TECNICAS PARA EL CULTIVO DE HELECHOS

A PARTIR DE SUS ESPOROS

POR JUAN JOSE VALLA *

SUMMARY

The author describes a technique to grow ferns starting from spores. Thespecies used are Pteris crética, Asplenium nidus, Adiantum raddianum and Platy-cerium alcicorne.

Los gametofitos de heléchos (protalos) son utilizados a menudo en lasclases prácticas de biología ya 'que proveen un excelente material didácticoy experimental (Miller, 1968).

Por otra parte son numerosos los interesados que nos consultan a me¬nudo sobre las técnicas a seguir para cultivar estas plantas a partir de losesporos, por lo que hemos creído que sería útil dar a conocer el métodoque seguimos en nuestro laboratorio y que es también, con algunas modi¬ficaciones, el que practican los cultivadores profesionales.

Entre las especies ensayadas están Pteris crética L., Asplenium nidus L.,Adiantum raddianum Presl y principalmente, Platycerium alcicorne Desv.A esta última pertenece el material fotografiado para este trabajo.

La cosecha de esporos se realiza al tomar los soros color castaño y cuan¬do al ser rozados suavemente con los dedos, los esporos caen en forma deun fino polvillo que se adhiere a la piel. Se procede entonces a cortar lafronde o parte de ella, envolviéndola en un sobre de papel liso que seguarda en un lugar seco y ventilado hasta que se produzca la dehiscenciade los esporangios.

Para eliminar de las frondes los esporos contaminantes, se ha recomen¬dado el tratamiento con hipoclorito de sodio al 5-10 % durante 5 a 10segundos, agregando un agente mojante ( Kleinschmidt, 1957).

Para verificar la viabilidad de los esporos y observar las primeras etapasde la formación de protalos, se prepara una pequeña caja de plástico trans¬parente y de fondo plano, en la que se coloca un trozo de papel de filtrobien humedecido sobre el que esparcen los esporos. Se tapa bien para evitar

* Cátedra de Botánica. Facultad de Agronomía y Veterinaria de Buenos Aires.

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la desecación y se incuba a 23-28° C. Se debe asegurar una iluminaciónde aproximadamente 300 f.c. durante 8 a 10 horas por día. A partir delsegundo día se puede observar la germinación. Para ello se destapa la cajay se coloca sobre la platina del microscopio, que se mantendrá horizontaly se usa el objetivo corto. El fondo transparente de la caja y el papel tras¬lúcido permiten ver los primeros estadios del proceso: aparición del primerrizoide de color castaño y las primeras células,con cloroplastos de la etapafilamentosa. Para una observación más detallada se levantan los esporosgerminados con una aguja muy fina o, mejor aúnfinamente adelgazado al que se adhieren conuna gota de agua puesta sobre un portaobjeto. Se cubre y observa ( foto 1).Podrá notarse que poco antes de la germinación coalescen las gotitas degrasa contenidas en el esporo. A los doce días el filamento presenta el as¬pecto mostrado en la foto 2.

Aproximadamente a los 20 días comienzan las divisiones que produci¬rán la laminación del protalo en las células terminales del filamento(foto 3).

A partir de este momento deberá observarse “in situ”, ya que los rizoi- - ,

des sujetan los protalos al papel impidiendo levantarlos.Para hacer la siembra definitiva, se preparan bandejas de chapa de alu¬

minio de 1 mm o más de espesor para asegurar su rigidez y cuyas medidasaproximadas serán de 20 X 40 X 5 cm, lo que facilita su manipuleo. Siel cultivo se hace correctamente, una caja de estas dimensioñes puede pro¬ducir alrededor de 10.000 plántulas. Si sólo se desean producir unos pocoscientos de protalos se pueden usar cajas circulares de aluminio de 8 a10 cm de diámetro y 5 cm de altura. Debe agujerearse el fondo de lascajas para asegurar el drenaje. .

Los mejores sustratos que hemos experimentado, son la mezcla en par¬tes iguales de tierra humífera y turba y también la resaca de río, librede cuerpos extraños. Es importante una humedad adecuada y esto se puededeterminar empíricamente cuando después de comprimir un puñado delmaterial, éste,mantiene su forma sobre la palma de la mano pero se des¬integra al apretar ligeramente con los dedos. Cualquiera sea el medioelegido se lo tamiza a través de una malla de alambre de 1 cm. El materialque atraviesa esta zaranda se vuelve a tamizar con una malla de 1,5 a2 mm. La parte que no pasa por esta malla se distribuye en el fondo de labandeja o caja comprimiendo y nivelando con una tablita hasta que alcance2,5 cm de altura. Luego se distribuye una capa de 1 cm de espesor de lamezcla que pasó por la malla fina y se comprime y nivela con cuidado.

