optimización del detector dad y resolución de … · ejemplos cálculo factor de similitud coef....
TRANSCRIPT
Optimización del Detector DAD
y Resolución de
Problemas Típicos de HPLC.
Isidre Masana
Especialista de Productos UHPLC/MS
Agilent Technologies
1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity
?
¿Algunas Soluciones a Problemas Típicos en HPLC?
¿Cómo Mejorar
Sensibilidad? ¿Cómo Resolver
Solapamientos?
¿Cómo Cuantificar
Simultáneamente
Trazas y Mayoritarios?
¿Cómo Reducir Tiempo
en la Preparación de
Tampones y Muestras?
¿El pico es Puro?
¿Detecto todas las
impurezas?
Página: 2
¿Transferencia de
métodos entre distintos
modelos?
?
¿Algunas Soluciones a Problemas Típicos en HPLC?
Soluciones con Detección DAD
¿Cómo Mejorar
Sensibilidad?
¿Cómo Resolver
Solapamientos?
¿El pico es Puro?
¿Detecto todas las
impurezas?
Página: 3
Sens. x10 con celda 60mm
con Tecnología Max Ligth
Optimizando Condiciones
Detección DAD
¿Cómo Cuantificar
Simultáneamente
Trazas y Mayoritarios?
¿Cómo Reducir Tiempo
en la Preparación de
Tampones y Muestras? ¿Transferencia de
métodos entre distintos
modelos?
Lámpara de
Tungsteno
Lámpara de
Deuterio
Lentes Filtro de
Óxido de
Holmio
Celda de
Flujo
Rendija
Programable
1 a 16 nm
Red
Holográfica
"Diode-Array"
de 1024
Elementos
190 nm
950 nm
Amplio
Rango de
Longitudes
de Onda
Verificación
Automática de
Longitudes de Onda
Optimización
Rápida de la
Sensibilidad y
Resolución
Excelente Resolución
Espectral
Tecnología compartida con
Espectrofotómetro UV/VIS Agilent-8453
Diseño Óptico DAD/MWD Agilent Series
(1090/1050) 1100/1200/1260 Infinity: Optimizado
para la Mejor Sensibilidad y Flexibilidad.
+30años Experiencia*
*1er DAD:1979 LC-DAD:1982 HP-1040
Página: 4
Ruído < 1x10-5AU
1 nm
8 nm
2 nm
4 nm
Rendijas más gruesas proporcionan mayor intensidad de luz, y en consecuencia mejor sensibilidad,
pero una menor resolución espectral. No obstante la anchura típica de las bandas espectrales en
disolución (30-60nm) se ve poco afectada por la utilización de p.e. rendijas de 8 nm.
Rendija
“slit” slit
Optimización de Sensibilidad / Resolución
Espectral con Rendija Programable
Página: 5
Espectro benceno
perfil NO habitual en LC
Resumen Optimización de Sensibilidad con Detectores “Diode Array – Agilent”
Ácido Anisídico
Ancho de Banda
al 50% de la altura
30 nm
Longitud de onda (nm)
mA
U
Longitud de Onda
Analítica
Ancho de Banda de Referencia
340 nm
100 nm
Longitud de Onda de Referencia
(lo más próxima posible a la analítica)
ÓPTIMO: - Rendija: 8nm (16)
- Señal: 255/30 Ref. 340/100
Página: 6
Influencia de la Frecuencia de Adquisición
de Datos en la Sensibilidad
Válido para cualquier tipo de detector HPLC / GC / CE
Ruido estadístico Detector α 1
n
n = número de puntos
promediados
Ventajas optimización: - Mejora sensibilidad sin pérdida resolución
- Ahorro de espacio de disco duro
- Reprocesado más rápido de los datos.
Tiempo (min)
2.3 seg
1.0 seg
0.3 seg
0.1 seg
0.1 mAU
Tiempo de
Respuesta
2.3 sec
1.0 sec
0.3 sec
0.1 sec
PeakWidth
(min) * S/N
0.1
0.05
0.01
0.005
6.1
3.7
1.8
1
* Utilizar un PK WD de adquisición
del orden del WIDTH (integración)
del pico más fino de interés
RSD% ~ 100 / (S/N)pico-pico
RSD%<1% >15 ptos./pico 1<RSD%<3% 12 ptos./pico RSD%10-12% 8 ptos./pico
?
¿Algunas Soluciones a Problemas Típicos en HPLC?
Soluciones con Detección DAD
¿Cómo Mejorar
Sensibilidad?
¿Cómo Resolver
Solapamientos?
¿Cómo Cuantificar
Simultáneamente
Trazas y Mayoritarios?
¿Cómo Reducir Tiempo
en la Preparación de
Tampones y Muestras?
