se han identificado varias proteínas de defensa

alteradas en mutantes que desarrollan lesiones espontáneas (Bruggeman et al., 2015;

Chen et al., 2013b; Fekih et al., 2014; Mizobuchi et al., 2002; Wu et al., 2008; Yin et al.,

2000). La gran mayoría de estos mutantes presentan una marcada resistencia a

enfermedades, principalmente bacterianas, aunque en ciertos casos también frente a M.

oryzae, debido a que desarrollan una HR rápidamente que detiene la progresión de

patógenos biótrofos (Chen et al., 2013b; Feng et al., 2013; Liu et al., 2012a; Mizobuchi et

al., 2002; Mur et al., 2008; Qiao et al., 2010; Undan et al., 2012; Vega-Sanchez et al., 2012;


- 99 -

Wu et al., 2008). En cebada se han estudiado una serie de mutantes con lesiones

necróticas para evaluar el fenotipo de resistencia/susceptibilidad frente a patógenos,

encontrándose que muestran susceptibilidad a hongos hemibiótrofos como el hongo

facultativo Ramularia collo-cygni (McGrann et al., 2015). Interesantemente, se han

encontrado fuertes semejanzas entre las líneas OsCPK13-Ox y el mutante en el gen MLO

de Hordeum vulgare, codificante de una proteína transmembrana de unión a calmodulina

(Stein & Somerville, 2002). Este mutante presenta lesiones espontáneas, defectos en el

crecimiento y baja productividad (Kjær et al., 1990) además de ser resistente al patógeno

biótrofo Blumeria graminis pero altamente susceptible al ataque por patógenos

hemibiótrofos como M. oryzae (Jarosch et al., 1999), F. graminearum (Jansen et al., 2005),

Bipolaris sorokiniana (Kumar et al., 2001) y R. collo-cygni (McGrann et al., 2014). La proteína

MLO de cebada ha sido descrita como un regulador negativo de la muerte celular y de la

resistencia a enfermedades (Peterhansel et al., 1997; Piffanelli et al., 2002), mientras que

en este trabajo se ha caracterizado a la proteína OsCPK13 como un regulador positivo de

la muerte celular y de la acumulación de ROS, siendo regulador negativo de la resistencia

a M. oryzae. En este punto se plantea la caracterización del fenotipo de las líneas de

sobreexpresión de OsCPK13 frente a la infección por patógenos estrictamente biótrofos,

lo que podría ayudar a determinar si esta proteína cumple una función en la inmunidad

de la planta de arroz.

Nuestros estudios han mostrado que la proteína OsCPK13 se encuentra asociada

a la membrana plasmática de la célula. La proteína presenta un sitio de miristoilación en

el N-terminal, probablemente determinante de su asociación a membrana, tal como se

ha descrito para otras proteínas CPKs (Asai et al., 2013; Campos-Soriano et al., 2011; Coca

& San Segundo, 2010). Es aquí en la membrana plasmática donde se inicia la producción

de ROS en respuesta a reconocimiento del patógeno mediante la activación de las

NADPH-oxidasas y las peroxidasas apoplásticas durante la respuesta de defensa basal o

ETI (Torres, 2010). La localización de OsCPK13 en membrana plasmática y la acumulación

de ROS constitutiva detectada en las líneas OsCPK13-Ox sugieren que esta proteína

Discusión

- 100 -

desempeñaría su función activando la producción ROS, probablemente a través de

peroxidasas apoplásticas como OsPOX22.3, en respuesta a las alteraciones en los niveles

de calcio citoplasmáticos inducidos durante la respuesta de defensa. La conexión entre

las CPKs y la producción de ROS se ha documentado ampliamente en la literatura

(Dubiella et al., 2013; Kobayashi et al., 2007; Romeis et al., 2001; Xing et al., 2001; Zou et

al., 2015). Las NADPH-oxidasas de membrana plasmática y catalasas, ambas implicadas

en la producción y detoxificación de ROS, han sido identificadas como dianas de proteínas

CPKs (Dubiella et al., 2013; Kobayashi et al., 2007; Zou et al., 2015). La activación tardía de

proteína OsCPK13 sugiere que participaría en la segunda onda de la explosión oxidativa,

y no la primera onda mucho más temprana, que se observan durante la respuesta de

defensa.

En resumen, nuestros estudios sugieren OsCPK13 regula la producción de ROS

durante la respuesta de defensa, que la expresión constitutiva de OsCPK13 resulta en la

desregulación de la acumulación de ROS y consecuentemente en un incremento de la

susceptibilidad al hongo hemibiótrofo M. oryzae.

Caracterización de OsCPK13 en la homeostasis de fosfatos

El papel que cumplen varias proteínas en las respuestas de las plantas frente a la

insuficiencia de fósforo en el medio de crecimiento y los mecanismos moleculares de esas

respuestas vienen siendo estudiados y descritos detalladamente desde hace varios años

(Hu & Chu, 2011; Jain et al., 2012; Panigrahy et al., 2009). No obstante, hasta donde se

conoce, no se han relacionado proteínas de plantas con funciones en la homeostasis de

fosfatos bajo condiciones de alta fertilización fosfatada, como se ha hecho en este trabajo

con la proteína OsCPK13. Se ha visto que el gen OsCPK13 presenta cambios en su

expresión transcripcional en raíces bajo condiciones de exceso de fosfatos en el medio de

crecimiento, aunque en este trabajo se encontró a menudo que su expresión también está

regulada en respuesta a deficiencia de fosfatos (datos no mostrados). Se ha visto

previamente la inducción de un gen CPK de Arabidopsis en respuesta a deficiencia de


- 101 -

fosfatos (Wu et al., 2003), sin embargo, aunque las CPKs se han implicado en las respuestas

a diferentes estímulos ambientales y procesos de desarrollo, no habían sido asociadas

directamente a los procesos de adaptación o mantenimiento de la homeostasis de

fosfatos. En un estudio previo donde se describe la participación de la quinasa Pstol1 en

la tolerancia a deficiencia de fosfatos en plantas de arroz mediante su sobreexpresión

(Gamuyao et al., 2012), y en estas plantas se encontró que el gen OsCPK13 está reprimido

constitutivamente, estableciendo nuevamente su relación con el mantenimiento de la

homeostasis de fosfatos. Estas evidencias sugieren que la proteína OsCPK13 podría ser un

regulador de las respuestas de la planta de arroz a contenidos anormales de fosfatos.

En arroz, así como en otras varias especies vegetales, se han identificado proteínas

que cumplen funciones en la ruta de señalización de deficiencia de fosfatos, buscando la

adaptación de la planta a estas condiciones de crecimiento (Hu & Chu, 2011; Panigrahy et

al., 2009). Así, se han descrito transportadores de fosfatos (Ai et al., 2009; Schünmann et

al., 2004; Sun et al., 2012), proteínas de ubiquitinación (Hu et al., 2011), factores de

transcripción (Dai et al., 2012; Zhou et al., 2008), señalizadores (Hou et al., 2005; Wang et

al., 2009a; Wang et al., 2009c) y miRNAs (Hackenberg et al., 2013a; Hackenberg et al.,

2013b) entre otros componentes de las vías de señalización. Las proteínas quinasas son

fundamentales en la transducción de señales y existen evidencias de la participación de

quinasas en la señalización de la respuesta a diferentes condiciones de fosfatos. Por

ejemplo, en Saccharomyces cerevisiae se ha visto la inducción rápida de PKA (Protein

kinase A) y su vía de regulación, mediada por el transportador de fosfatos Pho84 en células

deprivadas de fosfatos (Giots et al., 2003; Popova et al., 2010). Sin embargo, poco se sabe

de las funciones de las quinasas de plantas implicadas en este proceso. En Arabidopsis

específicamente, se han estudiado mutantes en el gen AtIPK1 (Inositol polyphosphate

kinase) que son hipersensibles a concentraciones de fosfatos en el medio de crecimiento

(Stevenson-Paulik et al., 2005) y en arroz la quinasa citoplasmática Pstol1 (Phosphorus-

starvation tolerance) confiere tolerancia a deficiencia de fosfatos particularmente en la

variedad silvestre Kasalath (Gamuyao et al., 2012). Se ha establecido también el papel que

Discusión

- 102 -

podría tener el Ca+2 en la detección y señalización por fosfatos en plantas de tomate

(Solanum lycopersicum), en las que se ha encontrado incrementos en los niveles de una

Ca+2-ATPasa, importante para el transporte de calcio, cuando las raíces eran sometidas a

bajas concentraciones de fosfatos (Muchhal et al., 1997). En este contexto, la proteína de

membrana OsCPK13, sensora de calcio y transmisora de la señal por fosforilación de

proteínas, podría tener una función en la detección de los niveles de fosfatos y la

señalización posterior para la adaptación de la planta a estas condiciones de crecimiento

con contenidos anormales de fosfatos.

Los estudios de actividad GUS guiada por el promotor OsCPK13, muestran mayor

actividad en tejidos de nueva formación tanto en hojas como en raíces. Esta distribución

de la actividad del promotor OsCPK13 se podría corresponder con la habilidad que tiene

el fósforo de movilizarse dentro de la planta desde los tejidos viejos a los tejidos más

nuevos, donde este nutriente es mayormente requerido (Mahler, 2004). El promotor de

OsCPK13, se ha observado también activo específicamente en los tejidos acompañantes

de los haces vasculares de las raíces. Varios componentes de la ruta de señalización por

fosfatos y que están relacionados con la detección, transporte y translocación de este

nutriente localizan su actividad también en los haces vasculares, incluidos ath-MIR399,

OsIPS1, OsPHO2, Pstol1, así como también de los transportadores de fosfatos OsPT1,

OsPT2 y OsPT6 (Ai et al., 2009; Aung et al., 2006; Gamuyao et al., 2012; Hou et al., 2005;

Hu et al., 2011; Sun et al., 2012). Por lo tanto, nuestros estudios indican que OsCPK13 es

co-expresado con otros componentes de la vía de señalización de la homeostasis de

fosfatos en los tejidos vasculares, responsables de la movilización del nutriente a toda la

planta.

El fosfato es relativamente inmóvil en el suelo, por lo que cuando las plantas

crecen en condiciones donde la disponibilidad de fosfatos es limitada, en el sistema

radicular se desencadenan una serie de respuestas adaptativas ante el estrés por fosfatos

o PSRs (Phosphate stress responses), incluyendo cambios en la morfología y arquitectura


- 103 -

de la raíz, exudación de ácidos orgánicos y fosfatasas al suelo, inducción o mejora de la

expresión de transportadores de alta afinidad y establecimiento de simbiosis con

micorrizas (Zhang et al., 2014b). En este trabajo se ha visto que la sobreexpresión de

OsCPK13 en las plantas provoca una disminución de la longitud de la raíz principal y un

aumento del número de raíces secundarias en condiciones normales de crecimiento. Se

sabe que los cambios en la elongación de las raíces principales es un fenómeno típico en

respuesta a la disponibilidad de fosfatos en arroz, y en Arabidopsis existen estudios que

demuestran que bajas concentraciones de fosfatos favorece el crecimiento de raíces

laterales en detrimento de la elongación de la raíz principal (Linkohr et al., 2002; Reymond

et al., 2006; Shimizu et al., 2004; Williamson et al., 2001; Wissuwa, 2003; Yi et al., 2005). La

alteración de genes relacionados con la ruta del fosfato en arroz provoca cambios en la

arquitectura del sistema radicular, como la mutación en el gen OsSIZ1, homólogo de

AtSIZ1, responsable de la sumoilación de AtPHR1, provoca la inhibición del crecimiento de

la raíz principal y un aumento del número y longitud de raíces secundarias y pelos

radiculares (Wang et al., 2011), fenotipo similar al observado en las líneas OsCPK13-Ox. La

sobreexpresión del factor de transcripción OsMYB2P-1 ocasiona una reducción en la

longitud de la raíz principal y del número de raíces secundarias en condiciones de

suficiencia de fosfatos, mientras que en condiciones de bajas concentraciones del

nutriente aumenta la longitud de la raíz principal y el número de raíces adventicias (Dai et

al., 2012). Así también, plantas de arroz sobreexpresoras de OsPHR2 presentan raíces

primarias y adventicias más largas, cuando son crecidas en deficiencia de fosfatos en el

medio y mayor proliferación de pelos radiculares en condiciones normales (Zhou et al.,

2008). La línea ltn1, mutante en el gen OsPHO2 presenta raíces primarias y adventicias

significativamente más largas en condiciones de nula fertilización fosfatada (Hu et al.,

2011). Plantas sobreexpresoras de la quinasa Pstol1 presentan raíces más largas y un mayor

área radicular que las plantas silvestres, tanto en condiciones de suficiencia como en

deficiencia de fosfatos (Gamuyao et al., 2012). Según estas observaciones, las raíces de las

plantas sobreexpresoras de OsCPK13 presentan un fenotipo que podría corresponderse o

Discusión

- 104 -

mimetizar ciertos aspectos de la arquitectura radicular frente a condiciones anormales de

fosfatos en el medio de crecimiento, a causa de tener alterada la vía de señalización.

La sobreacumulación de la proteína OsCPK13 en las plantas de arroz causa severos

defectos en el crecimiento y el desarrollo, tanto vegetativo como reproductivo y se ha

asociado este fenotipo con la acumulación excesiva de fosfatos en la parte aérea de la

planta. Fenotipos similares se han descrito para líneas alteradas en algunos de los

componentes de la ruta de señalización por fosfatos en plantas de arroz. Por ejemplo, la

sobreexpresión individual de los factores de transcripción OsMYB2P-1 y OsPHR2 provoca

un aumento en el contenido de fosfatos en las plantas crecidas en condiciones normales,

presentando un crecimiento retardado, menor producción de hijuelos, biomasa y altura;

mientras que en condiciones de deficiencia de fosfatos las plantas tienen un desarrollo

igual o mejor que plantas silvestres (Dai et al., 2012; Zhou et al., 2008). Igualmente, las

líneas ltn1, mutantes en OsPHO2, la enzima conjugadora de ubiquitina que regula al

transportador de fosfatos OsPT2, muestran menor altura, menor producción de hijuelos,

reducida fertilidad y acumulación excesiva de fósforo cuando crecen en condiciones

normales de fosfatos, revirtiéndose este fenotipo cuando las plantas crecen en medio

deficiente en el nutriente (Hu et al., 2011). Las plantas sobreexpresoras de OsSPX1 y

OsSPX3, así como las de expresión reducida de OsSPX1 producen menor biomasa tanto

en condiciones de suficiencia como en deficiencia de fosfatos, y esta última presenta

además un aumento en el contenido de fosfatos (Wang et al., 2009a; Wang et al., 2009c).

La sobreexpresión del transportador OsPT2 incrementa el contenido de fosfatos en las

plantas de arroz y ocasiona un crecimiento retardado en condiciones normales, mientras

que a bajas concentraciones de fosfatos mejora el crecimiento a niveles comparables con

plantas silvestres (Liu et al., 2010). Líneas de arroz mutantes en OsSIZ1 muestran defectos

en el desarrollo vegetativo, con altura y tamaño reducidos, y en el reproductivo,

produciendo panículas pequeñas y reducido número de flores y semillas (Wang et al.,

2011), mientras que la sobreexpresión heteróloga de este gen en Agrostis stolonifera deriva

en un aumento del contenido de fosfatos en parte aérea (Li et al., 2013b). Líneas de RNA


- 105 -

interferencia para Pstol1 en la variedad de arroz tolerante a bajas concentraciones de

fosfatos, presentan un menor crecimiento que la variedad nativa (Gamuyao et al., 2012).

En tejidos radiculares en cambio, las líneas OsCPK13-Ox no presentan una acumulación

diferencial de fosfatos, resultados similares a los obtenidos en las líneas de sobreexpresión

de OsPHR2 y mutantes en OsPHO2, lo que resulta particularmente interesante ya que

ambos genes han sido relacionados con la translocación del fosfato a la parte aérea de

las plantas (Hu et al., 2011; Zhou et al., 2008). La sobreexpresión de OsMYBP2-1 y OsPT2

sin embargo, resulta en la acumulación de mayores cantidades de fósforo en raíces, y en

estos casos ambas han sido relacionadas además de la translocación a la parte aérea, con

la absorción del nutriente desde el suelo (Dai et al., 2012; Liu et al., 2010). El desbalance en

la acumulación de fósforo en las líneas que tienen alterada la ruta de señalización por

fosfatos demuestra que existe una regulación muy fina de la homeostasis de este mineral

y que la desregulación de uno de los componentes arrastra consigo la alteración de los

componentes por debajo de la ruta de señalización cuyos efectos son acumulativos. Las

evidencias demuestran que tanto la acumulación de fosfatos en la parte aérea como los

defectos fenotípicos en las líneas OsCPK13-Ox son consecuencia de una alteración en la

ruta de homeostasis de fosfatos y que podría relacionarse a la proteína OsCPK13 con la

translocación de fosfatos a la parte aérea de las plantas de arroz.

Desde hace décadas se vienen realizando estudios sobre la interacción Zinc-

Fósforo (Zn-P) y se sabe que la principal causa de toxicidad por fosfatos en plantas es la

que ocurre como consecuencia de una deficiencia de Zn (Bouain et al., 2014; Zhu, 2001) e

incluso la falta de Zn causa una inducción de ciertos transportadores de fosfatos (Huang

et al., 2000). No obstante, poco se sabe sobre los síntomas de los efectos tóxicos de la

sobreacumulación de fósforo en las plantas, puesto que esta no es una situación corriente

en los suelos del mundo. Entre los síntomas de toxicidad por exceso de fosfatos se

mencionan: inhibición del crecimiento, clorosis intervenal, senescencia acelerada y

necrosis en las hojas (Silber et al., 2002). Sobre los niveles tóxicos en los tejidos, se ha

descrito que en arroz el nivel crítico entre la suficiencia y la toxicidad del contenido de

Discusión

- 106 -

fósforo en hojas es del 1% en la madurez (De Datta, 1981) y en este trabajo se vio que en

las hojas de las líneas OsCPK13-Ox existe hasta un 2,5% del peso seco, muy por encima

del nivel crítico y más del doble del contenido observado en hojas de las plantas silvestres

bajo condiciones normales, que no llegan al 1,5% de contenido de fósforo.

Nuestros estudios también muestran que existe una relación entre el desarrollo

de lesiones necróticas espontáneas en las hojas viejas de las plantas OsCPK13-Ox de arroz

y la toxicidad por exceso de fosfatos, puesto que estas lesiones desaparecen cuando las

plantas son crecidas con baja fertilización fosfatada. Un fenotipo similar de desarrollo de

lesiones necróticas asociado a la toxicidad del fosfato se ha reportado en líneas de

alteración de los componentes de la ruta del fosfato como en plantas sobreexpresoras de

OsPHR2, de OsPT2, mutantes en OsPHO2 y de expresión reducida de OsSPX1 (Hu et al.,

2011; Liu et al., 2010; Wang et al., 2009a; Zhou et al., 2008). Las líneas de interferencia

OsSPX1 presentan además alta sensibilidad al estrés oxidativo (Wang et al., 2009a; Wang

et al., 2013a). En general, las plantas sufren estrés oxidativo en las hojas ante la deficiencia

de fosfatos, debido a la reducción en fotosíntesis por falta de fósforo, la foto-inhibición y

el consecuente estrés foto-oxidativo en cloroplastos que causa la pérdida de clorofilas y

la peroxidación de lípidos (Hernandez & Munne-Bosch, 2015). Similarmente, el mutante

de Arabidopsis en el gen codificante para el transportador de fosfatos PHT4;6 muestra

una elevada producción basal de ROS, la inducción constitutiva de las respuestas de

defensa y el desarrollo de lesiones necróticas espontáneas (Hassler et al., 2012). Estos

trabajos establecen una conexión entre el estrés oxidativo, el desarrollo de lesiones

necróticas y la homeostasis de fosfatos, además de con las respuestas inmune de la planta,

al igual que lo observado en las líneas OsCPK13-Ox.

En este trabajo se han identificado genes reguladores de la vía de señalización

por fosfatos que tienen alterada su expresión en las líneas OsCPK13-Ox. En raíces se

observaron niveles de acumulación transcripcional elevados en el transportador de

fosfatos OsPT2 y su regulador negativo OsPHO2, y así también se vio una represión en la


- 107 -

expresión de la fosfatasa OsPAP10. La proteína OsPT2 ha sido descrita como un

transportador de fosfatos de baja afinidad que cumple funciones en los haces vasculares

de las raíces y específicamente en la membrana plasmática de las células, siendo

responsable de la translocación del fosfato desde las raíces hasta la parte aérea de la

planta de arroz (Ai et al., 2009; Liu et al., 2010). La expresión de este transportador también

se ha visto inducida en líneas sobreexpresoras del factor de transcripción OsMYB2P-1 y

reprimidas en sus líneas de RNA interferencia, observándose la regulación contraria para

OsPHO2 (Dai et al., 2012). Los cambios en la acumulación de OsPT2 en las líneas OsCPK13-

Ox podrían ser responsables del exceso de fósforo en la parte aérea de estas plantas. Este

transportador es regulado positivamente por el factor de transcripción OsPHR2, el cual

no presenta cambios en las líneas sobreexpresoras de OsCPK13. Sin embargo, su

regulador negativo OsPHO2 se ve inducido en estas líneas, por lo tanto, si la regulación

directa de la expresión de OsPT2 es debida a los altos niveles de OsPHO2 en las líneas

OsCPK13-Ox, cabría esperar que el transportador esté reprimido, como ocurre en el caso

del trabajo presentado por Dai et al. (2012). Este no es el caso de las líneas OsCPK13-Ox,

sugiriendo que el exceso de acumulación de la proteína OsCPK13 es la responsable de la

inducción del gen OsPT2. En cambio, la inducción de OsPHO2 podría ser resultado de la

autorregulación de la ruta de fosfatos a consecuencia de la acumulación excesiva de

fosfatos, en el intento de degradar el exceso del transportador OsPT2, que podría ser el

responsable de los efectos tóxicos de la acumulación de fosfatos en la parte aérea. No se

han visto diferencias en la expresión de OsPT6 en las líneas OsCPK13-Ox. Este

transportador ha sido descrito como implicado principalmente en la absorción de fosfatos

del suelo (Ai et al., 2009). Estas observaciones sugieren que las líneas OsCPK13-Ox tienen

alterada principalmente la translocación de fosfatos desde las raíces a la parte aérea.

Por otra parte, las fosfatasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de ciertos

sustratos ricos en fosfatos, actuando como un “reciclador” de grupos fosfatos, haciendo

disponible al fósforo para su utilización o remobilización (Schenk et al., 2013). Estas

enzimas son parte de la ruta de señalización por fosfatos y generalmente son necesarias

Discusión

- 108 -

en caso de insuficiencia de fosfatos en la planta. En las líneas OsCPK13-Ox, la fosfatasa

OsPAP10 se encuentra reprimida, probablemente debido a la acumulación excesiva de

fósforo, por lo que no es necesario el proceso de reutilización de fosfatos. En otros casos

de sobreacumulación de fosfatos en plantas de arroz, como en la sobreexpresión de

OsMYB2P-1 y OsPHR2 y en mutantes de OsPHO2, no se ha visto la represión de las

fosfatasas, sino más bien al contrario (Dai et al., 2012; Hu et al., 2011; Liu et al., 2010). Esta

característica molecular podría ser un indicador fiable de los niveles tóxicos de fosfatos

que poseen estas plantas sobreexpresoras de OsCPK13.

Se encontró además que los niveles de expresión de OsCPK13 no están alterados

en líneas sobreexpresoras de los miRNAs osa-MIR399 y osa-MIR827, que están implicados

en esta ruta como reguladores negativos de OsPHO2 y OsSPX1, respectivamente. Se

podría entonces considerar que las funciones de la proteína OsCPK13 en la regulación de

la vía de señalización por fosfatos no está por debajo de la regulación por estos miRNAs.

Según este análisis, OsCPK13 cumple funciones en la ruta del fosfato en condiciones de

suficiencia de fosfatos, por encima de OsPT2 y de forma independiente de la vía regulada

por OsSPX1 y OsPHO2. En la Figura 31 se muestra un modelo adaptado de Liu et al. (2010)

para la regulación de la homeostasis en condiciones de suficiencia de fosfatos en arroz

mediada por OsCPK13.

La expresión de OsCPK13 está regulada en presencia de un exceso de fosfatos en

el medio y su sobreexpresión induce al transportador de fosfatos de baja afinidad OsPT2

causando una acumulación excesiva y tóxica de fosfatos en la parte aérea. Estos datos

podrían indicar que la proteína OsCPK13 señaliza las altas concentraciones de fosfatos en

las raíces, activando al transportador que media la translocación del nutriente a la parte

aérea, sugiriendo a OsPT2 como posible diana de OsCPK13. Además, el hecho de que

ambas proteínas se localizan en la membrana plasmática celular y en los mismos tejidos

facilitaría su posible interacción. También, la secuencia aminoacídica de OsPT2 presenta

varios motivos de fosforilación, lo que apunta a una regulación del transportador por


- 109 -

fosforilación. Sin embargo, los estudios de interacción OsCPK13-OsPT2 en expresión

transitoria en N. benthamiana mediante FRET (Fluorescence resonance energy transfer)

realizados en el transcurso de este trabajo no mostraron interacción entre ambas

proteínas. No podemos descartar que, a pesar de estos resultados, haya interacción entre

ambas proteínas y que en las condiciones realizadas y mediante FRET no pueda ser

observada por deficiencias en la técnica. Experimentos adicionales serían necesarios para

determinar la relación entre OsCPK13 y el transportador OsPT2, y entender a nivel

molecular el modo de acción de OsCPK13 en la vía de señalización de fosfatos.

En resumen, nuestros estudios muestran que OsCPK13 regula la homeostasis de

fosfatos en las plantas de arroz modulando su translocación de la raíz a la parte aérea. La

sobreexpresión de OsCPK13 resulta en alteraciones morfológicas en las raíces, una mayor

absorción de fosfato, su sobreacumulación en la parte aérea, y los consecuentes efectos

fenotípicos causados por la toxicidad del exceso de fosfato, tales como el desarrollo de

lesiones necróticas en las hojas, la reducción del crecimiento y una menor producción de

semillas. Así, OsCPK13 podría representar una diana de mejora en la eficiencia de

absorción de fosfato en el cultivo del arroz en suelos pobres en este macronutriente, que

OsPHR2

OsPT2

OsPHO2

osa-miR399

OsIPS1

osa-mir827

OsSPX1OsCPK13?

Raíces en suficiencia de P

Figura 31. Modelo propuesto para la regulación de la homeostasis de fosfatos mediada por OsCPK13 en condiciones de suficiencia de fosfatos. Adaptado de Liu et al. (2010).

Discusión

- 110 -

permita reducir el uso de fertilizantes fosfatados en la práctica agrícola, aunque siempre

modulando los niveles de acumulación de esta proteína reguladora.

Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis demuestran que la proteína

OsCPK13 propuesta hace años como diana de mejora genética para la tolerancia a sequía

y altas concentraciones salinas (Saijo et al., 2000), también puede mejorar el

aprovechamiento del fosfato en el cultivo de arroz. Sin embargo, la aproximación no es

directa y ha de tomarse con precaución, modulando estrictamente los niveles de proteína,

puesto que si la acumulación de la proteína supera un determinado umbral puede tener

consecuencias graves en el crecimiento, desarrollo y productividad de la planta de arroz,

además de aumentar la susceptibilidad a patógenos. Esta situación está motivada por

tratarse de una proteína implicada en varias vías de señalización, y por regular la

acumulación de ROS que además de ser moléculas señalizadoras de muchas respuestas

de la planta y procesos de desarrollo, son moléculas tóxicas que pueden causar daño

celular y su producción ha de estar finamente regulada.

El descubrimiento del efecto negativo de la acumulación excesiva de OsCPK13

sobre la sensibilidad frente a la piriculariosis y sobre el desarrollo de la planta, podría ser

influyente en la visión de que la sobreexpresión de ese gen podría ser una vía interesante

para la obtención de variedades con un mejor desempeño en suelos salinos, en

condiciones de sequía y con bajas temperaturas (Saijo et al., 2000; Wang et al., 2008).

Queda una vez más demostrado que pueden existir efectos pleiotrópicos importantes

cuando se sobreexpresan genes que podrían estar implicados en varios procesos

fisiológicos de la planta. Esta situación podría ser objeto de estudios posteriores, pudiendo

utilizarse promotores inducibles frente a una situación específica, como sequía, salinidad,

frío o deficiencia de fosfatos, en el intento de evitar los efectos negativos de una

sobreacumulación de forma constitutiva.

Capítulo II

IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE miRNAs DE ARROZ IMPLICADOS EN LA RESPUESTA INMUNE Y EN LA

RESPUESTA A ESTRÉS HÍDRICO

Capítulo II: miRNAs en defensa y sequía

- 113 -

AAntecedentes

En el grupo de investigación se realizó previamente un análisis masivo de

pequeños RNAs con el propósito de identificar miRNAs cuya expresión esté regulada por

el tratamiento con elicitores del hongo M. oryzae. Así, utilizando este análisis, se

seleccionarían aquellos miRNAs que puedan desempeñar un papel regulador en la

respuesta inmune de las plantas de arroz. El análisis se realizó a partir de la secuenciación

masiva de pequeños RNAs (sRNA-seq) en la plataforma Illumina Solexa®. El método

utilizado para la secuenciación en esta plataforma se resume en la Figura 32, y consiste

en la ligación de adaptadores de RNAs a los extremos 3’ y 5’ de los sRNAs, los cuales,

como resultado del proceso de maduración mediado por proteínas DCL, poseen grupos

hidroxilo y fosfato, respectivamente. Por medio de una reacción de retrotranscripción (RT)

se realiza la síntesis del cDNA que luego es amplificado utilizando cebadores específicos

que contienen secuencias señalizadoras, utilizadas para diferenciarlas de los fragmentos

de la reacción de ligación de RNA y como marcadores para las lecturas de secuenciación.

También se ha hecho un análisis de secuenciación masiva de RNAs mensajeros

degradados por miRNAs (degradoma). En la Figura 33 se muestra el método utilizado,

denominado PARE (Parallel Analysis of RNA Ends), descrito por German et al. (2009) y

utilizado en arroz por Zhai et al. (2014). Los miRNAs de plantas regulan la acumulación de

sus dianas predominantemente a través del corte del RNA mensajero, lo que ocurre

generalmente entre el décimo y el undécimo nucleótido desde el extremo 5’ del miRNA.

El fragmento 3’ del tránscrito diana está poliadenilado y posee un grupo fosfato en su

extremo 5’, características que hacen a estos fragmentos compatibles para la ligación de

adaptadores mediante ligasas de RNA. Luego de la extracción de RNAs poliadenilados, se

añaden adaptadores con el sitio de reconocimiento por la enzima MmeI al extremo 3’ y

se realiza la síntesis de cDNA. Tras la amplificación por PCR se digiere el producto por la

enzima MmeI para obtener fragmentos del mismo tamaño que contengan los nucleótidos

con los cuales emparejan los miRNAs, y se purifican por geles. A estos fragmentos se

Antecedentes

- 114 -

añaden después unos adaptadores de DNA de doble cadena en su extremos 3’ y se

procede a la secuenciación masiva del degradoma.

Los resultados de estos análisis fueron la base para la selección de algunos

miRNAs potencialmente implicados en las respuestas de defensa de la planta de arroz y

para su posterior caracterización funcional tanto frente a infección por M. oryzae como

frente a estrés hídrico. En el trabajo publicado por Baldrich et al. (2015) se describe el

análisis de sRNA-seq realizado en respuesta a elicitores de M. oryzae, en plantas de arroz

variedad Nipponbare, en tejidos foliares y radiculares a dos tiempos post-tratamiento (30

Figura 32. Esquema del proceso de obtención de genotecas para la secuenciación masiva de pequeños RNAs en la plataforma Illumina Solexa®. A 1 μg de RNA enriquecido en fragmentos pequeños se añaden RNAs adaptadores específicos a los extremos 3’ y 5’. A partir de estos fragmentos se realiza la síntesis del cDNA complementario por retrotranscripción. El cDNA sintetizado se utiliza como molde para la amplificación por PCR utilizando cebadores específicos de las secuencias adaptadas en los extremos. El cebador 3’ contiene además una secuencia señalizadora. Luego de la purificación y selección de los amplicones en geles PAGE, se someten a la secuenciación masiva en la plataforma Illumina Solexa®. Adaptado del protocolo para la utilización del kit TruSeq Small RNA de Illumina®.

RNA enriquecidoen pequeños RNAs

RNA adaptador 3’

RNA adaptador 3’

Ligación 3’

RNA adaptador 3’

Ligación 5’RNA adaptador 5’

RNA adaptador 5’

RT-PCR síntesis de cDNA

Amplificación por PCRSecuencia

señalizadora

Purificación por geles

Secuenciación en Illumina Solexa ®


- 115 -

minutos y 2 horas). Así también se detalla el análisis de degradoma realizado en hojas

tratadas en las mismas condiciones y a los mismos tiempos que el sRNA-seq. El esquema

experimental se resume en la Figura 34. En ese trabajo se realizó el cribaje informático de

los datos de la secuenciación masiva tanto de pequeños RNAs como del degradoma, así

como el mapeo de las secuencias con el genoma del arroz.

Figura R33. Esquema de la construcción de genotecas PARE. Esquema del procedimiento seguido para la obtención de genotecas “Parallel Analysis of RNA Ends” para la identificación de dianas cortadas por miRNAs: (a) Extracción del RNA poliadenilado; (b) Ligación de RNAs adaptadores al extremo 5’ de los RNAs de cadena simple que hayan sido cortados por miRNAs o degradados por otros procesos, los cuales son competentes para la ligación por poseer un grupo monofosfato; (c) Síntesis de cDNA a partir de esos fragmentos de RNAs con un cebador dT; (d) Amplificación del cDNA por PCR; (e) el producto de PCR es digerido por la enzima de restricción MmeI para generar fragmentos de igual tamaño que después se purifican por PAGE; (f) Ligación de adaptadores de doble cadena al extremo 3´ de los fragmentos digeridos y purificados; (g) Amplificación por PCR con cebadores específicos y purificación del producto que será utilizado para la secuenciación masiva. Esquema publicado por German et al. (2009).

a

b

c

d

e

f-g

Antecedentes

- 116 -

Plantas de arroz Control oTratadas con elicitores de M. oryzae

Raíces30 min 2 h

Hojas

Secuenciación del degradomay sRNAs en Illumina Solexa ®

30 min 2 h

Secuenciación de sRNAsen Illumina Solexa ®

Figura 34. Esquema experimental de la obtención de genotecas para la secuenciación masiva de pequeños RNAs y de tránscritos degradados por miRNAs en la plataforma Illumina Solexa®. Se trataron hojas y raíces de plantas de arroz variedad Nipponbare con una suspensión de elicitores de M. oryzae a una concentración de 300 μg/ml. Las muestras para la extracción de RNAs fueron tomadas a los 30 minutos y 2 horas después del tratamiento. Además se tomaron muestras de tejidos tratadas con una solución control. Cada genoteca se realizó por triplicado. La secuenciación de los pequeños RNAs (sRNAs) se realizó en la plataforma Illumina Solexa® tanto en las genotecas de hojas como de raíces. Los tejidos foliares se utilizaron además para la obtención de genotecas para la secuenciación de tránscritos degradados por miRNAs (degradoma). Esquema experimental del trabajo publicado por Baldrich et al. (2015).


- 117 -

RResultados

1. Selección de miRNAs con acumulación alterada durante la respuesta inmune

de plantas de arroz

En este trabajo de tesis se propuso identificar miRNAs implicados en la

respuesta de defensa de la planta de arroz. Para ello se analizaron los datos del sRNA-

seq generado previamente en el grupo de investigación. Los criterios utilizados para la

selección de los miRNAs fueron fundamentalmente tres: 1) miRNAs regulados

negativamente a tiempos cortos en tejidos foliares durante la respuesta frente a

elicitores. El cambio logarítmico en la acumulación relativa entre el tratamiento y el

control se fijó en -0,5 o menos. Una regulación negativa implicaría que las proteínas

dianas cumplirían una función positiva en las respuestas de defensa de la planta de

arroz frente a M. oryzae. Un cambio a tiempos cortos podría suponer que estos miRNAs

son reguladores de la respuesta temprana frente a infección; 2) miRNAs cuya

abundancia promedio en condiciones control en tejidos foliares sea al menos superior a

20 lecturas. Este valor ha sido fijado también como umbral por Campo et al. (2013) y

ayuda a seleccionar miRNAs que puedan ser detectados por análisis Northern blot o por

qRT-PCR; y 3) miRNAs cuyas potenciales dianas codifiquen proteínas que pudieran

cumplir funciones en las respuestas de defensa o frente a estrés abiótico. El análisis del

sRNA-seq utilizando los criterios indicados llevó a la selección de 10 miRNAs, que están

listados en la Tabla 4.

Utilizando el servidor en línea del programa bioinformático RNA-fold web server

(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi) se ha predicho la estructura secundaria

de los precursores de los miRNAs (pre-miRNAs) seleccionados que se muestran en la

Figura 35, indicando la posición donde se encuentra cada uno de los miRNAs. Los 10

miRNAs están organizados en 7 pre-miRNA distintos, puesto que los miRNAs osa-

Resultados

- 118 -

miR390-3p y osa-miR390-5p, los osa-miR535-3p y osa-miR535-5p, y los osa-miR1847.1 y

osa-miR1847.2 se encuentran a pares en los mismos precursores.

Todos los miRNAs seleccionados cumplen con los criterios mencionados más

arriba (Tabla 4), excepto osa-miR535-3p, que si bien presenta una disminución en su

acumulación, no llega al umbral fijado. Este miRNA, sin embargo, está asociado a osa-

miR535-5p por ser ambos parte del precursor osa-MIR535 y por este motivo también se

lo tuvo en cuenta en análisis posteriores. Como se muestra en la Figura 36, la

acumulación de los miRNAs seleccionados está regulada negativamente a tiempos

tempranos luego del tratamiento con elicitores de M. oryzae (30 minutos). Esta represión

se mantiene hasta 2 horas después del tratamiento en 5 de los miRNAs en estudio (osa-

miR535-3p, osa-miR535-5p, osa-miR1319a, osa-miR1847.2 y osa-miR5808), mientras que

en otros 5 (osa-miR390-3p, osa-miR390-5p, osa-miR397a, osa-miR397b y osa-

miR1847.1) se observa una ligera inducción en su acumulación después de 2 horas del

tratamiento.

Tabla 4. Selección de miRNAs reprimidos en respuesta al tratamiento con elicitores de M. oryzae. (a) Valores logarítmicos del cambio de acumulación en respuesta al tratamiento con una suspensión de elicitores de M. oryzae (300 μg/ml) en comparación con la solución control en los tejidos indicados de la planta de arroz (var. Nipponbare) y a los tiempos de tratamiento indicados. El criterio de selección fue: FC≤-0,5 en hojas). (b) Valores del promedio de lecturas (reads), en condiciones control sin tratar. El criterio de selección fue: R≥20 en hojas.

miRNA

FC: Cambio en la acumulación aR: Abundancia b

Hojas Raíces

30 min 2 hs 30 min 2 hs Hojas Raícesosa-miR390-3p -0,8254 0,1711 0,2145 0,8418 23 11,5osa-miR390-5p -0,6113 0,0197 0,0219 0,2568 148,5 23osa-miR397a -0,8062 0,1325 -0,2726 0,2601 2498 618,5osa-miR397b -0,8062 0,1325 -0,2726 0,2601 2498 618,5osa-miR535-3p -0,3645 -0,4095 -0,7151 0,1637 80 10,5osa-miR535-5p -0,5103 -0,2370 -0,3407 0,3861 238,5 36osa-miR1319a -1,7514 -1,7675 1,6069 0,0117 22,5 2,5osa-miR1847.1 -0,9889 0,2890 2,0219 - 26,5 1osa-miR1847.2 -1,0885 -0,2147 -0,7855 0,8418 84 8osa-miR5808 -0,6269 -0,2105 0,6499 1,0788 71 9


- 119 -

Figura 35. Precursores de los miRNAs seleccionados por su respuesta frente a elicitores de M. oryzae. Representación de la estructura secundaria en forma de horquilla de los pre-miRNAs seleccionados. Las secuencias de los pre-miRNAs fueron consultadas en la base de datos miRBase (www.mirbase.org) y sus estructuras secundarias fueron modeladas en la plataforma bioinformática en línea RNAfold web server (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi). Las barras indican la posición en la que se encuentran los miRNAs maduros producto del procesamiento de estos pre-miRNAs.

