optimización de la formulación de cápsulas del nematodo
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UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS
ESCUELA DE AGRONOMÍA
Optimización de la formulación de cápsulas del nematodo
entomopatógeno Heterorhabditis sp. (Heterorhabditidae)
mediante la evaluación de dos métodos de encapsulamiento
Emma Taylor De La O
TESIS PARA OPTAR AL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERA
AGRÓNOMA CON EL GRADO DE LICENCIADA EN AGRONOMÍA
2018
ii
Optimización de la formulación de cápsulas del nematodo
entomopatógeno Heterorhabditis sp. (Heterorhabditidae) mediante
la evaluación de dos métodos de encapsulamiento
Emma Taylor De La O
TESIS PARA OPTAR AL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERA
AGRÓNOMA CON EL GRADO DE LICENCIADA EN AGRONOMÍA
UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS
ESCUELA DE AGRONOMÍA
2018
iii
DEDICATORIA
A YAHWEH (el Dios trino), el que día con día me ama con amor perfecto e
incondicional, quien siempre cuida de mí y me sostiene en todo momento. Él lo es todo.
Él es a quien pertenecen todas las cosas, visibles e invisibles, pues todo es hecho por Él y
para Él. A YAHWEH le ofrezco esta tesis de Licenciatura.
“Por tanto, al Rey de los siglos, inmortal, invisible, al único y sabio Dios, sea honor
y gloria por los siglos de los siglos. Amén.” (I Timoteo 1:17).
A la memoria de mis abuelos Jesse y Clara, los que fueron mis papás.
iv
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Dios por su gracia y su misericordia para conmigo al ayudarme a
concluir esta tesis; Aquel sin el cual nada en mi vida es posible.
A la profesora Lidieth Uribe Lorío, por ser mi directora de tesis y por todo su apoyo
durante la realización de este Trabajo de Graduación, así como por su paciencia,
dedicación y bondad hacia mí.
Al personal del Laboratorio de Microbiología Agrícola del Centro de
Investigaciones Agronómicas (CIA) de la Universidad de Costa Rica -y especialmente a
Rebeca Vargas Madrigal- por su colaboración para que yo pudiera llevar a cabo la parte
práctica en dicho lugar, así como por todo el apoyo y el cariño que me brindaron.
A mis profesores revisores Lorena Flores Chaves, Erick Castellón Elizondo, Helga
Blanco Metzler y Danny Humphreys Pereira, por dedicar de su tiempo para ayudarme a
corregir y perfeccionar el presente documento de tesis.
A los profesores Juan Ramón Navarro Flores y Eduardo Chacón Madrigal, de las
Escuelas de Agronomía y de Biología, respectivamente, por su disposición y su ayuda
para la realización de los análisis estadísticos de los datos.
A mis compañeras, las estudiantes Zamia Rojas Miranda y Delia Bogantes
Ledezma, por instruirme en los diferentes procedimientos a seguir para la cría del
material biológico utilizado y la realización de los experimentos en esta investigación.
Al profesor William Ramírez Benavides, el personal del Centro de Investigaciones
Apícolas Tropicales (CINAT) y a todos los productores apícolas que se preocuparon por
ayudarme a conseguir especímenes de Galleria mellonella para lograr terminar con éxito
la parte práctica de mi tesis.
v
A la Universidad de Costa Rica, por apoyarme y brindarme todo lo necesario para
que yo pudiera estudiar y finalizar mi carrera.
A todas las personas que laboran en la Facultad de Ciencias Agroalimentarias y a
mis compañeros que se han mostrado amigos, además de haberse acordado siempre de mí
y de haberme ayudado en muchas formas a través de los años hasta el presente.
A todas las personas fuera de la universidad que también estuvieron presentes
cuando lo necesité.
¡Gracias por su buena voluntad! ¡Que Dios les bendiga a todos!
vi
Optimización de la formulación de cápsulas del nematodo
entomopatógeno Heterorhabditis sp. (Heterorhabditidae) mediante
la evaluación de dos métodos de encapsulamiento
Emma Taylor De La O
TESIS PARA OPTAR AL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERA
AGRÓNOMA CON EL GRADO DE LICENCIADA EN AGRONOMÍA
_________________________
Lidieth Uribe Lorío Dra.
DIRECTORA DE TESIS
_________________________
Lorena Flores Chaves M.Sc.
MIEMBRO DEL TRIBUNAL
_________________________
Erick Castellón Elizondo Dr.
MIEMBRO DEL TRIBUNAL
_________________________
Danny Humphreys Pereira Dr.
MIEMBRO DEL TRIBUNAL
_________________________
Luis Gómez Alpízar Ph.D.
DIRECTOR DE ESCUELA
_________________________
Emma Taylor De La O Bach.