¿El pico es Puro?
¿Detecto todas las
impurezas?
Página: 8
Sens. x10 con celda 60mm
con Tecnología Max Ligth
Optimizando Condiciones
Detección DAD
Espectralmente
¿Transferencia de
métodos entre distintos
modelos?
8-37m
SUPRESIÓN ESPECTRAL
del compuestos B
A
285 nm
con Ref. 325 Abs
tR
B A
285 nm
sin Ref. Abs
tR
285 325 Longiºtud de Onda
Analítica
Longitud de Onda
referencia
Longitud Onda (nm)
Ab
so
rban
cia
A
B B
260) (Referencia
alternativa
Resolución Espectral de Picos Cromatográficos
Solapados: ¿Cómo cuantificar A en presencia de B?
Longitudes Onda Analítica Referencia
Posibilidad de restar la absorbancia de una zona en
la que el compuesto interferente absorbe lo
mismo
Página: 9
nm 450 500 550 600 650 700
Norm.
0
200
400
600
800
1000
*DAD1, 4.292 (203 mAU,Apx) Ref=4.152 & 4.592 of 001-2801.D
*DAD1, 9.079 (1162 mAU, - ) Ref=8.706 & 10.952 of 001-2801.D
min4 6 8 10
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
DAD1 B, Sig=430,50 Ref=570,100, TT (COLO0219\001-2801.D)
E-1
32
E-1
04
E-1
24
E-1
29
E-1
33
min4 6 8 10
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
*DAD1, Sig=630.00, 30.00 Ref=590.00, 38.00 , EXT of 001-2801.D
min4 6 8 10
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
*DAD1, Sig=612.00, 30.00 Ref=645.00, 20.00 , EXT of 001-2801.D
Selectividad Agilent DAD’s: Supresión Espectral de Picos Utilizando Longitud de Onda de Referencia
Esta opción permite “Resolver
Espectroscópicamente Picos
Cromatográficamente Solapados”.
E-132
E-133
630 612 Ref: 590 Ref: 645
: 612/30 nm ref: 645/20 nm
: 630/30 nm ref: 590/38 nm
E-133
Suprimido
Espectralmente
E-132
Suprimido
Espectralmente
Página: 10
?
¿Algunas Soluciones a Problemas Típicos en HPLC?
Soluciones con Detección DAD
¿Cómo Mejorar
Sensibilidad?
¿Cómo Resolver
Solapamientos?
¿Cómo Cuantificar
Simultáneamente
Trazas y Mayoritarios?
¿Cómo Reducir Tiempo
en la Preparación de
Tampones y Muestras?
¿Detecto todas las
impurezas?
¿El pico es Puro?
Página: 11
Sens. x10 con celda 60mm
con Tecnología Max Ligth
Optimizando Condiciones
Detección DAD
Espectralmente
Detección DAD con Banda Ancha
¿Transferencia de
métodos entre distintos
modelos? 10-35m
WL 260 nm, BW 80 nm
WL 250 nm, BW 4 nm
WL 280 nm, BW 4 nm
4 5 6 Tiempo (min)
Anchos de banda de 80-100 nm permiten disponer de un detector "Universal”
- Muy útil en optimización composición del eluyente
- Detección de compuestos no esperados
(Debe ser > ó = anchura de la rendija seleccionada)
BANDA ANCHA
80nm.
BANDA ESTRECHA 4nm
Detección UV "Universal"
Detección DAD con Banda Ancha
Página: 12
min3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
50
100
150
200
250
DAD1 A, Sig=525,250 Ref=800,100, TT (COLO0219\001-2801.D) 3
.057
4.2
89
5.5
27
5.9
03
8.4
12
9.0
81
min3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
50
100
150
200
250
DAD1 C, Sig=430,50 Ref=570,100, TT (COLO0219\001-2801.D)
3.0
57
5.5
27
min3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
50
100
150
200
250
DAD1 D, Sig=512,50 Ref=650,100, TT (COLO0219\001-2801.D)
5.9
03
8.4
12
min3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
50
100
150
200
250
DAD1 E, Sig=620,60 Ref=750,100, TT (COLO0219\001-2801.D)
4.2
89 9.0
81
430/50 nm
512/50 nm
620/60 nm
Universalidad Agilent DAD’s: Utilizando Detección con Banda Ancha
nm400 500 600 700 800 900
Norm.