Figura 36. Perfiles de acumulación de los miRNAs seleccionados en respuesta a tratamiento con elicitores de M. oryzae en hojas de arroz. La gráfica representa el cambio logarítmico de la acumulación de los miRNAs seleccionados en respuesta a tratamientos con una suspensión de elicitores de M. oryzae (300 μg/ml) en hojas de arroz var. Nipponbare, a los 30 minutos y 2 horas post-tratamiento. Valores de la acumulación cuantificados por análisis de sRNA-seq. Se indica con una barra ancha el umbral del cambio en la acumulación fijado para la selección de los miRNAs (FC≤-0,5).

osa-MIR1319a

osa-miR1847.1

osa-miR1847.2

osa-MIR1847

osa-MIR390eeedddhhosa-MIR397a

osa-MIR5808

osa-MIR397b

osa-MIR535

osa-miR397b

osa-miR5808

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

Cam

bio

en la

acu

mul

ació

n(F

C; re

l.al

con

trol; l

og2)

30 min

2 hs

Resultados

- 120 -

En general, los miRNAs maduros que son producto del procesamiento de un

mismo precursor, tienen el mismo perfil de expresión, como ocurre en este caso para los

miRNAs de los precursores osa-MIR390 y osa-MIR535. En este análisis se encontró

llamativo que los miRNAs osa-miR1847.1 y osa-miR1847.2 tengan una respuesta opuesta

a las 2 horas de tratamiento, el primero presentando una inducción (0,28) y el segundo

reprimido (-0,21). Una posible explicación podría ser que estos miRNAs controlen la

regulación de ciertos tránscritos relacionados con defensa a tiempos cortos, y que con el

paso del tiempo tengan un papel regulador de otros procesos fisiológicos. Los

resultados para los niveles de acumulación de los miRNAs maduros osa-miR397a y osa-

miR397b son exactamente iguales. El miRNA con la respuesta más fuerte en respuesta a

elicitores es osa-miR1319a, observándose una represión continuada desde los 30

minutos (-1,75) hasta las 2 horas (-1,76).

2. Características de los miRNAs seleccionados

Las características genómicas, secuencias y evidencias experimentales de los

miRNAs seleccionados están recogidas en la Tabla 5, y es la información que consta en

las bases de datos indicadas. Según los datos, todos los miRNAs seleccionados han sido

previamente detectados mediante sRNA-seq de arroz y los osa-miR390-5p y osa-

miR535-5p además fueron analizados por Northern blot. No se han encontrado datos

que demuestren que estos miRNAs hayan sido relacionados previamente con las

respuestas de defensa.

Según Zhao & Li, (2013), los pre-miRNAs de O. sativa provienen de intrones

(aproximadamente 49% de ellos), de regiones intergénicas (35% de los casos), de UTRs

(cerca del 12%) o de exones (sólo 4%). El análisis genómico de los 7 precursores

seleccionados muestra que 5 de ellos se ubican en zonas intergénicas (osa-MIR390, osa-

MIR397a, osa-MIR397b, osa-MIR535 y osa-MIR1319a), uno de ellos es intrónico (osa-

MIR1847, ubicado dentro del tercer intrón del gen de resistencia a enfermedades

OsRPM1) y uno ubicado en la región 3’ UTR del gen que codifica el factor de


- 121 -

transcripción OsZOS9-16 (osa-MIR5808). Cabe destacar que el precursor osa-MIR1319a

se encuentra en una disposición genómica especial, ya que en la cadena opuesta del

DNA se ubica el gen OsLTPL6, codificante para una proteína de transporte de lípidos

(Lipid transfer protein-like). En la Figura 37 se muestra un esquema de la ubicación en el

genoma de los precursores intragénicos osa-MIR1827 y osa-MIR5808, y de osa-

MIR1319a.

Tabla 5. Características generales de los miRNAs seleccionados. (a) Secuencia nucleotídica de los miRNAs según la base de datos miRBase (www.mirbase.org). (b) Métodos utilizados y evidencias experimentales en los trabajos previos para la detección de los miRNAs. Consultado en miRBase y los artículos indicados. (c) Corresponde a la posición en el genoma del precursor, indicando el cromosoma, las coordenadas específicas y la cadena (+o-) en la que está codificado. (d) Tipo de precursor relativo a su posición génica: intergénica o intragénica (exónica, intrónica o secuencias no traducidas-UTR). En caso de ser intragénica, se indica además el locus y el nombre del gen que lo contiene. Consultado en la base de datos Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.msu.edu/).

miRNA Secuencia del miRNA a Evidencia experimental b Ubicación genómica del pprecursor c Tipo dde precursor d

osa-miR390-3p CGCUAUCUAUCCUGAGCUCC SmallRNA-seq Illumina(Du et al., 2011) Chr3: 34275140-34275230

Cadena [--] Intergénicoosa-miR390-5p AAGCUCAGGAGGGAUAGCGCC Northern blot

(Sunkar et al., 2005)

osa-miR397a UCAUUGAGUGCAGCGUUGAUG SmallRNA-seq Illumina(Wu et al., 2009)

Chr6: 28489768-28489911Cadena [+] Intergénico

osa-miR397b UUAUUGAGUGCAGCGUUGAUG SmallRNA-seq Illumina(Wu et al., 2009)

Chr2: 3280781-3280898Cadena [--] Intergénico

osa-miR535-3p GUGCUUUCUCCCGUUGUCACU SmallRNA-seq Illumina(Du et al., 2011) Chr11: 16290530-16290623

Cadena [--] Intergénicoosa-miR535-5p UGACAACGAGAGAGAGCACGC Northern blot

(Arazi et al., 2005)

osa-miR1319a AACCGGCAUCUGUAAUAUAUUAUA SmallRNA-seq Roche 454(Morin et al., 2008)

Chr11: 702071-702191Cadena [--] Intergénico

osa-miR1847.1 UGCAGUUUGCAGUUGUGGCAC SmallRNA-seq Roche 454(Zhu et al., 2008) Chr1: 20332878-20332987

Cadena [+]

Intragénico: IntrónicoOsRPM1LOC_Os01g36640osa-miR1847.2 UGGCCCACAUGUUAGUGCCACAAC SmallRNA-seq Roche 454

(Zhu et al., 2008)

osa-miR5808 ACUAAAUCGUUUCUGAUCGUUGGA SmallRNA-seq Illumina(Jeong et al., 2011)

Chr9: 18739255-18739333Cadena [+]

Intragénico: 3’ UTROsZOS9-16LOC_Os09g31140

Resultados

- 122 -

Se ha realizado también un análisis de la conservación de los miRNAs

seleccionados en diferentes especies vegetales, tanto monocotiledóneas como

dicotiledóneas (Tabla 6). Este análisis de conservación se basó en la presencia o ausencia

de pre-miRNAs homólogos anotados en el genoma de las especies y se han analizado

sólo aquellas que presentan un mayor número de precursores anotados en la base de

datos miRBase (www.mirbase.org). Entre las monocotiledóneas, además de O. sativa, las

especies que tienen más anotaciones son Brachypodium distachyon, Sorghum bicolor,

Zea mays, Triticum aestivum y Hordeum vulgare. Entre las dicotiledóneas con mayor

número de pre-miRNAs anotados se encuentran las especies Glycine max, Arabidopsis

Figura 37. Localización genómica de los precursores osa-MIR1319a, osa-MIR1847 y osa-MIR5808. Representación gráfica que indica la ubicación en el genoma de osa-MIR1319a con respecto al gen adyacente OsLTPL6 (LOC_Os11g02379) (A) y de los precursores intragénicos osa-MIR1847 (B) y osa-MIR5808 (C) respecto a los genes que los contienen OsRPM1 (LOC_Os01g36640) y OsZOS9-16 (LOC_Os09g31140), respectivamente. Las líneas discontinuas corresponden a la doble cadena de DNA. Las barras anchas en los genes corresponden a las regiones no traducidas-UTRs (claras) y exones (oscuras). Las líneas continuas corresponden a los intrones. Las barras anchas en los MIR corresponden al precursor (claras) y a los miRNAs maduros (oscuras). Localizaciones genómicas consultadas en la base de datos Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.msu.edu/).

LOC_Os11g02379OsLTPL6

Cromosoma 11

697kb 703kb

osa-MIR1319a

A

B

LOC_Os01g36640OsRPM1

Cromosoma 1

20328kb 20335kb

osa-MIR1847

C

LOC_Os09g31140OsZOS9-16

Cromosoma 9

18735kb 18740kb

osa-MIR5808


- 123 -

thaliana, Solanum tuberosum, Nicotiana tabacum, así como las arbóreas Medicago

truncatula, Populus trichocarpa, Vitis vinifera y Malus domestica. Todas estas especies

evaluadas son además de gran importancia agrícola y plantas modelo en investigación.

Entre los miRNAs seleccionados, el MIR397 y el MIR390 son los más conservados,

mientras que se ha visto baja conservación evolutiva para los miRNAs MIR535, MIR1319,

MIR1847 y MIR5808. El MIR397 se encuentra en todas las especies analizadas, siendo el

más conservado de todos ellos. En cambio, el MIR390 está conservado en casi todas las

especies dicotiledóneas excepto en M. domestica, mientras que en algunas

monocotiledóneas no se encuentra, como H. vulgare y T. aestivum. Curiosamente, el

MIR535 sólo se ha encontrado en arroz y en especies arbóreas como V. vinifera y M.

domestica, no encontrándose en otras monocotiledóneas ni en especies dicotiledóneas

menores. El MIR1847 sólo está conservado en las monocotiledóneas O. sativa y T.

aestivum. No se ha visto conservación para los miRNAs MIR5808 y MIR1319, por lo que

hasta ahora se consideran específicos de arroz, y este último posee dos distintos

precursores miembros (osa-MIR1319a y osa-MIR1319b).

Tabla 6. Conservación en diferentes especies de los miRNAs seleccionados. En la tabla se indica la presencia (+) o ausencia (-- ) de genes MIR homólogos de los miRNAs de arroz seleccionados en las diferentes especies vegetales indicadas de acuerdo a los datos del miRBase (www.mirbase.org). Hv: Hordeum vulgare; Ta: Triticum aestivum; Zm: Zea mays; Sb: Sorghum bicolor; Bd: Brachypodium distachyon; At: Arabidopsis thaliana; Gm: Glycine max; St: Solanum tuberosum; Nt: Nicotiana tabacum; Pt: Populus trichocarpa; Mt: Medicago truncatula; Vv: Vitis vinifera; Md: Malus domestica.

miRNAMonocotiledóneas Dicotiledóneas

Hv Ta Zm Sb Bd At Gm St Nt Pt Mt Vv Md

MIR390 -- -- + + + + + + + + + + --MIR397 + + + + + + + + + + + + +MIR535 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- + +MIR1319 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --MIR1847 -- + -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --MIR5808 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --

Resultados

- 124 -

3. Identificación de los tránscritos dianas de los miRNAs seleccionados

3.1 Predicción bioinformática de dianas

Para determinar las dianas de los miRNAs seleccionados, en primer lugar, se

realizó una predicción in silico utilizando las plataformas bioinformáticas en línea

psRNATarget (Dai & Zhao, 2011) y UEA sRNA toolkit (Moxon et al., 2008). Los resultados

obtenidos se muestran en la Tabla 7, donde se incluyen potenciales tránscritos dianas

excluyendo los codificantes para proteínas desconocidas y transposones.

Tabla 7. Predicción bioinformática de dianas de los miRNAs seleccionados. Se indican los miRNAs (a); los loci de las dianas potenciales (b) según la predicción in silico utilizando las plataformas bioinformáticas en línea psRNATarget (http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/) y UEA sRNA toolkit (http://srna-tools.cmp.uea.ac.uk/); posición inicial (c) y final (d) del apareamiento del miRNA con la diana; las descripciones de las proteínas que codifican las potenciales dianas (e); las anotaciones funcionales de esas proteínas (f) según la base de datos Uniprot (http://www.uniprot.org/) utilizando el siguiente código: D, desarrollo; DEF, defensa; E, estrés; EA, estrés abiótico; EO, estrés oxidativo; M, metabolismo; PRNA, procesamiento de RNAs; S, señalización; SAU, señalización por auxinas; T, transporte.

miRNA a Diana b Inicio cc Final d Descripción e Función f

osa-miR390-3p

LOC_Os02g41550 2710 2729 FAD binding domain of DNA photolyase domain containing protein, expressed DLOC_Os06g36990 3065 3084 phospholipid-transporting ATPase 4, putative, expressed MLOC_Os06g49030 682 701 activator of 90 kDa heat shock protein ATPase homolog, putative, expressed M,EALOC_Os09g27080 2266 2285 axi 1 like protein, growth regulator related protein, putative, expressed D

osa-miR390-5p

LOC_Os01g33110 1664 1684 RLK5-receptor-like protein kinase 5 precursor, putative, expressed SLOC_Os02g10100 2170 2190 LRREXS-leucine-rich repeat receptor protein kinase EXS precursor, putative, expressed SLOC_Os03g51040 784 804 ATP binding protein, STRUBBELIG-RECEPTOR FAMILY 6 precursor, putative, expressed SLOC_Os04g29960 1966 1986 OsWAK43 - OsWAK receptor-like protein kinase, expressed SLOC_Os04g29990 1741 1761 OsWAK44 - OsWAK receptor-like protein kinase, expressed SLOC_Os04g30060 622 642 wall-associated receptor kinase-like 10 precursor, putative, expressed SLOC_Os04g30330 1078 1098 OsWAK59 - OsWAK receptor-like cytoplasmic kinase OsWAK-RLCK, expressed SLOC_Os04g45170 496 516 leucine-rich repeat family protein, putative, expressed SLOC_Os04g46700 777 796 ABC family transporter: toluene tolerance, putative, expressed TLOC_Os05g33160 1812 1832 OsBAK-Brassinosteroid insensitive 1-associated receptor kinase, putative, expressed SLOC_Os06g03970 1608 1628 OsSIK1-receptor-like protein kinase 5 precursor, putative, expressed S, EALOC_Os11g36140 1033 1053 RLK2-receptor-like protein kinase 2 precursor, putative, expressed S

osa-miR397a

LOC_Os01g44330 681 701 OsLAC2-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EOLOC_Os01g62480 793 813 OsLAC4-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EOLOC_Os01g62490 761 781 OsLAC26-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EOLOC_Os01g63200 666 686 OsLAC8-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EOLOC_Os02g01710 1626 1645 peptidase family C78 domain containing protein, expressed MLOC_Os03g16610 782 801 OsLAC10-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EOLOC_Os05g38410 747 767 OsLAC12-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EOLOC_Os05g38420 747 767 OsLAC13-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EOLOC_Os07g31310 480 499 PPR repeat domain containing protein, putative, expressed PRNALOC_Os08g35210 2841 2860 ferric reductase like transmembrane component family protein, putative, expressed TLOC_Os10g03850 409 429 OsFBX352 - F-box domain containing protein, expressed MLOC_Os10g04900 671 691 OsFBX364 - F-box domain containing protein, expressed MLOC_Os11g48060 1158 1178 OsLAC22-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EO

osa-miR397b

LOC_Os01g44330 681 701 OsLAC2-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EOLOC_Os01g62490 761 781 OsLAC26-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EOLOC_Os01g63180 678 698 OsLAC6-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EOLOC_Os01g63200 666 686 OsLAC8-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EOLOC_Os02g01030 781 800 hsc70-interacting, tetratricopeptide repeat domain containing protein, expressed M, D, EALOC_Os03g16610 782 801 OsLAC10-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EOLOC_Os05g38410 747 767 OsLAC12-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EOLOC_Os05g38420 747 767 OsLAC13-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EOLOC_Os07g31310 480 499 PPR repeat domain containing protein, putative, expressed PRNALOC_Os08g35210 2841 2860 ferric reductase, putative, expressed TLOC_Os09g27950 569 588 avr9 elicitor response protein, galactosyltransferase, putative, expressed DEFLOC_Os10g04900 671 691 OsFBX364 - F-box domain containing protein, expressed MLOC_Os11g48060 1158 1178 OsLAC22-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EOLOC_Os12g15680 747 767 OsLAC24-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed M, EO


- 125 -

Como dianas predichas para osa-miR390-3p fueron encontrados 4 genes

codificantes para proteínas relacionadas con desarrollo y metabolismo, como la proteína

Axi-1, relacionada con la regulación del crecimiento mediado por auxinas, y un activador

de proteínas de choque térmico, la cual podría ser mediadora en la respuesta a estrés

abiótico. Para el miRNA osa-miR390-5p se han predicho como dianas un total de 10

tránscritos de proteínas quinasas, un factor de transcripción y un transportador. Entre

estas proteínas quinasas se encuentran varias WAK (Wall-associated kinases) y RLK

(Receptor-like kinases), las cuales podrían tener un papel en la detección y traducción de

señales frente a estreses bióticos y abióticos, respuesta a hormonas o señales

ambientales. Una de las posibles dianas codifica a la proteína OsSIK1, que ha sido

descrita en la tolerancia al estrés hídrico y salino (Ouyang et al., 2010).

El caso de los osa-MIR397 es particular, pues al ser casi idénticos tienen también

casi las mismas dianas predichas, las cuales son principalmente codificantes para

proteínas lacasas, implicadas en el metabolismo de ligninas y en el estrés oxidativo. De

hecho, dos de estas lacasas ya han sido confirmadas experimentalmente como dianas

de estos miRNAs (Zhang et al., 2013). También se encontraron como posibles dianas

algunos factores de transcripción con dominio F-box. Los miembros osa-miR397 difieren

Tabla 7. Continuación.

a b d e f

_ g p , p , p ,osa-miR535-3p LOC_Os12g26030 3119 3139 FACT complex subunit SPT16, cell division control protein 68, putative, expressed D

osa-miR535-5p

LOC_Os02g07780 985 1005 OsSPL4 - SBP-box gene family member, expressed DLOC_Os04g47580 1241 1260 cyclin B2, Cyclin, N-terminal domain, putative, expressed DLOC_Os06g45310 852 872 OsSPL11 - SBP-box gene family member, expressed DLOC_Os06g49010 2443 2463 OsSPL12 - SBP-box gene family member, expressed DLOC_Os11g30370 1089 1109 OsSPL19 - SBP-box gene family member, expressed D

osa-miR1319a LOC_Os09g25770 663 682 auxin-induced, nodulin-like protein 5NG4, putative, expressed SAU, TLOC_Os11g02379 1207 1230 OsLTPL6 - Protease inhibitor/seed storage/LTP family protein precursor, expressed M, D, DEF

osa-miR1847.1

LOC_Os01g52250 2158 2178 starch/glycogen synthase, putative, expressed MLOC_Os01g63190 154 173 OsLAC7-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed [PFAM] M, EOLOC_Os03g01180 420 439 phosphoglycerate mutase pRIB5 protein, putative, expressed MLOC_Os03g12450 824 843 nucleoporin, putative, expressed DLOC_Os09g25430 933 952 ZOS9-07, C2H2 zinc finger protein, expressed D, ELOC_Os09g38390 2414 2434 cytoeskeletal protein, octicosapeptide/Phox/Bem1p, putative, expressed DLOC_Os10g31856 2483 2503 ATP binding protein, putative, expressed [PFAM] DLOC_Os12g29760 1251 1270 oxidoreductase, aldo/keto reductase family protein, putative, expressed M

osa-miR1847.2LOC_Os01g31980 436 455 MATE efflux family protein, putative, expressed TLOC_Os01g42040 2145 2164 ubiquitin-conjugating enzyme, putative, expressed MLOC_Os08g30780 1903 1924 ATATH3, ABC transporter, ATP-binding protein, putative, expressed T

osa-miR5808

LOC_Os01g33350 1184 1203 zinc-binding protein, PLATZ transcription factor, putative, expressed DLOC_Os01g43490 1490 1513 polygalacturonase, putative, expressed MLOC_Os01g69930 575 598 dnaJ domain containing protein, expressed D, ELOC_Os04g53060 3600 3623 NBS-LRR disease resistance protein, putative, expressed DEFLOC_Os06g03120 1594 1617 aspartic proteinase nepenthesin-2 precursor, putative, expressed MLOC_Os09g31140 1083 1106 OsZOS9-16 - C2H2 zinc finger protein, expressed D, ELOC_Os10g38540 920 943 glutathione S-transferase, putative, expressed D, E

Resultados

- 126 -

entre sí en un solo nucleótido, y esto podría ser determinante para que osa-miR397b

tenga como dianas potenciales además a los mensajeros de una proteína de respuesta

a elicitores y otra de interacción con proteínas de choque térmico, las cuales podrían

tener funciones en respuesta de defensa y estrés abiótico, respectivamente. Esta

característica podría significar una diferenciación funcional entre ambos miembros.

Las dianas predichas para los miRNAs maduros de osa-MIR535 codifican

proteínas implicadas en el desarrollo. Para el osa-miR535-3p se ha predicho una sola

diana, que está relacionada con la división celular. Entre las potenciales dianas de osa-

miR535-5p se encuentran varios genes codificantes de factores de transcripción del tipo

SPL (Squamosa-promoter binding protein-like). Esta familia de FTs está funcionalmente

implicada en el control del desarrollo tanto vegetativo como reproductivo. Además se

conoce que la acumulación de tránscritos de varios genes SPL está regulada post-

transcripcionalmente por la familia miR156 (Wang et al., 2009b).

Los tránscritos predichos como dianas para osa-miR1319a fueron los codificantes

para una proteína transportadora de inducción por auxinas y para la proteína de

transferencia de lípidos OsLTPL6, la cual ya ha sido presentada más arriba, porque el

gen OsLTPL6 y el precursor osa-MIR1319a se encuentran ubicados en el mismo sitio del

genoma, pero en la cadena opuesta del DNA. Las proteínas LTP de plantas han sido

descritas en el metabolismo de lípidos, en el desarrollo y relacionadas con las respuestas

de defensa (Kader, 1996).

Curiosamente, osa-miR1847.1 tiene como posible diana a otra lacasa, diferente a

las predichas para los osa-miR397. Se encontraron además mensajeros codificantes de

factores de transcripción y enzimas relacionadas con el desarrollo y el metabolismo. En

el caso de osa-miR1847.2 se encontraron dos tránscritos codificantes de proteínas de

transporte, entre las que está una detoxificadora del tipo MATE (Multi-antimicrobial

extrusión protein), la cual podría estar implicada en respuestas frente a patógenos.


- 127 -

Para osa-miR5808 fueron predichos como dianas, entre otros, tránscritos

codificantes para factores de transcripción como la proteína dedo de zinc OsZOS9-16,

mencionada anteriormente cuando se describió que el precursor del miRNA se ubica en

la zona 3’ UTR de este mensajero. Esta disposición genómica podría indicar la evolución

conjunta como un mecanismo de autorregulación. Además se encontraron como

posibles dianas genes relacionados con defensa y estrés oxidativo, como una proteína

del tipo NBS-LRR de resistencia a enfermedades, una proteína glutatión transferasa, una

proteasa y una proteína con un dominio dnaJ.

En resumen, muchos de los transcritos dianas predichos para los miRNAs

seleccionados podrían tener funciones en la respuesta de defensa de la planta de arroz,

además de en la respuesta a otros estreses ambientales.

3.2 Dianas validadas y descritas en la literatura

En trabajos realizados previamente en arroz, han sido descritas dianas para

algunos de los miRNAs seleccionados y se listan en la Tabla 8. El miRNA osa-miR390-5p,

tiene como dianas los tránscritos codificantes para 3 proteínas quinasas (Sunkar et al.,

2005; Zhou et al., 2010) y 4 tasiRNAs (trans-acting small interfering RNAs) que regulan

proteínas tipo ARF (Auxin response factor) (Zhu et al., 2008), todas validadas

funcionalmente. Así también, ambos miembros osa-miR397 tienen descritas a dos

lacasas y se ha validado funcionalmente la implicancia de esta interacción en la

producción de semillas (Li et al., 2011b; Zhang et al., 2013). Otra lacasa también ha sido

descrita por análisis de degradoma para estos miRNAs (Li et al., 2010a). Por análisis de

degradoma se han validado dos dianas para osa-miR1847.1, correspondiente a los

tránscritos de una proteína de función desconocida y una proteína de dominio ACT (Li

et al., 2010a).

Resultados

- 128 -

3.3 Validación de dianas por análisis de degradoma

Fueron analizados los datos de la secuenciación masiva de tránscritos

degradados por miRNAs en hojas de arroz en respuesta a elicitores de M. oryzae y los

resultados se detallan en la Tabla 9. El análisis del degradoma nos permitió validar

algunas dianas de los miRNAs seleccionados. Se han encontrado tránscritos codificantes

degradados por 6 de los miRNAs seleccionados: osa-miR390-3p, osa-miR390-5p, osa-

miR397b, osa-miR1319a, osa-miR1847.2 y osa-miR5808. Entre las dianas validadas se

encuentran algunas codificantes de proteínas que podrían ser funcionales en vías de

señalización (quinasas), expresión de genes relacionados con defensa (factores de

transcripción), cambio en el flujo de iones de la célula y protección frente a patógenos

Tabla 8. Revisión de dianas descritas para los miRNAs seleccionados. Se indican los miRNAs (a); los loci y la anotación de los tránscritos dianas (b); el método experimental utilizado para validar la interacción entre el miRNA y su diana (c); las publicaciones donde se validaron las dianas (d); posible función de la proteína codificada por el tránscrito diana (e), usando el siguiente código: D, desarrollo; EO, estrés oxidativo; M, metabolismo; PRNA, procesamiento de RNAs; S, señalización; SAU, señalización por auxinas. Datos consultados en las bases de datos TARBase v7.0 (http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=tarbase/index) y Uniprot (http://www.uniprot.org/) y en los artículos indicados en (d).

miRNA a Diana y descripción b Validación eexperimental c Referencia d Función ee

osa-miR390-3p Sin datos - -

osa-miR390-5p

LOC_Os02g10100: leucine-rich repeat receptor protein kinase EXS precursor FuncionalDegradoma

Sunkar et al. (2005)Zhou et al. (2010) S

LOC_Os08g34650: receptor-like protein kinase precursor, putative, expressed Funcional Sunkar et al. (2005) SLOC_Os11g36140: receptor-like protein kinase 2 precursor, putative, expressed Funcional Sunkar et al. (2005) SOsTAS3a1, OsTAS3a2, OsTAS3b1, OsTAS3b2 Funcional Zhu et al. (2008) SAU, PRNA

osa-miR397a

LOC_Os05g38410: L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed Funcional Zhang et al. (2013) M, EO, D

LOC_Os05g38420: L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed Funcional Zhang et al. (2013)Li et al. (2011) M, EO, D

LOC_Os11g48060: L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed Degradoma Li et al. (2010) M, EO, D

osa-miR397b

LOC_Os05g38410: L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed Funcional Zhang et al. (2013) M, EO, D

LOC_Os05g38420: L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed Funcional Zhang et al. (2013)Li et al. (2011) M, EO, D

LOC_Os11g48060: L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed Degradoma Li et al. (2010) M, EO, Dosa-miR535-3p Sin datos - -osa-miR535-5p Sin datos - -osa-miR1319a Sin datos - -

osa-miR1847.1LOC_Os02g34990: ACT domain containing protein Degradoma Li et al. (2010) MLOC_Os04g39170: expressed protein Degradoma Li et al. (2010) -

osa-miR1847.2 Sin datos - -osa-miR5808 Sin datos - -


- 129 -

(LTP). A excepción de la proteína AGO, que cumple funciones en el procesamiento de

sRNAs, ninguna de las dianas validadas mediante degradoma para los miRNAs

seleccionados tiene función conocida. Los sitios específicos de corte por el miRNA para

cada diana se señalan en la Figura 38. No se hallaron tránscritos degradados por los

miRNAs osa-miR1847.1, osa-miR535-3p, osa-miR535-5p y por osa-miR397a.

En la Tabla 10 se presenta un resumen sobre las dianas predichas, descritas y

validadas por degradoma en este trabajo. Algunas de las dianas que han sido predichas

para los miRNAs seleccionados ya han sido descritas y validadas en trabajos previos,

como para osa-miR390-5p dos quinasas (LOC_Os02g10100 y LOC_Os11g36140) y para

los osa-miR397 dos lacasas (LOC_Os05g38410 y LOC_Os05g38410). El hecho más

destacable es que en este trabajo se ha realizado la predicción de OsLTPL6 como diana

para osa-miR1319a y se ha validado la interacción entre estos componentes reguladores

en respuesta a elicitores fúngicos por análisis de degradoma.

Tabla 9. Tránscritos degradados por los miRNAs seleccionados en hojas de arroz en respuesta a elicitores de M. oryzae. Datos del degradoma realizado en hojas de plantas de arroz var. Nipponbare tratadas con una suspensión de elicitores de M. oryzae (300 μg/ml). Se indican los miRNAs (a); los tránscritos degradados por los miRNAs seleccionados (b); el sitio de corte del tránscrito diana por el miRNA (c); el valor de la probabilidad estadística (p≤0,05) (d); la complementariedad específica del miRNA con la secuencia diana según la descripción de Zhang (2005), donde 0 es óptimo y 5 supone mayores probabilidades de encontrar falsos positivos (e); la posible función según la base de datos Uniprot (http://www.uniprot.org/) (f), donde: D, desarrollo; DEF, defensa; M, metabolismo; PRNA, procesamiento de RNAs; S, señalización; T, transporte.

miRNA a Diana y descripción b Corte c p-valor d Score e Función ff

osa-miR390-3p LOC_Os06g42850.1 cDNA|extracellular ligand-gated ion channel 1655 0.03 3.0 T

osa-miR390-5pLOC_Os01g51200.2 cDNA|CK1_CaseinKinase_1.3 - CK1 1076 0.0 4.5

SLOC_Os01g51200.1 cDNA|CK1_CaseinKinase_1.3 - CK1 1017 0.03 4.5

osa-miR397a Ninguna - - - -

osa-miR397b

LOC_Os05g48970.2 cDNA|zinc finger, C3HC4 type domain containing protein 1045 0.01 3.0LOC_Os02g34600.2 cDNA|CAMK_CAMK_like.13 – CAMK 646 0.02 3.0

SLOC_Os02g34600.1 cDNA|CAMK_CAMK_like.13 – CAMK 646 0.01 3.0

osa-miR535-3p Ninguna - - - -

osa-miR535-5p Ninguna - - - -

osa-miR1319a LOC_Os11g02379.1 cDNA|LTPL6 - Protease inhibitor/seed storage/LTP family 1221 0.0 0.0 M, D, DEF

osa-miR1847.1 Ninguna - - - -

osa-miR1847.2LOC_Os04g06770.1 cDNA|argonaute, putative 2511 0.0 4.0 PRNALOC_Os04g06770.2 cDNA|argonaute, putative 2678 0.0 4.0 PRNA

osa-miR5808 LOC_Os06g13190.1 cDNA|expressed protein 623 0.0 2.0 -

Resultados

- 130 -

Figura 38. Sitio de corte de las dianas de los miRNAs seleccionados. Representación gráfica que indica el sitio de corte por los miRNAs estudiados. Las barras anchas corresponden a UTRs (claras) y exones (oscuras). Las barras finas corresponden a intrones. Gráficos de los genes tomados de Plaza 3.0 (http://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/ - Proost et al., 2014).

Tabla 10. Resumen de las dianas de los miRNAs seleccionados identificados in silico, descritas en la literatura y en el análisis de la secuenciación del degradoma.

LOC_Os11g02379

LOC_Os04g06770

LOC_Os06g42850

LOC_Os01g51200

LOC_Os05g48970

LOC_Os02g34600

LOC_Os06g13190

osa-miR1319a

osa-miR1847.2

osa-miR390-3p

osa-miR390-5p

osa-miR397b

osa-miR397b

osa-miR5808

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

miRNA Diana In silico Descrita Degradoma

osa-miR390-3pLOC_Os06g42850 extracellular ligand-gated ion channel -- -- +LOC_Os06g49030 activator of 90 kDa heat shock protein ATPase homolog, putative, expressed + -- --

osa-miR390-5p

LOC_Os01g33110 RLK5-receptor-like protein kinase 5 precursor, putative, expressed + -- --LOC_Os01g51200 CK1_CaseinKinase_1.3 - CK1 -- -- +LOC_Os02g10100 LRREXS-leucine-rich repeat receptor protein kinase EXS precursor, putative, expressed + + --LOC_Os04g29960 OsWAK43 - OsWAK receptor-like protein kinase, expressed + -- --LOC_Os04g29990 OsWAK44 - OsWAK receptor-like protein kinase, expressed + -- --LOC_Os04g30060 wall-associated receptor kinase-like 10 precursor, putative, expressed + -- --LOC_Os04g30330 OsWAK59 - OsWAK receptor-like cytoplasmic kinase OsWAK-RLCK, expressed + -- --LOC_Os04g45170 leucine-rich repeat family protein, putative, expressed + -- --LOC_Os05g33160 OsBAK1-Brassinosteroid insensitive 1-associated receptor kinase 1, putative, expressed + -- --LOC_Os06g03970 OsSIK1-receptor-like protein kinase 5 precursor, putative, expressed + -- --LOC_Os08g34650 receptor-like protein kinase precursor, putative, expressed -- + --LOC_Os11g36140 RLK2-receptor-like protein kinase 2 precursor, putative, expressed + + --

osa-miR397a

LOC_Os01g44330 OsLAC2-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + -- --LOC_Os01g62480 OsLAC4-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + -- --LOC_Os01g62490 OsLAC26-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + -- --LOC_Os01g63200 OsLAC8-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + -- --LOC_Os03g16610 OsLAC10-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + -- --LOC_Os05g38410 OsLAC12-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + + --LOC_Os05g38420 OsLAC13-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + + --LOC_Os11g48060 OsLAC22-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + + --


- 131 -

4. Análisis in silico de los promotores de los pre-miRNAs

Para profundizar en la caracterización de estos miRNAs se realizó un análisis in

silico de la región promotora de los precursores seleccionados. Como ya se mencionó

anteriormente, 2 de los precursores seleccionados se ubican en regiones intragénicas,

uno de ellos es el precursor osa-MIR1847 que se localiza en un intrón del gen OsRPM1, y

el otro es osa-MIR5808 que se encuentra en la zona 3’ UTR del gen OsZOS9-16. La

expresión de estos precursores podría estar sometida a la actividad del promotor del

gen que los contienen, como se ha descrito para otros miRNAs intragénicos de

Arabidopsis y arroz (Yang et al., 2012). De ser este el caso, la expresión del precursor

osa-MIR1847 podría estar ligada a la regulación del gen OsRPM1, un gen que responde a

la infección por patógenos (Tornero et al., 2002) y la del precursor osa-MIR5808

depender de la expresión de OsZOS9-16, del cual no se conoce su función. Aunque

Tabla 10. Continuación.

osa-miR397b

LOC_Os01g44330 OsLAC2-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + -- --LOC_Os01g62490 OsLAC26-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + -- --LOC_Os01g63180 OsLAC6-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + -- --LOC_Os01g63200 OsLAC8-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + -- --LOC_Os02g01030 hsc70-interacting, tetratricopeptide repeat domain containing protein, expressed + -- --LOC_Os02g34600 CAMK_CAMK_like.13 – CAMK -- -- +LOC_Os03g16610 OsLAC10-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + -- --LOC_Os05g38410 OsLAC12-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + + --LOC_Os05g38420 OsLAC13-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + + --LOC_Os05g48970 zinc finger, C3HC4 type domain containing protein -- -- +LOC_Os09g27950 avr9 elicitor response protein, galactosyltransferase, putative, expressed + -- --LOC_Os11g48060 OsLAC22-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + + --LOC_Os12g15680 OsLAC24-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed + -- --

osa-miR535-3p LOC_Os12g26030 FACT complex subunit SPT16, cell division control protein 68, putative, expressed + -- --

osa-miR535-5p

LOC_Os02g07780 OsSPL4 - SBP-box gene family member, expressed + -- --LOC_Os06g45310 OsSPL11 - SBP-box gene family member, expressed + -- --LOC_Os06g49010 OsSPL12 - SBP-box gene family member, expressed + -- --LOC_Os11g30370 OsSPL19 - SBP-box gene family member, expressed + -- --

osa-miR1319a LOC_Os11g02379 OsLTPL6 - Protease inhibitor/seed storage/LTP family protein precursor, expressed + -- +

osa-miR1847.1

LOC_Os01g63190 OsLAC7-L-ascorbate oxidase precursor, putative, expressed [PFAM] + -- --LOC_Os02g34990 ACT domain containing protein -- + --LOC_Os04g39170 expressed protein -- + --LOC_Os09g25430 ZOS9-07, C2H2 zinc finger protein, expressed + -- --

osa-miR1847.2LOC_Os01g31980 MATE efflux family protein, putative, expressed + -- --LOC_Os04g06770 argonaute, putative -- -- +LOC_Os08g30780 ATATH3, ABC transporter, ATP-binding protein, putative, expressed + -- --

osa-miR5808

LOC_Os01g69930 dnaJ domain containing protein, expressed + -- --LOC_Os04g53060 NBS-LRR disease resistance protein, putative, expressed + -- --LOC_Os06g13190 expressed protein -- -- +LOC_Os09g31140 OsZOS9-16 - C2H2 zinc finger protein, expressed + -- --LOC_Os10g38540 glutathione S-transferase, putative, expressed + -- --

Resultados

- 132 -

tampoco se podría descartar que estos precursores posean sus propias regiones

promotoras ya que la regulación de los miRNAs intragénicos continúa siendo una

incógnita en plantas. Existen herramientas para el reconocimiento de promotores para

miRNAs intragénicos, sin embargo sólo está disponible para miRNAs de animales, no

para plantas (Marsico et al., 2013). En este trabajo no se ha analizado si estos

precursores poseen o no su propio promotor, por lo que en el análisis de promotores

no fueron incluídos.

Se sabe que los miRNAs son producto del procesamiento inicial de un tránscrito

primario (pri-miRNA), que contiene en su secuencia el pre-miRNA que se pliega en una

estructura secundaria en forma de horquilla. Para realizar el análisis de los promotores

de los miRNAs seleccionados, primeramente se ha hecho la predicción del sitio de inicio

de la transcripción (TSS - Transcription start site) de los pri-miRNAs seleccionados. Este

análisis se realizó desde la plataforma bioinformática en línea Softberry y su programa

de predicción del inicio de la transcripción (www.softberry.com). En la Figura 39 se

representa el sitio del inicio de la transcripción predicho para osa-MIR390, que inicia 1197

pb antes del pre-miRNA; osa-MIR397a, 148 pb; osa-MIR397b, 936 pb; osa-MIR535, 756

pb; y osa-MIR1319a, 88 pb.