SUSTENTANTE
2018
vii
ÍNDICE DE CONTENIDO
DEDICATORIA ......................................................................................................................... iii
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................. iv
ÍNDICE DE CUADROS ............................................................................................................. x
ÍNDICE DE FIGURAS .............................................................................................................. xi
RESUMEN ................................................................................................................................. 13
INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 14
OBJETIVOS ............................................................................................................................... 17
Objetivo general ........................................................................................................... 17
Objetivos específicos ................................................................................................... 17
REVISIÓN DE LITERATURA ............................................................................................. 18
1. Nematodos entomopatógenos .................................................................................. 18
2. El nematodo entomopatógeno Heterorhabditis sp. Poinar, 1976 ............................ 19
3. Photorhabdus luminescens Thomas y Poinar, 1979 ................................................ 20
4. Ciclo de infección de Heterorhabditis sp. ............................................................... 23
4.1. Fase I .............................................................................................................. 23
4.2. Fase II ............................................................................................................. 23
4.3. Fase III ........................................................................................................... 24
4.4. Fase IV ........................................................................................................... 24
5. Susceptibilidad de nematodos a condiciones ambientales ....................................... 25
5.1. Temperatura ................................................................................................... 25
5.2. Humedad ........................................................................................................ 26
5.3. Radiación ....................................................................................................... 27
5.4. Textura del suelo ............................................................................................ 27
5.5. pH ................................................................................................................... 28
5.6. Salinidad ........................................................................................................ 28
6. Uso comercial de los nematodos entomopatógenos ................................................ 29
6.1. Steinernema-System ...................................................................................... 29
6.2. Heterorhabditis-System ................................................................................. 30
viii
6.3. Phasmarhabditis-System ............................................................................... 30
6.4. B-Green .......................................................................................................... 31
7. Encapsulamiento de nematodos entomopatógenos .................................................. 31
8. La polilla grande de la cera Galleria mellonella Linnaeus, 1756 ............................ 36
METODOLOGÍA ..................................................................................................................... 38
1. Localización de la investigación .............................................................................. 38
2. Material biológico .................................................................................................... 38
2.1. Organismos utilizados .................................................................................... 38
2.2. Cría del material biológico ............................................................................. 39
2.2.1. Galleria mellonella .................................................................................. 39
2.2.2. Heterorhabditis sp. .................................................................................. 39
3. Formación de cápsulas de Alginato-Ca y Ca-Alginato con tres concentraciones de
nematodos .................................................................................................................... 40
3.1. Formación de cápsulas de Alginato-Ca con tres concentraciones de
nematodos ............................................................................................................. 40
3.2. Formación de cápsulas de Ca-Alginato con tres concentraciones de
nematodos ............................................................................................................. 41
4. Evaluación de la sobrevivencia de diferentes concentraciones de 2000 JI/ml, 3000
JI/ml y 4000 JI/ml de NEP en cápsulas de Alginato-Ca y Ca-Alginato ...................... 45
5. Evaluación del efecto de nematodos Heterorhabditis sp. a concentraciones de 3000
JI/ml y 4000 JI/ml sobre la mortalidad de Galleria mellonella para las cápsulas de
Alginato-Ca. ................................................................................................................. 46
6. Evaluación del efecto de nematodos Heterorhabditis sp. a concentraciones de 3000
JI/ml y 4000 JI/ml sobre la mortalidad de Galleria mellonella para las cápsulas de Ca-
Alginato. ....................................................................................................................... 47
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................ 49
1. Formación de cápsulas de Alginato-Ca y Ca-Alginato con tres concentraciones de
nematodos .................................................................................................................... 49
2. Evaluación de la sobrevivencia de diferentes concentraciones de NEP en cápsulas
de Alginato-Ca y Ca-Alginato ..................................................................................... 54
3. Evaluación del efecto de las concentraciones de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml de
nematodos Heterorhabditis sp. a las dosis de 2 y 5 cápsulas por larva sobre la
mortalidad de Galleria mellonella para ambos métodos de encapsulamiento ............ 57
ix
CONCLUSIONES .................................................................................................................... 68
RECOMENDACIONES .......................................................................................................... 69
LITERATURA CITADA ........................................................................................................ 70
x
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Pruebas de preparación de cápsulas de Ca-Alginato .........................................42
Cuadro 2. Pruebas de preparación de cápsulas de Ca-Alginato utilizando una nueva
calidad de alginato de sodio, marca Sigma-A ....................................................................45
Cuadro 3. Porcentajes de sobrevivencia promedio de los nematodos contenidos en las
cápsulas de Alginato-Ca y Ca-Alginato con concentraciones de 2000 JI/ml, 3000 JI/mL y
4000 JI/mL de nematodos de Heterorhabditis sp. .............................................................55
Cuadro 4. Relación del efecto de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml de nematodos Heterorhabditis
sp. y dosis de 2 y 5 cápsulas por larva, de hidrogeles de Alginato-Ca con el porcentaje de
mortalidad promedio acumulada de larvas de Galleria mellonella obtenido para 5 días de
evaluación de los tratamientos. ..........................................................................................58
Cuadro 5. Relación del efecto de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml de nematodos Heterorhabditis
sp. y dosis de 2 y 5 cápsulas por larva de hidrogeles de Ca-Alginato con el porcentaje de
mortalidad promedio acumulada de larvas de Galleria mellonella obtenido para 5 días de
evaluación de los tratamientos. ..........................................................................................62
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Macho de nematodo entomopatógeno Heterorhabditis sp. cepa CIA-NE07 con
la bacteria Photorhabdus luminescens; se observa a la bacteria (pigmento rojo)
distribuida a lo largo del tracto intestinal del nematodo. Fuente: Vidaurre
(2016)……………….........................................................................................................22
Figura 2. Ciclo de vida de Heterorhabditis sp. Fuente: Gerdes et al. (2015) ....................25
Figura 3. Método de encapsulamiento de nematodos con alginato de sodio y CaCl2.: A)
juveniles infectivos suspendidos en el polímero polianiónico y goteados sobre la
disolución de catión o polímero policatiónico; B) representación de una cápsula con
nematodos basada en biopolímeros polianiónicos gelificados. Fuente: Bogantes et al.