0
1
2
3
4
*DAD1, 9.059 (4.7 mAU,Apx) Ref=8.926 & 9.232 of 001-3001.D
*DAD1, 8.406 (2.9 mAU, - ) Ref=8.345 & 8.505 of 001-3001.D
*DAD1, 5.912 (1.2 mAU, - ) Ref=5.806 & 6.066 of 001-3001.D
*DAD1, 5.532 (1.4 mAU, - ) Ref=5.445 & 5.659 of 001-3001.D
*DAD1, 4.299 (1.1 mAU, - ) Ref=4.219 & 4.412 of 001-3001.D
*DAD1, 3.065 (1.5 mAU, - ) Ref=2.959 & 3.212 of 001-3001.D
E-132
E-104/102
E-124/129 E-133
400nm 650nm
E-102:Tartrazina
E-104: Amarillo Quinolina
E-124: Ponceau 4R
E-132: Carmín Índigo
525/250 nm: detecta todo lo que absorba entre 400 y 650 nm.
BANDA ANCHA
250nm.
Página: 13
?
¿Algunas Soluciones a Problemas Típicos en HPLC?
Soluciones con Detección DAD
¿Cómo Mejorar
Sensibilidad?
¿Cómo Resolver
Solapamientos?
¿Cómo Cuantificar
Simultáneamente
Trazas y Mayoritarios?
¿Cómo Reducir Tiempo
en la Preparación de
Tampones y Muestras?
¿Detecto todas las
impurezas?
¿El pico es Puro?
Página: 14
Sens. x10 con celda 60mm
con Tecnología Max Ligth
Optimizando Condiciones
Detección DAD
Espectralmente
Detección DAD con Banda Ancha
Pureza Espectral de un Pico
¿Transferencia de
métodos entre distintos
modelos? 13-32m
Consideraciones para la Determinación de la
Pureza Espectral de un Pico.
• El pico deberá estar bien integrado, o con un
umbral de mínima intensidad espectral
correcto y en un rango de long. Onda con
buena linealidad (no empiece a saturar detector). • Alternativa: definir arrastrando el ratón la zona del pico
para calcular su pureza.
• Si no se utiliza el cálculo automático del factor
de pureza mínimo, éste se deberá ajustar
correctamente. • p.e. tomando como referencia el factor
de pureza que den patrones a concentración
similar.
• En caso de picos impuros revisar en
que zona del pico y del espectro se produce
la desviación.
Se fundamenta en calcular la similitud de los espectros a lo largo del pico,
con uno (o varios) que se toman como referencia
Página: 15
Cálculo Pureza Espectral del Pico Ejemplos Cálculo Factor de Similitud Coef. Correlación = 0.999963
Factor de Similitud = 999.963
0
20
40
60
80
100
No
rma
liza
do
300 250
Longitud de Onda (nm)
Patr
ón (
mA
U)
300
200
100
0
0 100 50 150
Desconocido (mAU)
Desconocido
Patrón o
Espectro de
Referencia
0
20
40
60
80
100
No
rmalizad
o
Patr
ón (
maU
) o E
spectr
o d
e R
efe
rencia
250 300 350 400
Longitud de Onda (nm)
300
200
100
0
0 10 20 30
Desconocido (mAU)
Coef. Correlación = 0.056
Factor de Similitud = 56
Desconocido
Patrón o
Espectro de
Referencia
x1000
Página: 16
Cada nm. del espectro se
representa por un punto en
función de su absorbancia
entre los 2 espectros a
comparar.
La Importancia del Ajuste del Umbral de
Intensidad Espectral Mínima para Pureza
de Pico
• En un pico mal integrado y
con un “Threshold” espectral
excesivamente bajo es
habitual obtener “falsos picos
impuros”
0 100 80 60 40 20
2
1
0
2
3
0
2
4
0 2
5
0
2
6
0
2
7
0
3
3
0
3
2
0
3
1
0
280nm 100
80
60
40
20
0 300 250
Pa
tró
n
100
80
60
40
20
0
+ 220n
m
+ 3
0
0
+
+ +
+ + +
+ +
+
Patrón
Desconocido
Ajuste de regresión
lineal Coeficiente de correlación = 0.92399
Factor de Similitud = 923.99
+
220 280
83
83
Página: 17
Pureza Mínima calculada
automáticamente
Ejemplo picos Puro/ Impuros Espectralmente
Página: 18
Pico puro mal integrado
pero con umbral
intensidad espectral
correcto
Pico impuro: impureza
en la cola del pico
Arrastrando icono se define la franja del pico
para calcular su pureza cuando su umbral e
integración son incorrectos
?
¿Algunas Soluciones a Problemas Típicos en HPLC?
con Detección DAD
¿Cómo Mejorar
Sensibilidad?
¿Cómo Resolver
Solapamientos?
¿Cómo Cuantificar
Simultáneamente
Trazas y Mayoritarios?
¿Cómo Reducir Tiempo
en la Preparación de
Tampones y Muestras?
¿Detecto todas las
impurezas?
¿El pico es Puro?