El análisis in silico de los promotores se realizó tomando las secuencias

correspondientes a los 1500 pb antes del inicio de la transcripción predicho y las

ubicadas entre el TSS y el inicio del pre-miRNA, utilizando la herramienta bioinformática

de análisis de promotores en línea PlantCARE. En la Tabla 11 se presenta un resumen

indicando la presencia o ausencia de elementos relacionados con la respuesta de

defensa, la posible respuesta a estrés hídrico, térmico y a hormonas, mientras que la

Figura 39 representa un esquema de las secuencias analizadas posicionando los

elementos reguladores encontrados, principalmente los de respuesta de defensa y a

estrés abiótico (sequía, estrés osmótico, frío, calor, salinidad y condiciones anaeróbicas),

así como las hormonas vegetales implicadas en la respuesta a estos estreses. No se han


- 133 -

encontrado elementos reguladores relacionados con salinidad en las secuencias

promotoras de estos miRNAs. Resulta destacable que todos los promotores analizados

presentan 3 o más elementos relacionados con sequía, como los sitios de unión a

factores de transcripción del tipo MYB (CCAAT, CAACTG) y de respuesta a ABA

(CACGTG, CCGCCGCGCT). También la mayoría de ellos presentan elementos

relacionados con la respuesta de defensa u hormonas mediadoras como el JA, ET o el

SA, como cajas de respuesta a elicitores (TTGACC) en los promotores de osa-MIR397a,

osa-MIR397b y osa-MIR1319a; de respuesta a hormonas como el ET (ATTTCAAA) en osa-

MIR390 y en osa-MIR397b, el JA (CGTCA) en todos excepto en osa-MIR397b y el SA

(GAGAAGAATA) en osa-MIR390, osa-MIR397b y osa-MIR1319a. Se ha visto también que

todos los promotores presentan elementos reguladores de respuesta a temperaturas

extremas como a calor (AGAAAATTCG) y en los promotores de osa-MIR390, osa-

MIR397b y osa-MIR535 también de respuesta a frío (CCGAAA).

En resumen, el análisis de los promotores de los miRNAs seleccionados sugiere

que su expresión podría estar regulada durante la respuesta de defensa, la respuesta a

estrés hídrico y el térmico.

Tabla 11. Elementos reguladores en los promotores de los miRNAs seleccionados. Presencia (+) o ausencia (-) de elementos de respuesta a las hormonas ácido jasmónico (JA), ácido salicílico (SA), etileno (ET) y ácido abscísico (ABA), a elicitores, defensa, sequía y estrés térmico (frío y/o calor), en las en las secuencias promotoras (1500 pb antes del inicio de la transcripción) de los precursores osa-MIR390, osa-MIR397a, osa-MIR397b, osa-MIR535 y osa-MIR1319a.

miRNAElementos reguladores de respuesta a factores relacionados con estrés

JA SA ET ABA Defensa Elicitores Sequía Tº

osa-MIR390 + -- + + -- -- + +osa-MIR397a + -- -- + + + + +osa-MIR397b -- + + + + + + +osa-MIR535 + -- -- + + -- + +

osa-MIR1319a + + -- + -- + + +

Resultados

- 134 -

Figura 39. Análisis de los promotores de los miRNAs seleccionados. Se detallan los elementos regulatorios relacionados con defensa, sequía y estreses abióticos, entre otros, presentes en las secuencias de la región promotora de osa-MIR390 (A), osa-MIR397a (B), osa-MIR397b (C), osa-MIR535 (D) y osa-MIR1319a (E). Las flechas gruesas corresponden al sitio de inicio de la transcripción (pri-miRNA), predicho mediante el análisis de los 1500 pb antes del inicio del pre-miRNA en la herramienta TSS (Transcription start site) de la plataforma bioinformática Softberry (http://www.softberry.com/). Las flechas finas indican el inicio del pre-miRNA. Para el análisis de los elementos regulatorios se tomaron los 1500 pb antes del inicio de la transcripción (franjas oscuras) y las secuencias previas al inicio del pre-miRNA (franjas claras). Las secuencias se analizaron en la plataforma bioinformática PlantCARE.

oosa-MIR390

-1500bp

osa-MIR397a

+148bp

pre

ERE: ethylene-responsive element

ARE: element essential for the anaerobic induction

CCAAT-box: MYBHv1 bindingsite

ABRE: element involved in the ABAresponsiveness

HSE: element involved in heat stress responsiveness

LTR: element involved in low-temperature responsiveness

CGTCA-motif : element involved in the MeJA-responsiveness

MBS: MYB binding site involved in drought-inducibility

TC-rich: element involved in defense/stress responsiveness

Box-W1: fungal elicitorresponsive element

motif IIb : ABAresponsiveelement

TCA-element: cis-acting element involved in SAresponsiveness

Defensa Sequía Otros abióticos

B

-1500bp

osa-MIR1319a

+88bp

preE

-1500bp +1197bp

preA

-1500bp

osa-MIR397b

+936bp

preC

-1500bp

osa-MIR535

+756bp

preD


- 135 -

5. Acumulación de los miRNAs seleccionados en respuesta a infección por M.

oryzae

Los resultados obtenidos mediante el análisis del sRNA-seq muestran una

acumulación diferencial de los miRNAs seleccionados en respuesta a elicitores fúngicos.

Para comprobar si además de frente a los elicitores, estos miRNAs están regulados

durante respuesta de defensa inducida por el propio patógeno, se realizó un análisis de

la acumulación de los miRNAs en hojas de arroz inoculadas con M. oryzae mediante la

técnica de stemloop qRT-PCR. Esta metodología permite la retrotranscripción de miRNAs

utilizando un cebador específico que forma una estructura de horquilla y aparea con los

nucleótidos del extremo 3’ del miRNA maduro, y le permite a la enzima

retrotranscriptasa sintetizar el cDNA del pequeño RNA para después realizar su

cuantificación por qPCR utilizando cebadores específicos del miRNA maduro (Chen et

al., 2005). Esta técnica se utilizó de manera general para la cuantificación de la

acumulación de miRNAs maduros en este trabajo. La expresión del gen marcador de

defensa OsPBZ1 (Probenazole inducible 1) fue utilizada como control del tratamiento. La

validación de esta técnica se presenta en el apartado de materiales y métodos.

Todos los miRNAs analizados presentan principalmente una disminución de su

acumulación en respuesta a la infección por M. oryzae, principalmente entre las 6 y las

12 horas de iniciada la infección (Figura 40). En ese rango es cuando presentan una

represión más intensa los miRNAs osa-miR390-5p (0,6 con respecto a las condiciones

iniciales), osa-miR535-5p (0,7), osa-miR1319a (0,4) y osa-miR5808 (0,7). Los miembros

osa-miR397 presentan sin embargo su represión más intensa después de 48 horas de

iniciada la infección (0,7). Esta disminución en los niveles de acumulación de los miRNAs

se correlaciona con la inducción del gen marcador de defensa OsPBZ1. Aunque la

acumulación de todos los miRNAs es bastante dinámica en el tiempo, en general se ve

disminuida en respuesta a la infección por el hongo M. oryzae. Un comportamiento que

se podría corresponder con la represión observada en respuesta al tratamiento con

Resultados

- 136 -

elicitores según los datos del sRNA-seq, lo que sugiere que estos miRNAs podrían ser

reguladores negativos de la respuesta inmune de la planta de arroz.

Figura 40. Acumulación de los miRNAs en respuesta a infección por M. oryzae en parte aérea de plantas de arroz. Gráficas de los niveles de acumulación de los miRNAs seleccionados, cuantificados por stemloop qRT-PCR. Plantas de arroz tratadas con una suspensión de esporas de M. oryzae a 105 esp/ml o tratadas con agua estéril (control). Las muestras fueron tomadas a los tiempos indicados luego del tratamiento. Se muestran los valores de acumulación media de los miRNAs maduros osa-miR390-5p, osa-miR397a/b (cuantificados indistintamente), osa-miR535-5p, osa-miR1319a y osa-miR5808, y del gen marcador de defensa OsPBZ1 (LOC_Os12g36880) frente al gen de referencia OsUbi1 (LOC_Os06g46770). Los tiempos correspondientes a las 3 y 12 horas para osa-miR1319a no fueron analizados. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales. Los valores de la acumulación están referenciados al valor obtenido en la muestra control de cada tiempo (valor de referencia del control=1).

AAcum

ulac

ión

relat

iva

Acum

ulac

ión

relat

iva

Horas post-infección

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 3 6 12 24 48

osa-miR390-5p

0

5

10

15

20

25

0 3 6 12 24 48

OsPBZ1

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 3 6 12 24 48

osa-miR397a/b

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 3 6 12 24 48

osa-miR5808

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 3 6 12 24 48

osa-miR535-5p

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 6 24 48

osa-miR1319a


- 137 -

6. Generación de líneas transgénicas de arroz sobreexpresoras de los pre-

miRNAs seleccionados

Para caracterizar funcionalmente los miRNAs seleccionados se propuso generar

líneas transgénicas de arroz sobreexpresoras de los correspondientes precursores.

6.1 Construcción de vectores de expresión en plantas

El DNA codificante para los 7 precursores de miRNA seleccionados se obtuvo

mediante amplificación por PCR, a partir de DNA genómico de hojas de arroz (var.

Nipponbare). Las secuencias de los precursores fueron tomadas de la base de datos

miRBase y cotejadas con las secuencias genómicas de la base de datos Rice Genome

Annotation Project para el diseño de los cebadores específicos situados

aproximadamente 100 pb delante del inicio del precusor y 40 pb después de su final.

Estas secuencias colindantes al precursor aseguran que se exprese una unidad

transcripcional más larga, como tránscrito primaro (pri-miRNA) y que pueda procesarse

por la maquinaria de la planta al pre-miRNA de interés. Se amplificó esta región del

genoma por PCR y al mismo tiempo se añadieron las secuencias de reconocimiento de

las enzimas de restricción BamHI y SmaI en los extremos 5’ y 3’, respectivamente. El

producto de amplificación se clonó por T/A en un vector de transición (pGEM-TEasy®) y

se confirmó mediante secuenciación la identidad de la secuencia. Los fragmentos de

DNA conteniendo las secuencias precursoras se clonaron utilizando los sitios de

restricción BamHI y SmaI en el vector de expresión en plantas pCAMBIA1300 que

contenía el promotor del gen Ubiquitin del maíz y el terminador del gen Nos, resultando

en las construcciones que permiten la expresión de los precursores bajo el control de un

promotor fuerte y constitutivo. Los vectores así obtenidos contienen además dentro del

T-DNA el gen de resistencia a higromicina (hptII) bajo el control del promotor y el

teminador 35S del CaMV. La Figura 41 representa un esquema del proceso seguido para

la generación de estas construcciones y finalmente los vectores de expresión en plantas.

Se obtuvieron 7 vectores portadores de las construcciones para la sobreexpresión de los

Resultados

- 138 -

pre-miRNAs seleccionados: pC:pUbi:osa-MIR390:tNos, pC:pUbi:osa-MIR397a:tNos,

pC:pUbi:osa-MIR397b:tNos, pC:pUbi:osa-MIR535:tNos, pC:pUbi:osa-MIR1319a:tNos,

pC:pUbi:osa-MIR1847:tNos y pC:pUbi:osa-MIR5808:tNos.

Figura 41. Esquema de la preparación de los vectores para la sobreexpresión de precursores de miRNAs. Amplificación por PCR del DNA genómico de los precursores de los miRNAs seleccionados (osa-MIR) aproximadamente 100 pb antes de su inicio y 40 pb después de su final e incorporando los sitios de restricción indicados. Clonación del producto de PCR en el vector pGEM-T mediante el sistema de clonación T/A. Clonación del fragmento de restricción BamHI-SmaI de las construcciones pGEM-T:MIR390, pGEM-T:MIR397a, pGEM-T:MIR397b, pGEM-T:MIR535, pGEM-T:MIR1319a, pGEM-T:MIR1847 y pGEM-T:MIR5808 en el vector pCAMBIA1300:pUbi:tNos para generar los vectores listados en el cuadro interno. En estos vectores, la expresión de los precursores de los miRNAs está dirigida por el promotor Ubiquitin de maíz y el terminador Nos. LB y RB: bordes izquierdo y derecho del T-DNA, respectivamente. 35S: promotor y terminador del virus del mosaico del coliflor (CaMV); Nos: nopalina sintasa; hptII: gen de la higromicina fosfotransferasa que confiere resistencia a higromicina; Kan: gen de resistencia a kanamicina.

pCAMBIA1300:pUbi:tNos

LB RBp35S t35ShptII

pUbi tNososa-MIR hptII

LB RB

p35S t35S

Kanr

Kanr

PCR

pGEM-Teasy®

osa-MIR DNABamHI SmaI

Clonación T/Aosa-MIR DNA

BamHI

SmaI

˷ 100 bp˷ 40 bp

pUbi tNos

BamHI SmaI

pC:pUbi:osa-MIR390:tNospC:pUbi:osa-MIR397a:tNospC:pUbi:osa-MIR397b:tNospC:pUbi:osa-MIR535:tNospC:pUbi:osa-MIR1319a:tNospC:pUbi:osa-MIR1847:tNospC:pUbi:osa-MIR5808:tNos


- 139 -

6.2 Análisis del procesamiento in vivo de los precursores en Nicotiana

benthamiana

La producción de miRNAs maduros en la planta es el resultado de una compleja

serie de procesamientos enzimáticos a partir de un tránscrito primario. La

sobreexpresión efectiva de los precursores de estos miRNAs, por consiguiente, depende

de que esta maquinaria sea capaz de procesar las construcciones introducidas en las

plantas y generar la acumulación de los correspondientes miRNAs. Para comprobar que

las construcciones generadas eran funcionales en planta, se realizó un análisis de

procesamiento in vivo de los precursores, mediante ensayos de expresión transitoria en

hojas de N. benthamiana. Estos análisis se realizaron con plantas de la línea mutante en

el gen RdR6, codificante de la RNA polimerasa dependiente de RNA implicada en el

silenciamiento génico de RNAs exógenos. Así, estas plantas tienen bloqueada la

maquinaria de silenciamiento y permiten analizar la expresión transitoria de los

precursores de los miRNAs.

La Figura 42A presenta un esquema del proceso seguido para la expresión

transitoria de los precursores de los miRNAs en hojas de N. benthamiana rdr6 mediante

agroinfiltración. Las hojas agroinfiltradas y los controles de infiltración fueron recogidos

48 horas después para realizar un análisis Northern blot de pequeños RNAs. Los

resultados obtenidos en ese análisis se muestran en la Figura 42B, donde se observa la

acumulación incrementada de los miRNAs osa-miR390-5p, osa-miR397a, osa-miR397b,

osa-miR535-5p, osa-miR1319a, osa-miR1847.1 y osa-miR5808 en las hojas agroinfiltradas

con los vectores correspondientes de cada precursor, en comparación con el carril

control. Estos resultados indican que los precursores han sido procesados y los miRNAs

maduros se acumulan, por lo tanto, las construcciones generadas son funcionales in

vivo. En algunos casos, como en las hojas transformadas con los vectores de precursores

osa-MIR390, osa-MIR397a, osa-MIR397b y osa-MIR535, se detecta una débil banda en los

controles de infiltración, correspondiente a los miRNAs endógenos y demostrando la

Resultados

- 140 -

conservación de estos 4 miRNAs en N. benthamiana. Al momento de realización de esta

tesis, aún no se han descrito los miRNAs presentes en el genoma de N. benthamiana

(Bombarely et al., 2012), sin embargo, como ya se ha mencionado en el apartado sobre

la conservación de los miRNAs en otras especies, en la literatura sí se ha descrito la

presencia de los miRNAs miR390 y miR397 en el genoma N. tabacum (Tang et al., 2012a).

A su vez, los niveles de acumulación de los miRNAs osa-miR390-5p, osa-miR397a, osa-

miR397b y osa-miR535-5p fue aparentemente mayor que los observados en osa-

miR1319a, osa-miR1847.1 y osa-miR5808, puesto que ha sido necesario el doble de RNA

para detectar la presencia de estos miRNAs, sugiriendo una mayor eficiencia de

procesamiento en el caso de los miRNAs conservados en N. benthamiana. También

llama la atención la banda ancha detectada para miR1847.1, lo que podría indicar algún

problema en el procesamiento de este precursor.

6.3 Transformación de callos de arroz y caracterización genotípica de las líneas

transgénicas obtenidas

Una vez confirmado que las construcciones generadas para la sobreexpresión de

los pre-miRNAs son eficientemente expresadas y los productos procesados para

producir los miRNAs maduros in planta, se utilizaron estos vectores para la

transformación de arroz. La transformación se realizó sobre callos embriogénicos de O.

sativa var. Tainung67, vía transferencia de T-DNA por A. tumefaciens. El proceso de

transformación se detalla en el apartado de materiales y métodos. Básicamente, se

obtienen callos embriogénicos a partir del escutelo de semillas arroz crecidas en medio

de inducción in vitro, luego se co-cultivan con células de A. tumefaciens portadoras del

vector de interés, para después de la selección de los callos transformantes inducir a

partir de los mismos la regeneración de planta. La selección de transformantes se realiza

mediante higromicina cuya resistencia está conferida por el gen htpII incluido en la

secuencia del T-DNA. De estas transformaciones resultaron varias líneas de

transformación para cada construcción. Así, se obtuvieron 18 líneas independientes para


- 141 -

pC:pUbi:osa-MIR390:tNos, 12 para pC:pUbi:osa-MIR397a:tNos, 19 para pC:pUbi:osa-

MIR397b:tNos, 14 para pC:pUbi:osa-MIR535:tNos, 12 para pC:pUbi:osa-MIR1319a:tNos,

también 12 para pC:pUbi:osa-MIR1847:tNos y 34 para pC:pUbi:osa-MIR5808:tNos.

Además se transformaron callos con el vector vacío, pero que contiene el gen de

selección de resistencia a higromicina dentro del T-DNA, para el cual se regeneraron 7

líneas independientes.

En la Figura 43 se muestra un resumen del análisis genotípico de algunas de las

plantas regeneradas a partir de la transformación con las diferentes construcciones. Este

análisis fue realizado por PCR utilizando cebadores específicos para el promotor

Ubiquitin del maíz y para el terminador Nos. El tamaño del amplicón en este caso es

proporcional al tamaño del precursor clonado y transferido al genoma del arroz. Para

los eventos de transformación del vector vacío, se utilizaron cebadores específicos del

gen de resistencia a higromicina (hptII).

El rango de líneas de transformación positivas para las inserciones del T-DNA

encontradas fue entre 71% para el evento del vector vacío (pC:p35S:hptII:t35S) y el 100%

para los eventos pC:pUbi:osa-MIR397a:tNos, pC:pUbi:osa-MIR1319a:tNos y pC:pUbi:osa-

MIR1847:tNos. A pesar de no haberse obtenido un 100% para los eventos pC:pUbi:osa-

MIR390:tNos, pC:pUbi:osa-MIR397b:tNos, pC:pUbi:osa-MIR535:tNos y pC:pUbi:osa-

MIR5808:tNos, los porcentajes de líneas positivas estaban alrededor del 90% (Tabla 12).

Sin embargo, se observó que sólo el 33% de líneas positivas para los eventos de

transformación para osa-MIR5808 y osa-MIR1319a produjeron semillas, y un rango entre

el 58 y el 72% para el resto de eventos.

Resultados

- 142 -

Figura 42. Procesamiento in vivo de los precursores de los miRNAs seleccionados. A. Diagrama del procedimiento seguido: transformación de células competentes de A. tumefaciens cepa EHA105 con los vectores de expresión listados en el cuadro y agroinfiltración de hojas jóvenes de N. benthamiana rdr6. B. Análisis Northern blot de pequeños RNAs obtenidos de hojas de N. benthamiana rdr6 agroinfiltradas (A) o infiltradas con la solución control (M). La flecha indica la posición del marcador de peso molecular de RNA de 21 nucleótidos. Para la detección de los miRNAs se utilizaron 10 μg de RNA total, excepto en las marcadas con asterisco (*), para las que se utilizaron 20 μg. Las sondas de DNA sintéticas utilizadas para las hibridaciones de los miRNAs se indican debajo de cada membrana.

AM

osa-miR390-5p

21 nt

osa-miR5808

AM

osa-miR1847.1

AM

21 nt

osa-miR1319a

AM

osa-miR535-5p

AM

osa-miR397a

AM

osa-miR397b

AM

BB

RNA EtBr

RNA EtBr

pC:pUbi:osa-MIR390:tNos

Sonda

Sonda

pC:pUbi:osa-MIR397a:tNos

pC:pUbi:osa-MIR397b:tNos


pC:pUbi:osa-MIR1319a:tNos*

pC:pUbi:osa-MIR1847:tNos*

pC:pUbi:osa-MIR5808:tNos*

Mock

Agroinfiltración

Agrobacterium tumefaciens EHA105

A

pUbi tNososa-MIR hptII

LB RB

p35S t35S

Kanr

pC:pUbi:osa-MIR:tNos

pC:pUbi:osa-MIR390:tNospC:pUbi:osa-MIR397a:tNospC:pUbi:osa-MIR397b:tNospC:pUbi:osa-MIR535:tNospC:pUbi:osa-MIR1319a:tNospC:pUbi:osa-MIR1847:tNospC:pUbi:osa-MIR5808:tNos

Nicotiana benthamiana rdr6


- 143 -

pUbi pNososa-MIR hptII

LB RB

p35S p35S

Ubi-fwd Nos-rvs hptII-fwd hptII-rvs

ppC:pUbi:osa-MIR397b:tNos







pC1300

A

B

Figura 43. Análisis de la inserción del T-DNA en las líneas de arroz regeneradas a partir de la transformación con los vectores de sobreexpresión de los precursores de los miRNAs seleccionados. A. Representación esquemática del T-DNA donde se indica la posición de los cebadores utilizados para el análisis PCR del DNA genómico de hojas. La amplificación se realizó con los cebadores Ubi-fwd y Nos-rvs, salvo en las líneas regeneradas de la transformación con el vector vacío que se realizó con hptII-fwd y hptII-rvs. B. Análisis mediante electroforesis en geles de agarosa de los fragmentos amplificados por PCR. Se muestra sólo el análisis de las líneas con las que se prosiguió el estudio: 8 líneas para los eventos de transformación con los vectores de sobreexpresión de los precursores indicados y 4 líneas para el evento de transformación con el vector vacío.

Tabla 12. Resumen del análisis genotípico y de fertilidad de los eventos de transformación de arroz. Se indica el número de plantas regeneradas para cada evento de transformación (a) el número y el porcentaje de plantas regeneradas que han incorporado el T-DNA en su genoma (transgénicas) (b), el número de líneas transgénicas que produjeron semillas al final de su ciclo biológico (c) y el porcentaje de plantas transgénicas fértiles para cada evento de transformación (d).

Eventos Plantasregeneradas aa

T-DNApositivas bb

Plantasfértiles c Fertilidad dd

pC1300 7 5 (71%) 3 60%

pC:pUbi:osa-MIR390:tNos 18 16 (89%) 11 69%

pC:pUbi:osa-MIR397a:tNos 12 12 (100%) 7 58%

pC:pUbi:osa-MIR397b:tNos 19 18 (95%) 13 72%


pC:pUbi:osa-MIR1319a:tNos 12 12 (100%) 4 33%



Resultados

- 144 -

6.4 Acumulación de los miRNAs en las líneas transgénicas de arroz generadas

Luego de comprobarse que las líneas regeneradas tras la transformación

portaban el transgén, se procedió a analizar la acumulación de los correspondientes

miRNAs para evaluar la expresión y procesado de los precursores en plantas de arroz y

seleccionar las líneas transgénicas para la obtención de homocigotas. La acumulación de

los miRNAs maduros se analizó en hojas jóvenes de las líneas transgénicas mediante

análisis Northern blot de pequeños RNAs. Se analizaron 8 líneas independientes para

cada evento de transformación y los resultados se muestran en la Figura 44. Como se

puede observar en la mayoría de los eventos, excepto los eventos para osa-MIR1847 y

osa-MIR5808, las líneas analizadas muestran mayor acumulación de los

correspondientes miRNAs que la variedad silvestre sin transformar, aunque muestran

diferencias en los niveles de acumulación. Este resultado indica que los transgenes se

expresan y los precursores osa-MIR390, osa-MIR397a, osa-MIR397b, osa-MIR535 y osa-

MIR1319a se procesan eficientemente en plantas de arroz, acumulando los

correspondientes miRNAs maduros. Cabe destacar la acumulación del osa-miR1319a en

las plantas transgénicas de arroz, apenas detectable en los ensayos de expresión

transitoria de N. benthamiana.

A pesar de haberse comprobado su procesamiento eficiente in vivo en N.

benthamiana, en las líneas de arroz portadoras del transgén diseñado para la expresión

del precursor osa-MIR5808 no se logró observar la acumulación diferencial del miRNA.

Sin embargo, sí se observan bandas de acumulación de tránscritos de mayor tamaño

correspondientes al pri-miRNA y el precursor. El caso del evento para osa-MIR1847 fue

similar, apenas se detecta el miRNA maduro. Solo algunas líneas presentan una banda

débil en la posición del miRNA, aunque todas ellas muestran una banda de mayor

intensidad que se podrían corresponder con el tránscrito primario o el pre-miRNA.

Aunque fue posible observar la acumulación de osa-miR1847.1 en las líneas transgénicas

analizadas, los niveles eran más bajos que los detectados con los otros miRNAs en los

demás eventos de transformación. Estos resultados prueban la correcta expresión del


- 145 -

precursor pero con un procesamiento ineficiente al miRNA maduro en las plantas de

arroz.

Figura 44. Análisis de la acumulación de los miRNAs en las líneas de arroz transgénicas. Análisis mediante Northern blot de pequeños RNAs (15 μg de RNA total) de hojas de las líneas transgénicas portadoras de los transgenes indicados. Como control se ha analizado la variedad silvestre Tainung67 (Wt), correspondiente al fondo genético de las líneas transgénicas. Las membranas se han hibridado con las sondas de DNA sintéticas indicadas debajo de cada membrana. Se indica con una flecha la posición aproximada del marcador de peso molecular de RNA de 21 nucleótidos. En las líneas portadoras de los transgenes pUbi:osa-MIR1847:tNos y pUbi:osa-MIR5808:tNos se muestra además la hibridación de la membrana en la posición aproximada de los tránscritos primarios y/o precursores que no han sido procesados al miRNA maduro (panel superior).

ppC:pUbi:osa-MIR390:tNos

osa-miR390-5p


osa-miR1319a

21 nt

RNA EtBr

Sonda


osa-miR535-5p

21 nt

RNA EtBr

Sonda

21 nt

RNA EtBrSonda


osa-miR397a

21 nt

RNA EtBrSonda

pC:pUbi:osa-MIR397b:tNos

osa-miR397b

21 nt

RNA EtBrSonda


osa-miR1847.1

21 nt

RNA EtBrSonda

pri/pre*


osa-miR5808

21 nt

RNA EtBrSonda

pri/pre*

Resultados

- 146 -

De esta forma se identificaron líneas independientes de arroz sobreexpresoras

para la mayoría de los pre-miRNAs seleccionados. Así, se han obtenido líneas

transgénicas con diferentes niveles de sobreexpresión del precursor correspondiente y

de acumulación de los miRNAs maduros (Tabla 13) para los eventos osa-MIR390-Ox,

osa-MIR397a-Ox, osa-MIR397b-Ox, osa-MIR535-Ox, osa-MIR1319a-Ox y osa-MIR1847-Ox,

mientras que las líneas transgénicas del evento osa-MIR5808-Ox sobreexpresan el

precursor pero no acumulan el miRNA maduro. La producción de semillas de cada línea

analizada se detalla en la Tabla 13. Líneas con bajos y con altos niveles de acumulación

del correspondiente miRNA han resultado estériles como las líneas osa-MIR390-Ox #7 y

osa-MIR397a-Ox #17, respectivamente. Así también resultaron con alta producción de

semillas líneas tanto con baja (osa-MIR535-Ox #5) como con alta (osa-MIR1319a-Ox #7)

acumulación del miRNA. Se puede observar que no existe una relación entre los niveles

de acumulación de los miRNAs en las líneas y la cantidad de semillas, y que, en general,

se ha obtenido una baja producción de semillas en la generación T0.


- 147 -

Tabla 13. Resumen de los niveles de acumulación de los miRNAs y la producción de semillas de las líneas transgénicas de arroz. Se indica el evento de transformación (a), la línea independiente (b), el nivel de acumulación del miRNA correspondiente, desde un nivel similar al Wt (–) a hasta los valores más altos (+++) (c) y el número de semillas producidas (d).

Evento a Línea b Acumulación miRNA c Semillas d

osa-MIR390-Ox

#1 + 70#4 +++ 0#5 ++ 0#7 + 0#8 ++ 50#10 ++ 350#15 +++ 200#17 ++ 30

osa-MIR397a-Ox

#2 +++ 0#4 +++ 50#5 +++ 20#8 + 50#11 +++ 50#12 +++ 40#16 +++ 0#17 +++ 0

osa-MIR397b-Ox

#1 ++ 120#2 +++ 70#3 ++ 0#4 + 10#5 +++ 5#7 ++ 30#8 + 15#9 + 10

osa-MIR535-Ox

#1 +++ 5#2.1 +++ 0#2.2 ++ 0#3 +++ 20#4 + 0#5 + 300

#6.1 + 0#6.3 ++ 5

osa-MIR1319a-Ox

#1 ++ 40#2 + 0#7 +++ 200#8 + 50#15 +++ 30#16 ++ 0#17 ++ 0#18 +++ 0

miRNA pre/pri

osa-MIR1847-Ox

#2 -- ++ 0#3 -- + 150#4 + +++ 150#6 -- + 20#9 + ++ 0#15 + + 0#16 + +++ 10#17 -- + 0

osa-MIR5808-Ox

#2 -- ++ 0#4 -- ++ 10#6 -- + 30#8 -- ++ 0#10 -- + 200#11 -- ++ 0#14 -- +++ 0#16 -- +++ 0

Resultados

- 148 -

7. Caracterización funcional de los miRNAs seleccionados

Las plantas de la generación T0 de líneas transgénicas sobreexpresoras

generadas fueron utilizadas como herramientas para realizar el análisis funcional de los

miRNAs y el estudio de sus dianas, siempre que hubo disponibilidad de semillas. En

aquellos casos en los que la productividad fue escasa se pasó a la siguiente generación

para la búsqueda de homocigotas y amplificación del material. A continuación se

detallarán los resultados obtenidos para cada miRNA, teniendo en cuenta que

descartamos las líneas portadoras de los precursores osa-MIR1847 y osa-MIR5808,

puesto que no se ha visto eficiencia en el procesamiento de sus miRNAs maduros.

7.1 Caracterización de osa-MIR535

7.1.1 Validación de dianas de osa-MIR535

En los análisis de predicción fueron identificadas como dianas para el miRNA

osa-miR535-5p cuatro factores de transcripción del tipo SPL (Squamosa-promoter

binding protein-like). Para validar la regulación post-transcripcional de estas dianas por

el miRNA, se analizó la acumulación de los tránscritos OsSPL4 (LOC_Os02g07780),

OsSPL11 (LOC_Os06g45310) OsSPL12 (LOC_Os06g49010) y OsSPL19 (LOC_Os11g30370)

en hojas de dos líneas transgénicas independientes de sobreexpresión del precursor

osa-MIR535. Como se puede ver en la Figura 45, se ha encontrado que OsSPL12 presenta

niveles de acumulación transcripcional más bajos en ambas líneas transgénicas osa-

MIR535-Ox, comparadas con las líneas control del vector vacío (Ev), mientras que la

acumulación de los otros tres tránscritos SPL no se ve alterada. La acumulación de

OsSPL12 se ve reducida hasta en un 80% en las líneas sobreexpresoras de osa-MIR535,

confirmándose que, en las condiciones de este trabajo, el tránscrito codificante para la

proteína OsSPL12 podría estar regulado por osa-miR535-5p.


- 149 -

7.2 Caracterización de osa-MIR390 en las respuestas de defensa y sequía

Como se ha presentado anteriormente, la acumulación de osa-miR390-5p está

regulada en respuesta al tratamiento con elicitores fúngicos y frente a infección por M.

oyzae, por lo que podría estar implicado en las respuestas de las plantas de arroz frente

a patógenos. Además, el promotor del precursor de este miRNA contiene varios

elementos regulatorios asociados a la respuesta de la planta frente a estrés hídrico. Por

estos motivos, en este trabajo se ha propuesto caracterizar funcionalmente este miRNA

en las respuestas de defensa y sequía de la planta de arroz.

Figura 45. Análisis de acumulación de los tránscritos predichos como dianas para osa-miR535-5p en las líneas transgénicas de arroz sobreexpresoras de osa-MIR535. Se muestra el valor medio de los niveles de acumulación de los tránscritos de genes OsSPL (Squamosa-promoter binding protein-like) predichos in silico como dianas de osa-miR535-5p en hojas jóvenes de dos líneas transgénicas sobreexpresoras del precursor del miRNA (generación T0). Los niveles de acumulación se cuantificaron mediante qRT-PCR utilizando como gen de referencia OsUbi1 (LOC_Os06g46770) y se compararon con dos líneas transgénicas independientes transformadas con el vector vacío (Ev). Los cebadores para amplificar la secuencia del tránscrito incluyen el sitio de corte por el miRNA y corresponden a los siguientes loci: OsSPL4 (LOC_Os02g07780), OsSPL11 (LOC_Os06g45310), OsSPL12 (LOC_Os06g49010) y OsSPL19 (LOC_Os11g30370). Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales.

0,000

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

0,008

0,009

0,010

OsSPL4 OsSPL11 OsSPL12 OsSPL19

AAcum

ulac

ión

rela

tiva

Dianas predichas osa-miR535-5p

Ev #6Ev #7osa-MIR535-Ox #1osa-MIR535-Ox #5

Resultados

- 150 -


Se analizó la acumulación de tránscritos de 4 quinasas, que han sido predichos

como dianas para osa-miR390-5p, en dos líneas independientes sobreexpresoras del

precursor correspondiente (osa-MIR390-Ox). Las quinasas predichas como dianas para

osa-miR390-5p que fueron analizadas son OsSIK1 (LOC_Os06g03970), OsWAK43

(LOC_Os04g29960), OsRLK5 (LOC_Os01g33110) y OsBAK (LOC_Os05g34270). Ambas

líneas de sobreexpresión de osa-MIR390 presentaron niveles de acumulación

transcripcional muy bajos de OsSIK1 comparadas con las líneas control del vector vacío

(Ev). La acumulación de este tránscrito en las líneas transgénicas se ve disminuida casi

totalmente (Figura 46). No se observó disminución de la acumulación de OsWAK43,

OsRLK5 ni OsBAK, sino al contrario, en las líneas osa-MIR390-Ox se vio un aumento de

los dos últimos, situación que podría deberse a un mecanismo de autorregulación de las

vías de señalización donde cumple funciones la proteína OsSIK1 y podría darse el caso

de que estas quinasas la sustituyan en funciones en respuesta a sus bajos niveles de

acumulación. Los resultados obtenidos sugieren que el tránscrito del gen OsSIK1 podría

estar regulado por osa-miR390-5p.

7.2.2 Respuesta de osa-MIR390 y OsSIK1 frente a infección por M. oryzae

Se caracterizó la acumulación de osa-miR390-5p y su potencial diana OsSIK1

frente a infección por M. oryzae y se analizó la correlación entre las respuestas de

ambos reguladores. La acumulación del miRNA se determinó por stemloop qRT-PCR y la

del tránscrito diana por qRT-PCR en hojas de arroz a diferentes tiempos después de ser

inoculadas con esporas del hongo.

La cinética de acumulación de osa-miR390-5p y del tránscrito OsSIK1 mostró un

perfil dinámico y bastante similar para ambos (Figura 47). Se detecta una caída en la

acumulación de osa-miR390-5p que comienza a las 6 horas y continua hasta las 12

horas después de la inoculación (0,6 en relación a condiciones control), después suben


- 151 -

para volver a caer a las 48 horas. Igualmente, los niveles de acumulación del tránscrito

OsSIK1 se ven reprimidos tanto a las 12 horas (0,6 respecto al control) como a las 48

horas (0,4) post-infección. Esto podría deberse a un desfase temporal en la regulación

de OsSIK1 por parte de osa-miR390-5p.

Figura 46. Análisis de acumulación de los tránscritos predichos como dianas para osa-miR390-5p en las líneas transgénicas de arroz sobreexpresoras de osa-MIR390. Se muestra el valor medio de los niveles de acumulación de los tránscritos codificantes para proteínas quinasas predichos in silico como dianas de osa-miR390-5p en hojas jóvenes de dos líneas transgénicas sobreexpresoras del precursor del miRNA (generación T0). Los niveles de acumulación se cuantificaron mediante qRT-PCR utilizando como gen de referencia OsUbi1 (LOC_Os06g46770) y se compararon con dos líneas transgénicas independientes transformadas con el vector vacío (Ev). Los cebadores para amplificar la secuencia del tránscrito incluyen el sitio de corte por el miRNA y corresponden a los siguientes loci: OsSIK1 (LOC_Os06g03970), OsWAK43 (LOC_Os04g29960), OsRLK5 (LOC_Os01g33110) y OsBAK1 (LOC_Os05g34270). Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales.

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

OsSIK1 OsWAK43 OsRLK5 OsBAK

AAcum

ulac

ión

rela

tiva

Dianas predichas osa-miR390-5p

Ev #6Ev #7osa-MIR390-Ox #4osa-MIR390-Ox #10

Resultados

- 152 -

Figura 47. Acumulación de osa-miR390-5p y de tránscritos de su diana OsSIK1 en respuesta a infección por M. oryzae en hojas de arroz. A. Gráficas de los niveles de acumulación de osa-miR390-5p y del tránscrito OsSIK1, cuantificados por stemloop qRT-PCR y qRT-PCR, en plantas de arroz inoculadas por aspersión de una suspensión de esporas de M. oryzae a 105 esp/ml o con agua estéril (control). Las muestras fueron tomadas a los tiempos indicados luego de la inoculación. Se muestran los valores de acumulación media de osa-miR390-5p y OsSIK1 (LOC_Os06g03970) frente al gen de referencia OsUbi1 (LOC_Os06g46770). Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales. Los valores de la acumulación están referenciados al valor obtenido en la muestra control de cada tiempo (valor de referencia del control=1). B. Gráfica de la dinámica temporal de acumulación de osa-miR390-5p y su diana OsSIK1 en respuesta a infección por M. oryzae. El eje de las ordenadas se representa el cambio logarítmico en la acumulación (FC) en condiciones de infección, relativo a la acumulación en el control. En el eje de las abscisas se representa el tiempo transcurrido después de la inoculación. Las líneas gruesas indican el umbral correspondiente a un cambio sustancial en la acumulación (criterio: FC=±0,5).

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

0 10 20 30 40 50 60

osa-miR390-5pOsSIK1

Cam

bio

en la

acu

mul

ació

n (F

C; re

lativ

o al

con

trol,

log 2

)


Acum

ulac

ión

rela

tiva


A

B

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 3 6 12 24 48

OsSIK1

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 3 6 12 24 48

osa-miR390-5p


- 153 -

7.2.3 Caracterización de líneas de Arabidopsis thaliana con acumulación diferencial

de miR390 frente a infección

Dado que el miR390 está conservado en Arabidopsis, y que disponíamos de una

colección de líneas de imitación de diana (target mimicry) de miRNAs generada en el

grupo del Dr. D. Weigel (Todesco et al., 2010), se decidió analizar el efecto de la pérdida

de la función del miRNA en la resistencia/susceptibilidad a infección por hongos de la

planta de Arabidopsis. Las líneas de imitación de diana son transgénicas que

sobreexpresan un tránscrito que mimetiza una diana del miRNA en estudio,

secuestrando el miRNA para el cual ha sido diseñado, causando una pérdida de función

del miRNA maduro. En Arabidopsis se han descrito dos homólogos de osa-MIR390 (ath-

MIR390a y ath-MIR390b), y disponíamos de una línea “target mimicry” (MIM-miR390) en

la que ambos miembros se ven afectados. El análisis de la acumulación de ath-miR390

en estas líneas se muestra en la Figura 48A, donde se observa que las plantas MIM-

miR390 presentan una menor acumulación del miRNA en comparación con las líneas

control.