(2018). ................................................................................................................................34
Figura 4. Método de encapsulamiento de nematodos con alginato de sodio y CaCl2: goteo
de la suspensión de CaCl2 sobre la disolución de alginato. Fuente: Bogantes et al. (2018),
con modificaciones.. ..........................................................................................................35
Figura 5. Larva de G. mellonella. Fuente: Martiré (INPN 2018)......................................38
Figura 6. Cápsulas obtenidas en pruebas de optimización del método de formación de
cápsulas de centro líquido (Ca-Alginato): A) cápsulas con forma de saco huecas; B)
cápsulas con forma esférica al estar sumergidas en agua desionizada; C) cápsulas
aplanadas sobre una superficie sólida, señaladas dentro de los círculos; D) cápsulas con
forma de gota. ....................................................................................................................50
Figura 7. Estructuras moleculares de los biopolímeros de alginato y xantano. A)
estructuras lineales de biopolímeros de alginato; B) estructura ramificada del xantano: (1)
conformación helicoidal en vista perpendicular (1) y paralela (2) al eje de la hélice.
Fuente: Nussinovitch (1997), con modificaciones. ...........................................................52
xii
Figura 8. Efecto de las concentraciones de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml de nematodos
Heterorhabditis sp. y a las dosis de 2 y 5 cápsulas de Alginato-Ca por larva sobre la
mortalidad promedio acumulada de larvas de Galleria mellonella, para 5 días de
evaluación de los tratamientos. ..........................................................................................59
Figura 9. Efecto de las concentraciones de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml de nematodos
Heterorhabditis sp. y a las dosis de 2 y 5 cápsulas de Alginato-Ca por larva sobre la
mortalidad promedio de larvas de Galleria mellonella a través del tiempo. T1 = 2
cápsulas de 3000 JI/ml por larva; T2 = 5 cápsulas de 3000 JI/ml por larva; T3 = 2
cápsulas de 4000 JI/ml por larva; T4 = 5 cápsulas de 4000 JI/ml por larva; Testigo = 0
cápsulas por larva. ..............................................................................................................60
Figura 10. Efecto de las concentraciones de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml de nematodos
Heterorhabditis sp. y a las dosis de 2 y 5 cápsulas de Ca-Alginato por larva sobre la
mortalidad promedio acumulada de larvas de Galleria mellonella, para 10 días de
evaluación de los tratamientos. ..........................................................................................63
Figura 11. Efecto de las concentraciones de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml de nematodos
Heterorhabditis sp. y a las dosis de 2 y 5 cápsulas de Ca-Alginato por larva sobre la
mortalidad promedio de larvas de Galleria mellonella a través del tiempo. T5 = 2
cápsulas de 3000 JI/ml por larva; T6 = 5 cápsulas de 3000 JI/ml por larva; T7 = 2
cápsulas de 4000 JI/ml por larva; T8 = 5 cápsulas de 4000 JI/ml por larva; Testigo = 0
cápsulas por larva. ..............................................................................................................65
13
RESUMEN
Costa Rica ha sido uno de los países de mayor consumo de agroquímicos en el
mundo. El uso de agentes entomopatógenos para el combate biológico de plagas se
propone como una de las alternativas al uso indiscriminado de plaguicidas en el país. La
utilización de nematodos entomopatógenos encapsulados como Heterorhabditis sp. cepa
CIA-NE07, promete ser una herramienta de gran utilidad para la protección de los
cultivos, ya que las formulaciones de encapsulamiento de biocontroladores mantienen su
viabilidad por más tiempo al ser aplicados por el productor, potenciando de esta forma su
eficacia en el control de plagas. El propósito del presente trabajo fue evaluar la
efectividad de cápsulas de alginato de calcio de centro líquido y de centro gelificado en la
sobrevivencia de juveniles infectivos de Heterorhabditis sp. CIA-NE07 y sobre la
mortalidad de larvas de Galleria mellonella en el laboratorio.
Se prepararon cápsulas de alginato de centro líquido y centro gelificado. Para las
cápsulas de centro gelificado se siguió la metodología descrita por Bogantes et al. (2018)
mientras que para la preparación de las cápsulas cápsulas de centro líquido evaluaron
diferentes concentraciones de alginato, Ca Cl2 y xantano, se eligió el uso de alginato de
sodio al 0,5 %, CaCl2 al 2,0 % y xantano al 0,4 %. Se evaluó la sobrevivencia de 2000,
3000 y 4000 JI/ml de Heterorhabditis sp. CIA-NE07 en las cápsulas de Alginato-Ca y
Ca-alginato; los resultados se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis con nivel
de significancia de 5 %. Se obtuvieron sobrevivencias de nematodos mayores al 90 % en
todos los tratamientos evaluados. Se evaluó además el efecto de las cápsulas sobre la
mortalidad de larvas de G. mellonella a concentraciones de 3000 y 4000 JI/ml y dosis de
2 y 5 cápsulas/larva; los resultados se analizaron con la prueba Di Rienzo, Guzmán y
Casanoves (DGC) con nivel de significancia de 5 %. La mortalidad de las larvas en el
tratamiento T1 (2 cápsulas de Alginato-Ca por larva con 3000 JI/ml) fue
significativamente menor a las encontradas en los demás tratamientos de Alginato-Ca.