Página: 19
Sens. x10 con celda 60mm
con Tecnología Max Ligth
Optimizando Condiciones
Detección DAD
Espectralmente
Detección DAD con Banda Ancha
Pureza Espectral de un Pico
30x Rango Dinámico con HDR-DAD
¿Transferencia de
métodos entre distintos
modelos?
19-26m
Incremento 30x del Rango Dinámico
Lineal para cuantificar en 1 sola
inyección compuestos a
muy distinta
concentración.
Agilent 1200 Infinity High Dynamic Range
(HDR-DAD) Solution
1260/1290 Infinity HDR-DAD
Página: 20
Combinaciones Dosis Fijas de Varios Principios
Activos (API) con Muy Distinta Respuesta: *from Roche
Switzerland
API 1
API 2
Sin la opción HDR-DAD se requerirán
2 inyecciones con distinto volumen
• Agilent 1200 (black): API 2: 10 ml injected
• Agilent 1200 (red): API 1: 100 ml injected
• Infinity HDR-DAD (blue): API 1 and 2
simultaneously: 70 ml injected
API 2: iny. 10 ml (API 1 baja resp.)
API 1: iny. 100 ml (API 2 satura detector.)
3 UA
7 UA
API 1+2: iny. 70 ml con HDR
Página: 21
Rango Dinámico x30 con HDR-DAD Combina 2 DAD‘s con celdas Max-Light de 3.7 mm y 60 mm
60 mm path-length
3.7 mm path-length
Cálculo de la señal combinada: 60 mm “ path-length“ para bajas concentraciones
3.7 mm “ path-length“ para altas concentraciones
Detector Signal
[AU/cm]
Conc
[µg/mL] 10 x mayor
sensibilidad
~3x mayor
límite superior
30x Rango Dinámico (HDR-DAD)
Página: 22
?
¿Algunas Soluciones a Problemas Típicos en HPLC?
Soluciones Cromatográficas
¿Cómo Mejorar
Sensibilidad?
¿Cómo Resolver
Solapamientos?
¿Cómo Cuantificar
Simultáneamente
Trazas y Mayoritarios?
¿Cómo Reducir Tiempo
en la Preparación de
Tampones y Muestras?
¿Detecto todas las
impurezas?
¿El pico es Puro?
Página: 23
Sens. x10 con celda 60mm
con Tecnología Max Ligth
Optimizando Condiciones
Detección DAD
Espectralmente
Detección DAD con Banda Ancha
Pureza Espectral de un Pico
30x Rango Dinámico con HDR-DAD
UHPLC y Flujos Elevados
¿Transferencia de
métodos entre distintos
modelos?
22-23m
•S: definirá la “sensibilidad” del analito a variaciones en la proporción de modificador orgánico.
•Valores típicos S: aumentan con el tamaño de la molécula
2-5 moléculas pequeñas / 10 moléculas grandes (péptidos) / 40 moléculas muy grandes (proteínas)
•Al aumentar el tamaño de la molécula aumenta su “sensibilidad” a cambios de composición del eluyente.
Flujos Elevados Mejoran la Capacidad de Separación con Gradientes
K‘ = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)
Parámetro dependiente de:
• Analito
• Modificador Orgánico
Volumen muerto de la columna
% de incremento de Modificador Orgánico Tiempo del gradiente (min)
Flujo (ml/min)
“Factor de Capacidad ó Retención” en Gradientes
Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8
4.6x50, 3.5µm
Gradiente 45 – 90% B en 3 y 2 min
Fase Móvil: A:25mM Na2HPO4 , pH 3
B: Metanol
Flujo: 2 y 3 mL/min
Temperatura: 35°C Muestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam
2. Dipyradamole 3. Nifedipina
4. Lidoflazina 5. Flunarizina
EJEMPLO - REDUCCIÓN TIEMPO ANÁLISIS: Reducir Tg Aumentando F
Al mantener TG x F = constante el perfil de la separación NO varía
1
2 3
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)
F = 2.0 mL/min
Tg = 3 min
3 min
1
2 3
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)
F = 3.0 mL/min
Tg = 2 min
2 min
Sí K’ aumenta el poder de separación aumentara. AUMENTAR el flujo aumentará capacidad de separación
Página: 24
Muestra de tranquilizantes
Columna: Porosa superficial
Poroshell-120 50 x 2.1mm, 2.7um
Flujo 3.5ml/min, ~ 700 bar Gradiente 2-92% ACN en 0.4min
T= 80 °C
0.095sec PW 0.140secPW
Agilent Poroshell: el poder de separación
de flujos elevados
Columnas Superficialmente Porosas: permiten muy
elevadas velocidades lineales con elevada
resolución y menor presión (↓40-50%) que las <2µm
0.5 s
Núcleo
Sólido
1.7um
} 0.5µm
2.7µm
Página: 25
10
se
gu
nd
os!!