Sobre la superficie así preparada se esparce una ligera capa de musgofinamente molido. El musgo se puede moler en un pequeño molino de mar¬tillos o frotándolo hasta desmenuzarlo sobre el cedazo de alambre de mallafina y utilizando el material que pasa por él. Es conocida la acción fungos-tática de los musgos y el agregado de esta capa previene en gran medidala enfermedad de los almácigos ( Damping-off ). Si bien se pueden usar

i, con un palillo de maderafacilidad, trasladándolos a

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fungicidas de pre-emergencia (Carbamatos o derivados de la quinoleína,etc.), éstos suelen afectar la viabilidad de los esporos.

Las bandejas se llevan luego al autoclave, esterilizando a 105° C du¬rante 15 a 20’. Si no se dispone de autoclave, se puede utilizar una ollaa presióq y hasta puede esterilizarse parcialmente en un horno de cocinamantenido con llama baja, hasta que la temperatura de la mezcla llegue a95-100° C. Al sacarse las cajas, se cubren con una lámina de vidrio con loque se disminuye el riesgo de recontaminaciones. De inmediato se hume¬dece la tierra colocando las bandejas en una cubeta algo más grande queellas y en la que se vierte agua, preferiblemente de lluvia, la que subirápor capilaridad hasta la superficie.

Para sembrar y siendo los esporos casi invisibles a simple vista, lo quedificulta su observación sobre el lecho de siembra, se procede así: se tomauna hoja de papel blanco que tenga la forma de la superficie a sembrary se la moja por inmersión en una cubeta con agua, dejando escurrir elexceso. Con un pincelito de cerda se toman los esporos del sobre en quese coleccionaron y manteniéndolo a 15-20 cm sobre la hoja de papel hú¬medo, evitando las corrientes de aire, se golpea muy suavemente el mangoy de este modo la caída y distribución de los esporos puede verse porcontraste con el fondo blanco. Si es preciso se observa con una lupa demano. Es conveniente ensayar con anterioridad esta operación estimandoal mismo tiempo la densidad de siembra. Después de pocas experienciasse adquiere la práctica necesaria.

A unos 2 ó 3 cm del lecho de siembra se dispone una rejilla construidacon alambres muy finos sujetos a un marquito y utilizándola a modo deapoyo, se coloca la hoja de papel con la cara que lleva los esporos haciaabajo y se la deja así hasta que seque completamente, lo que produce lacaída de los esporos en forma tan pareja como lo estaba en el papel. Lacaída total se asegura golpeando la hoja repetidamente con un lápiz.

Los recipientes sembrados se cubren con el vidrio y se colocan en unahabitación templada ( 20-25° C) y a 30 cm de altura se ubica un tubofluorescente de 40 W con reflector de hoja de aluminio, que se mantendráencendido durante 14 a 16 horas diarias. Esta fuente provee aproximada¬mente 300 f.c. sobre el lecho de siembra. En nuestro laboratorio hemosusado también lámparas El.P.L. de vapor de mercurio pero son muchomás costosas. En ambos casos la intensidad lumínica es suficiente paraurt buen crecimiento. Para evitar corrientes de aire o cambios bruscosde temperatura, es conveniente cubrir la fuente de luz y las bandejas conuna lámina de polietileno que se sostiene sobre un armazón de varillasde madera.

A las dos semanas de la siembra, los filamentos verdosos pueden versea simple vista. Como los rizoides los mantienen adheridos al sustrato yase los puede rociar con agua de lluvia, usando un pulverizador. A partir deeste momento es importante rociar un poco varias veces al día, evitándose

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Fotos 1-6. — Plalycerium alcicorne Desv. : 1, esporo germinado a los 5 dias de la siem¬

bra (X lid) : 2, ídem, a los 12 dias (X 50) ; 3, primeros estados de la laminación del

filamento, 22 dias de cultivo (X 200) ; 4, protalo con anberidios maduios cerca de ia

zona de los rizoides, 80 dias. (X 20) ; 5, anteridio maduro con espermatozoides mó¬

viles en su interior, 80 dias. (X 500) ; 6, espermatozoide « in vivo». La exposición

prolongada de la fotografía impide una mejor definición (X 1-000 aprox-. ).

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la marchitez y asegurando más adelante la película de agua necesaria paraque los espermatozoides alcancen los arquegonios.

Para observar protalos con anteridios maduros, se toma material deestos cultivos de unos 80 días de edad. Trabajando con lupa se puedenlevantar los protalos individualmente para ser montados en un portaob¬jeto sobre una gota de agua. Se cubre y examina al microscopio ( foto 4 ) .Cuando el cultivo llega a esta edad, es común hallar anteridios con esper¬matozoides móviles en su interior (foto 5).