Por otra parte, todos los demás tratamientos para ambos tipos de cápsulas no tuvieron
diferencias significativas entre ellos, y fueron más eficaces en causar la mortalidad de las
larvas.
14
INTRODUCCIÓN
Costa Rica se ha caracterizado en las últimas décadas por ser uno de los países de
mayor consumo de agroquímicos en el mundo, cuyo uso indiscriminado en los cultivos se
ha incrementado a través de los años de tal forma que para el 2016 se estima que se
usaron 8.897.084 kg, según lo indicaron el Servicio Fitosanitario del Estado y el
Ministerio de Agricultura y Ganadería (SFE-MAG 2017). En respuesta a la problemática
de salud ambiental y humana que causa el elevado uso de los plaguicidas, se han hecho
esfuerzos en busca de estrategias de control de plagas efectivas como alternativas al
combate químico (Joyti y Brewer 1999), entre las cuales se encuentra el combate
biológico. Fischbein (2012) define este tipo de combate como la utilización de
organismos vivos con el fin de reducir y mantener la abundancia poblacional de una
plaga por debajo de los niveles de daño económico.
El uso de agentes entomopatógenos para el combate biológico de plagas se remonta
hasta hace más de un siglo, habiéndose comprobado con el paso del tiempo la enorme
efectividad de algunos de ellos; estos microorganismos y entes parasíticos son capaces de
provocar enfermedades agudas y fatales en sus hospederos, y pueden ser agentes
controladores de gran importancia aún en el corto plazo, como reguladores de sus
poblaciones (Nicholls 2008). En general, el modo de acción de un agente
entomopatógeno consiste en la invasión y multiplicación del hospedero y su posterior
dispersión hacia otros hospederos que son también infectados; éste puede transmitirse por
contacto, por ingestión, por transmisión de los progenitores a su descendencia y por
medio de vectores (Nicholls 2008).
Los nematodos entomopatógenos (NEP) han demostrado tener un enorme potencial
en el combate biológico de insectos plaga, por lo cual constituyen una herramienta muy
útil para ser implementada en programas de Manejo Integrado de Plagas (MIP) en Costa
Rica. Sin embargo, las formulaciones comerciales de NEP más utilizadas en la actualidad
presentan una vida útil limitada, y las aplicaciones de éstos por pulverización de
suspensiones acuosas pueden ser laboriosas y muchas veces no muy eficientes, además
15
de que los nematodos de dichas formulaciones se encuentran expuestos en gran medida a
las radiaciones UV y a la desecación (Gaugler et al. 1997, Shapiro et al. 2006).
En vista de lo anterior, el encapsulamiento de los NEP constituye una alternativa
prometedora para la aplicación de los mismos, ya que este tipo de formulación provee a
los nematodos de una mayor protección contra los efectos abióticos adversos, así como
contra sus enemigos naturales (Kim et al. 2015). Los materiales que han sido utilizados
para la elaboración de cápsulas son variados, Bogantes et al. (2018) utilizó el alginato, la
carboximetilcelulosa, la pectina y la gelatina para el encapsulamiento de la cepa
Heterorhabditis sp. CIA-NE07.
Con respecto al alginato, Goud et al. (2010) se refieren al mismo como un material
que ha sido probado con éxito para el encapsulamiento y comercialización de los NEP;
San Blas (2013) afirma que la utilización de cápsulas de alginato de calcio para regular la
liberación de dichos nematodos fue realizada por primera vez por Kaya y Nelsen en
1985. Por otra parte, Hiltpold (2015) indica que es posible obtener cápsulas de alginato
de calcio con el centro gelificado cuando se gotea el alginato sobre CaCl2, mientras que
goteando el CaCl2 sobre el alginato, se generan cápsulas con el centro líquido.
Por su parte Bogantes et al. (2018), evaluaron diferentes materiales de
encapsulamiento (alginato de calcio, carboximetilcelulosa, pectina y gelatina), de acuerdo
con su capacidad de contener y preservar al nematodo entomopatógeno Heterorhabditis
sp. CIA-NE07. Dichos investigadores concluyeron que el alginato de calcio mostró ser el
más adecuado para el encapsulamiento y la sobrevivencia del nematodo; además
encontraron que a mayor concentración de NEP utilizada (2000 nematodos/ml) las
cápsulas fueron más efectivas para la infección de larvas de Galleria mellonella. Los
autores evaluaron además el uso de cápsulas inversas (Ca-alginato 1,2 %); sin embargo,
encontraron que éstas no llegaban a formarse. Al respecto, Hiltpold et al. (2012)
encontraron que las cápsulas de centro líquido se pueden obtener agregando xantano a la
solución de CaCl2, ya que este reactivo evita la formación de filamentos cuando la
disolución utilizada es muy fluida, propiciando así la formación de esferas.
16
El propósito de este trabajo fue evaluar la efectividad de cápsulas de alginato de
calcio de centro líquido y centro gelificado utilizando suspensiones de nematodos
mayores a 2000 JI/ml.