2 s
eg
un
do
s!!
Ideales para UHPLC con
equipos de 400bars
?
¿Algunas Soluciones a Problemas Típicos en HPLC?
Soluciones Cromatográficas
¿Cómo Mejorar
Sensibilidad?
¿Cómo Resolver
Solapamientos?
¿Cómo Cuantificar
Simultáneamente
Trazas y Mayoritarios?
¿Cómo Reducir Tiempo
en la Preparación de
Tampones y Muestras?
¿Detecto todas las
impurezas?
¿El pico es Puro?
Página: 26
Sens. x10 con celda 60mm
con Tecnología Max Ligth
Optimizando Condiciones
Detección DAD
Espectralmente
Detección DAD con Banda Ancha
Pureza Espectral de un Pico
30x Rango Dinámico con HDR-DAD
UHPLC y Flujos Elevados
LCxLC
¿Transferencia de
métodos entre distintos
modelos?
26-19m
LCxLC: Cromatografía Bidimensional Exhaustiva
“Comprehensive 2D-LC“ and heart-cutting 2D-LC
“Comprehensive 2D-LC“ (LCxLC):
LC1
LC2
1st peak from
1st dimension
2nd peak from
1st dimension
3rd peak from
1st dimension
LC1
LC2
El eluyente completo de la primera columna se inyecta a
la 2ª columna y se analiza con gradientes muy rápidos,
un pico de la primera dimensión debe muestrearse al
menos 3 a 4 veces. El tiempo en la 2 ª dimensión coincide
con el de la recolección del eluyente y los picos se
reconstruyen mediante software.
Página: 27
Hardware LCxLC – Flexibilidad de Módulos
1ª Dimensión
2ª Dimensión
1290 Infinity
Binary Pump
1290 Infinity
Binary Pump
1290 Infinity
Autosampler or 1260
HiP Autosampler
Optional
1260/1290
Infinity Detector
1ª Dimensión
One or two
1290 Infinity
TCC
Optional
1260/1290
Infinity
Detector
1260/1290
Infinity detector
2ª Dimensión
1260 Infinity Binary or
Quaternary Pump
1260 Infinity
Capillary Pump 1260 Infinity
Autosampler
For 1st
dimension
chromatogram
and peak-
triggering
To monitor
waste-line
La mayoría de Bombas o Autoinyectores Agilent sirven en la 1st dimensión!
Casí todos los detectores están soportados!
La 2ª dimensión requiere una Bomba 1290 Infinity Binaria.
waste
Loop1
Loop2
2pos/4port-duo
Nueva vávula Agilent
2D-LC con 2 rutas de
flujo completamente
simétricas y vaciado a
contracorriente de
ambos “loops“.
Página: 28
Muy Sencilla y Rápida Programación Gráfica
del Gradiente de la 2ª dimensión.
Muy sencilla programación gráfica del
gradiente de la 2ª dimensión (operación muy
tediosa y laboriosa por procedimientos habituales)
Página: 29
?
¿Algunas Soluciones a Problemas Típicos en HPLC?
Soluciones Cromatográficas
¿Cómo Mejorar
Sensibilidad?
¿Cómo Resolver
Solapamientos?
¿Cómo Cuantificar
Simultáneamente
Trazas y Mayoritarios?
¿Cómo Reducir Tiempo
en la Preparación de
Tampones y Muestras?
¿Detecto todas las
impurezas?
¿El pico es Puro?
Página: 30
Sens. x10 con celda 60mm
con Tecnología Max Ligth
Optimizando Condiciones
Detección DAD
Espectralmente
Detección DAD con Banda Ancha
Pureza Espectral de un Pico
30x Rango Dinámico con HDR-DAD
UHPLC y Flujos Elevados
LCxLC SFC
¿Transferencia de
métodos entre distintos
modelos?
30-15m
Exceso Enantiomérico (impurezas): Típica Aplicación Farmaceútica “díficil”.
Mezcla Racémica: R- 1,1’-bi-2-naphthol y S– 1,1’-bi-2-naphthol
OH
OH
Column
ChiralCel OD-H, 4.6 ID x 250
mm, 5 µm (Chiral
Technologies)
Supercritical
Fluid
CO2
Modifier MeOH w. 0.1% TFA + 0.1%
DEA
Outlet Pressure 150 bar
Flow Rate 2.0 mL/min
Isocratic % modifier
25%
Temperature 30°C
Injection Volume 5 µL
Detection DAD, 220 nm
Permite el Análisis de impurezas Quirales < 0.05% !!!