Se ha evaluado el fenotipo de la línea MIM-miR390 en respuesta a infección por

el hongo necrótrofo Plectosphaerella cucumerina, en condiciones de crecimiento in vitro

y en plántulas crecidas en tierra. Las plántulas crecidas in vitro no presentan diferencias

visibles en el fenotipo frente a la infección comparadas con la línea control (Figura 48B).

Bajo observación microscópica se cuantificaron las hojas lesionadas en cada planta y no

se encontraron diferencias significativas en la incidencia de lesiones entre las plantas

MIM-miR390 y la línea control, ambas con aproximadamente el 70% de hojas lesionadas

por la infección (Figura 48C). Tampoco se observaron diferencias visibles en el fenotipo

ante la infección por el hongo en plantas crecidas en tierra (Figura 48D). En las

condiciones de este trabajo y según los resultados obtenidos, ath-miR390 no parece

estar implicada funcionalmente en las respuestas de defensa de Arabidopsis frente a

infección por el hongo necrótrofo P. cucumerina.

Resultados

- 154 -

0%10%20%30%40%50%60%70%80%

MIM-miR390 Ev

Hoja

s les

iona

das p

or p

lant

a (%

)A

WtEvMIM-miR390

D

EvMIM-miR390

C

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,5

ath-miR390a/b

Acum

ulac

ión

rela

tiva

WtEvMIM-miR390

B

Figura 48. Caracterización de las líneas MIM-miR390 de A. thaliana en respuesta a infección por P. cucumerina. A. Niveles de acumulación del miR390 en plantas de Arabidopsis MIM-miR390, portadoras de vector vacío (Ev) y silvestres sin transformar (Wt) cuantificados por stemloop qRT-PCR. Las muestras corresponden a hojas de plántulas de 21 días crecidas en tierra en condiciones de invernadero. Se muestran los valores de acumulación media de ath-miR390a/b frente al gen de referencia Tubulin (At5g62700). Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales. B. Imágenes representativas de la infección causada por P. cucumerina a los 7 dpi. El ensayo se realizó con plántulas de 14 días crecidas in vitro en medio MS sólido inoculadas por rociado de una suspensión de esporas de P. cucumerina (105 esp/ml). C. Cuantificación del porcentaje de hojas lesionadas a los 7dpi según se indica en B. Se muestra el valor medio y el SEM de un ensayo con al menos 25 plántulas por línea y es representativo de dos réplicas experimentales. D. Imágenes representativas de ensayos de infección con plantas de 21 días crecidas en tierra e inoculadas con una suspensión de esporas de P. cucumerina (105 esp/ml). Las fotos fueron tomadas a los 11 dpi y son representativas de ensayos independientes.


- 155 -

7.2.4 Caracterización de las líneas de sobreexpresión de osa-MIR390 frente a

infección

Para caracterizar funcionalmente a osa-MIR390 en la respuesta de defensa de las

plantas de arroz, se realizaron ensayos de infección con M. oryzae en plantas de la

generación T1 de las líneas osa-MIR390-Ox generadas en este trabajo. Como controles

se utilizaron plantas silvestres sin transformar (Wt) y líneas con el mismo fondo genético

que han pasado por el proceso de transformación de callos pero que han perdido la

inserción del T-DNA, es decir, azigotas para el evento de transformación (Az).

Las plantas de 21 días de las líneas osa-MIR390-Ox no presentan diferencias

fenotípicas visibles comparadas con plantas de la variedad silvestre, en las condiciones

de crecimiento utilizadas en este trabajo (Figura 49A). Luego de la infección por M.

oryzae, las hojas analizadas de las líneas osa-MIR390-Ox presentan más tejido necrosado

en comparación con los controles Wt y Az (Figura R49B). La cuantificación del área

lesionada mediante análisis de imágenes muestra que el área de lesión en las hojas de

las líneas sobreexpresoras de osa-MIR390 es significativamente mayor que el de la

variedad silvestre y las líneas azigotas (Figura 49C). En las condiciones de este trabajo se

ha encontrado que plantas con altos niveles de acumulación de osa-miR390 son más

sensibles a la infección por M. oryzae, resultados que confirman que este miRNA es un

regulador negativo de las respuestas de defensa de las plantas de arroz.

7.2.5 Caracterización de las líneas de sobreexpresión de osa-MIR390 en respuesta a

sequía

Se ha evaluado la respuesta de osa-MIR390 frente a estrés hídrico. Para esto se

analizó la acumulación de osa-miR390-5p en hojas de plantas de arroz que habían sido

sometidas a desecación. En la Figura 50 se muestran los cambios en la acumulación del

miRNA en respuesta a la desecación, observándose una débil inducción después de 30

minutos, pero lo más llamativo es la fuerte represión después de 1 hora de iniciada la

Resultados

- 156 -

desecación, llegando casi a valores de -0,4 en relación al control. El miRNA osa-miR390-

5p está principalmente reprimido en respuesta a estrés hídrico, lo que indica que podría

ser un regulador negativo de las respuestas de la planta de arroz frente a sequía, al igual

que se había observado durante la respuesta de defensa.

Figura 49. Fenotipo de líneas de sobreexpresión de osa-MIR390 en respuesta a infección por M. oryzae. A. Plantas de 21 días de las líneas de arroz sobreexpresoras de osa-MIR390, generación T1, comparadas con plantas de la variedad silvestre Tainung67 (Wt). B. Imágenes representativas de las lesiones causadas por la infección con M. oryzae aislado Guy11 en la penúltima hoja emergida a los 7 días post-inoculación por aspersión de una suspensión de esporas a concentración de 105 esp/ml. C. Promedio del porcentaje del área foliar lesionada debido a la infección por M. oryzae. Cuantificación del área de lesión realizada por análisis de imágenes con el programa informático Assess v2.0. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) de al menos 6 réplicas biológicas. Los asteriscos corresponden a diferencias significativas según análisis de ANOVA (**=p<0,01). Los datos mostrados son de un ensayo independiente representativo de dos réplicas experimentales.

BB

Líneas osa-MIR390-Ox

Líneas ControlWt

#4

Az

#10

#15

C

Wt Wtosa-MIR390-Ox

#10#4

A

0

10

20

30

40

50

60

Wt Az #4 #10 #15

Porc

enta

je d

e ár

ea ffo

liar l

esio

nada

Incidencia de lesiones**

**

**

osa-MIR390-Ox


- 157 -

Se utilizaron las líneas de sobreexpresión de osa-MIR390 para analizar su

fenotipo en condiciones de sequía. Luego de evaluar los resultados de 2 réplicas

experimentales, no se observaron diferencias fenotípicas entre las plantas de las líneas

osa-MIR390-Ox y las plantas control de la variedad silvestre y las azigotas (Figura 51). En

este trabajo se ha descrito que el tránscrito del gen OsSIK1 es una diana regulada por el

miRNA osa-miR390-5p y en la literatura se encuentran evidencias de que esta quinasa

está implicada en la respuesta de las plantas de arroz a estrés hídrico (Ouyang et al.,

2010). Se sabe que las plantas de arroz sobreexpresoras de OsSIK1 son más tolerantes a

sequía, y dado que en las líneas osa-MIR390-Ox mostraban bajos niveles de

acumulación de los tránscritos de ese gen, la hipótesis de partida era que fuesen más

sensibles a la falta de agua. En las condiciones de este trabajo no se observaron

diferencias entre las líneas osa-MIR390-Ox y los controles silvestres o líneas azigotas,

mientras que sí se observaron diferencias con otras líneas evaluadas en paralelo

(OsCPK13-Ox). Aunque no se puede descartar que las condiciones utilizadas en este

trabajo no hayan sido las más adecuadas para evaluar el fenotipo de estas líneas frente

a sequía, estos resultados apuntan a que la sobreexpresión de osa-MIR390 en plantas de

arroz no afecta su tolerancia o susceptibilidad a sequía.

Figura 50. Acumulación de osa-miR390-5p en plantas de arroz en respuesta a estrés hídrico. La gráfica representa el cambio logarítmico de la acumulación de osa-miR390-5p en respuesta al tratamiento de desecación en hojas de la variedad silvestre Nipponbare, realizado bajo campana de flujo laminar, a los 30 minutos y 1 hora después de iniciado el tratamiento. Valores de la acumulación cuantificados por stemloop qRT-PCR. El cambio en la acumulación es relativo a la acumulación en condiciones control sin desecar y tomando como gen de referencia el de la OsUbi1 (LOC_Os06g46770).

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

30 min 1 h

Cam

bio

en la

acu

mul

ació

n (re

l.al c

ontro

l, lo

g 2) osa-miR390-5p

Tiempo post-desecación

Resultados

- 158 -

7.3 Caracterización de osa-MIR397 en las respuestas de defensa y sequía

Los resultados obtenidos en este trabajo muestran una acumulación diferencial

de osa-miR397 en respuesta al tratamiento con elicitores y frente a la infección por el

hongo M. oryzae en la planta de arroz, por lo que se propuso caracterizar la

acumulación de sus tránscritos diana durante la respuesta de defensa de la planta de

Figura 51. Fenotipo de las líneas osa-MIR390-Ox en respuesta a sequía. A. Diagrama del diseño experimental para la caracterización de la tolerancia a sequía. Las plantas se crecieron durante 21 días en invernadero en condiciones de riego normal y continuo. En ese momento (D0) se ha empezado el tratamiento sin riego por 5 días (D5). Después del periodo de sequía han sido recuperadas con tratamiento de riego normal y continuo durante 7 días (D12). B. Imágenes representativas de plantas de líneas osa-MIR390-Ox, y los controles silvestre Tainung67 (Wt), azigota (Az) y la línea de arroz de sobreexpresión del gen OsCPK13 tolerante a sequía (T) sometidas a un tratamiento de sequía durante 5 días por falta de riego (D5, paneles superiores) y uno de recuperación con riego normal durante 7 días (D12, paneles inferiores). Las imágenes mostradas son representativas de dos ensayos independientes.

WWt Az #10#4 #15osa-MIR390-Ox

D5D1

2

T

B

ACrecimiento normal – 21 días Sequía Riego normal de recuperación

D0 D5 D12


- 159 -

arroz. Además se decidió caracterizar la participación funcional de este miRNA en la

adaptación de la planta de arroz a estrés hídrico, puesto que habíamos identificado

elementos reguladores de respuesta a sequía en sus secuencias promotoras.


Como se ha mostrado anteriormente, la predicción de dianas para los miembros

osa-miR397 identificó a los tránscritos de varias proteínas lacasas, y además los genes

OsLAC12 y OsLAC13 ya han sido validados como sus dianas (Li et al., 2011b; Zhang et al.,

2013). Según la plataforma Uniprot (http://www.uniprot.org/) en arroz han sido descritas

25 lacasas, sin embargo, el análisis bioinformático de predicción de dianas ha dado

como resultado un gen lacasa adicional (LOC_Os01g62490) que se ha denominado

OsLAC26, siguiendo con la nomenclatura. Las secuencias de los 26 tránscritos de los

genes codificantes para proteínas lacasas se utilizaron para construir un árbol

filogenético usando el método PhyML (Guindon et al., 2010) en el programa informático

SeaView (Gouy et al., 2010) a partir del alineamiento de la región codificante realizado

en la plataforma MultAlin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/). La Figura 52A

muestra el alineamiento de las secuencias, donde se puede ver que el sitio de

reconocimiento está bastante conservado en casi todas las lacasas, sin embargo no

todas presentan la especificidad de secuencia para ser reguladas por los osa-miR397. El

árbol obtenido a partir de este alineamiento se muestra en la Figura 52B, donde se

resaltan aquellas lacasas predichas como dianas y las dos validadas en la literatura. El

gen OsLAC26 se ha encontrado particularmente interesante ya que es el que se

encuentra más próximo filogenéticamente a los de las lacasas validadas como dianas,

por lo que ha sido seleccionada para el análisis de su acumulación en las líneas de

sobreexpresión de osa-MIR397.

Resultados

- 160 -

AA osa-miR397a/b

BB

Figura 52. Análisis de las lacasas de arroz. A. Alineamiento de las secuencias correspondientes al mRNA de los genes OsLAC conocidos en arroz. Se muestra sólo el fragmento donde se encuentra el sitio conservado de reconocimiento por los miRNAs osa-miR397a y osa-miR397b, y que se indica con un cuadro oscuro. Las 25 lacasas conocidas fueron consultadas en la base de datos Uniprot (http://www.uniprot.org/) y se ha añadido una lacasa predicha como diana para estos miRNAs, indicada como OsLAC26 (LOC_Os01g62490). Las secuencias nucleotídicas de los tránscritos fueron consultadas en la base de datos Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.msu.edu/) y el alineamiento realizado en la plataforma MultAlin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/). B. Árbol filogenético de las lacasas de arroz construido a partir del alineamiento mostrado en (A), realizado por el método PhyML en el programa bioinformático SeaView v4. Se indican en cuadros rojos las lacasas validadas experimentalmente (OsLAC12 y OsLAC13), en verde la lacasa OsLAC26 y en gris otras lacasas predichas como dianas para osa-miR397a y/o osa-miR397b.


- 161 -

El análisis de la acumulación de las tres lacasas seleccionadas (OsLAC12, OsLAC13

y OsLAC26) en las líneas de sobreexpresión de los dos miembros de la familia osa-

miR397, en comparación con las líneas controles portadoras del vector vacío se muestra

en la Figura 53. Los tránscritos de OsLAC12 y OsLAC13 fueron amplificados y

cuantificados indistintamente en los análisis de qRT-PCR de este trabajo. Los datos

muestran unos niveles de acumulación claramente reducidos para las tres lacasas en tres

líneas independientes de sobreexpresión de osa-MIR397a y dos líneas osa-MIR397b-Ox,

en comparación con las líneas del vector vacío. La acumulación transcripcional de

OsLAC12/OsLAC13 es tan bajo que es casi indetectable en la línea osa-miR397a-Ox #4,

así como en las dos líneas osa-miR397b-Ox analizadas. En el caso de OsLAC26, los

niveles de acumulación son muy bajos, aunque un poco mayores que las observadas en

OsLAC12/OsLAC13, lo que podría indicar que los miRNAs osa-miR397 tienen mayor

eficiencia en la regulación de estos dos últimos. Este resultado confirma que estas líneas

son eficientes en la regulación post-transcripcional de sus dianas. Según los resultados

obtenidos, el tránscrito del gen OsLAC26 es una diana regulada en arroz por los

miembros osa-miR397.

7.3.2 Respuesta de osa-MIR397 y sus dianas frente a infección por M. oryzae

Inicialmente se evaluó mediante análisis de Northern blot, la acumulación de

osa-miR397b en respuesta a infección por M. oryzae en hojas de plantas de arroz

infectadas localmente. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 54, donde se

observa una menor acumulación del miRNA en condiciones de infección, principalmente

a las 12 y 24 horas después de la inoculación. Resulta destacable el aumento

considerable de la acumulación de osa-miR397b en condiciones control a lo largo del

tiempo. Esto podría deberse a una respuesta a la manipulación durante el ensayo,

probablemente inducido por la herida realizada en la hoja, ya que el ensayo se realizó

en hojas cortadas. No obstante, mediante este análisis se pudo confirmar la represión de

osa-miR397 en respuesta a infección y que además presenta inducción por heridas.

Resultados

- 162 -

Figura 54. Acumulación de osa-miR397b en respuesta a infección por M. oryzae en hojas de arroz. Análisis Northern blot de pequeños RNAs (10 μg de RNA por carril) de hojas de arroz variedad Nipponbare controles (C) o inoculadas (I) localmente con papeles de filtro embebidos en una suspensión de esporas de M. oryzae a 105 esp/ml a los tiempos indicados. La sonda sintética utilizada para la hibridación fue la de la secuencia de DNA completa de osa-miR397b. Se indica además la cuantificación de la intensidad de las bandas observadas relativas al control de carga de RNA total, realizada en el programa de análisis de imágenes MultiGauge de Fuji™ v2.0. Se ha tomado como referencia la acumulación al tiempo inicial en el control (valor=1). La flecha indica la posición del marcador de peso molecular de RNA de 21 nucleótidos.

Figura 53. Análisis de acumulación de los tránscritos OsLAC26 y OsLAC12/13 en las líneas transgénicas de arroz sobreexpresoras de osa-MIR397a y osa-MIR397b. Se muestra el valor medio de los niveles de acumulación de los tránscritos codificantes para las proteínas lacasas OsLAC26 (LOC_Os01g62490), OsLAC12 (LOC_Os05g38410) y OsLAC13 (LOC_Os05g38420), estos dos últimos cuantificados indistintamente por ser genes parálogos, frente al gen de referencia OsUbi1 (LOC_Os06g46770) determinados mediante qRT-PCR en hojas jóvenes de tres líneas independientes osa-MIR397a-Ox, dos líneas independientes osa-MIR397b-Ox y dos del vector vacío (Ev), todas de la generación T0. Cuantificación realizada por qRT-PCR utilizando cebadores específicos para amplificar la secuencia del tránscrito que incluye el sitio de corte por el miRNA. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales.

0,005

0,015

0,025Dianas predichas osa-miR397a/b

0,000

0,001

OsLAC26 OsLAC12/OsLAC13

Ev #6Ev #7osa-MIR397a-Ox #4osa-MIR397a-Ox #5osa-MIR397a-Ox #11osa-MIR397b-Ox #2osa-MIR397b-Ox #7

Acum

ulac

ión

relat

iva

1 0,950 1,269 1,121 1,236 1,500 2,732 1,378 2,992 1,598 1,156 1,286

osa-miR397b21 nt

RNA EtBr

C I C I C I C I C I C I

Cuantificación relativa

0 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h


- 163 -

La acumulación de osa-miR397 se monitorizó en plantas de arroz infectadas por

M. oryzae en ensayos de infección de planta entera, y además se analizó el perfil de

acumulación de sus dianas (Figura 55A). Los resultados muestran una cinética dinámica

tanto para los tránscritos de las lacasas como para osa-miR397. La acumulación de osa-

miR397 se ve generalmente reprimida en respuesta a infección en el tiempo, desde las 3

horas hasta después de 48 horas de infección (entre 0,6 y 0,8 relativo al control),

excepto a las 24 horas de la infección cuando se ve una leve inducción. Las lacasas

OsLAC26 y las parálogas OsLAC12/OsLAC13, en general, también presentan una

represión en respuesta al proceso infectivo, la primera especialmente intensa después

de 3 horas de la inoculación (0,5 relativo al control) y OsLAC12/13 una respuesta leve

pero muy constante desde las 3 horas hasta las 24 horas después de iniciada la

infección. La dinámica de acumulación de estos componentes se grafican en la Figura

55B, y se puede ver que los cambios en general no parecen tener una correlación entre

osa-miR397 y sus dianas. Aun así, se pueden establecer relaciones entre esos

componentes en momentos muy puntuales después de la infección, como ocurre

después de 48 horas, cuando se ve una fuerte represión de osa-miR397 y una inducción

de OsLAC12/13. Estas dinámicas de acumulación durante la respuesta de defensa de las

plantas de arroz podrían indicar que los osa-miR397 regulan la acumulación de sus

dianas de forma preferente a distintos tiempos de acuerdo a las funciones específicas de

estas lacasas y de acuerdo a las necesidades de la planta.

Según los resultados obtenidos, osa-miR397 está principalmente reprimida, así

como sus dianas OsLAC12, OsLAC13 y OsLAC26, aunque todos estos componentes

presentan dinámicas y correlaciones variables durante las respuestas de defensa de la

planta de arroz frente a M. oryzae.

Resultados

- 164 -

-1,0

-0,5

0,0

0,5

0 10 20 30 40 50 60

osa-miR397a/bOsLAC26OsLAC12/13

Cam

bio

en la

acu

mul

ació

n (F

C; re

lativ

o al

con

trol,

log 2

)


B

Acum

ulac

ión

relat

iva


A

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 3 6 12 24 48

OsLAC26

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 3 6 12 24 48

OsLAC12/13

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 3 6 12 24 48

osa-miR397a/b

Figura 55. Acumulación de los osa-miR397 y sus tránscritos dianas en respuesta a infección por M. oryzae en hojas de arroz. A. Gráficas de los niveles de acumulación de los osa-miR397 y de los tránscritos OsLAC12, OsLAC13 y OsLAC26, cuantificados por stemloop qRT-PCR y qRT-PCR. Plantas de arroz inoculadas por aspersión de una suspensión de esporas de M. oryzae a 105 esp/ml o con agua estéril (control). Las muestras fueron tomadas a los tiempos indicados luego de la inoculación. Se muestran los valores de acumulación media de osa-miR397a y osa-miR397b, OsLAC26 (LOC_Os01g62490), OsLAC12 (LOC_Os05g38410) y OsLAC13 (LOC_Os05g38420) frente al gen de referencia OsUbi1 (LOC_Os06g46770). La acumulación de osa-miR397a y osa-miR397b se cuantificó indistintamente, así como la acumulación de las lacasas parálogas OsLAC12 y OsLAC13. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales. Los valores de la acumulación están referenciados al valor obtenido en la muestra control de cada tiempo (valor de referencia del control=1). B. Gráfica de la dinámica temporal de acumulación de osa-miR397a/b y acumulación de sus dianas OsLAC26, OsLAC12 y OsLAC13 en respuesta a infección por M. oryzae. El eje de las ordenadas se representa el cambio logarítmico en la acumulación (FC) en condiciones de infección, relativo a la acumulación en el control. En el eje de las abscisas se representa el tiempo (horas) transcurrido después de la inoculación. Las líneas gruesas indican el umbral correspondiente a un cambio sustancial en la acumulación (criterio: FC=±0,5).


- 165 -

7.3.3 Caracterización de líneas de Arabidopsis thaliana con acumulación diferencial

de miR397 frente a infección

En Arabidopsis están descritos dos MIR397 (ath-MIR397a y ath-MIR397b), para

los que se contaba con una línea de imitación de diana como las descritas previamente.

Así pues, se realizó la caracterización del fenotipo en infección a hongos de la línea

MIM-miR397. Primeramente se analizó la acumulación de los miembros ath-miR397

mediante un análisis de stemloop qRT-PCR. Los resultados obtenidos se muestran en la

Figura 56A y confirman que estas líneas tienen disminuida la acumulación de ath-

miR397 en comparación con las líneas control.

El fenotipo de estas líneas frente a infección por el hongo fitopatógeno

necrótrofo P. cucumerina se evaluó tanto en ensayos in vitro como en tierra. En las

imágenes de la Figura 56B se muestran los resultados de los ensayos de infección in

vitro, donde no se aprecian diferencias entre el fenotipo de la línea MIM-miR397 y la

portadora del vector vacío. Esta observación se corresponde con la cuantificación de las

hojas lesionadas en cada planta, donde no se aprecian diferencias significativas entre las

plantas MIM-miR397 y las líneas control, exhibiendo resultados similares de

aproximadamente 60% de incidencia de lesiones (Figura 56C). Tampoco se observaron

diferencias visibles en los ensayos de infección en plantas crecidas en tierra (Figura 56D).

Los resultados obtenidos en las condiciones experimentales de este trabajo muestran

que los ath-miR397 podrían no participar en las respuestas de defensa de Arabidopsis

frente a infección necrótrofa por P. cucumerina.

Resultados

- 166 -

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

MIM-miR397 Ev

HHoja

s les

iona

das p

or p

lant

a ((%

)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

ath-miR397a/b

Acum

ulac

ión

rela

tiva Wt

EvMIM-miR397

EvMIM-miR397

A C

B

D

WtEvMIM-miR397

Figura 56. Caracterización de las líneas MIM-miR397 de A. thaliana en respuesta a infección por P. cucumerina. A. Niveles de acumulación del miR397 en plantas de Arabidopsis MIM-miR397, portadoras de vector vacío (Ev) y silvestres sin transformar (Wt) cuantificados por stemloop qRT-PCR. Las muestras corresponden a hojas de plántulas de 21 días crecidas en tierra en condiciones de invernadero. Se muestran los valores de acumulación media de ath-miR397a/b frente al gen de referencia Tubulin (At5g62700). Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales. B. Imágenes representativas de la infección causada por P. cucumerina a los 7 dpi. El ensayo se realizó con plántulas de 14 días crecidas in vitro en medio MS sólido inoculadas por rociado de una suspensión de esporas de P. cucumerina (105 esp/ml). C. Cuantificación del porcentaje de hojas lesionadas a los 7dpi según se indica en B. Se muestra el valor medio y el SEM de un ensayo con al menos 25 plántulas por línea y es representativo de dos réplicas experimentales. D. Imágenes representativas de ensayos de infección con plantas de 21 días crecidas en tierra e inoculadas con una suspensión de esporas de P. cucumerina (105 esp/ml). Las fotos fueron tomadas a los 11 dpi y son representativas de ensayos independientes.


- 167 -

7.3.4 Caracterización genotípica de líneas mutantes insercionales para osa-MIR397a

y OsLAC13

En el transcurso de este trabajo de tesis se pudo contar con líneas de mutantes

de arroz de la colección del TRIM (Taiwan rice insertional mutants), amablemente

cedidas por la Dra. Y-I Hsing, cuyas inserciones de T-DNA se encontraban próximos a

los locus de OsLAC13 (línea M0053518) y de osa-MIR397a (línea M0109988) (Hsing et al.,

2007). Estas líneas mutantes permitirían el estudio funcional de estos genes, si las

inserciones influencian los niveles de expresión del miRNA o de la lacasa.

En la Figura 57A, se muestra una representación del mapa genético de estos

mutantes en el sitio de la inserción del T-DNA y en relación con el pre-miRNA y el gen

de interés. Varias plantas de estas líneas fueron analizadas mediante análisis de PCR

utilizando cebadores específicos para el T-DNA y la región del genoma donde se

encuentran las inserciones, identificándose una línea homocigota para cada evento

(M0053518.5 y M0109988.3). La acumulación de osa-miR397a y de su tránscrito diana

OsLAC13 se analizó mediante qRT-PCR en hojas de plantas de esas líneas homocigotas

en comparación con líneas azigotas y la variedad silvestre. En la Figura 57B se muestran

los resultados, donde se puede ver que la línea M0053518.5 (osa-MIR397a-Ac) acumula

niveles tres veces más altos del miRNA que las líneas control. Esta activación de osa-

miR397a se corresponde con los niveles disminuidos de los tránscritos dianas

OsLAC12/13. La línea M0109988.3 (OsLAC13-Kd) a su vez, presenta niveles de

acumulación de OsLAC12/13 más bajos, que llegan sólo a la mitad de lo observado en

las líneas control silvestre y del vector vacío. Estas líneas fueron utilizadas como

herramientas para la caracterización funcional de osa-MIR397 y OsLAC13 frente a

infección por M. oryzae y frente a sequía.

Resultados

- 168 -

Figura 57. Análisis genotípico de las líneas de arroz mutantes insercionales de la colección TRIM para osa-MIR397a y OsLAC13. A. Representación gráfica que indica la ubicación en el genoma de la inserción del T-DNA para las líneas mutantes M0053518 y M0109988 del TRIM (Taiwan rice insertional mutants), con respecto a los genes adyacentes osa-MIR397a y OsLAC13 (LOC_Os05g38420), respectivamente. Se muestra la caracterización genotípica por PCR de las líneas mutantes homocigotas (Ho) y azigotas (Az) para la inserción de T-DNA, así como el control de la variedad silvestre Tainung67. La posición de hibridación de los cebadores utilizados se indica con flechas. Las líneas discontinuas corresponden a la doble cadena de DNA. Las barras anchas en el gen OsLAC13 corresponden a las regiones no traducidas-UTRs (claras) y exones (oscuras). Las líneas continuas corresponden a los intrones. Las barras anchas en osa-MIR397a corresponden al precursor (claras) y al miRNA maduro (oscura). Localizaciones genómicas consultadas en la base de datos del TRIM. B. Gráficas de los niveles de acumulación de osa-miR397a y de los tránscritos OsLAC12 y OsLAC13 en las líneas mutantes del TRIM, cuantificados por stemloop qRT-PCR y qRT-PCR. Se muestran los valores de acumulación media de osa-miR397a, OsLAC12 (LOC_Os05g38410) y OsLAC13 (LOC_Os05g38420) frente al gen de referencia OsUbi1 (LOC_Os06g46770). La acumulación de los genes parálogos OsLAC12 y OsLAC13 se cuantificó indistintamente. Las barras representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. El asterisco corresponde a diferencias significativas según análisis de ANOVA (*=p<0,05). Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales.

AA

Wt

RB-R

F-R

AzM0109988-3

HoM0109988-5

Cromosoma 5

22450kb 22455kb

OsLAC13

T-DNARB

FR

Cromosoma 6

28485kb 28490kb

osa-MIR397a

T-DNA RB

RF

Wt

RB-R

F-R

HoM0053518-1

AzM0053518-5

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

osa-miR397a OsLAC12/13

AAcum

ulac

ión

rela

tiva

WtAzM0053518-5 (osa-MIR397a-Ac)M0109988-3 (OsLAC13-Kd)

B

*


- 169 -

7.3.5 Caracterización de las líneas de acumulación diferencial de osa-miR397 y su

tránscrito diana OsLAC13 frente a infección

Según los resultados presentados previamente, osa-miR397 podría estar

implicado en las respuestas de defensa de las plantas de arroz. Se propuso entonces

caracterizar las líneas de acumulación alterada de los miRNAs osa-miR397a, osa-

miR397b y el mensajero del gen OsLAC13 frente a infección por M. oryzae. Los ensayos

de infección se realizaron con las líneas homocigotas de los mutantes TRIM osa-

MIR397a-Ac y OsLAC13-Kd, y con las líneas transgénicas osa-MIR397b-Ox (generación

T1).

Fenotípicamente, las plantas de 21 días de las líneas osa-MIR397b-Ox no

presentan diferencias visibles en comparación con la línea silvestre en las condiciones de

crecimiento utilizadas en este trabajo (Figura 58A). En la Figura 58B se muestran las

imágenes representativas de las lesiones desarrolladas en las hojas tras la infección por

M. oryzae. En dos ensayos independientes se observó un leve aumento de la

susceptibilidad en las líneas osa-MIR397b-Ox comparadas con las líneas control. Luego

del análisis cuantitativo del área foliar lesionada, se pudo comprobar que existen

diferencias significativas en el área foliar lesionada en una de las líneas sobreexpresoras

de osa-MIR397b (#8) llegando hasta un 40% del área foliar lesionada, con respecto a los

controles que sólo tuvieron una incidencia de la enfermedad de aproximadamente el

10% (Figura 58C). Se observó además que, a pesar de no presentar diferencias

significativas, las otras dos líneas osa-MIR397b-Ox (#1.1 y #1.2) también muestran un

porcentaje superior de área lesionada comparadas con los controles. Estos resultados

muestran que la sobreacumulación de osa-miR397b conlleva un incremento de la

susceptibilidad de la planta de arroz frente a la enfermedad de la piriculariosis.

Resultados

- 170 -

Las líneas homocigotas osa-MIR397-Ac y OsLAC13-Kd tampoco presentan

diferencias fenotípicas visibles comparadas con las líneas azigotas y silvestre (Figura

59A). En la Figura 59B se puede ver una muestra representativa de 3 réplicas biológicas

de las hojas de las líneas mutantes osa-MIR397a-Ac y OsLAC13-Kd infectadas por M.

oryzae. No se observaron diferencias notorias en el fenotipo de estas líneas frente a la

infección, en comparación con la variedad silvestre y la línea azigota. Así también, en el

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Wt Az #1.1 #1.2 #8

Porc

enta

je d

el á

rea

folia

r les

iona

da

Incidencia de lesiones

B

Líneas osa-MIR397b-Ox

Líneas ControlWt

Az

C

Wt Wtosa-MIR397b-Ox

#8#1.2

A

*

osa-MIR397b-Ox

#1.1

#1.2

#8

Figura 58. Fenotipo de líneas de sobreexpresión de osa-MIR397b en respuesta a infección por M. oryzae. A. Apariencia fenotípica de plantas de 21 días de las líneas de arroz sobreexpresoras de osa-MIR390, generación T1, comparadas con plantas de la variedad silvestre Tainung67 (Wt). B. Imágenes representativas de las lesiones causadas por la infección con M. oryzae aislado Guy11 en la penúltima hoja emergida a los 7 días post-inoculación por aspersión de una suspensión de esporas a concentración de 105 esp/ml. C. Promedio del porcentaje del área foliar lesionada debido a la infección por M. oryzae. Cuantificación del área de lesión realizada por análisis de imágenes con el programa informático Assess v2.0. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) de al menos 6 réplicas biológicas. El asterisco corresponde a diferencias significativas según análisis de ANOVA (*=p<0,05). Los datos mostrados son de un ensayo independiente representativo de dos réplicas experimentales.


- 171 -

análisis cuantitativo del área foliar afectada por la infección no se encontraron

diferencias significativas en cuanto a incidencia de lesiones entre las líneas mutantes

osa-MIR397a-Ac, que presentó un 25% de área lesionada, y OsLAC13-Kd, un 40%,

comparadas con las líneas silvestre (35%) y azigota (30%) (Figura 59C). Estos resultados

parecen indicar que podría existir una diferenciación entre ambos miembros osa-miR397

en cuanto a su funcionalidad. En este caso se ha visto que las líneas que acumulan osa-

miR397b parecen ser más susceptibles a la infección por M. oryzae, mientras que la línea

de activación de la expresión de osa-MIR397a no presenta un fenotipo de

resistencia/susceptibilidad en las mismas condiciones. Tampoco se ha visto que las

líneas de pérdida de función de OsLAC13 tengan un fenotipo que se pueda relacionar

con la respuesta de defensa de las plantas de arroz. Se podría decir entonces que el

papel que podría cumplir osa-miR397b en las respuestas de defensa de la planta de

arroz no viene dado por la regulación post-transcripcional de OsLAC13.

7.3.6 Respuesta de los osa-MIR397 y sus dianas frente a estrés hídrico

Las lacasas son componentes importantes de la señalización regulada por el

estrés oxidativo, íntimamente ligado a las rutas de señalización tanto de defensa como

de sequía (Cho et al., 2014; Turlapati et al., 2011). En este trabajo se ha analizado la

expresión de osa-MIR397 y sus dianas OsLAC12, OsLAC13 y OsLAC26 en tejido radicular

sometido a desecación. En el análisis cuantitativo de los niveles de acumulación se ha

encontrado que tanto el miRNA como sus tránscritos dianas, codificantes de las lacasas

mencionadas, están inducidas frente a estrés hídrico respecto al control en las raíces de

las plantas de arroz (Figura 60). Esta inducción se detecta entre los 60 minutos y las 3

horas después del inicio del tratamiento, suponiendo un incremento de hasta 3 veces en

los niveles de acumulación, y se observa tanto para osa-miR397 como para sus dianas

OsLAC12/13 y OsLAC26. Estos resultados muestran una clara activación de osa-MIR397

en respuesta a sequía, pero que no se correlaciona con una disminución en los niveles

de acumulación de los tránscritos de OsLAC12/13 y OsLAC26.

Resultados

- 172 -

7.3.7 Caracterización de las líneas de acumulación diferencial de osa-miR397 y su

tránscrito diana OsLAC13 frente a sequía

Los resultados mencionados previamente muestran que la expresión de osa-

MIR397 y sus dianas OsLAC12/13 y OsLAC26 está regulada durante las respuestas de la

planta de arroz frente a estrés hídrico, por lo que se caracterizaron las líneas osa-

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Porc

enta

je d

el á

rea

folia

r les

iona

da


B

Líneas mutantes TRIM

Líneas Control

C

Wt osa-MIR397a-AcAz #1 OsLAC13-KdAz #2

A

Wt

Az

OsLAC13-Kd

osa-MIR397a-Ac

Figura 59. Fenotipo de líneas mutantes en OsLAC13 y de activación de osa-MIR397a en respuesta a infección por M. oryzae. A. Apariencia fenotípica plantas de 21 días crecidas en tierra de las líneas OsLAC13-Kd y osa-MIR397a-Ac, de la variedad silvestre Tainung67 (Wt) y azigotas (Az). B. Imágenes representativas de las lesiones causadas por la infección con M. oryzae aislado Guy11 la penúltima hoja emergida a los 7 días post-inoculación por aspersión de una suspensión de esporas a concentración de 105 esp/ml. C. Promedio del porcentaje del área foliar lesionada debido a la infección por M. oryzae. Cuantificación del área de lesión realizada por análisis de imágenes con el programa informático Assess v2.0. Las barras representan el error estándar de la media de al menos 6 réplicas biológicas. Los datos mostrados son de un ensayo independiente representativo de dos réplicas experimentales.


- 173 -

MIR397a-Ac y OsLAC13-Kd frente a sequía. En la Figura 61 se muestra la apariencia de las

plantas sometidas a un tratamiento de sequía por falta de riego durante 5 días,

presentando un claro aspecto de decaimiento, hojas secas y pálidas en todas las líneas

analizadas (arriba); en cambio, luego de restaurar el riego normal durante 7 días (abajo),

se aprecia la recuperación tanto de las líneas osa-MIR397a-Ac y OsLAC13-Kd como del

control positivo OsCPK13-Ox, pero no de las líneas silvestre y azigotas. Estos resultados

muestran una mayor tolerancia a la sequía en las plantas de las líneas osa-MIR397a-Ac y

OsLAC13-Kd.

Se cuantificaron los resultados de dos réplicas biológicas y se pudo constatar

que las plantas de la línea OsLAC13-Kd tienen una supervivencia del 100% a sequía,

mientras que las plantas de la línea de activación de osa-MIR397a llegan al 50% (Figura

Figura 60. Acumulación de osa-miR397 y los tránscritos de sus dianas OsLAC26 y OsLAC12/13 en respuesta a estrés hídrico. Gráficas de los niveles de acumulación de los osa-miR397 y de los tránscritos OsLAC12, OsLAC13 y OsLAC26, cuantificados por stemloop qRT-PCR y qRT-PCR. Plantas de arroz de la variedad silvestre Nipponbare desecadas bajo campana de flujo laminar. Las muestras corresponden a raíces tratadas por desecación o no (control) tomadas a los tiempos indicados luego del inicio del tratamiento. Se muestran los valores de acumulación media de osa-miR397a y osa-miR397b, OsLAC26 (LOC_Os01g62490), OsLAC12 (LOC_Os05g38410) y OsLAC13 (LOC_Os05g38420) frente al gen de referencia OsUbi1 (LOC_Os06g46770). La acumulación de osa-miR397a y osa-miR397b se cuantificó indistintamente, así como las lacasas parálogas OsLAC12 y OsLAC13. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales. Los valores de la acumulación están referenciados al valor obtenido en la muestra control de cada tiempo (valor de referencia del control=1).

0

1

2

3

4

5

30 60 180 240

osa-miR397a/b

0

1

2

3

4

5

30 60 180 240

OsLAC12/13

0

1

2

3

4

5

6

30 60 180 240

OsLAC26

Acum

ulac

ión

relat

iva

Minutos post-desecación

Resultados

- 174 -

62A), en comparación con la supervivencia de la línea silvestre (30%) y las plantas

azigotas (35%). Así también se cuantificó la tolerancia al estrés que tenían estas líneas,

de acuerdo a una escala fenotípica que se ha establecido en este trabajo, viéndose que

las plantas OsLAC13-Kd son mucho más tolerantes, por presentar menos síntomas de

quemaduras en las hojas, mientras que las plantas osa-MIR397a-Ac tienen una leve

mejor tolerancia que las líneas control silvestre y azigota (Figura 62B).