Si se desea aislar espermatozoides, se elige un cultivo que haya perma¬necido entre 24 y 48 horas sin riego y se levantan con agujas unos cuan¬tos protalos sumergiéndolos en agua destilada ( 3 ó 4 gotas sobre un por¬taobjeto limpio). La elevada presión osmótica del anteridio determinauna rápida absorción de agua y la presión de turgencia produce su aper¬tura en pocos minutos, liberando los espermatozoides.

Con una pipeta Pasteur o una micropipeta se saca una gota de líquido,se monta y se observa al fnicroscopio. La foto 6 fue tomada del materialvivo y debido al tiempo de exposición requerido, la imagen pierde nitidezaunque permite reconocer la forma del espermatozoide y la presencia delos flagelos. Las técnicas corrientes de fijación y tinción posibilitan la ob¬servación detallada.

Para demostrar,el quimotactismo de los espermatozoides, se llevan a unportaobjeto dos o tres gotas del líquido que los contiene, obtenido de lamanera descripta. Se hace un capilar de vidrio lo más estrecho posible yse lo corta en fragmentos de cuatro a cinco centímetros. Estos capilaresse llenan con una solución de maleato de sodio al 0,1 % y uno de sus extre¬mos se sumerge en el borde de la gota que se tiene en el portaobjeto,dejando descansar al resto del tubo en la parte seca y se observa al mi¬croscopio, sin cubrir y con reducido aumento. Los espermatozoides se diri¬gen hacia la boca del capilar siguiendo el gradiente de concentración yse los puede ver en mayor cantidad alrededor del tubo. Es probable hallarespermatozoides que hayan penetrado en el capilar pero esta observaciónes más dificultosa debido a la refracción' que producen las paredes del tubo.

La observación de los arquegonios se puede hacer montando los prota¬los de la manera ya déscripta. El momento de su aparición varía conside¬rablemente con las distintas especies y condiciones de cultivo por lo quese determinará en forma tentativa.

Las primeras hojas de los esporofitos aparecen por sobre la masa de pro¬talos entre los 4 a 6 meses a partir de la siembra. En este momento seprocede a trasplantar a otra bandeja preparada como la anterior. Se hume¬dece bien el almácigo, se deja drenar el exceso de agua durante 12 horas

. y se van levantando los protalos con los jóvenes esporofitos con ayuda delancetas de histología o palillos de madera. No es preciso separarlos indi¬vidualmente sino que se toman pequeños grupos de 5 a 10, dependiendode la densidad del cultivo. Estos grupos se disponen ordenadamente enla nueva bandeja, separándolos 1 cm en todo sentido. Coñ la misma herra-

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mienta se hace una pequeña depresión en la tierra y allí se colocan lasplantitas. Se da un riego abundante y muy fino para asentarlas, se cubrecon vidrio y se colocan nuevamente en las condiciones anteriores. Si sedispone de un invernáculo sombreado con temperatura no inferior a 15° C,se pueden llevar a él. Aproximadamente a los 4 a 6 meses de hecho elprimer trasplante se puede hacer otro, separando individualmente las plan-titas. Aquellas cuyas frondes midan más de 3 cm ya pueden ponerse enmacetas individuales de 4 ó 6 cm de diámetro, empleando las mezclas yacitadas pero sin necesidad del tamizado fino. El medio debe esterilizarsecon vapor de agua para eliminar los parásitos. Si se dispone de ellas, sonmuy útiles las macetas de turba conocidas comercialmente como “JiffyPots”. A medida que las plantas crecen, se cambian a macetas de ma¬yor tamaño.

Si se cultiva Platycerium alcicorne Desv., siendo esta especie epífita,crece muy bien sobre la fibra utilizada para cultivar orquídeas (Osmunda

sp, o Dicksonia sp.) a condición de recibir periódicamente un abono mi¬neral disuelto en el agua de riego, pudiendo usarse la solución de Hoaglandu otra similar.

Para la diagnosis y tratamiento de las enfermedades y plagas de losheléchos, consultar Pirone et al., 1960.

BIBLIOGRAFIA

KLEINSCHMIDT, W. F., 1957. A method of preparing spores for fern cultures. Arner.Fern Journ. 47: 95-98.

MILLER, J. H., 1968. Fern gametophytes as experimental material, hot. Rev. 34 (4):361-440.

PIRONE, P. P., B. O. DODGE and H. W. RICKETT, 1960. Diseases and Pests of Orna¬mental Plants. Ronald Press. Co. N. York.

STOKEY, A. G. and L. R. ATKINSON, 1954. The gametophyte of five species of Platy¬cerium. Phytomorphology 4 (1-4): 165-172, il.