Página: 31
The Agilent 1200 Infinity Analytical SFC System The New Standard in Performance, Cost-efficiency, Reliability and Ease-of-Use
Página: 32
Highest Analytical SFC Performance.... Ever HPLC-like Sensitivity, Precision and Dynamic Range >10,000 for
accurate quantitation of 0.01% level impurities
Lowest Operating Cost, Green Chemistry 10-15x lower operating costs by compatibility with standard grade
CO2 instead of liquid SFC grade CO2
Lowest solvent consumption and waste generation
Ease of use, Flexibility and Reliability Highest investment protection by modular, reversible
design. Customers can reconfigure their SFC system
for HPLC.
Upgrade option* for pre-exisiting Agilent 1100 and
1200 LC systems (*incluye bomba binaria SFC).
ChemStation control, data analysis and reporting
Agilent warranty and service quality
Single Vendor Solution – Single Vendor Support
Makes routine analytical SFC a reality!
?
¿Algunas Soluciones a Problemas Típicos en HPLC?
Soluciones Cromatográficas
¿Cómo Mejorar
Sensibilidad?
¿Cómo Resolver
Solapamientos?
¿Cómo Cuantificar
Simultáneamente
Trazas y Mayoritarios?
¿Cómo Reducir Tiempo
en la Preparación de
Tampones y Muestras?
¿Detecto todas las
impurezas?
¿El pico es Puro?
Sens. x10 con celda 60mm
con Tecnología Max Ligth
Optimizando Condiciones
Detección DAD
Espectralmente
Detección DAD con Banda Ancha
Pureza Espectral de un Pico
30x Rango Dinámico con HDR-DAD
UHPLC y Flujos Elevados
LCxLC SFC
¿Transferencia de
métodos entre distintos
modelos?
ISET
Página: 33 32-13m
Problema: Reproducción de Analisis en
Gradiente con diferentes HPLC´s: - Impacto del
volumen muerto y de la calidad de la mezcla
min2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
50
100
150
200
DAD1 B, Sig=275,4 Ref=400,40 (B:\RIC\AGI...RIC DATA\1 PHARMA METOCLOPRAMIDE\WAD PHARMA\XBRIDGE-2000004.D) 2
.747
3.0
49
8.1
21
8.3
23
8.7
47 8
.930
9.5
45
9.9
75
12.
005
12.
215
12.
393
min2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
50
100
150
200
DAD1 C, DAD1B, DAD: Signal B, 275 nm/Bw:4 nm Ref 400 nm/Bw:60 nm (B:\RIC\AGI...A\GV 1PHARMA\HPLC000001.D)
2.7
44 2
.884
6.0
88
6.3
28
6.6
73
6.8
72
7.4
80
7.9
23 9.9
37
10.
249
min2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
50
100
150
200
DAD1 C, DAD1B, DAD: Signal B, 275 nm/Bw:4 nm Ref 400 nm/Bw:60 nm (B:\RIC\AGI...A\GV 1PHARMA\HPLC000003.D)
2.8
87
3.3
20
8.5
38
8.7
44
9.1
59 9
.325
9.9
51
10.
379
12.
395
12.
630
12.
763
1200 Series LC Quatenary Pump
1290 Infinity LC
Sample: 0.5% impurities in formulation (metoclopramide)
Xbridge C18, 150x3 mm, 3.5 µm dp,
0.45 ml/min, Eluent: A =0 .25 % AmAc, B = ACN,
Gradient: 0-15 min; 5-57 % B
El resultado:
• Diferencias en los RT y resolución
• ¡Se juntan 2 picos!
Página: 34
Tecnología de Emulación Inteligente - Como trabaja (1290 con un 1200)
Programa de gradiente
1290 gradiente
1200 gradiente
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
0
50
100
150
200
250
300
350
400
min
mAU
Inyecctión
Mismas condiciones de gradiente
pero desplazando el gradiente y
emulando el perfil del gradiente a
clonar
Página: 35
June 28, 2012
Intelligent System Emulation Technology ISET - Selección de Modelos a Emular
Seleccionar
modelo
autoinyector
Emulación de “cualquier” HPLC/UHPLC con el
1290 y la nueva tecnología ISET. Seleccionar
modelo
Bomba
Página: 36
Analisis de Impurezas con 1100 y 1290 Binario Columna: 4.6 x 50 mm, 1.8 µm
min 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 2.75 3 3.25
mAU
0
5
10 Rs= 3.23
1100 Series Binary LC
min 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 2.75 3 3.25
mAU
0
5
10 Rs= 2.92 1290 Infinity LC
min 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 2.75 3 3.25
mAU
0
5
10 Rs= 3.29 1290 Infinity LC
con iSET
Página: 37
?
¿Algunas Soluciones a Problemas Típicos en HPLC?
Soluciones Cromatográficas
¿Cómo Mejorar
Sensibilidad?