Uno de los factores que influye en la tolerancia al estrés hídrico es la baja

pérdida de agua en condiciones de sequía. Fue calculada la curva de pérdida de agua

WWt Az osa-MIR397a-Ac OsLAC13-Kd

D5D1

2

T


D0 D5 D12

B

Figura 61. Fenotipo de las líneas osa-MIR397a-Ac y OsLAC13-Kd en respuesta a sequía. A. Diagrama del diseño experimental para la caracterización de la tolerancia a sequía. Las plantas se crecieron en condiciones normales durante 21 días (D0), momento en el que dejaron de regarse durante 5 días (D5), para después volver a riego normal durante 7 días (D12). B. Imágenes representativas de plantas de líneas osa-MIR397a-Ac, OsLAC13-Kd y los controles silvestre Tainung67 (Wt), azigota (Az) y la línea de arroz de sobreexpresión del gen OsCPK13 tolerante a sequía (T) a los 5 días sin riego (D5, paneles superiores) y al final del periodo de recuperación (D12, paneles inferiores). Las imágenes mostradas son representativas de dos ensayos independientes.


- 175 -

en estas líneas por medio de la cuantificación de la pérdida de peso por desecación con

el paso del tiempo. No se encontraron diferencias significativas entre las líneas

analizadas (Figura 62C). Según estos resultados, no existe correlación entre la pérdida de

agua de las líneas mutantes y su tolerancia a sequía.

Figura 62. Tolerancia a sequía de las líneas osa-MIR397a-Ac y OsLAC13-Kd. A. Gráfica del porcentaje de supervivencia al tratamiento de sequía indicado en la Figura 61, de plantas de las líneas osa-MIR397a-Ac y OsLAC13-Kd, azigotas (Az) y de la variedad silvestre Tainung67 (Wt). B. Porcentaje de plantas mostrando los síntomas de estrés por sequía en la escala de 0 a 5; donde 0=sin síntomas, y 5= planta muerta. C. Cuantificación del porcentaje de la pérdida de peso en el tiempo con respecto al peso inicial en plantas de 7 días crecidas in vitro y secadas al aire. Las barras corresponden al SEM. En todos los ensayos se analizaron al menos 10 muestras biológicas por cada línea. Los asteriscos corresponden a diferencias significativas según análisis de ANOVA (**=p<0,01). Los datos mostrados corresponden a un experimento representativo de dos réplicas experimentales.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 1 2 3 4 5

Peso

per

dido

(%)

Horas de secado

Curva de retención de agua

WtAzosa-MIR397a-AcOsLAC13-Kd

C

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Tolerancia al estrés hídrico

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

SupervivenciaA

**

0-Planta sin quemaduras1-Planta con pocas quemaduras foliares2-Planta con quemaduras foliares severas3-Planta seca con nuevos tejidos emergiendo4-Planta seca con pocos tejidos verdes5-Planta muerta

B

Resultados

- 176 -

En las condiciones de este trabajo, las plantas de la línea mutante OsLAC13-Kd

muestran significativamente mayor resistencia a estrés hídrico, al igual que las plantas de

la línea osa-MIR397a-Ac, a pesar de que el incremento en esta última no es

estadísticamente significativo, sugiriendo la participación funcional de osa-miR397a y

OsLAC13 en la adaptación de la planta de arroz frente a la sequía.

7.3.8 Análisis de la producción de peróxido de hidrógeno en las líneas de

acumulación diferencial de osa-miR397 y OsLAC13 en respuesta a estrés

hídrico

Uno de los efectos asociados al déficit hídrico en la célula es la producción de

ROS que pueden actuar como moléculas señalizadoras, pero que a niveles elevados

pueden causar daño celular (Cruz de Carvalho, 2008). Además, en estudios aún no

publicados realizados en el grupo de la Dra. Y-I Hsing (Academia Sinica, Taiwán) han

identificado que osa-miR397 participa en la respuesta a estrés oxidativo en raíces de

arroz y que en esas condiciones tiene como diana a OsLAC26 (Wu & Hsing,

comunicación personal). Estos datos sugieren que las líneas osa-MIR397a-Ac y OsLAC13-

Kd, que muestran niveles de acumulación alterados para algunos tránscritos lacasas,

podrían presentar alteraciones en la producción y acumulación de ROS, pudiendo

correlacionarse con la tolerancia a sequía mostrada por estas plantas de arroz. Por ello

se procedió a analizar el contenido de peróxido de hidrógeno (H2O2) en diferentes

tejidos de plántulas de esas líneas y en condiciones de sequía.

La Figura 63 recoge los resultados obtenidos, donde se puede observar que

todas las líneas analizadas acumulan niveles similares de peróxido de hidrógeno en

condiciones controles, tanto en raíces como en parte aérea. En respuesta a la

desecación se observa un claro incremento en el contenido de H2O2, alcanzando niveles

similares en las hojas de todas las líneas analizadas, pero claramente superiores en las

raíces de las líneas osa-MIR397a-Ac y OsLAC13-Kd. Las raíces de la línea OsLAC13-Kd

alcanzan valores incluso superiores que las de la línea osa-MIR397a-Ac, pudiendo


- 177 -

determinar las diferencias fenotípicas observadas entre ambas líneas mutantes. Estos

datos indican que una menor acumulación de los mensajeros OsLAC12/13 resulta en una

mayor capacidad para producir ROS en respuesta a desecación. Las proteínas lacasas

interfieren en el proceso de formación de ROS (Wang et al., 2013b). Interesantemente,

esta mayor producción de ROS se correlaciona con una mayor tolerancia a sequía

mostrada por las líneas mutantes OsLAC13-Kd y osa-MIR397a-Ac.

7.4 Caracterización de osa-MIR1319a en las respuestas de defensa y sequía

En los resultados presentados previamente en este trabajo de tesis, se ha visto

que osa-miR1319a presenta una disminución de su acumulación frente a tratamientos

por elicitores y en infección por M. oryzae. Además, se ha visto que la región promotora

de su precursor presenta elementos regulatorios relacionados con estrés hídrico, por lo

que se propuso realizar la caracterización de este miRNA y sus dianas tanto en defensa

como en sequía.

Figura 63. Producción de peróxido de hidrógeno en las líneas osa-MIR397a-Ac y OsLAC13-Kd en condiciones de estrés hídrico. Cuantificación del contenido de H2O2 en raíces y hojas de plantas osa-MIR397a-Ac, OsLAC13-Kd, azigotas (Az) y silvestres (Wt) crecidas in vitro durante 7 días y sometidas a un tratamiento de desecación al aire por 3 horas o mantenidas en condiciones control. Los datos corresponden a un único experimento y a grupos de al menos 10 plantas por cada línea.

0

5

10

15

20

25

30

35

Control Desecación Control Desecación


μμMH 2

O2/

g

Producción de H2O2

WtAzosa-MIR397a-AcOsLAC13-Kd

Resultados

- 178 -

7.4.1 Validación de dianas de osa-MIR1319a

El tránscrito del gen OsLTPL6 (LOC_Os11g02379) ha sido predicho como diana

para osa-miR1319a y además se ha encontrado que, efectivamente, el mismo sufre una

regulación post-transcripcional degradándose por este miRNA según el análisis de

degradoma. En tres líneas osa-MIR1319a-Ox se ha analizado la acumulación de OsLTPL6

y se ha verificado que las mismas presentan muy baja acumulación transcripcional, con

una disminución de más del 80%, comparadas con la línea del vector vacío (Figura 64).

Estos resultados sugieren que osa-miR1319a regula post-transcripcionalmente la

expresión del gen OsLTPL6.

7.4.2 Respuesta de osa-MIR1319a y OsLTPL6 frente a infección por M. oryzae

Anteriormente se ha presentado el análisis de la respuesta de osa-MIR1319a

frente a infección por M. oryzae y se propuso analizar también la expresión de su diana

OsLTPL6 en las mismas condiciones mediante qRT-PCR. Los resultados muestran

cambios en los niveles de acumulación del miRNA y del tránscrito diana (Figura 65), y se

puede ver que existe una disminución de osa-miR1319a, especialmente marcada a las 6

horas de la inoculación (0,4 relativo al control no inoculado) y después de 48 horas (0,6).

Figura 64. Acumulación del tránscrito OsLTPL6 en las líneas transgénicas de sobreexpresión de osa-MIR1319a. Niveles de acumulación promedio del tránscrito OsLTPL6 (LOC_Os11g02379), determinados mediante qRT-PCR utilizando como referencia OsUbi1 (LOC_Os06g46770), en hojas jóvenes de tres líneas transgénicas independientes osa-MIR1319a-Ox (generación T0) en comparación con una línea transformada con el vector vacío (Ev). Las barras de error representan la desviación estándar (SD). Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales.

0,0000

0,0005

0,0010

0,0015

0,0020

0,0025

0,0030

0,0035

OsLTPL6

AAcum

ulac

ión

rela

tiva

Diana de osa-miR1319a

EV#7osa-MIR1319a-Ox #7osa-MIR1319a-Ox #16osa-MIR1319a-Ox #18


- 179 -

Su diana OsLTPL6 presenta un aumento gradual en su expresión conforme avanza la

infección por el hongo desde las 6 hasta las 24 horas (entre 1,2 y 1,3 veces más respecto

al control) llegando a los valores máximos de acumulación a las 48 horas de iniciada la

infección (1,7 veces el control). Se puede establecer una correlación directa entre la

disminución de osa-miR1319a y el aumento de la expresión de su diana en respuesta a

infección. La inducción de la acumulación de OsLTPL6, sugiere que cumple un papel

regulador positivo en las respuestas de defensa de la planta de arroz frente a M. oryzae

y está regulado negativamente por osa-miR1319a.

7.4.3 Caracterización genotípica de líneas mutantes insercionales para osa-

MIR1319a

Como herramientas para el estudio funcional de osa-MIR1319a se han

identificado dos líneas mutantes del TRIM cuyas inserciones de T-DNA se encontraban

próximas a la ubicación genómica del gen MIR (líneas M0058436 y M0058445), que

podrían tener efectos en la acumulación del miRNA en estudio. La Figura 66A representa

el mapa genómico de la inserción y las secuencias adyacentes. Se analizaron por PCR

varias plantas de las líneas mutantes, utilizando cebadores específicos para el T-DNA y la

zona genómica donde se encuentra insertado. Así, se identificó una línea homocigota

para uno de los eventos de transformación (M0058436.1). Se analizaron los niveles de

acumulación del osa-miR1319a en esta línea mediante stemloop qRT-PCR y como se

muestra en la Figura 66B, la línea M0058436.1 (osa-MIR1319a-Kd) presenta entre el 20 y

el 40% de disminución en la acumulación de este miRNA, comparadas con líneas

azigotas y la variedad silvestre. Sin embargo, la acumulación de su tránscrito diana

OsLTPL6 sólo presenta un ligero aumento en los niveles de acumulación, principalmente

en comparación con la línea azigota (0,008 vs. 0,006). Así, el mutante osa-MIR1319a-Kd

presenta una leve disminución de la expresión de osa-MIR1319a, lo que conlleva un

ligero aumento en los niveles de acumulación del tránscrito diana OsLPT6. Esta línea se

Resultados

- 180 -

utilizó para caracterizar el papel de este miRNA y su diana en la defensa de la planta de

arroz frente a M. oryzae y frente a sequía.

Figura 65. Acumulación de osa-miR1319a y de tránscritos de su diana OsLTPL6 en respuesta a infección por M. oryzae en hojas de arroz. A. Gráficas de los niveles de acumulación de osa-miR1319a y del tránscrito OsLTPL6, cuantificados por stemloop qRT-PCR. Plantas de arroz inoculadas por aspersión de una suspensión de esporas de M. oryzae a 105 esp/ml o con agua estéril (control). Las muestras fueron tomadas a los tiempos indicados luego de la inoculación. Se muestran los valores de acumulación media de osa-miR1319a y OsLTPL6 (LOC_Os11g02379) frente al gen de referencia OsUbi1 (LOC_Os06g46770). Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales. Los valores de la acumulación están referenciados al valor obtenido en la muestra control de cada tiempo (valor de referencia del control=1). B. Gráfica de la dinámica temporal de acumulación de osa-miR1319a y su diana OsLTPL6 en respuesta a infección por M. oryzae. El eje de las ordenadas se representa el cambio logarítmico en la acumulación (FC) en condiciones de infección, relativo a la acumulación en el control. En el eje de las abscisas se representa el tiempo transcurrido después de la inoculación. Las líneas gruesas indican el umbral correspondiente a un cambio sustancial en la acumulación (criterio: FC=±0,5).

Acum

ulac

ión

relat

iva


-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

0 10 20 30 40 50 60

osa-miR1319a

OsLTPL6

Cam

bio

en la

acu

mul

ació

n (F

C; re

lativ

o al

con

trol,

log 2

)


A

B

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 6 24 48

OsLTPL6

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 6 24 48

osa-miR1319a


- 181 -

Figura 66. Análisis genotípico de las líneas de arroz mutantes insercionales de la colección TRIM para osa-MIR1319a. A. Representación gráfica que indica la ubicación en el genoma de la inserción del T-DNA para las líneas mutantes M0058436 y M0058445 con respecto a los genes adyacentes osa-MIR1319a y OsLTPL6 (LOC_Os11g02379). Las inserciones de T-DNA en ambos mutantes se encuentran casi en la misma posición en el genoma. Se muestra la caracterización genotípica por PCR de las líneas mutantes homocigotas (Ho) y azigotas (Az) para la inserción de T-DNA, así como el control de la variedad silvestre Tainung67. La posición de hibridación de los cebadores utilizados se indica con flechas. Las líneas discontinuas corresponden a la doble cadena de DNA. Las barras anchas en el gen OsLTPL6 corresponden a las regiones no traducidas-UTRs (claras) y exones (oscuras). Las líneas continuas corresponden a los intrones. Las barras anchas en osa-MIR1319a corresponden al precursor (claras) y al miRNA maduro (oscura). Localizaciones genómicas consultadas en la base de datos del TRIM. B. Gráficas de los niveles de acumulación de osa-miR1319a y del gen OsLTPL6 en las líneas mutantes del TRIM, cuantificados por stemloop qRT-PCR y qRT-PCR. Se muestran los valores de acumulación media de osa-miR1319a y OsLTPL6 (LOC_Os11g02379) frente al gen de referencia OsUbi1 (LOC_Os06g46770). Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales.

BB

A

Cromosoma 11

697kb 707kb

Wt

RB-R

F-R

AzM0058436-1

HoM0058445-1

osa-MIR1319aOsLTPL6

T-DNARB

FR

0,0000,0010,0020,0030,0040,0050,0060,0070,0080,009

osa-miR1319a OsLTPL6

AAcum

ulac

ión

rela

tiva

WtAzM0058436-1 (osa-MIR1319a-Kd)

Resultados

- 182 -

7.4.4 Caracterización de la línea de acumulación diferencial de osa-miR1319a frente

a infección

Se propuso analizar el fenotipo de las líneas osa-MIR1319a-Ox frente a infección

por M. oryzae, pero para el tiempo de finalización de esta tesis aún no se contaban con

semillas suficientes para realizar análisis con las mismas. Se ha realizado entonces la

caracterización de la línea osa-MIR1319a-Kd en respuesta a infección por M. oryzae.

Crecidas en las mismas condiciones, las plantas de 21 días de la línea osa-MIR1319a-Kd

no presentan diferencias fenotípicas visibles comparadas con las líneas azigotas y

silvestre (Figura 67A). Las mismas se inocularon con esporas de M. oryzae aislado Guy11

que expresa constitutivamente la proteína fluorescente GFP, y se siguió visualmente el

progreso de la enfermedad durante 7 días. Las plantas de las líneas mutantes

desarrollaron menos lesiones y más pequeñas que las plantas controles azigotas y

silvestres (Figura 67B). La cuantificación del área de lesión mediante análisis de imágenes

que se presenta en la Figura 67C, mostró una diferencia significativamente menor en las

hojas de las líneas osa-MIR1319a-Kd (10-15% de área foliar lesionada) en comparación

con los controles (30-35%).

La visualización bajo fluorescencia mostró que la mayoría de lesiones

observadas en la variedad silvestre y en la línea azigota tenían la forma típica romboidal

y eran fluorescentes, indicador del crecimiento del hongo (Figura 67D, panel izquierdo y

central). Sin embargo, en el panel derecho de la Figura 67D se puede ver que en las

hojas de la línea osa-MIR1319a-Kd esas lesiones típicas no ocurrían con frecuencia,

observándose algunas pequeñas lesiones fluorescentes (a) y otras un poco mayores no

fluorescentes (b).

Estos resultados muestran que las plantas de la línea osa-MIR1319a-Kd son más

resistentes a la colonización del tejido foliar por M. oryzae, y sugieren que osa-miR1319a

y su diana OsLTPL6 probablemente están funcionalmente implicados en las respuestas

de defensa de la planta de arroz frente a M. oryzae.


- 183 -

Figura 67. Fenotipo de líneas mutantes osa-MIR1319a-Kd en respuesta a infección por M. oryzae. A. Apariencia fenotípica de plantas de 21 días de las líneas de arroz mutantes en osa-MIR1319a, comparadas con plantas de la variedad silvestre Tainung67 (Wt) y con plantas azigotas (Az). B. Imágenes representativas de las lesiones desarrolladas en hojas infectadas con M. oryzae aislado Guy11 transformado con GFP en las penúltimas hojas emergidas a los 7 días post-inoculación por aspersión de una suspensión de esporas a concentración de 105 esp/ml. C. Promedio del porcentaje del área foliar lesionada debido a la infección por M. oryzae. Cuantificación del área de lesión realizada por análisis de imágenes con el programa informático Assess v2.0. Las barras de error representan el SEM de al menos 6 réplicas biológicas. Los asteriscos corresponden a diferencias significativas según análisis de ANOVA (*=p<0,05). Los datos mostrados son representativos de dos ensayos independientes. D. Imágenes tomadas con lupa esteroscópica de fluorescencia del detalle de las lesiones representativas. Los paneles superiores corresponden al canal de la GFP (verde) que muestra el crecimiento del hongo fluorescente y la autofluorescencia del tejido foliar (rojo). Los paneles inferiores corresponden a las imágenes de campo claro. Las flechas incidan sitios donde hay crecimiento del hongo (a) y lesiones donde se ha detenido ese crecimiento (b) en hojas de la línea osa-MIR1319a-Kd. Las barras de escala corresponden a 500 μm.

BB

Línea mutante TRIM

Líneas Control

C

Wt

Az

Wt osa-MIR1319a-KdAz #1 Az #2

A

osa-MIR1319a-Kd

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Porc

enta

je d

el á

rea

folia

r les

iona

da


**osa-MIR1319a-KdWt AzD

a

b

Resultados

- 184 -

7.4.5 Análisis de la expresión de genes relacionados con defensa en la línea de

acumulación diferencial de osa-miR1319a

Se analizó la expresión de genes de defensa en la línea resistente osa-MIR1319a-

Kd. Los genes marcadores de defensa analizados fueron el gen OsPBZ1 (Probenazole

inducible 1); el marcador de patogénesis OsPR10 (Pathogenesis-related protein 10); la

fenil-alanin-liasa OsPAL1, implicada en la ruta de señalización del SA; y la peroxidasa

OsPOX22.3, relacionada con el estrés oxidativo. En la Figura 68 se muestran los

resultados obtenidos, donde se observa que la expresión de todos los genes analizados

está inducida en las plantas de la línea osa-MIR1319a-Kd en comparación con plantas de

la línea silvestre. Ya en condiciones basales sin infectar se observa que la línea mutante

tiene una expresión incrementada de OsPOX22.3, OsPBZ1 y OsPR10, estos dos últimos

llegan a niveles cercanos a los observados en la silvestre en condiciones de infección,

mientras que la expresión de OsPAL1 es incluso mayor que en la variedad silvestre

infectada. Las diferencias en la expresión de estos genes entre las plantas osa-MIR1319a-

Kd y la variedad silvestre son mayores en condiciones de infección, especialmente

OsPBZ1 y OsPR10, que alcanzan casi el doble de acumulación. Estos datos indican que

las plantas mutantes osa-MIR1319a-Kd tienen activada de manera constitutiva la

respuesta de defensa, y que además se ve potenciada en respuesta a infección por M.

oryzae, pudiendo ser determinante en el fenotipo de resistencia observado en estas

plantas.

7.4.6 Respuesta de osa-MIR1319a y OsLTPL6 frente a estrés hídrico

Como se ha visto en el análisis de promotores in silico, la secuencia promotora

de osa-MIR1319a posee elementos de regulación por estrés hídrico, por lo que se

analizó la acumulación de osa-miR1319a y de su tránscrito diana OsLTPL6 en respuesta a

desecación. En la Figura 69 se muestra que tanto el miRNA como el tránscrito de su

diana se inducen en condiciones de desecación. La acumulación de osa-miR1319a se


- 185 -

detecta ya a los 30 minutos de iniciarse la desecación, alcanzando niveles de casi el

doble de acumulación frente a las condiciones basales a la hora de tratamiento. La

respuesta de OsLTPL6 es aún más intensa, observándose que a los 30 minutos aumenta

su acumulación al triple y hasta se cuadruplica después de una hora del tratamiento. Los

resultados muestran que tanto osa-miR1319a como su diana OsLTPL6 se acumulan en

respuesta a estrés hídrico.

7.4.7 Caracterización de las líneas de acumulación diferencial de osa-miR1319a

frente a sequía

Se ha caracterizado el fenotipo de las líneas osa-MIR1319a-Kd frente a sequía.

Plantas de la línea silvestre, azigota y de la línea osa-MIR1319a-Kd se sometieron a un

Figura 68. Expresión de genes de defensa en respuesta a infección por M. oryzae en hojas de la línea osa-MIR1319a-Kd. Gráficas de los niveles de expresión de los genes OsPBZ1, OsPR10, OsPAL1 y OsPOX22.3, cuantificados por qRT-PCR. Plantas de arroz variedad Tainung67 (Wt) y de la línea osa-MIR1319a-Kd inoculadas por aspersión de una suspensión de esporas de M. oryzae a 105 esp/ml (Infectada) o con agua estéril (control). Las muestras de las hojas fueron tomadas 16 horas después de la inoculación. Se muestran los valores de expresión media de OsPBZ1 (LOC_Os12g36880), OsPR10 (LOC_Os03g18850), OsPAL1 (LOC_Os02g41650) y OsPOX22.3 (LOC_Os07g01370) frente al gen de referencia OsUbi1 (LOC_Os06g46770). Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas. Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

Control Infectada Control Infectada Control Infectada Control Infectada

OsPBZ1 OsPR10 OsPAL1 OsPOX22.3

Expr

esió

n re

lativ

a

Genes de defensa

Wtosa-MIR1319a-Kd

Resultados

- 186 -

régimen de sequía durante 5 días después de haber sido crecidas con riego normal en

tierra por 21 días, y a continuación se reanudó el riego para su recuperación por 7 días.

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 70, donde se puede observar que las

plantas de la línea osa-MIR1319a-Kd sobreviven y presentan tejido verde comparable a la

línea tolerante a sequía OsCPK13-Ox luego del tratamiento de recuperación, a diferencia

de la variedad silvestre y la línea azigota. La supervivencia de plantas osa-MIR1319a-Kd

en estas condiciones es de hasta un 70%, mientras que los controles no llegan al 40%

(Figura 71A). Estas plantas tienen además una mejor tolerancia a sequía respecto a las

líneas control (Wt y Az), ya que presentan un menor daño en los tejidos de la parte

aérea (Figura 71B), pero no tienen diferencias significativas en la pérdida de agua en

condiciones de desecación, en comparación con las líneas azigotas y silvestre (Figura

71C). Los resultados muestran que la línea osa-MIR1319a-Kd es más tolerante a

condiciones de estrés hídrico, y tiene un alto porcentaje de supervivencia luego del

periodo de sequía, sugiriendo que osa-miR1319a y OsLTPL6 tienen un papel en la

adaptación de la planta de arroz frente a este estrés.

Figura 69. Acumulación de osa-miR1319a y del tránscrito diana OsLTPL6 en respuesta a estrés hídrico. Se muestran los niveles de acumulación promedio del osa-miR1319a y del tránscrito OsLTP6 (LOC_Os11g02379), cuantificados por stemloop qRT-PCR, usando OsUbi1 como gen de referencia. Plantas de arroz (cv. Nipponbare) de 7 días crecidas in vitro fueron desecadas bajo campana de flujo laminar a los tiempos indicados luego del inicio del tratamiento. Se muestran los valores de acumulación media de osa-miR1319a y OsLTPL6. Las barras de error corresponden la desviación estándar (SD) de tres réplicas técnicas de un grupo de 10 plantas. Los datos corresponden a un único experimento.

0,000

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0 30 60

OsLTPL6

0,0000

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,0010

0,0012

0 30 60

osa-miR1319a

Acum

ulac

ión

relat

iva

Minutos post-desecación


- 187 -

7.4.8 Análisis de la producción de peróxido de hidrógeno en la línea de

acumulación diferencial de osa-miR1319a en respuesta a estrés hídrico

Puesto que se ha visto que la línea osa-MIR1319a-Kd tiene alterados los niveles

de expresión de la peroxidasa OsPOX22.3, se propuso analizar el contenido de peróxido

de hidrógeno en estas plantas en condiciones de sequía. Se cuantificó el contenido de

H2O2 en plantas de 7 días de la línea osa-MIR1319a-Kd y líneas controles sometidos a

desecación. Los resultados se muestran en la Figura 72, y se puede ver que el contenido

Figura 70. Fenotipo de las líneas osa-MIR1319a-Kd en respuesta a sequía. A. Diagrama del diseño experimental para la caracterización de la tolerancia a sequía. Las plantas se crecieron en condiciones normales durante 21 días (D0), momento en el que dejaron de regarse durante 5 días (D5), para después volver a riego normal durante 7 días (D12). B. Imágenes representativas de plantas de líneas osa-MIR1319a-Kd y los controles silvestre Tainung67 (Wt), azigota (Az) y la línea de arroz de sobreexpresión del gen OsCPK13 tolerante a sequía (T) sometidas a un tratamiento de sequía durante 5 días por falta de riego (D5, paneles superiores) y uno de recuperación con riego normal durante 7 días (D12, paneles inferiores). Las imágenes mostradas son representativas de dos ensayos independientes.

WWt Az osa-MIR1319a-Kd

D5D1

2

T


D0 D5 D12

B

Resultados

- 188 -

de H2O2 aumenta tanto en la parte aérea como en raíces cuando la planta se somete a

desecación. No se observan diferencias notorias en la producción de esta molécula ROS

en la línea osa-MIR1319a-Kd en condiciones control ni en estrés hídrico en la parte aérea,

en comparación con las líneas controles azigotas y variedad silvestre. Sin embargo, las

raíces de la línea osa-MIR1319a-Kd producen sólo la mitad de contenido de H2O2 en

condiciones de sequía con respecto a las líneas controles, no observándose diferencias

en condiciones sin desecar. Estudios adicionales son necesarios para entender los

mecanismos moleculares específicos que podrían estar implicados en otorgar el

fenotipo de tolerancia a sequía a la línea osa-MIR1319a-Kd.

Figura 71. Tolerancia a sequía de las líneas osa-MIR1319a-Kd. A. Gráfica del porcentaje de supervivencia al tratamiento de sequía indicado en la Figura 70, de plantas de las líneas osa-MIR1319a-Kd, azigotas (Az) y de la variedad silvestre Tainung67 (Wt). El asterisco corresponde a diferencias significativas según análisis de ANOVA (*=p<0,05). B. Porcentaje de plantas mostrando los síntomas de estrés por sequía en la escala de 0 a 5; donde 0=sin síntomas, y 5= planta muerta. C. Cuantificación del porcentaje de la pérdida de peso en el tiempo con respecto al peso inicial en plantas de 7 días crecidas in vitro y secadas al aire. Las barras corresponden al SEM. En todos los casos se analizaron al menos 10 muestras biológicas por cada línea. Los datos mostrados corresponden a un experimento representativo de dos réplicas experimentales.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 1 2 3 4 5

Peso

per

dido

(%)

Horas de secado

Curva de retención de agua

WtAzosa-MIR1319a-Kd

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Tolerancia al estrés hídrico

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%Supervivencia

C

A

*

B

0-Planta sin quemaduras1-Planta con pocas quemaduras foliares2-Planta con quemaduras foliares severas3-Planta seca con nuevos tejidos emergiendo4-Planta seca con pocos tejidos verdes5-Planta muerta


- 189 -

Figura 72. Producción de peróxido de hidrógeno en la línea osa-MIR1319a-Kd en condiciones de estrés hídrico. Cuantificación del contenido de H2O2 en raíces y hojas de plantas osa-MIR1319a-Kd, azigotas (Az) y silvestres (Wt) crecidas in vitro durante 7 días y sometidas a un tratamiento de desecación al aire por 3 horas o mantenidas en condiciones control. Los datos corresponden a un único experimento y a grupos de al menos 10 plantas por cada línea.

0

2

4

6

8

10

12

Control Desecación Control Desecación


μMH 2

O2/

g

Producción de H2O2

WtAzosa-MIR1319a-Kd

Resultados

- 190 -


- 193 -

DDiscusión

Los miRNAs cumplen funciones muy importantes en las interacciones planta-

patógeno y la identificación de aquellos diferencialmente expresados tras el

reconocimiento del patógeno es el primer paso para caracterizarlos en sus funciones. En

el segundo capítulo de este trabajo se han seleccionado 10 miRNAs de arroz

potencialmente implicados en la regulación negativa de la respuesta basal (PTI) y se han

caracterizado funcionalmente algunos de esos miRNAs en las respuestas de defensa

frente a M. oryzae y frente a sequía. En la búsqueda de proteínas que puedan ser

reguladoras positivas de las respuestas de defensa, se ha establecido una vía de detección

inversa, mediante la caracterización de miRNAs regulados negativamente frente a

elicitores fúngicos y la identificación de sus dianas. Se ha descrito previamente que existe

una mayor cantidad de miRNAs reguladores negativos de la respuesta de defensa en

arroz que aquellos que la regulan positivamente (Li et al., 2013a), por lo que se podría

suponer que los miRNAs reguladores negativos tienen un papel relevante en el proceso

defensivo. Entre estos miRNAs también se han buscado dianas que pudieran estar

implicados en las respuestas a estrés abiótico, principalmente hídrico, para intentar

establecer relaciones entre las vías de respuestas a los estreses bióticos y abióticos. Los

miRNAs fueron seleccionados por su represión temprana frente a elicitores de M. oryzae,

ya que una respuesta rápida indicaría una regulación directa en respuesta al

reconocimiento de los PAMPs. En todos los miRNAs se ha observado una respuesta

dinámica de la expresión en la respuesta, varios de ellos mostrando inducción en tiempos

tardíos, que podría ser una consecuencia, además del reconocimiento de los PAMPs, de

la interacción con otros factores como: autorregulación de la vía de señalización,

condiciones de luz, temperatura o humedad.

Se ha visto en este trabajo que los miRNAs que forman parte de un mismo

precursor siguen un mismo patrón de expresión en el tiempo, excepto los osa-miR1847,

que después de 2 horas del tratamiento se observa inducción de osa-miR1847.1 y

Discusión

- 194 -

represión de osa-miR1847.2. Esta diferencia podría deberse al mecanismo llamado “arm

switching” o “cambio de brazo” que se refiere a la selección específica de uno de los

miRNA maduros que forman el dúplex, para ser cargado en el complejo RISC (Griffiths-

Jones et al., 2011). La expresión de uno u otro miRNA maduro del mismo precursor puede

ser específico de cada tejido, estado de desarrollo o diferentes respuestas frente a

condiciones del ambiente, teniendo un impacto en la regulación diferencial de las dianas

(Griffiths-Jones et al., 2011; Guo et al., 2014). El fenómeno de “arm switching”, descubierto

recientemente, se ha descrito en miRNAs de algunas especies vegetales, incluida el arroz

(Hu et al., 2014). Así también puede darse la expresión de los denominados “isomiRs” o

variantes de los miRNAs (Guo et al., 2014), que en el caso específico de osa-MIR1847 y

según la base de datos del miRBase, estos isomiRs fueron detectados a lo largo de todo

el precursor en varios análisis de secuenciación masiva. Esta situación también podría ser

la explicación de haberse visto bandas de varios tamaños en los análisis por Northern blot

para osa-MIR1847. Los eventos de transformación correspondientes a la sobreexpresión

de los precursores osa-MIR1847 y osa-MIR5808 no resultaron eficientes en la acumulación

del miRNA maduro en arroz, aunque se ha visto la acumulación in vivo en N. benthamiana.

Según los resultados de sRNA-seq de este trabajo, la expresión de ambos en condiciones

normales en la planta de arroz es muy baja (<100 lecturas), por lo que podría ser que la

maquinaria enzimática de biogénesis no sea suficiente para lograr una acumulación

diferencial en las plantas transgénicas. Sin embargo, el caso de osa-MIR1319a es similar y

aun así se ha visto una acumulación incrementada en plantas de arroz transgénicas.

Es interesante el hecho de que el precursor osa-MIR1847 sea producto de un

intrón del gen de resistencia a patógenos OsRPM1, por lo que cabría esperar que la

expresión de este precursor esté mediada por la expresión del gen de resistencia durante

la respuesta de defensa. Este miRNA está reprimido en la respuesta PTI, mientras que

OsRPM1 se induce en la respuesta ETI por ser una proteína de interacción con efectores

(Tornero et al., 2002). Cabría entonces la posibilidad de que osa-MIR1847 pueda también


- 195 -

ser inducido en la respuesta ETI. Lo que sugiere que tendría un papel diferencial en la

respuesta PTI y en la respuesta ETI.

El pre-miRNA osa-MIR5808 es producto de una zona no traducida de OsZOS9-16,

un FT del tipo dedo de Zn de la subfamilia C2H2, los cuales han sido relacionados con

respuestas frente a estrés (Kam et al., 2008; Kottapalli et al., 2007), aunque la función

específica de este gen en concreto es desconocida. En la literatura se ha visto que osa-

miR1847.1 tiene como diana al tránscrito codificante para una proteína que contiene un

dominio ACT (Li et al., 2010), de las que se sabe que son elementos reguladores

funcionales en el metabolismo, transporte de solutos y transducción de señales mediante

la interacción con factores de transcripción del tipo bHLH, principalmente (Chipman &

Shaanan, 2001; Feller et al., 2006; Grant, 2006; Kong et al., 2012), existiendo la posibilidad

de que cumpla funciones en la defensa de la planta.

Identificación y validación de dianas de los miRNAs seleccionados

Desde el desarrollo por German et al. (2009) del método PARE (Parallel analysis

of RNA ends) para la detección de tránscritos degradados por miRNAs (degradoma), esta

estrategia ha sido ampliamente utilizada y aceptada en las publicaciones para la validación

de dianas de miRNAs de plantas (Hackenberg et al., 2012; Li et al., 2010a; Meng et al., 2012;

Peng et al., 2013; Qiao-Ying et al., 2012; Tang et al., 2012b). Así también, la sobreexpresión

de miRNAs en arroz y otras plantas se ha utilizado como herramienta para la detección

de dianas y su estudio funcional (Campo et al., 2013; Gao et al., 2010, 2011; Hu et al., 2011;

Li et al., 2013a; Lu et al., 2013; Wang et al., 2014; Wu et al., 2014; Xie et al., 2006; Zhang et

al., 2011; Zhang et al., 2013; Zhu et al., 2009). En este trabajo se validó, por análisis de

degradoma, la interacción entre algunos de los miRNAs seleccionados y sus dianas en la

respuesta inmune PTI de las plantas de arroz. Algunas dianas también se han validado

funcionalmente mediante sobreexpresión de los miRNAs en plantas de arroz y el análisis

de la acumulación de sus tránscritos. El análisis de secuenciación de degradoma confirmó

que, en la respuesta inmune de las plantas de arroz el miRNA osa-miR390-3p corta el

Discusión

- 196 -

mRNA de un gen relacionado con el transporte de iones (LOC_Os06g42850); osa-miR390-

5p degrada tránscritos de la quinasa OsCK1.3; osa-miR397b tiene como dianas los mRNAs

del gen OsCAMK13 y del gen codificante para un FT del tipo dedo de zinc; osa-miR1319a

tiene como diana al tránscrito del gen OsLTPL6; y osa-miR1847.2 degrada el mRNA de un

gen AGO. Los genes detectados como dianas para estos miRNAs podrían estar implicados

en mecanismos moleculares de la respuesta PTI como la señalización mediada por

fosforilación reversible de proteínas (quinasas), flujo de iones en la célula, regulación

transcripcional (FT) y post-transcripcional (AGO). Si bien estos miRNAs fueron

seleccionados por su represión en las respuestas PTI de la planta de arroz, los niveles de

regulación post-transcripcional de sus dianas en esas condiciones podrían ser suficientes

como para detectar esa interacción en el análisis de secuenciación masiva del degradoma.

El análisis de acumulación de tránscritos para la validación de dianas utilizando las líneas

sobreexpresoras de miRNAs mostró que los niveles de acumulación de los tránscritos

OsSIK1, OsLAC26, OsSPL12 y OsLTPL6 disminuyen en las líneas sobreexpresoras de osa-

MIR390, osa-MIR397a/b, osa-MIR535 y osa-MIR1319a, respectivamente. Estos resultados

confirman que dichos tránscritos son dianas para los miRNAs osa-miR390-5p (OsSIK1),

osa-miR397a/b (OsLAC26), osa-miR535-5p (OsSPL12) y osa-miR1319a (OsLTPL6).

Los resultados obtenidos dan cuenta de que osa-miR390-5p tiene como dianas a

los tránscritos codificantes para quinasas OsCK1.3 y OsSIK1, coincidiendo con lo descrito

previamente por Sunkar et al. (2005) quienes habían encontrado que este miRNA tiene

como dianas los tránscritos de tres genes quinasas, además de los TAS que han sido

descritos tanto en Arabidopsis como en arroz (Cho et al., 2012; Krasnikova et al., 2013;

Marin et al., 2010). Entre las posibles dianas analizadas se ha encontrado que la

acumulación de los tránscritos OsRLK5 y OsBAK está claramente inducida en las líneas

osa-MIR390-Ox. Una posible explicación, como mencionan Li et al. (2013a), es que podrían

o bien ser dianas de osa-miR390-5p por inhibición traduccional o estar bajo el efecto de

una autorregulación de sus productos, como también se ha visto para miR172 en

Arabidopsis (Schwab et al., 2005). La regulación post-transcripcional de genes quinasas


- 197 -

pone a osa-miR390-5p en el punto crítico para el control de la señalización de las

respuestas, siendo las quinasas componentes fundamentales en las cascadas de detección

y traducción de señales por fosforilación pudiendo cumplir funciones en diferentes

procesos fisiológicos como en las respuestas frente a estrés. En efecto, la proteína OsSIK1

ha sido previamente descrita y caracterizada como reguladora positiva de las respuestas

de la planta de arroz en sequía y salinidad, siendo las plantas sobreexpresoras tolerantes

a estos estreses abióticos (Ouyang et al., 2010).