17
OBJETIVOS
Objetivo general
Optimizar la formulación del controlador biológico Heterorhabditis sp. mediante
dos procedimientos de encapsulamiento del nematodo con hidrogeles de centro líquido y
de centro gelificado.
Objetivos específicos
1. Probar el efecto de dos métodos de encapsulamiento de Alginato-Ca y Ca-Alginato
sobre la sobrevivencia de juveniles infectivos (JI) de Heterorhabditis sp.
2. Evaluar el efecto de dos concentraciones de nematodos sobre la mortalidad de
larvas de Galleria mellonella para ambos métodos de encapsulamiento.
18
REVISIÓN DE LITERATURA
1. Nematodos entomopatógenos
Los nematodos entomopatógenos son organismos microscópicos que habitan en el
suelo, los cuales son capaces de alimentarse de insectos debido a que mantienen una
asociación simbiótica con una bacteria que les confiere dicha capacidad (Merino y France
2009). Éstos han ganado interés como potenciales agentes de combate biológico, debido a
que su rango de hospederos es amplio y les causan la muerte rápidamente una vez que
son infectados, además la capacidad de búsqueda de estos nematodos es eficiente, ya que
son hábiles para encontrar y seguir a los insectos en el suelo (Merino y France 2009).
Algo que hace a los NEP atractivos para su uso en el combate biológico es que
pueden ser reproducidos en grandes cantidades tanto por métodos in vivo como in vitro y
pueden ser aplicados con facilidad, sin representar un riesgo para el ambiente y
organismos no blanco (Merino y France 2009). Además, los estadios infectivos J3 o JI
(juvenil infectivo), pueden ser formulados y almacenados; son fácilmente aplicables con
los equipos estándares y el riego, y es posible combinarlos con otros agentes
biorreguladores y productos químicos (Rodríguez et al. 2011).
Por otra parte, existen algunas limitaciones del uso de los NEP en el combate
biológico de plagas. Entre esas limitaciones se pueden mencionar la escasez de
conocimiento del potencial de estos organismos y de su correcta utilización para su
implementación en programas de MIP, y una insuficiente capacitación de extensionistas y
productores para su correcta familiarización con los productos a base de dichos
nematodos (Rodríguez et al. 2011).
Los nematodos entomopatógenos más utilizados en el combate biológico son
aquellos pertenecientes a los géneros Heterorhabditis (Familia Heterorhabditidae), con
18 especies descritas hasta el momento y Steinernema, (Familia Steinernematidae), con
más de 90 especies descritas (Morales et al. 2016, Cimen et al. 2016). El ciclo de vida de
19
estos invertebrados comprende el estadio de huevo, el juvenil (con cuatro estadios
juveniles) y el adulto (Merino y France 2009).
2. El nematodo entomopatógeno Heterorhabditis sp. Poinar, 1976
Los nematodos del género Heterorhabditis son agentes entomopatógenos con la
capacidad de infectar a la mayoría de los órdenes y familias de insectos; el hábitat natural
de estos organismos se encuentra en el suelo (Klein 1990). Pueden encontrarse
generaciones hermafroditas y anfimícticas dentro del ciclo de vida de este género, las
cuales se dan muchas veces dentro del hospedero parasitado y se superponen (Burnell y
Stock 2000), de modo que los adultos que resultan de los juveniles infectivos o JI se
caracterizan por ser hermafroditas, los cuales producen huevos de los que emergen
juveniles que se convierten en machos y hembras o en JI; dichas hembras se aparean con
los machos y producen huevos, a partir de los cuales nacen otros JI (Stock y Goodrich
2012). La bacteria del género Photorhabdus (Enterobacteriaceae) es el microorganismo
que guarda una relación mutualista altamente específica con Heterorhabditis (Bennett y
Clarke 2005, Frost y Clarke 2002), ya que el nematodo necesita obligatoriamente de la
presencia de la bacteria para su reproducción (Gerdes et al. 2015). Sin embargo, a pesar
de que dicha relación simbiótica es obligatoria para el nematodo (Patterson et al. 2015),
no es necesaria para la bacteria, ya que ésta puede sobrevivir en condiciones de anoxia
(Gerdes et al. 2015).
20
El nematodo Heterorhabditis sp. presenta la siguiente clasificación taxonómica
(Arctos 2018):
Reino Metazoa
Filo Nematoda
Clase Secernentea
Subclase Rhabditia
Orden Rhabditida
Superfamilia Rhabditoidea
Familia Heterorhabditidae
Género Heterorhabditis
Especie Heterorhabditis sp.
Heterorhabditis es el único género perteneciente a la familia Heterorhabditidae;
comprende 18 especies descritas hasta el momento, con Heterorhabditis bacteriophora
como el tipo (Stock y Goodrich 2012) . La cepa Heterorhabditis sp. CIA-NE07, fue
descrita por Vidaurre (2016), la cual presenta las características diagnósticas del género y
establece la simbiosis con la bacteria Photorhadus luminescens.
3. Photorhabdus luminescens Thomas y Poinar, 1979
Photorhabdus luminescens es una bacteria gram negativa perteneciente a la familia
de las enterobacterias; esta bacteria se caracteriza por ser bioluminiscente (Rodou et al.
