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Práctica 2. Centrifugación

A. Objetivos

1. Analizar las bases teóricas de la Centrifugación y la utilidad de esta herramienta para su correcta aplicación en estudios, métodos y operaciones bioquímicos.

2. Aplicar correctamente la centrífuga clínica para la obtención de suero, plasma y % de hematocrito.

B. Investigación previa

1. Elaborar un cuadro sinóptico con la información sobre las principales técnicas físicas,

métodos y los enfoques de estudio bioquímicos, que se indican en la siguiente

bibliografía: Murray, K. R. et al., 2001. Biomoléculas y métodos bioquímicos. Cap. 2, páginas 9-14, cuadros 2-5, 2-6 y 2-7 y las figuras 2-2 y 2-3.

2. Elaborar un cuadro-resumen con información sobre la estructura y modo de acción de los anticoagulantes más utilizados (Sugerencias: i)

http://labbioq.blogspot.mx/2010/10/anticoagulantes.html , ii) Coles, 1989 y iii) Benjamin, 1991).

3. Investigar los valores normales o de referencia de hematocrito en las siguientes especies animales: bovinos, ovinos, pollos y cerdos y el hombre.

4. Investigar casos en animales, en los que se presenta alteración del hematocrito. 5. Definir las siguientes palabras clave: sobrenadante, tipos de centrifugación, rotor,

centrifugación diferencial, sedimentación, coeficiente de sedimentación, nomograma,

obtenidas a partir de la información contenida en el documento ubicado en el siguiente sitio: a) Biología celular. Módulo 1, Sección 1.3.2. Disponible en

http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/programacell.htm . Recuperado el 17 de enero de 2016.

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C. Introducción La Bioquímica es una disciplina experimental que pretende describir la estructura, organización y funciones de las moléculas que forman a los seres vivos, así como los

procesos que dirigen su degradación y síntesis, en este sentido la Centrifugación es una herramienta muy útil, pues permite separar células, organelos y biomoléculas, en virtud

de sus diferentes tamaños, pesos e inclusive formas, al someterlas a determinadas fuerza de gravedad y velocidad relativamente altas. El campo centrífugo (G), es la fuerza responsable del empuje que del centro a la periferia

experimentan los cuerpos que se mueven en una trayectoria circular, lo que ocasiona que un determinado peso sea desplazado en dirección radial hacia fuera y sedimente. G está

determinado por la velocidad angular (w, rad s-1) del rotor y la distancia radial (r, cm) de la partícula al eje de rotación, de acuerdo a la ecuación 1:

rwG 2 (1)

Si en la ecuación (1) se sustituye el valor de velocidad angular del rotor (w) en

revoluciones por minuto (rpm), [60

2 rpmw

], queda la ecuación (2):

(2)

rrpmxrmpr

FCR 2522

)(1011.1)980)(3600(

.)..(4...

(3)

3600

)(4 22 rrpmG

El campo centrífugo (G) es expresado generalmente en múltiplos de la aceleración de la gravedad (g, 980 cm s-2) y se

conoce como Campo Centrífugo Relativo (RCF), que se expresa en la ecuación (3).

( 3 )

Si en la ecuación (3) se sustituye el valor de , el RCF se

obtiene multiplicando el valor 1.11 x 10-5 por la velocidad de

centrifugación al cuadrado y por el radio del rotor (r), (Ec. 4).

RCF= 1.11 x 10-5 (rpm)2 r (4)

De tal forma que si consideramos una velocidad del rotor de 10 000 rev min-1 y el radio de rotación o distancia radial “r” como 5 cm, entonces al sustituir en la ecuación 4, queda que el RCF

es 5 550 veces la aceleración de la gravedad (5 550 g).

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Nomograma

Las gráficas denominadas nomogramas, son recursos que permiten calcular el RFC, combinando tres variables en forma de columna, de manera que relacionando dos de

ellas, es posible conocer la tercera. El nomograma utilizado en la centrifugación (Figura 1), relaciona, el RCF, la velocidad del rotor (rpm) y el radio promedio de rotación (r, cm),

de manera que si se conocen, el radio y la velocidad, es posible estimar a partir de estos, el campo centrífugo relativo (RCF) aplicado. En la figura 1 se indica que un RCF cercano a 600 g se puede conseguir con un rotor de 6 cm de radio y una velocidad de 3 000 rpm. El

valor de RCF se puede confirmar, si se sustituyen los datos de radio y velocidad en la ecuación 4.