Los análisis realizados han puesto en evidencia que ambos osa-miR397 regulan la

acumulación de tránscritos del gen lacasa OsLAC26 y que osa-miR397b es responsable de

la regulación de OsCAMK13 y un factor de transcripción, siendo el primer registro de

dianas que no sean lacasas descritas para algún miembro osa-miR397. Previamente han

sido caracterizados en arroz dos genes lacasas (OsLAC12 y OsLAC13) como dianas tanto

para osa-miR397a como para osa-miR397b, y se ha validado funcionalmente esa

interacción en el desarrollo reproductivo (Zhang et al., 2013). Así también, esa interacción

entre miembros de la familia miR397 y genes lacasas se ha documentado en la biosíntesis

de lignina y el desarrollo reproductivo de Arabidopsis (Wang et al., 2014) y en el contenido

de lignina en Populus trichocarpa (Lu et al., 2013). Otro tránscrito de un gen lacasa

(OsLAC22) también ha sido encontrado como posible diana para los osa-miR397 por

análisis de degradoma (Li et al., 2010a). Las lacasas son glicoproteínas oxidasas que

contienen varios átomos de cobre capaces de catalizar la oxidación de compuestos

fenólicos y aminos mediante la reducción de oxígeno, por lo que pueden estar

relacionadas con la regulación de la formación de ROS, y son funcionales principalmente

en la formación de lignina (Cai et al., 2006; Gavnholt & Larsen, 2002; Mayer & Staples,

2002; Turlapati et al., 2011). En plántulas de arroz tratadas con H2O2 se ha visto una

inducción de osa-miR397 (Li et al., 2011b) y en estudios aún no publicados del grupo de

investigación de la Dra. Y-I Hsing de la Academia Sinica en Taiwán, con quienes se ha

colaborado, se vio que la lacasa OsLAC26 es regulada específicamente por osa-miR397

en respuesta a H2O2 en raíces. Estos datos establecen la relación entre el ROS y las

Discusión

- 198 -

interacciones entre las lacasas y los miembros osa-miR397, indicando que podrían cumplir

funciones en las respuestas a estrés a través de la regulación de la formación de ROS.

La interacción entre osa-miR1319a y su diana OsLTPL6 es coincidente tanto en la

respuesta PTI como en las líneas de expresión diferencial de osa-MIR1319a. Se ha visto

además que estos dos componentes reguladores de la respuesta de defensa están muy

cercanos en el genoma, aunque la regulación de su expresión es independiente. Esta

situación tan particular podría ser producto de la evolución conjunta de osa-MIR1319a y

su diana, estableciendo y asegurando un mecanismo de autorregulación de los procesos

fisiológicos en las que están implicados. Existen evidencias en la literatura de una co-

evolución entre los miRNAs de plantas y sus dianas, como se ha descrito en Arabidopsis,

sugiriendo que en arroz podría ocurrir lo mismo (Ehrenreich & Purugganan, 2008; Zhang

& Wing, 2013), sin embargo, la evolución conjunta en tándem no fue aún caracterizada.

Las LTPs (Lipid-transfer proteins) de plantas son pequeñas proteínas muy abundantes,

capaces de unirse a lípidos in vitro, aunque esta función no se da in vivo, por su

localización extracelular. Las LTPs fueron descritas funcionalmente en muchos procesos

fisiológicos, especialmente en la respuesta de defensa, pero también en el desarrollo,

señalización y estrés abiótico (Kader, 1996; Ng et al., 2012). Sin embargo, su función

biológica específica no está del todo clara aún (Yeats & Rose, 2008). El hecho de que las

LTPs participen en tan amplio rango de procesos hace suponer que la interacción entre

osa-miR1319a y su diana OsLTPL6 podría ser funcional en las respuestas de defensa de la

planta de arroz.

Se ha validado que el tránscrito del gen OsSPL12 es diana regulada post-

transcripcionalmente de osa-miR535-5p. Las proteínas SPLs (Squamosa promoter binding-

like) son factores de transcripción específicos de plantas, que regulan procesos del

crecimiento y desarrollo de la planta, principalmente la transición entre los estadíos,

desarrollo de flores y frutos, arquitectura de la planta, señalización por GA, entre otros.

Estos FT han sido descritos como dianas de la familia miR156, controlando principalmente


- 199 -

la acumulación de las SPLs en la transición de la floración (Chen et al., 2010; Galvao et al.,

2012; Jorgensen & Preston, 2014; Salinas et al., 2012; Shalom et al., 2015; Wang et al.,

2009b; Yu et al., 2012). Varias SPLs y su interacción con sus miRNAs reguladores fueron

también relacionadas con estrés, principalmente frente a temperaturas extremas en

Arabidopsis y arroz (Kim et al., 2012; Sailaja et al., 2014; Stief et al., 2014). En arroz se ha

descrito además una vía de señalización de respuesta a estrés hídrico mediada por

OsSPL9, la cual controla la expresión de osa-MIR408, responsable de la tolerancia a sequía

en la variedad N22 de arroz indica (Mutum et al., 2013). Los genes OsSPL10/11/12 se

encuentran muy cercanos en el genoma y están descritos como dianas para los miembros

osa-mir156. Se ha visto además que los genes OsSPL10 y OsSPL11 se encuentran cercanos

a osa-miR156j y osa-miR156h, estableciéndose así un “cluster” o grupo entre estos genes

SPL y sus reguladores (Xie et al., 2006). La separación de OsSPL12 podría indicar que este

gen posee una regulación mediada por osa-miR535-5p, alternativa a la vía de osa-miR156,

que no poseen los demás SPL. En arroz se ha visto que OsSPL12 se expresa principalmente

en la fase reproductiva en las panículas, localización que se corresponde con la

acumulación durante el llenado de granos de su regulador osa-miR535 (Peng et al., 2013;

Xie et al., 2006), por lo que es posible que esta interacción esté regulando procesos

fisiológicos en el desarrollo de semillas. Peng et al. (2013) también han encontrado que

OsSPL12 se expresa en la fase vegetativa en tallos, vainas y en menor medida en hojas, al

igual que se han visto en los resultados de esta tesis para la acumulación de osa-miR535-

5p en la parte aérea de la planta joven, por lo que su interacción también podría regular

procesos fisiológicos en estos tejidos.

Caracterización de los miRNAs seleccionados en la respuesta de defensa

En este capítulo de la tesis se ha mostrado principalmente que existe una

correlación entre la represión de los miRNAs seleccionados en respuesta a elicitores

fúngicos y en respuesta a infección por M. oryzae. En todos los casos se han visto

respuestas dinámicas de los miRNAs y sus dianas, lo que podría ser debido a que los

Discusión

- 200 -

miRNAs proveen una regulación fina y cuantitativa de la expresión de sus dianas en

distintos procesos fisiológicos, otorgando a la planta la capacidad de resistir al estrés al

cual se ve sometida en un momento preciso. La represión de estos miRNAs en respuesta

a elicitores establece su implicancia en la regulación en las respuestas PTI, como se ha

descrito previamente para otros miRNAs. En Arabidopsis específicamente, uno de los más

estudiados y caracterizados es el miR393, que tiene como dianas a proteínas AFB de

dominio F-Box en las respuestas de defensa PTI y es un regulador de la vía de señalización

mediada por auxinas (Navarro et al., 2006; Staiger et al., 2013). Así también se ha visto que

la sobreexpresión de miR160a resulta en una alta deposición de calosa en tratamientos

con elicitores bacterianos, promoviendo la respuesta PTI (Li et al., 2010b). Al contrario de

los miRNAs estudiados en esta tesis, miR393 y miR160 son reguladores positivos de la

respuesta de defensa, aunque también se han descrito los reguladores negativos miR398

y miR773, que inhiben la deposición de calosa y su sobreexpresión promueve el

crecimiento bacteriano (Li et al., 2010b; Yang & Huang, 2014). En arroz se ha identificado

a osa-miR7695 por su inducción en la respuesta PTI y se lo ha caracterizado como un

regulador positivo de la respuesta de defensa frente a M. oryzae, mediante la regulación

de un tránscrito alternativo del gen relacionado con transporte de metales OsNRAMP6

(Campo et al., 2013). Recientemente se ha descrito que los miRNAs osa-miR160 y osa-

miR398b son reguladores positivos de la respuesta de defensa de las plantas de arroz y

su sobreexpresión otorga resistencia a la infección por M. oryzae mediante la inhibición

del crecimiento del hongo debido a la acumulación de H2O2 (Li et al., 2013a). Así también,

Li et al. (2013a) han descrito que osa-miR535-3p es un regulador negativo de la respuesta

de defensa frente a M. oryzae, coincidentemente con los resultados presentados en esta

tesis. En la literatura se han identificado otros tantos miRNAs regulados en la respuesta

de defensa de arroz y otras especies (Campo et al., 2013; Li et al., 2013a; Tang et al., 2012a;

Zhu et al., 2013).

Este trabajo ha demostrado que la sobreexpresión de osa-MIR390 y osa-MIR397b

en plantas de arroz, resulta en un incremento de la susceptibilidad frente a la infección


- 201 -

por M. oryzae, así como que la pérdida de función de osa-MIR1319a otorga un fenotipo

de resistencia frente a este patógeno truncando el proceso de colonización de los tejidos

foliares. Estas observaciones confirman que osa-miR390-5p, osa-miR397b y osa-

miR1319a, son reguladores negativos de la respuesta de defensa de las plantas de arroz

mediante la regulación post-transcripcional de alguna o varias de sus dianas reguladoras

positivas de la respuesta de defensa. A pesar de ser sistemas diferentes, en este trabajo

se intentó probar que los miRNAs identificados en arroz podrían también ser funcionales

en la respuesta de defensa de Arabidopsis, sin embargo, la pérdida de función de los ath-

miR390 y ath-miR397 no otorga un fenotipo visible en la respuesta de defensa frente al

hongo P. cucumerina, que a diferencia del hemibiótrofo M. oryzae, presenta crecimiento

exclusivamente necrótrofo. Estas evidencias podrían indicar que estos miRNAs tienen

funciones distintas en las diferentes especies vegetales o que pueden cumplir funciones

en la respuesta de defensa frente a patógenos biotróficos. Deberían realizarse más

estudios para contrastar estas hipótesis. Los trabajos publicados por Wang et al. (2014) y

por Zhang et al. (2013) sobre los miembros miR397 de Arabidopsis y arroz, son

coincidentes en las funciones de estos miRNAs en el desarrollo reproductivo mediante la

regulación post-transcripcional de sus dianas las lacasas AtLAC4 y OsLAC12/13,

respectivamente. Esto pone en manifiesto que estos miRNAs cumplen funciones similares

en ambas especies, aunque la coincidencia en sus funciones en cuanto a las respuestas

de defensa queda aún por determinar. Estos resultados podrían ser el inicio para intentar

diferenciar la funcionalidad de estos miRNAs en las vías de señalización de la respuesta

en diferentes especies y frente a diferentes tipos de patógenos.

Las líneas osa-MIR390-Ox presentan un fenotipo de hipersusceptibilidad frente a

M. oryzae, pudiendo deberse a la regulación post-transcripcional de su diana OsSIK1, la

que ya ha sido descrita como un regulador positivo en las respuestas a estrés abiótico

(Ouyang et al., 2010). Estas evidencias ponen en consideración que la quinasa OsSIK1

podría mediar positivamente la señalización de las respuestas de las plantas de arroz a

diferentes tipos de estreses tanto abióticos como bióticos. Esta situación de regulación

Discusión

- 202 -

positiva en varias respuestas no es muy común, ya que generalmente la planta se

encuentra en un equilibrio fisiológico cuando es sometida a diferentes tipos de estrés,

teniendo a menudo consecuencias negativas en otros procesos, como el desarrollo,

metabolismo y en otras respuestas a estrés. En ese contexto, en arroz se ha reportado la

interacción negativa entre las respuestas a estrés biótico y abiótico, como lo observado

en el primer capítulo de este trabajo con OsCPK13 que es un regulador negativo de la

respuesta de defensa y regulador positivo de la respuesta a sequía, ocurriendo una

situación similar con OsCPK12 con respecto a la defensa y la salinidad (Asano et al., 2012).

Sin embargo, se ha visto que algunas proteínas quinasas tienen la particularidad de

cumplir funciones en la regulación positiva en varias respuestas, como OsCPK4, la cual es

responsable de otorgar tolerancia a estrés abiótico (sequía y salinidad) y resistencia a M.

oryzae (Campo et al., 2014; Bundó & Coca, 2015). Estos resultados sugieren que OsSIK1

podría ser un buen candidato para su estudio en las respuestas de defensa frente a M.

oryzae.

La sobreacumulación de osa-miR397b otorga un ligero aumento de la

susceptibilidad frente a M. oryzae, sin embargo, no se encontró un fenotipo en la

respuesta de defensa asociado a la acumulación de osa-miR397a ni a la pérdida de

función de OsLAC13. Una posible explicación podría ser que ambos miembros osa-miR397

regulen diferentes dianas en una relación espacio-temporal distinto, condiciones

fisiológicas, respuestas a estrés, o bien podrían ser más afines a unos u otros tránscritos

dianas. Estas diferencias fenotípicas entre la sobreexpresión de uno u otro miembro

miR397 no se han visto en los resultados en Arabidopsis presentados por Wang et al.

(2014) ni en los trabajos en arroz realizados por Zang et al. (2013). No obstante, en este

último trabajo demuestran que existen diferencias en la eficiencia de degradación por

osa-miR397a y osa-miR397b de sus dianas comunes. Se ha visto en la predicción de

dianas que osa-miR397b tiene, además de las lacasas y otras en común con osa-miR397a,

posibles dianas como el tránscrito avr9 de respuesta a elicitores y un tránscrito codificante

para una proteína de choque térmico, las que podrían hacer la diferencia en su


- 203 -

funcionalidad en respuestas a estrés biótico. No se han descrito aún proteínas lacasas que

estén implicadas en las respuestas de defensa de las plantas, aunque su rol en el estrés

oxidativo podría ser un punto de enfoque para su estudio frente a estrés. No obstante, se

ha especulado que: por los patrones de expresión en tejidos no lignificados, por los

cambios en la composición de los monómeros de lignina en respuesta a estrés, y por la

presencia de cajas del tipo W (WRKY) en la región promotora de varios genes lacasas,

estas proteínas podrían tener un papel en la respuesta de defensa (Cho et al., 2014;

Turlapati et al., 2011). En el caso de los resultados observados en esta tesis, se ha

confirmado que osa-miR397b es un regulador negativo funcional en la respuesta de

defensa de la planta de arroz, aunque queda aún por determinar cuál es la vía reguladora

en la que cumple sus funciones y si esta vía está dada por la regulación de alguna de sus

dianas lacasas.

En este trabajo se ha demostrado que la resistencia a M. oryzae observada en las

líneas osa-MIR1319a-Kd podría ser debida a la inhibición del proceso de colonización del

hongo mediante la inducción basal de genes relacionados con la patogénesis como

OsPBZ1, OsPR10, OsPAL1 y OsPOX22.3, cuya inducción se incrementa aún más en

condiciones de infección. La acumulación de OsPOX22.3 además podría ser un indicativo

de que en estas líneas existe una desregulación en la producción de ROS en respuesta a

estrés. En este contexto se ha establecido además una relación directa entre la

acumulación de tránscritos de OsLTPL6 y la disminución de su regulador osa-miR1319a en

condiciones de infección, interacción que se ha visto directamente relacionada con la

resistencia de las plantas de arroz frente a M. oryzae. Las LTPs de plantas fueron

ampliamente estudiadas por su implicancia en la respuesta de defensa de las plantas

frente a patógenos, pudiendo actuar directamente como antimicrobianos inhibiendo el

crecimiento o siendo funcionales en la señalización de la respuesta, incluso a través de la

señalización sistémica o SAR (García-Olmedo et al., 1995; Li et al., 2006; Li et al., 2008;

Sarowar et al., 2009; Segura et al., 1993; Vignols et al., 1997; Zottich et al., 2014). En arroz

específicamente se ha visto una inducción de genes LTP en respuesta a la interacción con

Discusión

- 204 -

micorrizas en raíces (Campos-Soriano et al., 2012) y se ha demostrado que LTP110 actúa

como antimicrobiano inhibiendo la germinación de esporas de M. oryzae y ralentizando

el crecimiento de X. oryzae (Ge et al., 2003; Ng et al., 2012). Cabe mencionar que los genes

analizados corresponden principalmente a la ruta de señalización por SA y que no se

descarta que pudieran existir alteraciones también en otras vías de respuesta como la del

ET o la del JA, de respuesta a patógenos necrótrofos. En trabajos previos se ha establecido

una relación entre las distintas vías de señalización por hormonas y varios miRNAs (Curaba

et al., 2014), pudiendo también osa-miR1319a formar parte de esta red. Estas evidencias

sugieren que la acumulación de OsLTPL6 podría ser funcional en la inhibición de la

colonización de los tejidos por M. oryzae o bien formar parte de la señalización que guía

la expresión de los genes de defensa.

Caracterización de los miRNAs seleccionados frente a estrés hídrico

Los miRNAs estudiados en esta tesis fueron seleccionados por su posible

implicancia en la respuesta de defensa, aunque también se buscaba establecer una

conexión entre esas respuestas frente a estrés biótico y posibles respuestas a estrés

abiótico, especialmente hídrico. Los promotores de varios de los miRNAs seleccionados

poseen elementos reguladores de respuesta a sequía, lo que se corresponde con la

expresión diferencial de algunos de esos miRNAs en respuesta a desecación,

confirmándose la represión de osa-miR390-5p y la inducción de osa-miR397a/b y osa-

miR1319a. Estas evidencias indicarían a priori, que estos dos últimos podrían ser

reguladores positivos de la respuesta frente a estrés hídrico y osa-miR390-5p actuar como

regulador negativo. Los resultados obtenidos confirman que osa-miR397a es un

regulador positivo de la tolerancia a sequía probablemente mediante la regulación de

OsLAC13, ya que una acumulación de este miRNA otorga un ligero incremento de la

resistencia, y que la pérdida de función de su diana OsLAC13 aumenta esa tolerancia

significativamente. Se ha visto, sin embargo, que la sobreexpresión de osa-MIR390 no

confiere a las plantas de arroz un fenotipo visible frente a condiciones de sequía y que la


- 205 -

pérdida de función de osa-MIR1319a, al contrario de lo que cabría esperar, otorga

resistencia a esas condiciones. En trabajos previos se ha visto que la sobreexpresión de

osa-MIR393 en plantas de arroz otorga menos tolerancia a sequía, siendo un regulador

negativo de las respuestas (Xia et al., 2012). Por otra parte se ha demostrado que miR169

es un regulador positivo, ya que se ha visto que la sobreexpresión de este miRNA de

tomate confiere resistencia a sequía (Zhang et al., 2011). Los resultados obtenidos en esta

tesis coinciden con los encontrados en la literatura sobre el papel de varios miRNAs en la

respuesta frente a sequía, probablemente mediante la regulación de sus dianas.

En los trabajos realizados no se ha logrado observar correspondencia entre la

sobreexpresión de osa-MIR390 y un fenotipo claro en respuesta a sequía. Las líneas osa-

MIR390-Ox, como se ha visto, tienen una pérdida de función de la quinasa que otorga

tolerancia a estrés hídrico OsSIK1 (Ouyang et al., 2010), por lo que un fenotipo esperable

sería que estas plantas sean más susceptibles a condiciones de sequía, lo que en este

trabajo no se pudo observar. En los trabajos publicados por Saijo et al. (2000) no se han

utilizado las líneas de pérdida de función de la quinasa de tolerancia a

sequía/salinidad/frío OsCPK13 en los análisis fenotípicos frente a falta de agua pero sí

frente a frío, observándose el fenotipo contrario a la sobreexpresión. Esta situación hace

suponer que probablemente no han logrado poner a punto las condiciones para observar

el fenotipo de susceptibilidad en sequía. Sin embargo, podrían realizarse más esfuerzos

en la búsqueda de las condiciones experimentales óptimas para analizar fenotipos

susceptibles a sequía y analizar las líneas osa-MIR390 para establecer la relación entre osa-

miR390-5p y su diana OsSIK1 en respuesta a sequía.

La acumulación de osa-miR397a y principalmente la pérdida de función de

OsLAC13 otorga a la planta de arroz un fenotipo de resistencia a condiciones de sequía,

probablemente debido a una mayor acumulación de H2O2 en las raíces en respuesta a la

desecación. Previamente se han identificado motivos de unión a factores de transcripción

relacionados con estrés abiótico en los promotores de miRNAs de arroz, principalmente

Discusión

- 206 -

de unión a FTs del tipo MYB de respuesta a deshidratación en los miembros osa-miR397

(Rama Devi et al., 2013), datos coincidentes con los encontrados en los análisis de

promotores de esta tesis. En cebada se ha descrito que la expresión heteróloga del factor

de transcripción del tipo AP2/EREBP de trigo TaDREB3, que confiere tolerancia a sequía,

afecta la expresión de varios miRNAs entre los que se encuentra miR397 (Hackenberg et

al., 2012). Así también, en varias especies vegetales, incluido el arroz, se han estudiado

miRNAs por su respuesta a diferentes condiciones hídricas, encontrándose a menudo la

acumulación diferencial de miR397 (Ferreira et al., 2012; Gupta et al., 2014; Li et al., 2011;

Liu et al., 2008; Liu et al., 2012b; Zhou et al., 2010). Se ha visto que este miRNA tiene una

respuesta a varios factores abióticos además de la desecación, como el frío, salinidad y

tratamientos con H2O2 y ABA, la hormona reguladora de las respuestas a estrés hídrico (Li

et al., 2011b; Rama Devi et al., 2013; Sunkar & Zhu, 2004; Zhou et al., 2010). Las plantas

producen ROS en condiciones de estrés hídrico y existen enzimas detoxificadoras y

antioxidantes que regulan el contenido de estas moléculas y mantienen el estado redox

de la célula (Cruz de Carvalho, 2008). Entre estas enzimas se podrían encontrar las lacasas

por su papel antioxidante en la reducción de oxígeno. En plantas de arroz sobreexpresoras

del gen OsCPK4, tolerantes a sequía y salinidad, se ha visto inducida una lacasa y se la

relaciona con la capacidad de reducir la peroxidación de lípidos de membrana,

protegiendo a los tejidos del daño causado por la acumulación de ROS en respuesta al

estrés (Campo et al., 2014). Esta situación es la contraria a la encontrada en este trabajo

en las líneas osa-MIR397a-Ac y OsLAC13-Kd, sin embargo, la tolerancia a sequía también

podría deberse a la autorregulación, posiblemente acumulando otras lacasas o moléculas

detoxificadoras de ROS en respuesta al bajo contenido de OsLAC13. La acumulación de

H2O2 en las raíces en condiciones de desecación en las líneas osa-MIR397a-Ac y OsLAC13-

Kd, podría estar relacionada con la incapacidad que tienen esas plantas de detoxificar las

grandes cantidades de ROS, producidas a falta de OsLAC13, enzima que podría ser

funcional en ese proceso de detoxificación. Por esto, se sugiere que OsLAC13 podría

cumplir funciones en la detoxificación de ROS en las raíces en respuesta a estrés. Un


- 207 -

incremento de H2O2 podría también actuar como molécula señalizadora,

desencadenando las respuestas de aclimatación frente al estrés, o mediando la respuesta

de la vía del ABA, induciendo el cierre de estomas a través de la activación de canales de

Ca+2 (Cruz de Carvalho, 2008; Mittler & Blumwald, 2015). Estas hipótesis son sólo

especulativas, y deberían realizarse más estudios para entender precisamente el

mecanismo de la resistencia a sequía en estas líneas.

En este trabajo se ha demostrado que tanto osa-MIR1319a como su diana OsLTPL6

se inducen en respuesta a desecación. Las líneas de pérdida de función de osa-MIR1319a

tienen un fenotipo de tolerancia a sequía, probablemente mediante la baja acumulación

de la proteína OsLTPL6 y una reducción en la formación de H2O2 en raíces bajo

condiciones de estrés. Estos resultados indican que osa-miR1319a es un regulador

negativo de las respuestas frente a estrés hídrico, mientras que OsLTPL6 funciona como

un regulador positivo. Las LTPs han sido descritas en una gran variedad de estreses, como

ya se ha mencionado previamente, y se ha demostrado que se inducen en tratamientos

por ABA y desecación. La inducción de genes LTP en respuesta a estrés hídrico podría

justificarse por su implicancia en la deposición de cutina que protege a la planta evitando

su desecación (Kader, 1996). Por ejemplo, en trigo se ha visto que las TaLTP1 y TaLTP2 se

inducen en respuesta a estrés hídrico y salinidad (Li et al., 2006) y en Lotus japonicus que

LjLTP10 está regulada en respuesta a sequía (Tapia et al., 2013). En arroz específicamente

se ha visto que la sobreexpresión de genes LTP como OsChI1 y OsDIL1 otorga a las plantas

un fenotipo de tolerancia a sequía (Cho et al., 2014; Guo et al., 2013) y este trabajo sugiere

que la desregulación post-transcripcional de OsLTPL6 puede mediar la tolerancia a

desecación en la planta de arroz. Esta tolerancia podría estar relacionada con la baja

producción de H2O2 en sus raíces cuando son sometidas a desecación, que podría

prevenir la peroxidación de lípidos de la membrana protegiendo a los tejidos del daño

oxidativo. La peroxidación de lípidos por exceso de ROS se ha asociado a diferentes

estreses abióticos y perturba la permeabilidad de las membranas (Perez & Brown, 2014).

El mantenimiento de la integridad de las membranas celulares es un determinante de la

Discusión

- 208 -

tolerancia a sequía en plantas (Farooq et al., 2012).Se ha descrito previamente que la línea

osa-MIR1319a-Kd tiene ligeramente inducida la expresión de la peroxidasa OsPOX22.3, y

que su expresión aumenta aún más en condiciones de estrés, por lo que la baja

producción de H2O2 en esta línea podría deberse a un aumento de la expresión de

peroxidasas en respuesta a estrés hídrico. La tolerancia mediada por una reducción en la

acumulación de osa-miR1319a y por consiguiente la acumulación de la proteína OsLTPL6,

impide que las raíces acumulen altas cantidades de ROS, posiblemente protegiéndolas

del daño oxidativo, aunque los mecanismos específicos quedan aún por establecerse.

La manipulación de la regulación post-transcripcional de genes es una

aproximación fina para modificar componentes implicados en las respuestas de las plantas

frente a distintos tipos de estrés. En este trabajo se han encontrado miRNAs que son

reguladores negativos funcionales de la respuesta de defensa de las plantas de arroz

frente a M. oryzae (osa-MIR390, osa-MIR397b y osa-MIR1319a) y cuyas dianas podrían

tener un papel en la regulación positiva en esas respuestas (OsSIK1, lacasas, OsLTPL6).

Además, se ha encontrado que OsLAC13 participa negativamente en la tolerancia a estrés

hídrico y que esa respuesta podría estar regulada por osa-MIR397a. Se ha establecido así

una posible diferenciación funcional entre los miembros osa-MIR397 de arroz.

Interesantemente se ha llegado a confirmar que osa-MIR1319a es un regulador negativo

además de la respuesta a sequía, mediante la interacción con su diana OsLTPL6. Así, la

estrategia basada en la disminución de osa-miR1319a sería una excelente diana para

mejorar la resistencia a patógenos y tolerancia a sequía.

Conclusiones

- 211 -

CConclusiones

1. El gen OsCPK13 se expresa de manera constitutiva y a niveles similares tanto en raíces

como en la parte aérea de la planta de arroz, siendo en los tejidos jóvenes y los haces

vasculares donde su promotor presenta mayor actividad. Su expresión se induce en

respuesta a elicitores fúngicos y por alta fertilización fosfatada.

2. La proteína OsCPK13 se localiza en la membrana plasmática, cuando se produce de

manera transitoria como fusión a proteínas fluorescentes en células epiteliales de

hojas de tabaco.

3. La proteína OsCPK13 se acumula tardíamente durante la respuesta de defensa frente

al hongo patógeno de arroz M. oryzae.

4. La sobreexpresión de OsCPK13 en plantas de arroz confiere una mayor

susceptibilidad a la infección por M. oryzae. Este fenotipo está asociado a la

acumulación constitutiva de altos niveles de ROS.

5. No se han detectado cambios fenotípicos asociados al silenciamiento de la expresión

del gen OsCPK13.

6. La sobreexpresión de OsCPK13 influye en la estructura radicular de las plantas de

arroz, provocando el desarrollo de un mayor número de raíces secundarias y el

acortamiento de la raíz principal.

7. La sobreexpresión de OsCPK13 causa también defectos severos en el desarrollo

vegetativo y reproductivo de las plantas y genera lesiones necróticas espontáneas en

las hojas de plantas adultas, como consecuencia de acumular cantidades tóxicas de

Conclusiones

- 212 -

fósforo en las hojas. Los defectos fenotípicos son aliviados cuando las plantas crecen

en un medio deficiente en contenido de fosfatos.

8. La sobreexpresión de OsCPK13 provoca alteraciones en la expresión de genes

relacionados con la homeostasis de fosfatos, como la inducción de OsPHO2 y el

transportador OsPT2 y la represión de la fosfatasa OsPAP10. La acumulación excesiva

de fósforo en las hojas está asociada con los altos niveles de expresión del

transportador de fosfatos OsPT2, responsable de la translocación del nutriente a la

parte aérea desde las raíces.

9. Se han seleccionado 10 miRNAs de arroz potencialmente implicados en la regulación

negativa de las respuestas de defensa, se han clonado y se han generado líneas

transgénicas de arroz sobreexpresoras de los precursores osa-MIR390, osa-MIR397a,

osaMIR397b, osaMIR535, osa-MIR1319a, osa-MIR1847 y osa-MIR5808.

10. Se ha observado una represión de osa-miR390-5p, mientras que los miRNAs osa-

miR397a/b y osa-miR1319a presentan una inducción de su expresión, en condiciones

de estrés hídrico.

11. Se ha identificado como diana de osa-miR535-5p al tránscrito del gen OsSPL12 y se

ha validado su interacción en plantas transgénicas sobreexpresoras de osa-MIR535.

12. El tránscrito del gen OsSIK1 ha sido identificado y validado como diana de osa-

miR390-5p. La sobreexpresión de su precursor osa-MIR390 en plantas de arroz

confiere una mayor susceptibilidad a la infección por M. oryzae, pero ningún fenotipo

aparente frente a sequía.

13. No se han detectado cambios fenotípicos asociados al silenciamiento de la expresión

de ath-miR390 ni en ath-miR397 en plantas de Arabidopsis.

Conclusiones

- 213 -

14. Se ha identificado y validado funcionalmente al mRNA del gen OsLAC26 como de

diana de osa-miR397a y osa-miR397b.

15. La acumulación de osa-miR397b en las plantas de arroz provoca un leve aumento en

la susceptibilidad frente a M. oryzae, mientras que la acumulación de osa-miR397a y

la pérdida de función de OsLAC13 no supone una respuesta fenotípica en condiciones

de infección pero sí presentan una mayor tolerancia y supervivencia a condiciones

de sequía, fenotipo relacionado a una acumulación de H2O2 en el tejido radicular

sometido a estrés hídrico.

16. Se ha establecido la interacción entre el tránscrito del gen OsLTPL6 y el miRNA osa-

miR1319a por degradoma y se ha validado como diana para ese miRNA mediante

análisis de líneas sobreexpresoras y mutantes de osa-MIR1319a.

17. La acumulación de OsLTPL6 como consecuencia de una baja expresión de su

regulador osa-MIR1319a en plantas de arroz provoca una inducción constitutiva de

genes de defensa y confiere mayor resistencia a infección por M. oryzae, impidiendo

el proceso de colonización de los tejidos foliares. Otorga además tolerancia a sequía,

aumentando la supervivencia de las plantas sometidas al estrés.

Conclusiones

- 214 -

Materiales y métodos


- 217 -

MMateriales

1. Bacterias

Cepas de Escherichia coli

- DH5αF’ (Hanahan, 1983): cepa no expresiva de uso general en las clonaciones y en

propagación de plásmidos.

- DB3.1: cepa para la propagación de vectores Gateway® de Invitrogen™ que poseen

el gen ccdB. Contiene la mutación gyrA462 que provee resistencia a los efectos

tóxicos de ccdB.

Cepa de Agrobacterium tumefaciens

- EHA105 (Hood et al., 1993): cepa utilizada en la transformación estable de callos de

O. sativa y para infiltración de hojas de N. benthamiana.

Cepa de Dickeya dadantii

- AC4150: utilizada para ensayos de infección en plantas de arroz.

2. Hongos

- Fusarium verticillioides (cedida por el Servei de Protecciò del Vegetals, Generalitat de

Catalunya): aislado de plantas de arroz del Delta del Ebro.

- Plectosphaerella cucumerina

- Magnaporthe oryzae aislado Guy11-GFP (cedido por la Dra. A. Sesma, CBGP, Madrid,

España): produce de forma constitutiva la proteína fluorescente GFP.

- M. oryzae aislado FR13 (cedido por Dr. D. Tharreau, CIRAD, Montpellier, Francia).

3. Material vegetal

Variedades y líneas de arroz que fueron utilizadas:

- Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare

- Oryza sativa ssp. japonica cv. Tainung67

- Oryza sativa ssp. japonica cv. Maratelli

- Oryza sativa ssp. japonica cv. Saber

- Oryza sativa ssp. japonica cv. Ariete


- 218 -

- Líneas transgénicas OsCPK13-Ox: O. sativa ssp. japonica cv. Nipponbare

sobreexpresora del gen OsCPK13 bajo el control del promotor del gen Ubiquitin de

maíz y del terminador Nos.

- Líneas transgénicas OsCPK13-Kd: O. sativa ssp. japonica cv. Nipponbare expresora

de un miRNA artificial que tiene como diana al tránscrito del gen OsCPK13 bajo el

control del promotor del gen Ubiquitin de maíz y del terminador Nos.

- Líneas transgénicas Ev: O. sativa ssp. japonica cv. Nipponbare transformada con un

vector binario de expresión con el promotor del gen Ubiquitin de maíz y el

terminador Nos o transformada con el vector de expresión en plantas que contiene

sólo el gen de selección hptII dentro del T-DNA.

- Líneas transgénicas pOsCPK13:GUS:T-Nos: O. sativa ssp. japonica cv. Ariete expresora

del gen marcador GUS bajo el control del promotor del gen OsCPK13 y del

terminador Nos.

- Líneas transgénicas TRIM (Academia Sinica, Taiwán): Mutantes de T-DNA

insercionales generadas sobre el fondo genético de O. sativa ssp. japonica cv.

Tainung67.

Líneas de Arabidopsis thaliana:

- A. thaliana ecotipo Columbia 0

- Línea transgénica Ev: A. thaliana ecotipo Columbia 0 transformada con el vector de

transformación sin inserciones dentro del T-DNA.

- Línea transgénica MIM-miR390: A. thaliana ecotipo Columbia 0 expresora de una

construcción que mimetiza una diana para miR390. Cedida por el Dr. I. Rubio-

Somoza, Max Planck Institute for Developmental Biology, Alemania.

- Línea transgénica MIM-miR397: A. thaliana ecotipo Columbia 0 expresora de una

construcción que mimetiza una diana para miR397. Cedida por el Dr. I. Rubio-

Somoza, Max Planck Institute for Developmental Biology, Alemania.

La línea de Nicotiana benthamiana fue:

- Línea RdR6: mutante en el gen RdR6, componente de la maquinaria de

silenciamiento génico de RNAs exógenos. Cedida por el Dr. D. Baulcombe, University

of Cambridge, Reino Unido.


- 219 -

4. Oligonucleótidos

Los cebadores utilizados en este trabajo fueron diseñados en el programa

bioinformático en línea Primer3 v4.0 (http://primer3.ut.ee/) y las secuencias analizadas en la

base de datos del NCBI BLAST (Basic local alignment search tool -

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Los mismos fueron sintetizados por las casas

comerciales IDT y/o Sigma y se listan en las Tablas 14, 15 y 16.

5. Plásmidos, vectores y construcciones

Los plásmidos, vectores y construcciones utilizados y/o generados en este trabajo se

muestran en la Tabla 17.

6. Anticuerpos

El anticuerpo específico utilizado en este trabajo fue el preparado contra la región

N-terminal de la proteína OsCPK13 y es proveniente de conejos. Ha sido utilizado en

experimentos de inmunotransferencia de proteínas y detección de la proteína mencionada a

una dilución de 1:1000.