2010) y por establecer una simbiosis con los nematodos entomopatógenos de la familia
Heterorhabditidiae (French et al. 2003, Joyce et al. 2006).
El ciclo de vida de P. luminescens en condiciones naturales es complejo (Rodou et
al. 2010), ya que involucra una simbiosis tripartita donde la bacteria interactúa con el
nematodo simbionte y con el insecto hospedero (Rodou et al. 2010). De esta forma, P.
luminescens posee en su cromosoma islas de patogenicidad con genes responsables de la
simbiosis y el crecimiento de los nematodos, así como genes codificantes de enzimas,
21
antibióticos, toxinas y bacteriocinas, secretados por medio de diferentes sistemas de
secreción (Rodou et al. 2010); estos tipos de genes fueron encontrados en el genoma de la
bacteria simbionte de Heterorhabditis CIA-NE07, en trabajos realizados en Costa Rica
(Monge 2017). Además, se ha demostrado en ensayos de laboratorio la producción de
metabolitos secundarios, actividad enzimática, actividad antagónica y actividad
patogénica (Vargas 2012, Galiano 2015, Sanahuja 2016).
La bacteria puede presentar dos variantes fenotípicas, de modo que experimenta
una variación de dos fases (Forst et al. 1997, Joyce et al. 2006, Rodou et al. 2010). La
fase I o variante primaria se da en el JI del nematodo; en ella la bacteria produce
pigmentos, lipasas, proteasas, antibióticos y bioluminiscencia, cuya emisión se debe a la
actividad del operón lux (Rodou et al. 2010, Vargas 2012, Vidaurre 2016). Las variantes
de fase II o secundarias se observan en bacterias en condiciones de cultivos in vitro con
incubación prolongada, y carecen o tienen niveles reducidos de las propiedades de las
variantes de fase I, aunque ambas fases muestran una patogenicidad similar (Rodou et al.
2010, Vargas 2012, Vidaurre 2016). Se cree que las variantes de fase II son una respuesta
del microorganismo al estrés ambiental (Rodou et al. 2010).
En la fotografía de la Figura 1 se muestra a un macho de Heterorhabditis sp. CIA-
NE07 con la bacteria P. luminescens en su interior denotada por una coloración rojiza.
22
Figura 1. Macho de nematodo entomopatógeno Heterorhabditis sp. cepa CIA-NE07
con la bacteria Photorhabdus luminescens; se observa a la bacteria
(pigmento rojo) distribuida a lo largo del tracto intestinal del nematodo.
Fuente: Vidaurre (2016).
A continuación, se presenta la clasificación taxonómica de la bacteria
Photorhabdus luminescens (ITIS 2018):
Dominio Bacteria
Filo Proteobacteria
Clase Gammaproteobacteria
Orden Enterobacteriales
Familia Enterobacteriaceae
Género Photorhabdus
Especie Photorhabdus luminescens
23
4. Ciclo de infección de Heterorhabditis sp.
El ciclo de vida de los nematodos en general comprende los estados de huevo,
cuatro estadios de juvenil (J1, J2, J3 y J4) y el adulto (Merino y France 2009). El ciclo de
vida de Heterorhabditis sp. podría ser dividido en cuatro fases, las cuales se describen a
continuación:
4.1. Fase I
El nematodo juvenil infectivo espera en el suelo a su hospedero, que suele ser un insecto en
estado de larva; al encontrarlo le sigue, guiándose por la gradiente de CO2 producida por su
respiración (quimiotaxis) y lo infecta penetrando a través de las aberturas naturales (boca, ano,
espiráculos) o atraviesa su cutícula, y penetra las membranas intersegmentales, utilizando para
ello su diente bucal (Forst et al. 1997, Ciche y Ensign 2002, Merino y France 2009, Vidaurre
2016). Forst et al. (1997) mencionan que el JI presenta una adaptación morfológica y fisiológica
para dispersarse y sobrevivir en el suelo por largos periodos, buscar al hospedero e infectarlo
luego de localizarlo, y que en este estadio el nematodo no se alimenta. Una vez que ha ingresado
en el hospedero, el JI se mueve hasta el intestino del insecto, el cual perfora con ayuda de su
diente bucal para entrar en el mismo (Ciche y Ensign 2002). Durante esta fase, Heterorhabditis
sp. lleva consigo a la bacteria Photorhabdus luminescens en su intestino medio (Ciche y Ensign
2002, Vidaurre 2016).
4.2. Fase II
Una vez que el nematodo se encuentra en el intestino de su hospedero, libera la
bacteria dentro de la hemolinfa del insecto y segrega sustancias que inhiben la actividad
inmunológica del organismo del insecto, lo que favorece el desarrollo de P. luminescens,
la cual se multiplica con rapidez (Forst et al. 1997, Guo et al. 1999, Merino y France
2009). Consecuentemente, la bacteria prolifera en la hemolinfa del hospedero y comienza
a secretar toxinas y enzimas líticas que le causan la muerte a éste en un tiempo
comprendido entre las 24 y las 48 horas (Forst et al. 1997, Guo et al. 1999, Merino y
France 2009, Vidaurre 2016, Bogantes et al. 2018). La bacteria P. luminescens se
24
caracteriza por presentar una virulencia de tal severidad que, según se ha demostrado, una
cantidad muy baja de células de esta bacteria liberada en la hemolinfa del insecto (de 1 a
10 bacterias) es suficiente para matarlo (Ciche y Ensign 2002).