En función de la magnitud del RCF, las centrífugas se clasifican en: centrífugas clínicas (500 – 4 000 g), super centrífugas (4 000 - 20 000 g) y ultra centrífugas (30 000 - 500 000 g).

Figura 1. Nomograma que relaciona el radio, el campo centrífugo relativo, RCF y la velocidad del

rotor. (Williams B. y K. Wilson, 1976. Principles y Techniques of Practical Biochemistry. London: E.

Arnold).

En la figura 2 se presenta un esquema para separar por centrifugación, los diferentes

componentes de un homogeneizado de tejido. Así, para obtener células enteras se deberá aplicar al homogeneizado un RCF de 600 g y para aislar mitocondrias, lisosomas y

peroxisomas, el RCF deberá ser aproximadamente de 20 000 g. En una centrífuga, las partículas a separar están normalmente en un medio líquido, contenido en un tubo o botella, que luego se coloca en un recipiente llamado “camisa”, el que se coloca en el

“rotor”.

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Figura 2. Esquema de centrifugación diferencial para un homogenado.

(http://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimica-s3).

Suero y Plasma

El suero sanguíneo es el líquido amarillento que se obtiene después de centrifugar a 600 g, la sangre sin anticoagulante (tubo con tapón rojo).

El suero sanguíneo se diferencia del plasma en que no

contiene Fibrinógeno, proteína implicada en la formación del coágulo. En el suero, el Fibrinógeno se transforma en fibrina, principal constituyente del coágulo. La formación del coágulo

está inhibida en sangre capilar o arterial, dado que éstas contienen anticoagulantes naturales. El suero o plasma

contienen diversos componentes nitrogenados como: proteínas, enzimas, anticuerpos, hormonas, factores de coagulación, ácidos nucleicos, así como moléculas nitrogenadas de bajo peso

molecular como urea, aminoácidos, glutatión entre otros, los que tienen la característica de que no son removidos al

adicionar un agente precipitante. Para obtener plasma, la centrifugación de la sangre se realiza en presencia de algún

anticoagulante como Etilendiaminotetracético (EDTA), citrato de sodio, oxalato de sodio o heparina, esto en función del análisis a realizar. Los tubos con tapón morado o “lavanda”,

contienen EDTA (Benjamin, 1981). El líquido amarillento obtenido después de centrifugar a 600 g, representa el plasma sanguíneo. Debajo del plasma quedan sedimentados los glóbulos blancos, las plaquetas y

los glóbulos rojos.

Figura 3. Fracciones

resultantes de centrifugar sangre a 600g.

(www.ulcerayozono.com.ar) .

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Las precauciones y los procedimientos de conservación de suero/plasma varían en cada caso, según la naturaleza de la muestra y los parámetros que vayan a determinarse en

ella.

Aislamiento de fracciones subcelulares mediante gradientes

La separación de organelos del citosol para el posterior aislamiento de una biomolécula, constituye una etapa muy importante en los estudios bioquímicos. Los métodos a seguir

para la separación dependen del tipo de tejido y del tipo de ubicación del organelo o molécula en la célula.

Un primer paso a realizar es la separación, ésta requiere de la homogenización del tejido en un medio isosmótico y amortiguado. Este procedimiento deja a las células y organelos (núcleos, mitocondrias, lisosomas) casi intactos, de modo que aprovechando que estos

tienen diferente tamaño y gravedad específica, la separación entre ellos se puede lograr mediante una centrifugación diferencial o centrifugación isopícnica utilizando soluciones de

sacarosa, con lo que las partículas sedimentan con diferentes velocidades, ubicándose en diferentes zonas del gradiente produciéndose un fraccionamiento del contenido citoplásmico.

Mediante una cuidadosa separación del material de cada región del gradiente y su observación al microscopio es posible definir la posición de cada organelo y obtenerlos

purificados para posteriores estudios bioquímicos, como ubicación de proteínas, enzimas y rutas metabólicas. Sacarosa y Cloruro de Cesio (CsCl) son algunos de los materiales utilizados para separar

organelos mediante gradiente (http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Centrifugacion.pdf).

D. Material y Reactivos

Material y equipo

Centrífuga clínica con camisas para tubos de 13 x 100 mm, Balanza de dos platillos, Tubos

Eppendorf de 1 y 2 ml con gradilla, Piceta, Pipeta Pasteur larga (22 cm) y cortas, bulbo para pipeta Pasteur, Tubos Vacutainer de 5 ml con tapón rojo y con tapón morado

(lavanda), Tubo de Wintrobe de 0-100 mm, jeringas de 5 ml o agujas estériles.