Tabla 14. Cebadores relacionados con clonaciones y genotipadosNombre Ta (ººC) Secuencia (5'-3') Utilización y características relevantesDirecto 53 GTAAAACGACGGCCAGT Confirmación y secuenciación de insertos en pGEM-TReverso 47 CAGGAAACAGCTATGAChptII-fwd 57 CTATTTCTTTGCCCTCGGACGA Amplificación del gen de resistencia a higromicina hptIIhptII-rvs 57 CTTCTACACAGCCATCGGTCCattR1_fwd 51 ATCACAAGTTTGTACAAAAAAGC Confirmación y secuenciación de insertos en vectores

Gateway® con secuencias attRattR2_rvs 53 ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGOsCPK13-BamHI-fwd 62 CGGGATCCCGTTTGATGGGCAACGCATGCG Amplificación del cDNA OsCPK13 a partir del ATG y sin

codón de parada, añadiendo secuencias BamHI y XhoI a los extremos 5' y 3', respectivamenteOsCPK13NoStop-XhoI-rvs 63 TACTCGAGGCACCAGGTGCGTCCCTCAT

osa-MIR390-BamHI-fwd 54 GCGGATCCTGAAGGATCTCATGGCCTTT Amplificación del gDNA conteniendo la secuencia de osa-MIR390, añadiendo secuencias BamHI y SmaI a los extremos 5' y 3', respectivamenteosa-MIR390-SmaI-fwd 58 GCCCCGGGCAGAGGTGTGCGTGGAGAC

osa-MIR397a-BglII-fwd 56 GCAGATCTACACACGAAAGTTGCAGCAG Amplificación del gDNA conteniendo la secuencia de osa-MIR397a, añadiendo secuencias BglII y SmaI a los extremos 5' y 3', respectivamenteosa-MIR397a-SmaI-fwd 55 GCCCCGGGCCATAACTGAGTTGCTGCATTG

osa-MIR397b-BamHI-fwd 57 GCGGATCCGAAGCTGCCTAGCCAAGTGA Amplificación del gDNA conteniendo la secuencia de osa-MIR397b, añadiendo secuencias BamHI y SmaI a los extremos 5' y 3', respectivamenteosa-MIR397b-SmaI-fwd 54 GCCCCGGGTGGATTGTGTGTGCATCTGA

osa-MIR535-BamHI-fwd 56 GCGGATCCTCAGAGGGAGCTGATCTTGTC Amplificación del gDNA conteniendo la secuencia de osa-MIR535, añadiendo secuencias BamHI y SmaI a los extremos 5' y 3', respectivamenteosa-MIR535-SmaI-fwd 55 GCCCCGGGCATGCGAGCGAGAGCATA

osa-MIR1319a-BamHI-fwd 56 GCGGATCCAGGTACCGGACGTGCTAAAA Amplificación del gDNA conteniendo la secuencia de osa-MIR1319a, añadiendo secuencias BamHI y SmaI a los extremos 5' y 3', respectivamenteosa-MIR1319a-SmaI-fwd 58 GCCCCGGGGGGAGTAGATAGGGTGGCTCA

osa-MIR1847-BamHI-fwd 57 GCGGATCCTATGGGTGCTGACTGCTGAG Amplificación del gDNA conteniendo la secuencia de osa-MIR1847, añadiendo secuencias BamHI y SmaI a los extremos 5' y 3', respectivamenteosa-MIR1847-SmaI-fwd 55 GCCCCGGGGAAGTGCTTCTATGCTCCTCAAA

osa-MIR5808-BglII-fwd 59 GCAGATCTACCACGACTCCTCCTCCAC Amplificación del gDNA conteniendo la secuencia de osa-MIR5808, añadiendo secuencias BglII y SmaI a los extremos 5' y 3', respectivamenteosa-MIR5808-SmaI-fwd 54 GCCCCGGGGAAGAGATTCACTCTGGTCCAA

RB-fwd 54 ACTCATGGCGATCTCTTACC Genotipado de mutantes TRIM


- 220 -

Secuencia (5'-3')

pM0053518-fwd 54 CTGCTGCAACTTTCGTGT Genotipado del mutante TRIM M0053518M0053518-rvs 53 GGGTGAGCAGTACAAAGAAAM0109988-fwd 54 ATTTGCATCGCTTCACACAG Genotipado del mutante TRIM M0109988M0109988-rvs 54 CACGACTCCACTATCACACAM0058436/45-fwd 54 ACTCGCATTTCTCATATACCCA Genotipado de los mutantes TRIM M0058436 y M0058445M0058436/45-rvs 54 TTGGTTCGTTGCTGATGAGA

Tabla 15. Sondas y cebadores de stemloop-RTNombre Secuencia (5'-3') Utilización y características relevantesosa-miR390-5p-Sonda GGCGCTATCCCTCCTGAGCTT Detección de osa-miR390-5p por análisis Northern blotosa-miR397a-Sonda CATCAACGCTGCACTCAATGA Detección de osa-miR397a por análisis Northern blotosa-miR397b-Sonda CATCAACGCTGCACTCAATAA Detección de osa-miR397b por análisis Northern blotosa-miR535-5p-Sonda GCGTGCTCTCTCTCGTTGTCA Detección de osa-miR535-5p por análisis Northern blotosa-miR1319a-Sonda TATAATATATTACAGATGCCGGTT Detección de osa-miR1319a por análisis Northern blotosa-miR1847.1-Sonda GTGCCACAACTGCAAACTGCA Detección de osa-miR1847.1 por análisis Northern blotosa-miR5808-Sonda TCCAACGATCAGAAACGATTTAGT Detección de osa-miR5808 por análisis Northern blot

SLosa-miR390-5p GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCGCT Stemloop RT de osa-miR390-5p

SLosa-miR397a/b GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCATCAA Stemloop RT de osa-miR397a/b

SLosa-miR535-5p GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCGTGC Stemloop RT de osa-miR535-5p

SLosa-miR1319a-5p GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTATAAT Stemloop RT de osa-miR1319a

SLosa-miR5808 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCCAAC Stemloop RT de osa-miR5808

SLath-miR390a/b GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCGCT Stemloop RT de ath-miR390a/b

SLath-miR397a/b GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCATCAA Stemloop RT de ath-miR397a/b

Tabla 16. Cebadores para qRT-PCRNombre Ta (ººC) Secuencia (5'-3') Utilización y características relevantesOsUbi1-fwd 56 TTCCCCAATGGAGCTATGGTT qRT-PCR del mRNA del gen de referencia de arroz OsUbi1OsUbi1-rvs 58 AAACGGGACACGACCAAGGOsEF1α-fwd 63 GTGCTCGACAAGCTCAAGGCCG RT-PCR del mRNA del gen de referencia de arroz OsEF1α, diseñado

para distinguir la presencia de gDNA en el cDNA sintetizadoOsEF1α-rvs 62 GTCTGATGGCCTCTTGGGCTCGATTUB-fwd 57 TGTTCAGGCGAGTGAGTGAG qRT-PCR del mRNA del gen de referencia para arabidopsis ATTUBATTUB-rvs 57 ATGTTGCTCTCCGCTTCTGTOsCPK13-fwd 59 ATGCGGCGGTTCCCTTAGAT qRT-PCR del mRNA OsCPK13, diseñados en la región correspondiente

a N-terminal de la proteínaOsCPK13-rvs 56 TTGTTGTTGTCGTCGGTGTCOsPOX22.3-fwd 59 CTCTCTCAGGAGCACACACGAT qRT-PCR del mRNA OsPOX22.3OsPOX22.3-rvs 57 CCCTGAAATTCTGGCACTGCOsPR1a-fwd 56 GGAAGTACGGCGAGAACATC qRT-PCR del mRNA OsPR1aOsPR1a-rvs 56 GGCGAGTAGTTGCAGGTGOsPR5-fwd 59 GACGACCAGACGAGCACCTT qRT-PCR del mRNA OsPR5OsPR5-rvs 58 GTCCCTCATGGGCAGAAGACOsJAmyb-fwd 53 CATGTGCATGGTGATGATGA qRT-PCR del mRNA OsJAmybOsJAmyb-rvs 53 CGGACAAACCCTCAGAAAAAOsEREBP-fwd 56 AAGATCCGTGGCAAGAAAGC qRT-PCR del mRNA OsEREBPOsEREBP-rvs 58 GCTTCTGAGCAACAGCTGGTTOsAOC-fwd 56 GCAGGAGATGTTCGTGTACG qRT-PCR del mRNA OsAOCOsAOC-rvs 66 GTTGCGCTCCGGCACGTGCTOsPBZ1-fwd 59 GCGATGGCTCCTGTGTGG qRT-PCR del mRNA OsPBZ1OsPBZ1-rvs 60 CTCCGGCGACAGTGAGCTOsPR10-fwd 57 TCAGGCAGTTCAACTTCACCTC qRT-PCR del mRNA OsPR10OsPR10-rvs 57 CTTAGCCTTGGTGATCTCGTCCOsPAL1-fwd 57 ATTGAGCACGGCTTCTTCGA qRT-PCR del mRNA OsPAL1OsPAL1-rvs 58 CACCATGGCAAGACCTTCCTOsPHR1-fwd 60 AGGACAGTGAGGCTGCCTTG qRT-PCR del mRNA OsPHR1OsPHR1-rvs 58 GGACTCGGTTGCTGCAGTTTOsPHO2-fwd 55 CACAAGCCACCAAAGCATTTC qRT-PCR del mRNA OsPHO2OsPHO2-rvs 57 AGATCGCCGCCGAGATAAG


- 221 -

Secuencia (5'-3')

OsPT2-fwd 58 GACGAGACCGCCCAAGAAG qRT-PCR del mRNA OsPT2OsPT2-rvs 59 TTTTCAGTCACTCACGGTCGAGACOsPT6-fwd 58 CCGCCCCTGCAAACTGTA qRT-PCR del mRNA OsPT6OsPT6-rvs 56 CAACTGGCGGTTTCTTCGATOsPAP10-fwd 61 ATACTGGCAGCCGACGGATGA qRT-PCR del mRNA OsPAP10OsPAP10-rvs 61 GAGGGAGCTGGAGCGGAGAAOsPHR2-fwd 58 TCTCTCCAAGATGTGGACCCA qRT-PCR del mRNA OsPHR2OsPHR2-rvs 55 CCGTGAAAAGGCAAAAACGATOsSPL4-fwd 60 TTCCATTTTGCAGGTCCGGA qRT-PCR del mRNA OsSPL4, el amplicón incluye el sitio de

apareamiento con osa-miR535-5pOsSPL4-rvs 60 GCCTGTGAATTGGATGACGCOsSPL11-fwd 60 GCTCTTGCCAATAAAAGGTGCA qRT-PCR del mRNA OsSPL11, el amplicón incluye el sitio de

apareamiento con osa-miR535-5pOsSPL11-rvs 60 AAGATGTTTGGTGTCCGGGGOsSPL12-fwd 56 CTGCAACCCCAGGATTTATT qRT-PCR del mRNA OsSPL12, el amplicón incluye el sitio de

apareamiento con osa-miR535-5pOsSPL12-rvs 60 CAGCTCATTCCCAAGACGAGTOsSPL19-fwd 60 CCAACATTACCACAACCCGC qRT-PCR del mRNA OsSPL19, el amplicón incluye el sitio de

apareamiento con osa-miR535-5pOsSPL19-rvs 57 TCTGCTGAAAGAAGAGGGGOsSIK1-fwd 57 CAGAAGTTGGAGAGTCTGACT qRT-PCR del mRNA OsSIK1, el amplicón incluye el sitio de

apareamiento con osa-miR390-5pOsSIK1-rvs 59 TGTCCAAGTTGATGATGTGACCOsWAK43-fwd 57 CCAAAGGAACACCAGGGTAT qRT-PCR del mRNA OsWAK43, el amplicón incluye el sitio de

apareamiento con osa-miR390-5pOsWAK43-rvs 60 TCCTATCTTTTGACAGCGGCTOsRLK5-fwd 60 GGCCGGCTTTCACCAAATTT qRT-PCR del mRNA OsRLK5, el amplicón incluye el sitio de

apareamiento con osa-miR390-5pOsRLK5-rvs 59 AGTGGACAGACTGAGCTTTACAOsBAK-fwd 60 TATGCACGTACTCTGGTGGC qRT-PCR del mRNA OsBAK, el amplicón incluye el sitio se

apareamiento con osa-miR390-5pOsBAK-rvs 60 TCTCCGGTGCAGTTGAAACAOsLAC12/13-fwd 60 CGGGAAGACGTACATGCTGA qRT-PCR de los mRNAs de OsLAC12 y OsLAC13, el amplicón incluye el

sitio de apareamiento con osa-miR397a/bOsLAC12/13-rvs 60 GTGGTTGGCGATGGAGAAGAOsLAC26-fwd 60 GCTCTACAACTGCTCTGCCA qRT-PCR del mRNA OsLAC26, el amplicón incluye el sitio de

apareamiento con osa-miR397a/bOsLAC26-rvs 60 GGCGATGGAGAAGAAGAGCTOsLTPL6-fwd 54 ACTGTTGTGGATGGAAGAGG qRT-PCR del mRNA OsLTPL6, diseñados en el fragmento de

degradación 5', fuera del sitio de apareamiento con osa-miR1319aOsLTPL6-rvs 57 CCACCCTATCTACTCCCATCCTosa-miR390-5p-fwd 62 CGCGGAAGCTCAGGAGGGAT Stemloop qRT-PCR de osa-miR390-5posa-miR397a/b-fwd 62 CGGCGTCATTGAGTGCAGCG Stemloop qRT-PCR de osa-miR397a/bosa-miR535-5p-fwd 61 CGCGGGTGACAACGAGAGAGA Stemloop qRT-PCR de osa-miR535-5posa-miR1319a-fwd 61 CGCGGGAACCGGCATCTGTAATAT Stemloop qRT-PCR de osa-miR1319aosa-miR5808-fwd 62 CGCGGGTGACAACGAGAGAGA Stemloop qRT-PCR de osa-miR5808ath-miR390a/b-fwd 62 CGCGGAAGCTCAGGAGGGAT Stemloop qRT-PCR de ath-miR390a/bath-miR397a/b-fwd 62 CGGCGTCATTGAGTGCAGCG Stemloop qRT-PCR de ath-miR397a/bSLuniv-qRT-rvs 62 CCAGTGCAGGGTCCGAGGT qRT-PCR de miRNAs obtenidos por Stemloop RT

Tabla 17. Plásmidos, vectores y construccionesNombre Representación Utilización y características relevantespGEM-TEasy® Clonación de productos de PCR por el sistema de clonaje T/A . AmpR. Promega™.

pENTR3C® Clonación de fragmentos de DNA mediante restricción. Contiene sitios de recombinación attR del sistema Gateway®. CmR, ccdB, KanR. Invitrogen™.

pCAMBIA1300® pC:p35S:hptII:t35S Clonación de fragmentos de DNA obtenidos por restricción. Vector binario de expresión en plantas utilizado para transformación mediante A. tumefaciens. KanR, HygR. CAMBIA™.

pGWB541 pGW:p35S:CFP:tNosClonación de fragmentos de DNA mediante recombinación por el sistema Gateway®. Posee los sitios de recombinación homóloga attL. Permite realizar fusiones con la proteína fluorescente CFP en la C-terminal de la proteína de interés. CmR, ccdB, SpcR, HygR. Cedido por el Dr. Nakagawa, Center for Integrated Research in Science, Japón.

pGWB544 pGW:p35S:YFP:tNosClonación de fragmentos de DNA mediante recombinación por el sistema Gateway®. Posee los sitios de recombinación homóloga attL. Permite realizar fusiones con la proteína fluorescente YFP en la C-terminal de la proteína de interés. CmR, ccdB, SpcR, HygR. Cedido por el Dr. Nakagawa, Center for Integrated Research in Science, Japón.

pCAMBIAUbiNos pC:pUbi:tNos Clonación de los precursores de los miRNAs bajo el control del promotor Ubi y el terminador Nos.

pGWBOsCPK13CFP pGW:p35S:OsCPK13-CFP:tNos Agroinfiltración de hojas de N. benthamiana para expresión transitoria de la proteína fusión OsCPK13-CFP.

pGWBOsCPK13YFP pGW:p35S:OsCPK13-YFP:tNos Agroinfiltración de hojas de N. benthamiana para expresión transitoria de la proteína fusión OsCPK13-YFP.

pGEMTCPK13 pG:OsCPK13Secuencia codificante completa para la proteína OsCPK13 sin el codón de parada y con los sitios BamHI y XhoI en los extremos 5' y 3', respectivamente, clonada en el plásmido pGEM-Teasy®.

pENTRCPK13 pE:OsCPK13 Secuencia codificante completa para la proteína OsCPK13 sin el codón de parada clonada por los sitios BamHI y XhoI en el plásmido pENTR3C®.

pGEMTMIR390 pG:osa-MIR390 Secuencia completa del precursor osa-MIR390 con los sitios BamHI y SmaI en los extremos 5' y 3', respectivamente, clonada en el plásmido pGEM-Teasy®.

pGEMTMIR397a pG:osa-MIR397a Secuencia completa del precursor osa-MIR397a con los sitios BglII y SmaI en los extremos 5' y 3', respectivamente, clonada en el plásmido pGEM-Teasy®.

pGEMTMIR397b pG:osa-MIR397b Secuencia completa del precursor osa-MIR397b con los sitios BamHI y SmaI en los extremos 5' y 3', respectivamente, clonada en el plásmido pGEM-Teasy®.


- 222 -

7. Medios de cultivo

Bacterias

Medio LB: utilizado para el crecimiento de E. coli

Triptona: 10 g/l Extracto de levadura: 5 g/l NaCl: 10 g/l Agar (para medio sólido): 15 g/l pH (ajustado con NaOH): 7,5 Autoclavado durante 20 minutos

Medio SOB: medio utilizado para la recuperación de células transformadas

Triptona: 2% Extracto de levadura: 0,5% NaCl: 10 mM KCl: 2,5 mM MgCl2: 10 mM MgSO4: 10 mM Autoclavado durante 20 minutos

Medio YEB: utilizado para el crecimiento de A. tumefaciens

Extracto de carne: 5 g/l Extracto de levadura: 1 g/l Peptona: 5 g/l Sacarosa: 5 g/l MgSO4: 0,48 g/l Agar (para medio sólido): 15 g/l Autoclavado durante 20 minutos

y , p , p p y


pGEMTMIR1319a pG:osa-MIR1319a Secuencia completa del precursor osa-MIR1319a con los sitios BamHI y SmaI en los extremos 5' y 3', respectivamente, clonada en el plásmido pGEM-Teasy®.


pGEMTMIR5808 pG:osa-MIR5808 Secuencia completa del precursor osa-MIR5808 con los sitios BglII y SmaI en los extremos 5' y 3', respectivamente, clonada en el plásmido pGEM-Teasy®.

pCAMBIAMIR390 pC:pUbi:osa-MIR390:tNos Secuencia completa del precursor osa-MIR390 clonada por los sitios BamHI y SmaI en el plásmido pCAMBIAUbiNos.

pCAMBIAMIR397a pC:pUbi:osa-MIR397a:tNos Secuencia completa del precursor osa-MIR397a clonada por los sitios BglII y SmaI en el plásmido pCAMBIAUbiNos.

pCAMBIAMIR397b pC:pUbi:osa-MIR397b:tNos Secuencia completa del precursor osa-MIR397b clonada por los sitios BamHI y SmaI en el plásmido pCAMBIAUbiNos.


pCAMBIAMIR1319a pC:pUbi:osa-MIR1319a:tNos Secuencia completa del precursor osa-MIR1319a clonada por los sitios BamHI y SmaI en el plásmido pCAMBIAUbiNos.


pCAMBIAMIR5808 pC:pUbi:osa-MIR5808:tNos Secuencia completa del precursor osa-MIR5808 clonada por los sitios BglII y SmaI en el plásmido pCAMBIAUbiNos.


- 223 -

Medio MI: utilizado para la infiltración de células de A. tumefaciens

MgCl2: 10 μM MES: 10 μM Acetosiringona 0,15 μM

Antibióticos: suplemento de los medios de crecimiento de bacterias

Cloranfenicol: 30 μg/l Kanamicina: 50 μg/l Carbenicilina: 100 μg/l Rifampicina: 100 μg/l Espectinomicina: 100 μg/l

Hongos

Medios PDA y PDB: utilizado para el crecimiento de F. verticillioides

Potato dextrose broth (Difco): 24 g/l Agar (para medio sólido): 15 g/l Cloranfenicol: 30 mg/l Autoclavado durante 20 minutos

Medio CMA: utilizado para el crecimiento de M. oryzae

Glucosa: 10 g/l Peptona: 2 g/l Extracto de levadura: 1 g/l Casaminoácidos: 1 g/l NaNO3: 6 g/l KCl: 0,52 g/l MgSO4.7H2O: 0,52 g/l KH2PO4: 1,52 g/l ZnSO4.7H2O: 22 mg/l H3BO3: 11 mg/l MnCl2.4H2O: 5 mg/l FeSO4.7H2O: 5 mg/l CoCl2.6H2O: 1,7 mg/l CuSO4.2H2O: 1,6 mg/l Na2MoO4.2H2O: 1,5 mg/l Na2EDTA: 50 mg/l Biotina: 0,1 mg/l Piridoxina: 0,1 mg/l Tiamina: 0,1 mg/l Riboflavina: 0,1 mg/l Ácido p-aminobenzóico: 0,1 mg/l Ácido nicotínico: 0,1 mg/l Agar (para medio sólido): 15 g/l pH (ajustado con NaOH): 6,5 Cloranfenicol: 30 mg/l Autoclavado durante 20 minutos


- 224 -

Plantas

Medio Agar-kinetina: utilizado en ensayos de infección de hoja cortada de arroz

Agar: 10 g/l Kinetina: 2 mg/l Autoclavado durante 20 minutos

Medio MS (Murashige & Skoog, 1962): utilizado para el crecimiento in vitro

Una solución de: NH4NO3: 1,65 g/l KCl: 170 mg/l KNO3: 1,9 g/l CaCl2.2H2O: 440 mg/l MgSO4.7H2O: 370 mg/l MnSO4.7H2O: 6,2 mg/l H3BO3: 22,3 mg/l KI: 0,83 mg/l Na2MoO4.2H2O: 0,25 mg/l CuSO4.5H2O: 0,025 mg/l CoCl2.6H2O: 0,025 mg/l Ácido nicotínico: 0,5 mg/l Piridoxina HCl: 0,5 mg/l Tiamina HCl: 0,1 mg/l Mio-inositol: 100 mg/l Glicina: 2 mg/l O en su lugar: MS (Duchefa): 4,4g/l Junto con: Agar: 8 g/l Sacarosa: 30 g/l ó 10 g/l ó 0 g/l Higromicina (medio selectivo): 50 mg/l pH (ajustado con KOH): 5,8 Autoclavado durante 20 minutos

Medio NB y NB selectivo: para el proceso de transformación de callos de arroz

KNO3: 2,83 g/l (NH4)2SO4: 463 mg/l KH2PO4: 400 mg/l CaCl2.2H2O: 165 mg/l MgSO4.7H2O: 185 mg/l MnSO4.2H2O: 10 mg/l H3BO3: 3 mg/l ZnSO4.7H2O: 2 mg/l KI: 0,75 mg/l Na2MoO4.2H2O: 0,25 mg/l CuSO4.2H2O: 0,025 mg/l CoCl2.6H2O: 0,025 mg/l Na2EDTA: 3,72 mg/l


- 225 -

FeSO4.7H2O: 27,8 mg/l Piridoxina: 1 mg/l Tiamina: 10 mg/l Ácido nicotínico: 1 mg/l Sacarosa: 30 g/l L-Prolina: 0,5 g/l L-Glutamina: 0,5 g/l Caseína hidrolizada: 0,3 g/l Mio-inositol: 100 mg/l 2,4 D: 2,5 mg/l Phytagel (NB no selectivo): 2,6 g/l Agarosa (NB selectivo): 7 g/l Cefotaxima (NB selectivo): 400 mg/l Vancomicina (NB selectivo): 100 mg/l Higromicina (NB selectivo): 50 mg/l pH: 5,8 (no selectivo) 6 (selectivo) Filtrado con Sterivex®0,22um

Medio R2 (líquido y sólido) y R2 selectivo: para transformación de callos de arroz

KNO3: 4 g/l (NH4)2SO4: 330 mg/l CaCl2.2H2O: 146 mg/l MgSO4.7H2O: 246 mg/l NaH2PO4.H2O: 312 mg/l MnSO4.2H2O: 1,6 mg/l H3BO3: 2,83 mg/l ZnSO4.7H2O: 2,2 mg/l Na2MoO4.2H2O: 0,125 mg/l CuSO4.2H2O: 0,2 mg/l Na2EDTA: 1,8 mg/l FeSO4.7H2O: 12,5 mg/l Tiamina: 1 mg/l Glucosa (R2 sólido y líquido): 10 g/l Sacarosa (R2 selectivo): 30 g/l 2,4 D: 2,5 mg/l Acetosiringona: 19,62 mg/l Agarosa (R2 sólido y selectivo): 7 g/l Cefotaxima (NB selectivo): 400 mg/l Vancomicina (NB selectivo): 100 mg/l Higromicina (NB selectivo): 50 mg/l pH: 5,2 (no selectivo) 6 (selectivo) Filtrado con Sterivex®0,22um

Medio P-RN: medio utilizado en el proceso de transformación de callos de arroz

KNO3: 2,83 g/l (NH4)2SO4: 463 mg/l KH2PO4: 400 mg/l CaCl2.2H2O: 165 mg/l MgSO4.7H2O: 185 mg/l


- 226 -

MnSO4.2H2O: 10 mg/l H3BO3: 3 mg/l ZnSO4.7H2O: 2 mg/l KI: 0,75 mg/l Na2MoO4.2H2O: 0,25 mg/l CuSO4.2H2O: 0,025 mg/l CoCl2.6H2O: 0,025 mg/l Na2EDTA: 3,72 mg/l FeSO4.7H2O: 27,8 mg/l Piridoxina: 1 mg/l Tiamina: 10 mg/l Ácido nicotínico: 1 mg/l Sacarosa: 30 g/l L-Prolina: 0,5 g/l L-Glutamina: 0,5 g/l Caseína hidrolizada: 0,3 g/l Mio-inositol: 100 mg/l Agarosa: 7 g/l Cefotaxima: 400 mg/l Vancomicina: 100 mg/l Higromicina: 50 mg/l Benzilaminopurina: 2 mg/l Ácido naftalen-acético: 0,1 mg/l Ácido absícico: 2,5 mg/l pH: 5,8 Filtrado con Sterivex®0,22um

Medio RN: medio utilizado en el proceso de transformación de callos de arroz

KNO3: 2,83 g/l (NH4)2SO4: 463 mg/l KH2PO4: 400 mg/l CaCl2.2H2O: 165 mg/l MgSO4.7H2O: 185 mg/l MnSO4.2H2O: 10 mg/l H3BO3: 3 mg/l ZnSO4.7H2O: 2 mg/l KI: 0,75 mg/l Na2MoO4.2H2O: 0,25 mg/l CuSO4.2H2O: 0,025 mg/l CoCl2.6H2O: 0,025 mg/l Na2EDTA: 3,72 mg/l FeSO4.7H2O: 27,8 mg/l Piridoxina: 1 mg/l Tiamina: 10 mg/l Ácido nicotínico: 1 mg/l Sacarosa: 30 g/l L-Prolina: 0,5 g/l L-Glutamina: 0,5 g/l Caseína hidrolizada: 0,3 g/l


- 227 -

Mio-inositol: 100 mg/l Phytagel: 3,5 g/l Benzilaminopurina: 2 mg/l Ácido naftalen-acético: 0,1 mg/l pH: 5,8 Filtrado con Sterivex®0,22um

Medio P: medio utilizado para el enraizamiento de plantas de arroz transformadas

MS (Duchefa): 4,4 g/l Phytagel (NB no selectivo): 2,6 g/l Sacarosa: 50 g/l pH: 5,8 Autoclavado durante 20 minutos

Medio Yoshida: medio utilizado para crecimiento hidropónico de plantas de arroz

NH4NO3: 114,3 mg/l K2SO4: 89,4 mg/l KH2PO4: 115,5 mg/l K2HPO4: 21,4 mg/l CaCl2.2H2O: 110,8 mg/l MgSO4.7H2O: 405,2 mg/l MnCl2.4H2O: 1,88 mg/l (NH4)6Mo7O24.4H2O: 0,093 mg/l H3BO3: 1,17 mg/l ZnSO4.7H2O: 0,044 mg/l CuSO4.2H2O: 0,039 mg/l FeNaEDTA: 13,12 mg/l pH: 5 Autoclavado durante 20 minutos

Sustrato de arroz

El sustrato es una mezcla de turba y vermiculita a razón de 1:1. Por cada kg de esta

mezcla se agrega 1 g de CaCO3 y 1 g de fertilizante 15-15-15. Se humedece y se deja reposar

sin autoclavar durante 1 semana. La turba corresponde a una turba clara de Sphangum, con

pH 3,5; materia orgánica de 96% y contenido de N total de 1%. El fertilizante 15-15-15 está

formulado con 15% de nitrógeno total (nítrico, amoniacal y uréico), 15% de anhídrico

fosfórico (P2O5) y 15% de óxido de potasio (K2O).

Solución nutritiva de fertirrigación de arroz

KNO3: 14 mg/l NH4NO3: 1,6 mg/l K2HPO4: 3,5 mg/l KH2PO4: 8,2 mg/l Ca(NO3)2.4H2O: 9,9 mg/l MgSO4.7H2O: 2,8 mg/l


- 228 -

FeSO4.7H2O: 2,7 mg/l Kelamix (Fe-EDDHA): 35 mg/l Microelementos: 0,4 g/l (B 0,005%; Cu 0,001%; Fe 0,012%; Zn 0,004%; Mo 0,005%; Mn 0,005% quelados por EDTA)

8. Soluciones y tampones

TE

Tris-HCl pH 8 50 mM EDTA 5 mM

PBS 20X

NaPO4.H2O 16 mM Na2HPO4.2H2O 84 mM NaCl 1,5 M

PBST

PBS 1X Tween 0,1%

SSC 20X

NaCl 3 M Citrato trisódico 0,3 M

TBE 10X

Tris-HCl 0,089 M Ácido bórico 0,089 M EDTA 0,002 M

MEN 10X

MOPS 200 mM NaAc 50 mM EDTA 10 mM BSA 20 g/l

Solución desnaturalizante

NaOH 0,5 M NaCl 1,5 M

Solución neutralizante

Tris-HCl 0,5 M NaCl 1,5 M pH (ajustado con HCl) 8,0

Solución TBF1

KOAc 30 mM MnCl2.4H2O 50 mM


- 229 -

CaCl2.2H2O 10 mM RbCl 100 mM Glicerol 15% Esterilizado por filtración

Solución TBF2

MOPS pH 7 10 mM CaCl2.2H2O 75 mM RbCl 10 mM Glicerol 15% Esterilizado por filtración

Tampón MATAB

TRIS-HCl pH 8 100 mM NaCl 1,4 M EDTA 20 mM MATAB 2% PEG 6000 1% NaSO3 0,5%

Tampón de extracción de proteínas

Hepes pH 7,4 50 mM EGTA 5 mM EDTA 5 mM NaF 10 mM Na3VO4 10 mM Β-glicerofosfato 50 mM DTT 5 mM Leupepstatina 60 μM Pepstatina 1 μM Aprotinina 10 μM E-64 10 μM PMSF 1 mM Inhibidores de proteasas (Sigma™) 1/500

Tampón de elución de proteínas

Hepes pH 7,4 20 mM NaF 10 mM Na3VO4 10 mM Β-glicerofosfato 50 mM Leupepstatina 60 μM Pepstatina 1 μM Aprotinina 10 μM E-64 10 μM PMSF 1 mM Inhibidores de proteasas (Sigma™) 1/500 Tampón fosfato-Na+pH 7,5 20 mM Tritón 1%


- 230 -

MgCl2 1 mM

Tampón de gel separador de proteínas (Lower)

Tris-HCl pH 8,8 1,5 M SDS 0,4%

Tampón de gel concentrador de proteínas (Upper)

Tris-HCl pH 6,5 0,5 M SDS 0,4%

Tampón de electroforesis de proteínas

Tris-HCl 0,25 M Glicina 1,92 M SDS 10% pH 8,3-8,8

Tampón GUS

Ferricianuro potásico 100 μM Ferrocianuro potásico 100 μM EDTA pH 8 10 mM X-Gluc 1 mg/ml Tampón fosfato pH 7,5 50 mM N,N dimetilformamida 1%

Tampón de carga para DNA 6X

Glicerol 30% Azul de bromofenol 0,25% Xileno cianol 0,25% EDTA 0,5 M

Tampón de carga para RNA 2X

Tampón de carga para DNA 6X 20% Formamida desionizada 50% Formaldehído 6,4% MEN 10X 10% Bromuro de etidio 200 μg

Tampón de carga para proteínas 2X

Tris 125 mM Glicerol 20% SDS 4% Bromophenol 0.04% DTT 10%

Tampón de transferencia para proteínas

Tris 48 mM Glicina 39 mM Metanol 20%


- 231 -

SDS 1,3 mM pH 9-9,4

Rojo Ponceau

Rojo Ponceau 0,1% Ac. Acético 1%

RNAsa

Tris-HCl 10 mM NaCl 15 mM Ribonucleasa A 10 mg/ml


- 232 -

MMétodos

1. Métodos generales

Las técnicas generales de manipulación y análisis de ácidos nucleicos y proteínas se

han realizado siguiendo los manuales Molecular cloning: A laboratory manual (Sambrook &

Russell, 2001) y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 2003). Se incluyen otras

metodologías específicas o técnicas que se han puesto a punto en el transcurso de este

trabajo que han sido fundamentales para la obtención de los resultados presentados.

2. Obtención y análisis de ácidos nucleicos

Todos los ácidos nucleicos fueron comprobados en calidad y cantidad mediante

geles de electroforesis de agarosa y medición por espectrofotometría en un aparato

Nanodrop® de Thermo Fischer™.

2.1 Clonación de fragmentos de DNA en vectores plasmídicos y análisis de

recombinantes

2.1.1 Obtención de DNA plasmídico de bacterias

Para la obtención de DNA plasmídico a gran escala se utilizó el kit para

midipreparaciones Genopure® de Roche™ siguiendo las instrucciones del fabricante y en

caso de extracción de DNA plasmídico en escala pequeña se utilizó el kit de

minipreparaciones High Pure Plasmid Isolation® de Roche™ según el protocolo indicado por

el mismo, partir de 50-200 ml y de 5 ml de cultivo respectivamente. El DNA resultante es de

alta pureza y libre de DNAsas.

2.1.2 Modificación de DNA: digestión por enzimas de restricción y ligación

Se han realizado las reacciones de digestión de DNA con endonucleasas de

restricción y ligaciones teniendo en cuenta las recomendaciones de los fabricantes de las

enzimas comerciales.

2.1.3 Clonación de fragmentos por recombinación homóloga mediante el sistema

Gateway®

Las clonaciones en el plásmido que contiene los sitios de recombinación homóloga

pENTR3C se ha realizado por medio de enzimas de restricción. Se han realizado clonaciones

por recombinación homóloga mediante el sistema Gateway® de Invitrogen™ desde el


- 233 -

plásmido pENTR3C, que contiene los sitios de recombinación homóloga attL al vector

pGWB541 o pGWB544 (Nakagawa et al., 2007), que contienen los sitios attR, mediante la

enzima recombinasa LR de Invitrogen™, según las recomendaciones del fabricante.

2.1.4 Purificación de DNA

Para la purificación de fragmentos de DNA separados por electroforesis en geles de

agarosa se ha utilizado el kit de purificación High Pure PCR Product Purification® de

Roche™, siguiendo las instrucciones del fabricante.

2.1.5 Clonación de fragmentos de DNA por sistema T/A

Las clonaciones de fragmentos purificados de DNA se realizó por el sistema T/A

utilizando el kit pGEM-TEasy® de Promega™, siguiendo las indicaciones del fabricante.

2.1.6 Preparación de células competentes de E. coli

Se prepararon células listas para ser transformadas siguiendo el siguiente protocolo

en esterilidad:

- Inocular una colonia de E. coli proveniente de una placa fresca en 5 ml de medio LB.

- Incubar durante 16 horas a 37ºC con agitación orbital constante de 250 rpm.

- Inocular 250 ml de medio LB con 2,5 ml del cultivo inicial en un Erlenmeyer de 1 litro.

- Incubar el cultivo a 37ºC con agitación de 250 rpm hasta alcanzar una DO(600nm) de

0,5-1,0.

- Enfriar el cultivo en hielo durante 15 minutos y transferir el mismo a tubos de

centrífuga previamente enfriados en hielo.

- Centrifugar en frío (4ºC) durante 10 minutos a 4000 rpm, con frenado suave.

- Descartar sobrenadante y resuspender las células precipitadas suavemente en 50 ml

de solución fría de TFB1. Incubar esta suspensión de células 10 minutos a 4ºC.

- Centrifugar a 4ºC por 10 minutos a 4000 rpm.

- Descartar sobrenadante y resuspender las células suavemente en 5 ml de solución

fría de TFB2.

- Preparar alícuotas de 100 μl de esta suspensión de células en microtubos y congelar

inmediatamente en N2 líquido. Se conservan las células a -80ºC.


- 234 -

2.1.7 Preparación de células competentes de A. tumefaciens

- Inocular una colonia de A. tumefaciens proveniente de una placa fresca en 5 ml de

medio LB.

- Incubar durante 16 horas a 28ºC con agitación orbital constante de 250 rpm.

- Inocular 100 ml de medio YEB con 2 ml del cultivo inicial.

- Incubar el cultivo a 28ºC con agitación de 250 rpm hasta alcanzar una DO(600nm) de

0,5-1,0.

- Enfriar el cultivo en hielo durante 15 minutos y transferir el mismo a tubos de

centrífuga previamente enfriados en hielo.

- Centrifugar en frío (4ºC) durante 5 minutos a 4500 rpm, con frenado suave.

- Descartar sobrenadante y resuspender las células precipitadas suavemente en 1 ml

de solución fría de CaCl2 a 20mM.

- Preparar alícuotas de 100 μl de esta suspensión de células en microtubos y congelar

inmediatamente en N2 líquido. Se conservan las células a -80ºC.

2.1.8 Transformación de células competentes bacterianas

Se añade 1 μg de DNA plasmídico o el producto total de una reacción de ligación de

DNA a una alícuota de 100 μl de células competentes y se congela inmediatamente en N2

líquido. El protocolo difiere a partir de este paso según cada bacteria:

E. coli:

- Luego del congelamiento se mantener las células a 37ºC durante 5 minutos, agregar

1 ml de medio SOB e incubar las células a 37ºC durante 1 hora en agitación.

- Centrifugar durante 1 minuto a 13000 rpm, descartar sobrenadante y resuspender las

células en 100 μl de medio SOB.

- Sembrar las células en placas de Petri con medio LB sólido y con los antibióticos de

selección de la cepa bacteriana y los plásmidos con los que se han transformado.

A. tumefaciens:

- Luego del congelamiento se mantener las células a 37ºC durante 5 minutos, agregar

1 ml de medio YEB e incubar las células a 28ºC durante 2-4 horas en agitación.

- Centrifugar durante 1 minuto a 13000 rpm, descartar sobrenadante y resuspender las

células en 100 μl de medio YEB.


- 235 -

- Sembrar las células en placas de Petri con medio YEB sólido y con los antibióticos de

selección de la cepa bacteriana y los plásmidos con los que se han transformado.

2.2 Extracción de DNA genómico vegetal

Se extrajo el DNA genómico de muestras vegetales según el protocolo descrito por

Murray y Thompson (1980) con ligeras modificaciones.

- Triturar el tejido con mortero en N2 líquido y pasar aproximadamente 100 mg a

tubos de polipropileno junto con bolas de cristal de 2 mm.

- Con el objetivo de obtener una mejor extracción, triturar las muestras en nitrógeno

líquido por medio de TissueLyser® siguiendo las instrucciones del fabricante

Quiagen™.

- Agregar 600 μl de tampón de extracción MATAB (mixed alkyltrimethylammonium

bromide - Sigma®) A 72ºC e incubar 1 hora a esa temperatura, homogeneizando

por vortex cada 15 minutos.

- Dejar enfriar a temperatura ambiente y añadir 600 μl de una dilución de cloroformo

y alcohol isoamílico (24:1 v/v). Centrifugar 5 minutos a 13000 rpm.

- Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y agregar 5 μl de RNAsa. Incubar

durante 30 minutos a 37ºC.

- Agregar 600 μl de isopropanol, centrifugar durante 5 minutos a 13000 rpm y

descartar el sobrenadante.

- Añadir 400 μl de etanol al 70%, vortear y centrifugar 5 minutos a 13000 rpm.

- Descartar el sobrenadante, secar el pellet y resuspenderlo en 50 μl de agua mQ

estéril. El DNA genómico es conservado a 4ºC para utilización a corto término y a -

20ºC para conservación por periodos largos.

2.3 Extracción, manipulación y análisis de RNA de plantas

2.3.1 Extracción de RNA total de tejidos vegetales

El protocolo de extracción de RNA con Trizol® se basó en el descrito por la casa

comercial, descrito a continuación.


tubos de polipropileno junto con bolas de cristal de 2 mm.


- 236 -

- Con el objetivo de obtener una mejor extracción, triturar las muestras en nitrógeno

líquido por medio de Tissue Lyser® siguiendo las instrucciones del fabricante

Quiagen™.

- A las muestras aún congeladas agregar 1 ml de Trizol®, homogeneizar con vortex e

incubar 10 minutos a temperatura ambiente.

- Añadir 200 μl de cloroformo, homogeneizar por inversión e incubar 5 minutos a

temperatura ambiente.

- Centrifugar a 4ºC durante 15 minutos y a 13000 rpm.

- Recuperar el sobrenadante, añadir 500 μl de isopropanol e incubar 10 minutos a

temperatura ambiente.

- Centrifugar a 4ºC durante 15 minutos y a 13000 rpm.

- Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 1 ml de etanol al 75%.

- Centrifugar a 4ºC durante 5 minutos y a 13000 rpm. Dejar secar el pellet y

resuspenderlo en 50 μl de agua mQ estéril.

- Incubar la solución de RNA a 65ºC durante 5 minutos.

- Centrifugar 1 minuto a 13000 rpm y recuperar el sobrenadante.

- Precipitar el RNA con 125 μl de etanol absoluto y 5 μl de acetato sódico 3M pH 5,5

durante toda la noche a -20ºC.

- Centrifugar a 4ºC durante 20 minutos a 13000 rpm y descartar el sobrenadante.

- Lavar el pellet con 200 μl de etanol al 70%, secarlo y resuspenderlo en 50 μl de agua

mQ estéril. El RNA total es conservado a -20ºC para utilización a corto término y a -

80ºC para conservación por periodos largos.

- En el caso de extracción de RNA de tejidos radiculares de plantas de arroz crecidas

en tierra, las muestras de RNA se purificaron además en columnas del kit PureLink®

de Ambion™.

2.3.2 Electroforesis de RNA en geles de poliacrilamida

En este trabajo se realizaron trabajos relacionados principalmente con miRNAs, por

lo que se utilizaron geles de poliacrilamida para la electroforesis de RNA. Este sistema

permite que el RNA que ingrese dentro del tramaje del gel sea sólo de pequeño tamaño.