4.3. Fase III
La bacteria produce exoenzimas, antibióticos y cristales de proteínas dentro del
insecto para inhibir la acción de otras bacterias competidoras y para transformar los
tejidos del organismo del hospedero en alimento, que consumen tanto la bacteria como el
nematodo vector; al mismo tiempo que esto ocurre, el nematodo se reproduce dentro del
cadáver del insecto (Forst et al. 1997, Rodou et al. 2010, Gerdes et al. 2015). Esta fase
junto con la fase II, son completadas al cabo de 48 horas, aproximadamente (Frost y
Clarke 2002).
4.4. Fase IV
En esta etapa los nematodos de la nueva generación se desarrollan y reciben a las
bacterias de P. luminescens, que llegan a colonizar y vivir en el intestino (Frost y Clarke
2002, Vidaurre 2016). En el interior del cuerpo del hospedero pueden originarse hasta
dos o tres generaciones de nematodos, los cuales viven allí hasta el agotamiento de los
nutrientes; posterior a esto, los juveniles infectivos emergen de los restos del organismo
del insecto al suelo en dos semanas y migran en una cantidad de al menos 150 000
individuos en busca de otro hospedero, llevando consigo la bacteria (Akhurst y Bedding
1986, Merino y France 2009).
En la Figura 2 se muestra de manera resumida el ciclo de vida de Heterorhabditis
sp.
25
Figura 2. Ciclo de vida de Heterorhabditis sp. Fuente: Gerdes et al. (2015).
5. Susceptibilidad de nematodos a condiciones ambientales
Las condiciones ambientales tienen una gran influencia en el desempeño
entomopatogénico de los nematodos (Rumbos y Athanassiou 2016). Entre los factores
que los afectan en mayor medida pueden mencionarse la temperatura, la humedad, la
radiación, la textura del suelo, el pH y la salinidad, los cuales son descritos a
continuación.
5.1. Temperatura
En cuanto a las condiciones de temperatura, Grewal et al. (1994) afirman que los
requerimientos para la reproducción y la infección varían entre especies y cepas de
nematodos entomopatógenos. Con respecto a esto, se ha encontrado por ejemplo que
Heterorhabditis indica se caracteriza por ser un nematodo relativamente tolerante al
calor, lo contrario a H. megidis que tolera temperaturas más bajas (Shapiro et al. 2012).
26
Por otra parte, de acuerdo con Ehlers et al. (2005) y Gerdes et al. (2015), Heterorhabditis
bacteriophora posee una alta tolerancia a temperaturas altas y bajas. Tales autores
afirman que hay cepas de H. bacteriophora que son capaces de sobrevivir incluso a
temperaturas de 6 ºC y a temperaturas de hasta 39 ºC, y que dicha tolerancia presenta la
ventaja de que estos nematodos pueden ser almacenados durante largos periodos de
tiempo en un amplio rango de localidades y a diferentes temperaturas, altas y bajas. Por
otro lado, Gerdes et al. (2015) afirma que la bacteria P. luminescens no es tolerante a
temperaturas variadas como lo es el nematodo; sin embargo, al encontrarse dentro del
intestino de su simbionte, puede permanecer viva debido a la protección del ambiente
interno que le proporciona el nematodo.
Por otra parte, también en referencia a H. bacteriophora, Doucet et al. (1996)
mencionan un rango de entre 22 ºC y 26 ºC como la temperatura óptima para la actividad
biológica del nematodo, y según Athanassiou et al. (2010), temperaturas más altas a la
óptima por lo general reducen su eficacia. No obstante, si bien se considera que las altas
temperaturas son desfavorables a la sobrevivencia, la persistencia y la virulencia de los
nematodos entomopatógenos (Kung et al. 1991, Hsiao et al. 1996, Menti et al. 2000),
éstos presentarán una mejor virulencia a temperaturas más elevadas si provienen de una
región cálida (Hazir et al. 2001).
5.2. Humedad
La humedad también juega un papel importante para la sobrevivencia y la
migración del estadio juvenil infectivo (JI) hacia el hospedero. A pesar de que los valores
de humedad relativa óptima son variables según la especie y la cepa de nematodos de que
se trate (Koppenhofer et al.1995), se afirma que los bajos niveles de ésta producen la
quiescencia y la desecación de los nematodos (Kung et al. 1991, Navaneethan et al. 2010,
Shapiro et al. 2012).
En este mismo sentido Womersley (1990), indica que los JI son capaces de
sobrevivir a condiciones de humedad relativamente baja, siempre que se llegue a esos
27
niveles de manera gradual, ya que esto permite a los nematodos adaptarse a una etapa de
inactividad, así, en el suelo, los JI pueden ser inducidos a inactividad sin que esto
implique su muerte, ya que el secado gradual del mismo les da el tiempo suficiente para
entrar en un estado de latencia como un mecanismo de sobrevivencia (Koppenhöfer y
Kaya 2003).
Otra estrategia de sobrevivencia que pueden utilizar los NEP ante la desecación por
bajos niveles de humedad, es su permanencia dentro del cadáver del hospedero hasta que
la humedad aumente a niveles adecuados (Brown y Gaugler 1997, Koppenhöfer et al.