Reactivos

Muestra de sangre

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E. Metodología

E.1. Procedimiento para usar la Centrífuga Clínica

3. Permitir que la centrífuga frene por sí sola. ¡No frenar manualmente!, pues se daña

el equipo y el material puede resuspenderse nuevamente. No abrir la centrífuga cuando esté en movimiento.

4. Al final, dejar limpias las camisas, colocarlas en su lugar, desconectar el aparato, acomodar el cable de forma segura y colocar la centrífuga en su lugar.

E. 2 Obtención de plasma sanguíneo (Coles, 1989, Bateman, 1970). 1. Extraer con jeringa, 3 cm3 de sangre y depositarla cuidadosamente en un tubo

Vacutainer CON anticoagulante (Tubo con tapón lavanda). Mezclar muy bien. 2. Medir el radio de rotación de la centrífuga y calcular la velocidad que se debe aplicar

para obtener un RCF de 600 g y centrifugar el tubo Vacutainer por 20 minutos. 3. Después de obtenido el plasma en el tubo Vacutainer, con ayuda de una pipeta

Pasteur, transferirlo (fase superior amarillenta) a un tubo de ensayo pequeño limpio y

seco. 4. Refrigerar el plasma a 4°C o guardar en congelación.

1. Los tubos conteniendo el material a centrifugar, se colocan en las camisas

apropiadas y utilizando una balanza de dos platillos, se equilibran en peso. Esta

operación deberá realizarse en pares. De no seguir esta indicación, se estará causando daño a la centrífuga. En la igualación de

peso, puede adicionarse agua entre la camisa y el tubo o si es posible, puede adicionarse

más del material a centrifugar al tubo que lo necesite.

2. Las camisas con los tubos, equilibradas en

peso, se colocan en el rotor o cabezal, una frente a otra dentro de la centrífuga y se inicia

la operación de la centrífuga. Esto deberá hacerse gradualmente, hasta alcanzar la velocidad requerida. Sí existen problemas de

vibración, repetir el balanceo de las camisas con los recipientes conteniendo las muestras.

Figura 4. Centrífuga y rotor (color

azul) con camisas (color negro).

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E.3 Obtención de suero sanguíneo

E.4 Determinación de hematocrito (macrométodo)

1. Llenar un tubo de Wintrobe con sangre total con anticoagulante, aplicando la

sangre desde el fondo hasta la marca superior del tubo, teniendo cuidado de no formar

espuma. Para esta aplicación utilizar una pipeta Pasteur larga. 2. Centrifugar el tubo de Wintrobe por 15 minutos a 600 g.

3. Medir el nivel de la columna del paquete celular, directamente en el tubo graduado. Determinar el % de hematocrito. Comparar el resultado con el valor de referencia para el tipo de sangre empleada.

F. Cálculos y Resultados

1. Determinar el % de Hematocrito. Analizar la congruencia del resultado, mediante la comparación con el valor de referencia. [bovino: 24-46% (Mundo pecuario), hombre:

40.7-50.3 %]. 2. Con base en el % de Hematocrito, calcular el porciento de plasma en la muestra.

G. Autoevaluación

1. Dibujar y describir los componentes principales de la centrífuga. 2. ¿Cuáles son los principales métodos y técnicas bioquímicos empleados para estudiar a

la célula y al metabolismo celular?.

Figura 5. Tubos para obtención de plasma (tubo tapón morado) y suero (tubo tapón rojo). http://www.sanmarcovet.it/pagina.asp?m1=211&m2=1025

1. El suero se obtiene aplicando la misma técnica que para obtener plasma, solo que la sangre se deposita en un tubo

Vacutainer SIN anticoagulante, (tubo con tapón rojo).

2. La sangre se deja coagular a temperatura ambiente por 20 minutos y

se centrifuga por 20-30 minutos a 600 g. Posteriormente se separa el suero (fase superior amarillenta), se transfiere a un

tubo de ensayo seco y limpio y se

refrigera a 4°C o se congela.

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3. Respecto a los anticoagulantes: a) su mecanismo general de acción y c) el mecanismo de acción del EDTA. (http://biometriahematica.blogspot.mx/ y Benjamin, 1991)

4. ¿Qué proteína diferencia al suero del plasma?. 5. Explicar el efecto de la aplicación de un RCF de 600 g sobre a) sangre y sobre b) un

homogenado de tejido. 6. Explicar el resultado de aplicar un RCF de 5 000 g a un homogenado.