- 237 -

Los geles desnaturalizantes utilizados para la electroforesis de RNA fueron de 1,5

mm con una concentración de poliacrilamida al 17,5%. Los aparatos utilizados fueron los de

Miniprotean® de Biorad™ o Hoefer SE 400™. La composición de los geles fue la siguiente

para un total de 25 ml:

Urea: 10,5 g Acrilamida:bis-acrilamida (29:1): 10,92 ml TBE 5X: 2,5 ml APS 10%: 200 μl TEMED: 9,16 μl

Las muestras de RNA (total de 10-100 μg) se prepararon con formamida al 50% y el

tampón de carga para miRNAs a 1X. La migración del RNA se realizó en tampón TBE 0,5X a

un voltaje de 100-120V durante aproximadamente 2 horas (Miniprotean®) o a 180-200V

durante 6 horas (Hoefer™).

2.3.3 Transferencia de RNA a un soporte inerte – Northern blot

El RNA se transfiere a una membrana de nylon Nytran® de Whatman™ utilizando el

sistema de electrotransferencia semiseca XCell Sure Lock ® de Invitrogen™ o Transblot

Semi-dry® de Biorad™, siguiendo las instrucciones de los fabricantes y con tampón TBE 0,5X

durante aproximadamente 1 hora a 300 mA. Luego de la transferencia se fija el RNA en la

membrana con 1200 J, por medio de un crosslinker.

2.3.4 Marcaje radiactivo y purificación de sondas

El DNA utilizado como sonda de hibridación de microRNAs (21-24 nt) es un

oligonucleótido. Para el marcaje radiactivo de estas sondas de hibridación se utilizaron 2 μl

de oligonucleótido (10 μM) y el kit comercial de T4 Polynucleotide Kinase® siguiendo las

indicaciones del fabricante. El marcaje se realizó en un volumen final de 50 μl, utilizando 5 μl

del isótopo radiactivo γATP32 durante 1 hora a 37ºC. La sonda se purificó para eliminar la

radiactividad no incorporada mediante columnas Probe Quant™ G-25 (Amersham) según

instrucciones del fabricante. A continuación, y previo a la hibridación, la sonda se

desnaturaliza incubándola durante 10 minutos a 95ºC.


- 238 -

2.3.5 Hibridación de membranas de RNA

- Pre-hibridación: previamente a la hibridación con la sonda radiactiva la membrana

debe ser embebida en 5 ml de la solución de hibridación e incubada durante 1-6

horas a 37ºC en agitación suave. En este trabajo se utilizó la solución comercial

PerfectHyb® plus de Sigma™.

- Hibridación: Añadir a la solución de hibridación la sonda marcada radiactivamente e

incubar a 37ºC durante 1-3 días.

- Lavados y exposición: Se lavan las membranas 3 veces con una solución de SSC 2X y

SDS 0,2% a 37ºC. Las membranas se sellan dentro de film de plástico, se exponen en

una pantalla Phosphorimager® de Biorad™ y la imagen se visualiza en Storm 860®

de GE™.

2.3.6 Síntesis de cDNA

La síntesis de cDNA se ha utilizado para los estudios de expresión génica mediante

análisis de RT-PCR. Para ello se realiza una digestión con DNAsa previa a la

retrotranscripción. La reacción de retrotranscripción de miRNAs maduros se realizó por

medio de la técnica de stemloop RT, descrita por Chen et al. (2005), según las modificaciones

realizadas indicadas a continuación.

- Digestión con DNAsa: Antes de comenzar la retrotranscripción del RNA mensajero

hay que asegurarse de que no queden restos de DNA genómico en las muestras

que puedan interferir en la PCR, digiriendo la preparación de RNA con DNAsa. Se

utilizó el kit Turbo DNAFree® de Ambion™. Una mezcla de 10 μg de RNA total, 1 μL

DNA-asa, 4 μL de tampón de DNAsa 10X se llevan a un volumen final de 40 μL con

agua mQ estéril. Incubar a 37ºC durante 30 minutos y se inactiva la DNAsa durante

5 minutos a 70ºC. Precipitar con etanol antes y resuspender el RNA en 40 μL de

agua mQ estéril.

- Retrotranscripción (RT): Se utilizó o bien el kit High Capacity cDNA Reverse

Trancription® de Life Technology™ o bien el kit Transcriptor First cDNA Synthesis®

de Roche™ siguiendo las indicaciones de los fabricantes. Generalmente se realizó la

reacción con un total de 1 μg de RNA total con inhibidor de RNAsas y con oligo-dT


- 239 -

como cebador de la reacción para la síntesis a partir de los mRNA con colas de

polyA.

- Retrotranscripción de pequeños RNAs: Los miRNA maduros son RNAs pequeños de

21-24 nucleótidos de largo, lo cuales son producto de un procesamiento pos-

transcripcional, por lo que no poseen polyA y no sirven como molde para la síntesis

de cDNAs en una reacción de RT típica a partir del cebador de oligo-dT. La técnica

de stemloop RT se utilizó para sintetizar cDNA a partir de mRNAs y miRNAs maduros

conjuntamente y se detalla en la Figura 73, así como la reacción de stemloop RT y

los componentes que se utilizaron en este trabajo. Para la síntesis de cDNA total,

incluídos los miRNAs, en ocasiones también fue utilizado el kit MiR-X® de

Clontech™ según especificaciones del fabricante. La composición de la reacción de

stemloop RT utilizada en este trabajo fue la siguiente:

RNA total: 1 μg Cebador SL: 10 μM Cebador oligoT: 10 μM Enzima RT: 10 U Inhibidor de RNAsas: 20 U dNTPs: 10 mM Tampón RT: 4 μl Agua libre de nucleasas: hasta 20 μl

2.4 Amplificación de fragmentos de DNA por PCR

La técnica de PCR se utilizó para amplificar fragmentos de DNA a partir de DNA

genómico o de plásmidos recombinantes. También fue utilizada en estudios de expresión

génica mediante RT-PCR y en confirmación de reacciones de RT.

Contenidos generales de los en las reacciones de PCR realizadas en este trabajo:

DNA 10-100 ng Tampón PCR 10X 1X MgCl2 2,5 mM dNTPs 200 μM Cebadores 100 nM Taq polimerasa 0,5 U

La Figura 74 muestra las condiciones generales de temperaturas, tiempos y ciclos

para las PCR. Las mismas fueron optimizadas para cada reacción.


- 240 -

2.5 PCR en tiempo real cuantitativa

En este trabajo se ha utilizado la técnica de PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR)

para estudios de expresión génica, en combinación con la reacción de síntesis de cDNA

mediante retrotranscriptasa, es decir, de RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR).

Los cebadores utilizados en las reacciones de PCR en tiempo real cuantitativa se

diseñaron desde el sitio Primer3web (http://primer3.ut.ee/) siguiendo parámetros específicos

como: aproximadamente 20 pb de largo, 45-55% de contenido de G y C, máximo 2 G o C en

las 5 últimas bases en 3’, mejor no tener G en 5’, Tm de 55-72ºC pero óptimo de 60ºC y un

amplicón de 70-150 pares de bases con una Tm máxima de 92ºC. Para las PCRs se utilizó

como mezcla de reacción LightCycler 480® SYBRGreen Master de Roche™. Esta mezcla

contiene ya todos los componentes necesarios para la reacción, solamente hay que añadir

los cebadores de interés y el DNA problema. Las PCR se realizaron en 10 μL de volumen final

con una concentración final de cada cebador de 300 nM. Para el análisis de la expresión se

realiza generalmente una dilución 1:10 de los cDNA obtenidos y se utilizan 2 μL de la misma

en cada reacción.

Para generar las curvas estándar con qué comparar las muestras problema se

prepara una dilución seriada con cDNA (1:5, 1:20, 1:80, 1:320). Se utilizaron 2 μL en cada

reacción. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un aparato LightCycler 480 II® de

Roche™. Se realizan 40 ciclos de PCR utilizando el programa de PCR recomendado por el

fabricante (Figura 75).

Figura 73. Protocolo de la reacción de stemloop RT.

16ºC

30ºC

42ºC

85ºC

50ºC

30 min

30 s

30 s60 s

5 min60 ciclos


- 241 -

Los datos se analizan mediante el programa informático del mismo. Para el caso de

miRNAs de muy baja expresión se realizó una segunda ronda de qRT-PCR utilizando como

muestra una dilución de 1/10.000 del producto de la primera ronda (ej: osa-miR1319a), según

el protocolo descrito por Mou et al. (2013). La técnica de stemloop qRT-PCR se ha validado

con análisis Northern blot y se ha comprobado que los niveles de detección se

corresponden, como se muestra en la Figura 76, donde se ven los análisis realizados en la

detección de osa-miR1319a en las líneas transgénicas osa-MIR1319a #7, #16 y #18.

Cada muestra se analiza por triplicado en cada PCR tanto para el gen problema

como para el gen de referencia. En cada placa incluye el control sin cDNA para cada pareja

de cebadores, con tal de comprobar posibles contaminaciones. La cantidad relativa del

cDNA problema en cada muestra se calcula comparando el valor de CT de las muestras

(valor CT: número de ciclo en el cual la fluorescencia sobrepasa un valor umbral en la fase

logarítmica de la curva de amplificación) con una recta patrón y se normaliza mediante el

95ºC 95ºC

Ta

72ºC72ºC5 min 30-60 s

30-60 s

X s 10 min

25-30 ciclos

Desnaturalización Desnaturalización Apareamiento Síntesis Extensión

Figura 74. Condiciones generales para amplificación de fragmentos de DNA por PCR.

95ºC 95ºC

60 ºC

72ºC72ºC30 s 5 s

10 s

10 s10 min

40 ciclos

Desnaturalización Desnaturalización Apareamiento Síntesis Curva de disociación

Lectura de la fluorescencia

Figura 75. Protocolo de amplificación de fragmentos de cDNA por qPCR utilizando SybrGreen® de Roche™.


- 242 -

valor obtenido para el gen constitutivo. Para utilizar el método de comparación de CT se ha

de validar primero la especificidad de los cebadores realizando una curva patrón para

comprobar que la eficiencia de amplificación del cDNA problema es aproximadamente igual

a la eficiencia de los cebadores del gen de referencia (Livak & Schmittgen, 2001).

2.6 Secuenciación y análisis de DNA

La secuenciación capilar se ha realizado utilizando la tecnología ABI 3730 DNA

Analyzer® de Applied Biosystems™, en el servicio de secuenciación del CRAG. Para la

búsqueda de homologías se consultaron las bases de datos KOME (Knowlegde-based Oryza

Molecular biological Enciclopedia), GenBank, EMBL, SWISSPROT y Plaza utilizando el

programa BLAST a través del servidor Nacional Center for Biotechnology Information web site

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/) y del servidor de la base de datos KOME

(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/Wblast2.html). Los alineamientos de secuencias se han

realizado utilizando el programa ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).

0,0E+00

5,0E-06

1,0E-05

1,5E-05

2,0E-05

2,5E-05

3,0E-05

3,5E-05

4,0E-05

4,5E-05

5,0E-05

osa-miR1319a

EExpr

esió

n re

lativ

a

EV#7osa-MIR1319a-Ox #7osa-MIR1319a-Ox #16osa-MIR1319a-Ox #18

osa-MIR1319a-Ox

osa-miR1319a

21 ntRNA EtBr

Sonda

A

B

Figura 76. Validación de la técnica stemloop qRT-PCR mediante análisis Northern blot. A. Análisis Northern blot de la acumulación del miRNA osa-miR1319a. Los datos son los presentados en los resultados. B. Cuantificación por stemloop qRT-PCR de la acumulación de osa-miR1319a, según la metodología presentada y utilizando el mismo RNA que en (A).


- 243 -

3. Obtención y análisis de proteínas

3.1 Extracción de proteínas de tejidos vegetales

El protocolo de extracción de proteínas utilizado en este trabajo es el descrito a

continuación.


tubos de polipropileno.

- A las muestras aún congeladas agregar 400 μl de tampón de extracción de

proteínas y homogeneizar con vortex.

- Centrifugar a 4ºC durante 15 minutos a 2000 rpm.

- Recuperar el sobrenadante en un tubo nuevo y centrifugar a 4ºC durante 15 minutos

a 13000 rpm.

- Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con ayuda de un baño de

sonicación en 100 μl de tampón de elución de proteínas.

- Cuantificar el contenido de proteínas por el método descrito por Bradford (1976).

3.2 Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida

Los geles utilizados para la electroforesis de proteínas fueron de 1,5 mm con una

concentración de poliacrilamida al 10%. Los aparatos utilizados fueron los de Miniprotean®

de Biorad™. La composición de los geles fue la siguiente para 2 geles:

Gel separador (Lower):

Acrilamida:bis-acrilamida (37:1): 5 ml Tampón separador: 5 ml Agua mQ: 10 ml APS 10%: 80 μl TEMED: 10 μl

Gel concentrador (Upper):

Acrilamida:bis-acrilamida (37:1): 1 ml Tampón concentrador: 2 ml Agua mQ: 4,5 ml APS 10%: 80 μl TEMED: 20 μl

Los geles se preparan con ¾ de contenido de gel separador y ¼ de concentrador.

Las muestras de proteínas se prepararon con el tampón de carga para proteínas a 1X. La


- 244 -

migración de las proteínas se realizó en tampón de electroforesis de proteínas a un voltaje

de 100-120V hasta que lleguen al final del gel.

3.3 Transferencia de proteínas a un soporte inerte – Western blot

Las membranas deben equilibrarse previamente a la transferencia embebiéndose en

el tampón de transferencia de proteínas 1X. Las proteínas se transfieren desde el gel de

acrilamida por capilaridad a una membrana de nitrocelulosa Hybond® de Amersham™. La

transferencia se realiza en el XCell Sure Lock ® de Invitrogen™, siguiendo las instrucciones

de los fabricantes y con tampón de transferencia de proteínas 1X. Las condiciones para la

electrotransferencia son de 12 V durante 1 hora. Luego de la transferencia, desmontar la

membrana, teñirla con rojo Ponceau y sacar una fotografía de las proteínas teñidas.

3.4 Inmunodetección de proteínas

Para realizar la inmunodetección de la proteína deseada, en este trabajo se siguió el

siguiente protocolo.

- Lavar la membrana dos veces con PBST durante 5 minutos en agitación.

- Bloquear las membranas con una solución de leche en polvo (Sveltesse® de

Molico™) al 10% en PBST durante 1 hora a 37ºC.

- Lavar con PBST durante 5 minutos en agitación.

- Incubar la membrana con el anticuerpo primario a la dilución necesaria (OsCPK13:

1/1000) diluída en PBST, durante 2 horas a temperatura ambiente en agitación.

- Realizar 4 lavados de 5 minutos en agitación con PBST.

- Incubar la membrana con el anticuerpo secundario a una dilución 1/10000 (anti-

conejo) diluída en PBST, durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación.

- Lavar 4 veces la membrana con PBST durante 5 minutos en agitación.

- Revelar la membrana con los reactivos del kit Fast Western Blot Kit® de Thermo™,

siguiendo las recomendaciones del fabricante.

- Detectar la señal en un aparato ImageQuant LAS 4000® de GE™.


- 245 -

4. Crecimiento y manipulación de hongos patógenos

4.1 Crecimiento de M. oryzae

Esporas de M. oryzae del aislado de interés se inoculan en placas de CMA en

condiciones de esterilidad y se mantienen en condiciones controladas de crecimiento a una

temperatura de 25ºC y fotoperiodo de 16/8 (luz/oscuridad) durante 15 días para obtener una

buena producción de esporas.

4.2 Crecimiento de F. verticillioides y P. cucumerina

Se inoculan esporas de F. verticillioides o de P. cucumerina en placas de PDA y se

mantienen a temperatura ambiente en condiciones de esterilidad durante 15 a 21 días.

4.3 Obtención de suspensiones de esporas de hongos

Bajo campana de flujo laminar en condiciones de esterilidad se añaden 5 ml de agua

mQ estéril a las placas donde ha crecido el hongo de interés. Se remueven las esporas con

un ansa de vidrio para suspenderlas en el agua. Se toma el total de la suspensión y se filtran

con papel de filtro miracloth. Se realiza el conteo de esporas utilizando la cámara de

Neubauer o de Hausser y se diluye a la concentración necesaria. A la dilución a ser utilizada

para ensayos de infección se agrega Tween® hasta una concentración de 0,02%.

5. Crecimiento, manipulación, análisis y tratamiento de plantas

5.1 Esterilización superficial y germinación de semillas de arroz

Las condiciones de crecimiento en invernadero fueron: 14h/10h de fotoperiodo

(luz/oscuridad); 60% de humedad y 28ºC de temperatura. Cuando las semillas no son

sembradas directamente en tierra o se necesitan condiciones estériles de crecimiento, se

procede de la siguiente manera:

- Descascarillar las semillas.

- Pasar las semillas a un tubo o similar y lavar con etanol 70% durante 3 minutos en

agitación.

- Decantar el etanol y añadir una solución de hipoclorito sódico 30% (Carlo Erba™) y

mantener en agitación durante 30 minutos.

- En campana de flujo laminar, decantar el hipoclorito sódico y seguidamente lavar

con agua estéril repetidas veces.


- 246 -

- Las semillas pueden conservarse en agua estéril hasta 4h antes de proceder a

sembrarlas en medio estéril.

Una vez esterilizadas, las semillas pueden sembrarse en el medio deseado. Como

norma general, para la germinación de plantas de arroz se utiliza medio MS suplementado

con 3% de sacarosa, si bien pueden usarse MS sin sacarosa o a otras concentraciones si las

condiciones del experimento lo requieren. Las condiciones de crecimiento in vitro fueron:

16h/8h de fotoperiodo (luz/oscuridad) y 28ºC de temperatura.

5.2 Esterilización superficial y germinación de semillas de Arabidopsis

Las condiciones de crecimiento en invernadero fueron: 12h/12h de fotoperiodo

(luz/oscuridad); 40% de humedad y 22ºC de temperatura. Cuando las semillas no son

sembradas directamente en tierra o se necesitan condiciones estériles de crecimiento, se

procede de la siguiente manera:

- Poner un pequeño volumen de semillas en un tubo de polipropileno de 1,5 ml.

- Preparar (bajo campana extractora) una solución con 100mL de hipoclorito sódico

concentrado y 3 ml de HCl al 37% fumante.

- Colocar los tubos abiertos dentro de un desecador cerrado con la solución

preparada durante 4 horas. Esta solución genera gases y esteriliza las semillas.

- Ventilar los tubos en una campana de flujo laminar 15 minutos para eliminar los

vapores.

- Sembrar las semillas en placas de MS (sin sacarosa, habitualmente).

- Estratificar la germinación de 2-3 días a 4ºC en oscuridad (este paso es realizado

también para semillas sembradas directamente en tierra).

- Transferir a la cámara de cultivo. Las condiciones de crecimiento in vitro fueron:

12h/12h de fotoperiodo (luz/oscuridad); 40% de humedad y 22ºC te temperatura.

5.3 Inoculación de plantas de arroz con agentes patogénicos

5.3.1 Infección con M. oryzae

- Infección de plantas enteras: Las plantas de arroz de la línea o variedad de interés se

crecieron en macetas de tierra en invernadero, bajo condiciones controladas de luz,

temperatura y humedad durante 21 días. Cada maceta conteniendo 10 a 12 plantas. En los

casos de líneas hemicigotas se han crecido 7 días in vitro en presencia del agente de


- 247 -

selección y después fueron trasplantadas a tierra y crecidas por 14 días. Las plantas se

inocularon por aspersión a 2 atm con un aerógrafo a razón de 2 ml/maceta con una

suspensión de esporas de M. oryzae del aislado de interés, a concentración de 105 esp/ml.

Para análisis moleculares de estas plantas, se tomaron muestras de la parte aérea según la

necesidad del experimento a los tiempos requeridos. Para el análisis del fenotipo, las plantas

se mantuvieron durante 7 días en las mismas condiciones en las que habían crecido. Para

evaluar la incidencia de lesiones fúngicas, se tomaron las penúltimas hojas emergidas de

cada planta.

- Infección de hojas cortadas: Se crecieron las plantas de la misma forma que la referida

para la infección de plantas enteras. Se cortaron las penúltimas hojas emergidas de cada

planta y se posicionaron sobre una placa de agar-kinetina. Las hojas se inocularon con varios

papeles de filtro de 5 mm de diámetro embebidos en una suspensión de esporas de M.

oryzae del aislado necesario, a una concentración de 105 esp/ml. Las placas se mantuvieron

tapadas durante 24 horas en condiciones de oscuridad y se retiraron los papeles de filtro.

Una vez retirados los papeles de filtro, las placas se mantuvieron en condiciones de

crecimiento in vitro de plantas de arroz. Para análisis moleculares de estas hojas, se tomaron

muestras según la necesidad del experimento a los tiempos requeridos. El análisis del

fenotipo se ha evaluado luego de 7 días de iniciada la infección.

5.3.2 Infección con F. verticillioides

Se sembraron semillas de las líneas de interés en condiciones in vitro en medio MS

sin sacarosa a razón de 10-12 semillas/jarra y se mantuvieron en esterilidad y germinando

durante 4-8 horas. Se inoculó cada semilla con 50 μl de una suspensión de esporas de F.

verticillioides a una concentración de 104 esp/ml. Se mantuvieron las semillas durante 7 días

en condiciones in vitro y temperatura de 28ºC.

5.3.3 Inoculación con elicitores de M. oryzae

Las plantas se crecieron durante 21 días en macetas de tierra en invernadero bajo

condiciones controladas de luz, temperatura y humedad y se trataron las plantas por

aspersión de una suspensión de elicitores de M. oryzae a una concentración de 300 μg/ml.

Se tomaron muestras de la parte aérea de las plantas a diferentes tiempos luego del

tratamiento.


- 248 -

5.4 Infección de Arabidopsis con P. cucumerina

- Infección in vitro: Se sembraron semillas de las líneas de interés en placas de medio

sólido MS sin sacarosa y se mantuvieron in vitro durante 15 días. Después se inocularon por

aspersión de una suspensión de esporas de P. cucumerina a una concentración de 105

esp/ml. El fenotipo de las plantas fue evaluado después de 5 días de la inoculación.

- Infección en tierra: Se crecieron plantas de las líneas requeridas macetas de tierra y se

mantuvieron en invernadero bajo condiciones controladas de luz, temperatura y humedad

durante 21 días. Después de este tiempo se inocularon con una suspensión de esporas de P.

cucumerina a una concentración de 105 esp/ml. Se mantuvieron las plantas en condiciones

normales de crecimiento pero con alta humedad. El fenotipo es analizado luego de 12 días

de iniciada la inoculación.

5.5 Agroinfiltración de plantas de N. benthamiana

El protocolo seguido para la infiltración de hojas de N. benthamiana con células de

A. tumefaciens fue el que se detalla a continuación.

- Inocular células de A. tumefaciens EHA105, conteniendo los vectores de interés, en 5

ml de medio YEB líquido suplementado con los antibióticos necesarios.

- Incubar el cultivo a 26ºC y 250 rpm durante 2 días.

- Inocular 1 ml de este cultivo en 5 ml de YEB líquido e incubar durante 24 horas.

- La OD(600nm) óptima del cultivo para obtenerse en fase exponencial se ubica entre 0,8

y 1.

- Lavar las células ajustando la concentración de células a una OD(600nm) de 0,2 a un

volumen final de 50 ml con medio MI.

- Centrifugar esta suspensión de células a 4ºC durante 10 min a 13000 rpm.

- Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 50 ml de medio MI.

- Incubar durante 3 h a temperatura ambiente.

- Utilizar plantas de N. benthamiana de aproximadamente 30 días y 5-6 hojas.

- Infiltrar las hojas por mitades, en una de las mitades las células de A. tumefaciens y

en la otra mitad un control sin células bacterianas, sólo con medio MI.


- 249 -

- Extraer las muestras para su posterior análisis entre 24 a 72 horas después de la

agroinfiltración, cuando se ha hecho efectiva la transformación transitoria de las

células foliares.

5.6 Tratamiento de estrés hídrico en plantas de arroz

- Tratamiento en tierra: Las plantas de arroz de la línea o variedad de interés se crecieron

en macetas de tierra en invernadero, bajo condiciones controladas de luz, temperatura y

humedad durante 21 días. Cada maceta conteniendo 6-8 plantas. En los casos de líneas

hemicigotas se han crecido 7 días in vitro en presencia del agente de selección y después

fueron trasplantadas a tierra y crecidas por 14 días. Las plantas se sometieron a un régimen

de sequía (sin riego) durante 5 días. Pasado este tiempo se empezó el riego de recuperación

durante 7 días y se ha evaluado el fenotipo.

- Tratamiento in vitro: Se crecieron plantas de las líneas deseadas durante 7 días en

condiciones in vitro y después se sometieron a desecación en campana de flujo laminar. Se

tomaron muestras de tejido de la parte aérea y radicular a los tiempos necesarios.

- Curva de retención de agua: Se crecieron plantas de las líneas de interés durante 7 días

en condiciones in vitro y después de este tiempo se mantuvieron sobre papel de filtro y se

pesaron las plantas a diferentes tiempos post-desecación. Los cálculos de la pérdida de agua

se refirieron al peso inicial de las plantas.

5.7 Tratamientos de fertilización fosfatada en plantas de arroz

5.7.1 Tratamiento en tierra

- Suficiencia de fosfatos: Se crecieron plantas de las líneas deseadas en macetas

conteniendo el sustrato normal de crecimiento de arroz. Se regó cada 2 días con agua sin

fertilización y una vez a la semana con fertirriego conteniendo los nutrientes a

concentraciones normales.

- Deficiencia de fosfatos: Las plantas se crecieron en las mismas condiciones que en

suficiencia de fosfatos, excepto en lo relativo al fertirriego. Cada semana se realizó el riego

con fertilización exenta de fuentes de fosfatos, por lo que las plantas sólo tenían disponible

los fosfatos de liberación lenta del sustrato.


- 250 -

5.7.2 Tratamiento en hidroponía

Las plantas se crecieron en medio Yoshida a las concentraciones normales de

nutrientes, que corresponde a suficiencia de fosfatos. Para los tratamientos de deficiencia se

preparó el medio de crecimiento hidropónico con una concentración de 1/10 de fuentes de

fosfatos (KH2PO4 y K2HPO4). Para los tratamientos de exceso de fosfatos se crecieron las

plantas en medio hidropónico Yoshida preparado con la concentración de 10X de las fuentes

de fosfatos.

5.8 Análisis histoquímico de la actividad GUS

Los ensayos para la detección histoquímica de la actividad β-glucuronidasa (GUS) se

realizaron sobre las plantas de arroz portadoras del transgén que contiene la región

codificante del gen GUS bajo el control del promotor de OsCPK13, siguiendo el siguiente

protocolo.

- Crecer las plantas en hidroponía con medio Yoshida en condiciones de esterilidad,

durante 14 días (o según el tratamiento de interés).

- Fijar la actividad GUS de las plántulas de arroz sumergiéndolas en acetona al 90% a

4ºC durante 20 minutos.

- Eliminar la acetona y lavar 3 veces las plántulas con agua mQ.

- Infiltrar al vacío las plántulas con tampón GUS durante 15 minutos e incubar a 37ºC

durante 16 horas en oscuridad.

- Retirar el tampón GUS y lavar las plántulas varias veces con alcohol etílico al 70%

hasta que el color verde de las hojas haya desaparecido.

- Visualizar directamente la tinción de las hojas bajo lupa o realizando

microdisecciones de los tejidos con un vibratomo.

5.9 Detección y análisis de la producción de ROS

5.9.1 Análisis histoquímico para la detección de superóxido (O2-) por tinción con NBT

Los tejidos de arroz se sometieron al tratamiento para evaluar la presencia de iones

superóxido (O2-) según el siguiente protocolo.

- Incubar las secciones de hojas en una solución de tampón fosfato de potasio (pH

7,8) y azida sódica, ambos a una concentración de 10 mM.

- Infiltrar al vacío durante 10 min.


- 251 -

- Extraer los tejidos y sumergirlos en una solución fresca de tampón fosfato potásico

(pH 7,8) 10 mM y NBT al 0,1%.

- Infiltrar durante 15 minutos mediante vacío e incubar toda la noche a temperatura

ambiente.

- Un precipitado azul ha de formarse por la reacción entre el NBT y el O2- en

presencia de azida sódica, observable en hojas desprovistas de clorofila.

- Fijar el precipitado azul mediante incubación en una solución 2:1:1 de etanol:ácido

láctico:fenol durante 30 min a 65ºC.

- Clarificar las hojas lavando 2 veces en alcohol etílico al 50% y 2 veces en agua.

- Visualizar bajo lupa.

5.9.2 Detección de ROS por fluorescencia de CM-H2DCFDA

El tratamiento para evaluar la presencia de moléculas ROS en tratamientos con

elicitores, utilizando el compuesto CM-H2DCFDA, que es fluorescente en presencia de esas

moléculas, fue el siguiente.

- Incubar las secciones de hojas en la solución de CM-H2DCFDA en PBST a una

concentración de 10 μM e infiltrar al vacío durante 1 h.

- Lavar en PBST y tratarlos o no con una suspensión de elicitores de M. oryzae a una

concentración de 300 μg/ml durante el tiempo necesario.

- Visualizar bajo microscopio de fluorescencia GFP.

5.9.3 Cuantificación del contenido de H2O2

Los ensayos para la cuantificación del contenido de peróxido de hidrógeno se

realizaron sobre plantas crecidas in vitro, siguiendo el siguiente protocolo.

- Se pesan 50 mg de tejido fresco.

- Se añaden en frío 500 μl de TCA al 0,1% p/v y se mantienen en hielo.

- Centrifugar durante 15 minutos a 4ºC y 13.000 rpm.

- Extraer el máximo e igual volumen de sobrenadante para cada muestra.

- Agregar al mismo volumen de tampón fosfato-sodio 10 mM pH 7,5.

- Añadir el doble de volumen de ioduro de potasio fresco 1 M.

- Medir la absorbancia OD(390nm) y calcular el contenido de H2O2 utilizando el

coeficiente de extinción E=0,28 μM-1cm-1 y la fórmula μMH2O2=A/(0,9.E).


- 252 -

- Referir al peso inicial para obtener el resultado en μM de H2O2 por mg de tejido.

5.10 Análisis del contenido de fósforo en tejidos de plantas de arroz

El contenido de fósforo en tejidos de plantas de arroz fue realizado por colorimetría

mediante el protocolo adaptado de Plank (1992) y Ames (1966).

Reactivos:

HNO3 concentrado H2O2 30% Ácido ascórbico 10% Molibdato de amonio diluído en ácido sulfúrico 1N, al 0,42% KH2PO4 1000 mgP/l Agua mQ

Destrucción de materia orgánica (digestión húmeda rápida):

- Enjuagar el tejido con agua y secar con papel absorbente.

- Congelar el material en N2 líquido, triturar con mortero y homogeneizar. Secar el

material triturado a 80ºC por 3 días.

- Pesar 50-100 mg de material seco y ponerlo en un recipiente de vidrio resistente al

calor.

- Bajo una campana de extracción añadir 1 ml de ácido nítrico concentrado por cada

50 mg de muestra y digerir la muestra en un microondas durante 3 minutos a 30%

de potencia (210 watts) hasta que la muestra esté seca.

- Dejar enfriar el recipiente y añadir 3 ml de peróxido de hidrógeno al 30%

enjuagando las paredes. Digerir durante 2 minutos a 60% de potencia (390 watts)

hasta que la muestra esté completamente seca.

- Agregar a la muestra aún caliente 5 ml de agua mQ y disolver por vortex.

- Filtrar la solución con papel Whatman #1. Esta muestra puede utilizarse para el

análisis del contenido de fósforo por colorimetría.

Preparación de una curva estándar de contenido de P:

- Se prepara una solución stock de KH2PO4 a una concentración de 1000 mgP/l:

disolver 0,439 g de fosfato de monopotasio en agua mQ y diluir en 100 ml.

- Diluir esta solución a concentraciones de 20, 40, 0, 80 y 100 mgP/l, además de una

muestra con 0 mgP/ml.


- 253 -

- Determinar la curva estándar del contenido de fósforo por colorimetría utilizando

estas muestras.

Determinación del contenido de fósforo por colorimetría:

- Transferir una alícuota de 50 μl de la muestra a un tubo de polipropileno de 1,5 ml y

ajustar el volumen a 300 μl con agua mQ.

- Preparar una solución de 1 parte de ácido ascórbico al 10% y 6 partes de molibdato

de amonio.

- Añadir 700 μl de esta solución a la muestra, homogeneizar con vortex e incubar

durante 30 minutos a 42ºC.

- Medir la OD(820nm) en un espectrofotómetro. El color es estable por varias horas.

- Referir cada muestra a la curva estándar de concentración conocida.

6. Obtención de líneas transgénicas de arroz

Se obtuvieron líneas transgénicas de O. sativa cv. Tainung67 mediante el protocolo

de transformación de callos embriogénicos mediado por A. tumefaciens basado en el

descrito por Hiei et al. (1994) y puesto a punto por el Institute of Molecular Plant Science

(Universidad de Leiden, Holanda) y por la UMR DAP del CIRAD, Montpellier, Francia. El

protocolo seguido se detalla a continuación y se resume en el esquema de la Figura 77.

6.1 Inducción de callos embriogénicos

- Semillas esterilizadas superficialmente según el protocolo mencionado previamente

son puestas en condiciones de esterilidad sobre placas altas de cultivo celular

Greiner Bio-one® de 100 mm x 20 mm con medio NB, a razón de 12 semillas/placa.

Se dejan las placas abiertas bajo el flujo laminar con el fin de evitar exceso de líquido

y luego se cierran con Parafilm®.

- Se incuban las placas a 28ºC en oscuridad durante 4-5 semanas. Luego de ese

periodo se habrán formado callos primarios pequeños (de 0,5-2 mm), compactos,

resistentes, esféricos y blanquecinos.

- Transferir estas unidades embriogénicas a una nueva placa de NB a razón de 50-70

callos/placa e incubarlas a 28ºC en oscuridad durante 10 días.


- 254 -

- Luego de 10 días estos callos se habrán desarrollado en unidades esféricas de 2-4

mm y con superficie rugosa, las cuales son utilizadas para la transformación

mediada por A. tumefaciens.

Semillas de arroz

Generación de callos

Co-cultivo A. tumefaciens

Callos transformados

Plantas regeneradas

Generación T0

a

b

c

d

e

f

Figura 77. Esquema del proceso de transformación de arroz a partir de callos embriogénicos via A. tumefaciens. Diagrama del proceso de transformación de callos de arroz. Las semillas de arroz se crecen in vitro en medio de inducción (a) para generación de callos embriogénicos (b), los cuales se co-cultivan con una suspensión de células de A. tumefaciens cepa EHA105 portadoras del vector de interés (c). Los callos son crecidos en medio selectivo para la identificación de callos transformados (d) que regeneran plantas de arroz transgénicas de la generación T0 (e-f).


- 255 -

6.2 Transformación de callos embriogénicos mediada por A. tumefaciens

- Inocular la cepa de A. tumefaciens EHA105 portadora del vector de transformación

deseado en 5 ml de medio YEB líquido con los antibióticos de selección adecuados

e incubar con agitación suave a 28ºC durante 12-24 horas.

- Inocular 200 μl del cultivo líquido en placas de medio YEB sólido selectivo con

antibióticos e incubar las placas durante 3 días a 28ºC.

- Con ayuda de una espátula estéril recoger el cultivo mocoso de Agrobacterium

crecido en la placa y resuspenderlo en 20 ml de medio R2 líquido. Medir la OD(600nm).

- Preparar 30 ml de suspensión de células bacterianas a OD(600nm) de 0,3 que es la

óptima para realizar el co-cultivo con los callos.

- Seleccionar 50 callos para ser transformados, pasarlas a una placa de Petri vacía y

añadir los 30 ml de suspensión de Agrobacterium. El co-cultivo se incuba durante 15

minutos, removiendo cada 3 minutos.

- Secar los callos haciéndolos rodar suavemente sobre un papel de filtro Whatman

CHR1 esterilizado y seco en flujo laminar durante 2 minutos. Repetir este proceso de

secado 5 veces.

- Una vez secos los callos se pasan a placas altas de medio R2 sólido a razón de 10

callos/placa y se mantienen a 24ºC durante 3 días en oscuridad.

6.3 Selección de callos transformados y regeneración de plantas transgénicas

- Pasar los callos que has sido co-cultivados a placas altas de medio R2 selectivo

sólido, el que contiene el antibiótico de selección higromicina.

- Mantener los callos en condiciones de oscuridad y a 28ºC durante 2 semanas. En

caso de contaminaciones por presencia de Agrobacterium, pasar a una placa nueva

los callos limpios y eliminar los contaminados.

- Luego de las 2 semanas se pasan los callos a placas altas de medio NBS sólido y se

incuban a 28ºC en oscuridad durante otras 2 semanas.

- Los callos primarios transformados se van necrosando, pero producen callos

secundarios que crecen sobre el mismo. En el periodo de 2 semanas cada 5 días se

disgregan estos callos secundarios alrededor del callo primario para favorecer su

crecimiento.


- 256 -

- Se seleccionan callos secundarios pequeños (de 0,5-2 mm), compactos, resistentes,

esféricos y blanquecinos para regenerar plantas transgénicas. Transferirlos a placas

altas de medio P-RN sólido e incubarlos en oscuridad a 28ºC durante 10 días.

- Pasar los callos a placas altas de medio RN sólido a razón de 10 callos/placa e

incubarlos a 28ºC en oscuridad durante 2 días y luego en régimen de luz 16h/8h de

luz/oscuridad durante 3-4 semanas.

- Los callos que han regenerado pequeñas plantas completas, con parte verde y raíces

formadas, se transfieren a tubos de cultivo In vitro de 5 cm de diámetro con medio

de cultivo P para enraizamiento y se mantienen a 28ºC en las mismas condiciones

de luz.

- Una vez que las plantas hayan desarrollado un buen sistema radicular y parte aérea

se trasplantan a tierra en condiciones normales de invernadero.

- Luego de 4 semanas se toman muestras de las hojas de cada planta y se realiza un

análisis genómico de inserción de T-DNA para confirmar la transgénesis.

7. Métodos informáticos

7.1 Bases de datos consultadas

Las bases de datos consultadas fueron las relacionadas con: secuencias del genoma

de arroz, secuencias y estructuras de miRNAs y dianas de miRNAs.

- Rice Genome Annotation Project: http://rice.plantbiology.msu.edu/ (Kawahara et al.

2013).

- miRBase: www.mirbase.org (Kozomara & Griffiths-Jones, 2014).

- TARBase:http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=tarbase/

index (Vlachos et al., 2014).

- Uniprot: http://www.uniprot.org/

7.2 Análisis de promotores

Para el análisis de las secuencias promotoras en esta tesis se han tomado los 1500

pb antes del inicio de la transcripción, además de las secuencias 5’ UTR de genes y las

secuencias ubicadas entre el inicio de la transcripción y el inicio del precursor para los

miRNAs. Estas secuencias se han sometido al análisis en la búsqueda de elementos


- 257 -

reguladores en las plataformas bioinformáticas en línea PlantCARE:

http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ (Lescot et al., 2002) y/o PLACE:

http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/ (Higo et al., 1999), según lo indicado para cada

experimento. Para el análisis del sitio de inicio de transcripción se utilizó la plataforma en

línea Softberry y su programa de predicción del inicio de la transcripción: www.softberry.com

(Shahmuradov et al., 2003).

7.3 Tratamiento de secuencias y construcción de árboles filogenéticos

El alineamiento de las secuencias se realizó en la plataforma bioinformática en línea

MultAlin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/), según el caso utilizando la secuencia

genómica o de los tránscritos. Para la construcción de árboles filogenéticos se tomaron las

secuencias de los tránscritos de los genes y se alinearon como se ha descrito. Este

alineamiento se ha utilizado en el programa bioinformático SeaView (Gouy et al., 2010) y se

ha corrido el programa de construcción de árboles según el método PhyML (Guindon et al.,

2010). Para realizar la predicción de estructura secundaria de precursores de miRNAs se

utilizó el servidor en línea del programa bioinformático RNA-fold web server

(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi).


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