¿Cómo Resolver
Solapamientos?
¿Cómo Cuantificar
Simultáneamente
Trazas y Mayoritarios?
¿Cómo Reducir Tiempo
en la Preparación de
Tampones y Muestras?
¿Detecto todas las
impurezas?
¿El pico es Puro?
Sens. x10 con celda 60mm
con Tecnología Max Ligth
Optimizando Condiciones
Detección DAD
Espectralmente
Detección DAD con Banda Ancha
Pureza Espectral de un Pico
30x Rango Dinámico con HDR-DAD
UHPLC y Flujos Elevados
LCxLC SFC
¿Transferencia de
métodos entre distintos
modelos?
ISET
Página: 38
Bomba Cuaternaria 1290 Infinity
con ”BlendAssist”. Nueva bomba
36-9m
Nueva Bomba 1290 Infinity Cuaternaria: Asistente de Mezclas ”BlendAssist”
Water Water
1% TFA
ACN
ACN
1% TFA
Ejemplo de 2 métodos con modificadores:
1. 5 to 95% gradiente de ACN con 0.1% TFA en
Agua y 0.08% TFA in ACN.
2. 20 – 80% gradiente de ACN con 0.5% TFA en
Agua y 0.4% TFA en ACN.
Sin BlendAssist necesita o mezclar perviaemnte
los disolventes necesarios, o mediante el uso de
soluciones stock de TFA en agua y en ACN
programar complejos gradientes cuaternarios (%
A, B, C, D).
Con BlendAssist: basta programar el gradiente
binario H2O/ACN y definir el factor de dilución!
“BlendAssist“: una sencilla herramienta para la programación del gradiente y
dilución “online“ de tampones y modificadores a partir de soluciones stock.
Página: 39
Bomba 1290 Infinity Cuaternaria con ”BlendAssist”
Versión opcional „BlendAssist Pro“ con funcionalidades adicionales
• Ahorra tiempo de personal: al reducir
necesidad de preparar tampones.
• Reduce posibilidad de error y mejora la
trazabilidad.
• Mejora la reproducibilidad (distintos días).
Nueva tecnología de mezclado a baja presión con “InletWeaver” y “active damping”:
• Gradientes con elevada exactitud y precisión de 1-99% (en rango composición).
• Sólo <350µL volumen retado del gradiente.
Programación ”BlendAssist”
Página: 40
min 1 2 3 4
Norm.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
6 fases móviles mezcladas manualmente
(por diferentes usuarios)
6 fases móviles mezcladas dinámicamente
min 1 2 3 4
Norm.
0
5
10
15
20
25
30
Comparación de Mezcla de Fases Móviles: Dinámica
(“online”) vs. Manual con Diferentes Usuarios Análisis of Glucocorticoides
El mezclado dinámico mejora
considerablemente la reproducibilidad* de
tiempos de retención (*entre días y entre usuarios)
Usuarios1 a 6
Página: 41
?
¿Algunas Soluciones a Problemas Típicos en HPLC?
Soluciones Cromatográficas
¿Cómo Mejorar
Sensibilidad?
¿Cómo Resolver
Solapamientos?
¿Cómo Cuantificar
Simultáneamente
Trazas y Mayoritarios?
¿Cómo Reducir Tiempo
en la Preparación de
Tampones y Muestras?
¿Detecto todas las
impurezas?
¿El pico es Puro?
Sens. x10 con celda 60mm
con Tecnología Max Ligth
Optimizando Condiciones
Detección DAD
Espectralmente
Detección DAD con Banda Ancha
Pureza Espectral de un Pico
30x Rango Dinámico con HDR-DAD
UHPLC y Flujos Elevados
LCxLC SFC
¿Transferencia de
métodos entre distintos
modelos?