7. Describir dos casos en los que se presenta alteración en la concentración del hematocrito y su significado clínico.

8. Obtener el factor de 1.11 x 10-5 de la ecuación 4.

9. Describir los tipos de rotores y el tipo de rotor que se utilizó en la presente práctica. (http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Centrifugacion.pdf). Página 15.

10. Es posible separar membranas plasmáticas a partir de un homogenado de tejido, si se aplica un campo centrífugo relativo (RCF) de 20 000 g. Utilizando el nomograma, indicar dos condiciones de radio y velocidad del rotor con las que puede alcanzarse

este campo centrífugo relativo. 11. A partir de la ecuación correspondiente, calcular el RCF obtenido, si el radio del rotor

es 11 cm y la velocidad es 35 000 rpm. 12. Describir cómo centrifugaría un homogenado de músculo cardíaco para aislar

ribosomas, los que requieren 150 000 g.

13. Si se parte de 5 cm3 de sangre entera de bovino, teóricamente, ¿cuántos cm3 de plasma se deberán obtener?.

14. De acuerdo a la información sobre anticoagulantes, discutir qué anticoagulante es más adecuado para análisis bioquímicos.

15. Si el hematocrito es del 35%, ¿qué volumen de plasma se obtendrá, si se parte de 2

ml de sangre?. 16. Explicar si es mejor, el suero o plasma para realizar análisis químicos y bioquímicos.

17. En general, ¿cuál es el método correcto para conservar plasma sanguíneo y sangre entera, en caso de no utilizarse pronto?.

18. ¿Qué se indica en la referencia #4 (Cap. 5) respecto al tiempo de ayuno recomendado

para la toma de muestra de sangre?. ¿Qué metabolitos aumentan y cuales disminuyen durante el ayuno prolongado?.

19. Elaborar un glosario con términos relacionados con la presente práctica.

H. Bibliografía

1. Bateman, J. V. 1970. Nutrición Animal. Manual de Métodos Analíticos. México, D.F.: Herrero, Hnos. Los capítulos 3 y 14 son especialmente útiles para esta práctica, pues tratan información general del laboratorio. Algunos de los métodos empleados en

Bioquímica, son descritos en el capítulo 3. En el capítulo 14, se tratan algunos aspectos sobre la obtención y conservación de las muestras de sangre, que son de

interés para la presente práctica.

2. Benjamin, M. M. 1991. Manual de Patología Clínica en veterinaria. Caps 1,9. México: Editorial Limusa. El capítulo 1 contiene amplia información sobre los

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anticoagulantes más comunes, mientras que en el capítulo 9 se desarrolla el tema del hematocrito.

3. Coles, H. E. 1989. Diagnóstico y Patología en Veterinaria. 4ª Ed. México, D.F.:

Ed. Nueva Editorial Interamericana. El capítulo 1, expone el material básico para integrar un laboratorio clínico, así como las observaciones que deben seguirse para

obtener una muestra biológica procedente de un animal enfermo y como enviarla al laboratorio. El capítulo 6 incluye temas como: recolección y manejo correcto de muestras de sangre, de suero y plasma, filtración y centrifugación, uso de pipetas,

colorimetría y control de calidad, entre otros.

4. García, S. Y. 2009. Curso de laboratorio. Recuperado el 17 de enero de 2016 de: http://www.mailxmail.com/curso-laboratorio-obtencion-muestras/muestras-sangre-extraccion-procedimientos-previos.

5. Kaneko, J. 1989. Clinical Biochemistry of Domestic Animals. Ed. 4th. Academic Press.

6. Lehninger, A. L.; D. L. Nelson y M. M. Cox. 1995. The Cells. Principles of Biochemistry. Cap. 2. 2nd Ed. New York. N. Y.: Worth Publishers Inc.

7. Mathews, C. W., van Holde, K. E. y Ahern, K. G. 2002. Introducción a las proteínas: nivel primario de la estructura proteica. Herramientas bioquímicas.

Bioquímica. Cap. 5. 3ª ed. Madrid, España: Pearson Educación, S. A. 8. Montero, L. de G. (s/f). Métodos de centrifugación. Recuperado de

http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Centrifugacion.pdf. Consultado el 11 de enero de 2016.

9. Murray, R. K., P. A. Mayes, D. K. Granner y V. W. Rodwell. 2001. Bioquímica de

Harper. 15ª ed. México, D.F.: Editorial El Manual Moderno.