ISET
Página: 42
Bomba Cuaternaria 1290 Infinity
con ”BlendAssist”. Nueva bomba
Autoinyectores con capacidad
de Mezcla/ Derivatización
40-5m
Preparación Muestra en Inyector Automático. Ejemplo Derivatización precolumna: Aminoácidos (OPA + FMOC)
Disponible en : 1290 Infinity,1260 Infinity, 1200, 1100, 1050, 1090
Dosificador de Muestra
Unidad de
Muestreo
deshecho
Bomba
a columna
Muestra Reactivo VWD1 A, Wavelength=338 nm, TT (AASM0531\095-0101.D) VWD1 A, Wavelength=338 nm, TT (AASM0531\003-0201.D) VWD1 A, Wavelength=338 nm, TT (AASM0531\007-0401.D)
min 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
mAU
0
50
100
150
200
250
300
350
ASP
GLU
SER
THR
TYR CYS-CYS
VAL
MET PHE
ILE
ASN
TRP
ORN
ROJO: muestra AAS libres
GLY
HIS
ARG
ALA
LEU LYS
PRO
DERIVATIZACION AMINOACIDOS
1.-Toma 5 µl tampón Borato (vial 2)
2.-Toma 1 µl reactivo OPA (vial 3)
3.-Toma O µl agua (vial 1) - lavado exterior aguja
4.-Toma 1 µl muestra AAS (vial X)
5.-Toma O µl agua (vial 1) – lavado aguja
6.-Mezclar 7 µl 6 veces – Derivatiza AAS PRIMARIOS
7.-Toma O µl agua (vial 1) - lavado exterior aguja
8.-Toma 1 µl reactivo FMOC (vial 3)
9.-Mezclar 8 µl 3 veces – Derivatiza AAS SECUNDARIOS
10.-INYECTAR
También es útil para mezclar patrones durante la puesta a punto de métodos o p.e. para automatizar la
derivatización con FMOC en el análisis de Glifosato y AMPA por LC/MS
Página: 43
?
¿Algunas Soluciones a Problemas Típicos en HPLC?
Soluciones Cromatográficas
¿Cómo Mejorar
Sensibilidad?
¿Cómo Resolver
Solapamientos?
¿Cómo Cuantificar
Simultáneamente
Trazas y Mayoritarios?
¿Cómo Reducir Tiempo
en la Preparación de
Tampones y Muestras?
¿Detecto todas las
impurezas?
¿El pico es Puro?
Sens. x10 con celda 60mm
con Tecnología Max Ligth
Optimizando Condiciones
Detección DAD
Espectralmente
Detección DAD con Banda Ancha
Pureza Espectral de un Pico
30x Rango Dinámico con HDR-DAD
UHPLC y Flujos Elevados
LCxLC SFC
¿Transferencia de
métodos entre distintos
modelos?
ISET
Página: 44
Bomba Cuaternaria 1290 Infinity
con ”BlendAssist”. Nueva bomba
Autoinyectores con capacidad
de Mezcla/ Derivatización
LC/MS AMDS
42-3m
• 1 columna para todo C18
• Los mismos eluyentes
• ESI+: A: 0.1%HCOOH
B: 95% ACN/ 0.1%HCOOH
• Métodos (gradientes y transiciones) específicos para cada familia.
LC/MS-QqQ: La clave para la Productividad
Pesticidas, Herbicidas,
Micotoxinas, Aflatoxinas
Vitaminas, Hormonas,
beta-gonistas, Fármacos
Antibióticos, Sudanes,
Melaminas,.......... La selectividad y robustez de QqQ en MRM calibrando
sobre matriz permite el uso de columnas y eluyentes
comunes para una gran variedad de aplicaciones.
REDUCE COSTES especialmente de mano de obra ...........
Página: 45
Resumen: Algunas Soluciones a Problemas Típicos
en HPLC
¿Cómo Mejorar
Sensibilidad?
¿Cómo Resolver
Solapamientos?
¿Cómo Cuantificar
Simultáneamente
Trazas y Mayoritarios?
¿Cómo Reducir Tiempo
en la Preparación de
Tampones y Muestras?
¿Detecto todas las
impurezas?
¿El pico es Puro?
Sens. x10 con celda 60mm
con Tecnología Max Ligth
Optimizando Condiciones
Detección DAD
Espectralmente
Detección DAD con Banda Ancha
Pureza Espectral de un Pico
30x Rango Dinámico con HDR-DAD
UHPLC y Flujos Elevados
LCxLC SFC
¿Transferencia de
métodos entre distintos
modelos?
ISET
Bomba Cuaternaria 1290 Infinity
con ”BlendAssist”. Nueva bomba
Autoinyectores con capacidad
de Mezcla/ Derivatización
passed LC/MS
Página: 46
AMDS
Agilent 1290 Infinity
El más Versátil
UHPLC:
• Cualquier tipo de columnas:
UHPLC, LC, Solid Core, Monolitics,…
• Columnas de 1 a 8 mm d.i..
• Longitudes hasta 25cm x1.8µm.
• UHPLC & UFLC con CH3OH.
• ….
• ..
•.
Infinitas Posibilidades !!
Muchas
Gracias
por su
Atención
Agilent 1290 Infinity
El más Versátil
UHPLC:
• Cualquier tipo de columnas:
UHPLC, LC, Solid Core, Monolitics,…
• Columnas de 1 a 8 mm d.i..
• Longitudes hasta 25cm x1.8µm.
• UHPLC & UFLC con CH3OH.
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Infinitas Posibilidades !!
¿Preguntas?
Estamos a su
disposición en
tel.: 901.11.6890
www.agilent.com/chem [email protected]