1997). Por otra parte, si los nematodos se encuentran en hábitats expuestos, por ejemplo
en el follaje, llegan a morir en cuestión de minutos o de horas si la humedad relativa no
es cercana al 100% (Koppenhöfer y Kaya 2003).
5.3. Radiación
La radiación es otro factor ambiental que afecta a los nematodos. La exposición
directa a la radiación ultravioleta de la luz solar es perjudicial para los NEP, ya que ésta
puede inactivarlos y matarlos en muy poco tiempo (Koppenhöfer y Kaya 2003). Es por
esta razón que se recomienda minimizar esa exposición directa aplicando los productos
biológicos que contienen los nematodos entomopatógenos en las horas más tempranas de
la mañana o por la noche, o utilizando suficientes cantidades de agua al aplicar los
juveniles en el suelo (Koppenhöfer y Kaya 2003).
5.4. Textura del suelo
La textura del suelo también tiene un efecto sobre la supervivencia de los
nematodos entomopatógenos; ello debido posiblemente a la cantidad de oxígeno
disponible en el suelo. Al respecto, Koppenhöfer y Kaya (2003) afirman que por lo
general, los JI tienen menor probabilidad de supervivencia en suelos de texturas finas o
arcillosas, quizás debido a un tamaño más reducido de los poros, que provoca menores
niveles de oxígeno. El contenido de oxígeno también puede ser limitado cuando hay una
28
saturación del suelo con agua o un alto contenido de materia orgánica (Koppenhöfer y
Kaya 2003).
5.5. pH
En cuanto al pH del suelo, Koppenhöfer y Kaya (2003) afirman que éste no afecta
fuertemente la supervivencia de los nematodos y señalan que valores de pH entre 4 y 8 no
varían en su efecto sobre los juveniles infectivos, sin embargo, cuando el valor de pH es
de 10, su supervivencia declina con rapidez. Al respecto, Bogantes et al. (2018) encontró
que las soluciones de FeCl3 al 5,5 % con un pH de 0,81 causan la muerte de H.
bacteriophora.
Así mismo, entre las distintas soluciones utilizadas para la formación de cápsulas,
las cápsulas formadas por alginato de sodio goteado sobre CaCl2 al 4,4% (p/v)
presentaron el pH más adecuado para la sobrevivencia de los nematodos, siendo el
alginato de sodio de un pH 8,12, mientras que el CaCl2 tenía un pH 7,12.
5.6. Salinidad
Según Thurston et al. (1994), la salinidad presenta efectos negativos limitados
sobre los nematodos entomopatógenos, aún en el caso de contenidos de sales que
sobrepasan con mucho los niveles de tolerancia de la mayoría de los cultivos.
Koppenhöfer y Kaya (2003) señalan al NaCl como una sal que no afecta la sobrevivencia
de Steinernema glaseri cuando se encuentra en altas concentraciones, y por el contrario,
en cantidades altas disminuye la sobrevivencia de H. bacteriophora. En el caso de las
sales KCl y CaCl2, éstas son mencionadas por Griffin et al. (1994) como compuestos que
no afectan la sobrevivencia de los nematodos.
29
6. Uso comercial de los nematodos entomopatógenos
Los productos de combate biológico a base de NEP han sido utilizados en el
mundo, muchos de los cuales existen hoy en día en el continente europeo, Estados
Unidos, América Latina y Japón, entre otros países (Rodríguez et al. 2012). En cuanto a
formulaciones, Cruz et al. (2017) afirman que las formulaciones actualmente
desarrolladas se encuentran clasificadas en dos tipos: formulaciones para almacenamiento
y transporte y formulaciones para aplicación directa en el campo. De acuerdo con dichos
autores, dentro de las primeras se encuentran las suspensiones acuosas, las esponjas
sintéticas, los geles y las arcillas y polvos, mientras que en las segundas se tienen los
geles y los cadáveres infectados.
Particularmente en Costa Rica, se pueden encontrar algunos productos comerciales
a base de NEP que están actualmente registrados en el Servicio Fitosanitario del Estado;
los cuales son fabricados por la empresa Biobest S.L. y los comercializa la empresa BIO
CONTROL S.A. (S.F.E. 2016). De ellos se hablará a continuación.
6.1. Steinernema-System
Este producto se ha recomendado para el combate de plagas en cultivos de
invernadero y se basa en una cepa seleccionada del nematodo entomopatógeno
Steinernema feltiae, el cual infecta dípteros de la familia Sciaridae, y moscas minadoras
Liriomyza spp., así como trips de la especie Frankliniella occidentalis; el nematodo debe
ser aplicado al follaje para que pueda infectar a los trips y a Liriomyza spp. La bacteria
simbionte de este nematodo pertenece al género Xenorhabdus.
El producto se comercializa en formulación de gel, en envases con diferentes
cantidades de nematodos en etapa juvenil, a saber, 5 x106, 5,0 x107, 2,5 x108 y 1,25 x109
nematodos de S. feltiae (Biobest 2016). El gel es disuelto en el agua de aplicación, de
modo que los nematodos se encuentran suspendidos en la solución (Biobest 2016). Puede
además aplicarse en una amplia variedad de cultivos anuales y perennes, tales como
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aguacate, arroz, café, caña de azúcar, chile dulce, cebolla, palma aceitera, fresa,
ornamentales, tomate, papaya, pepino, melón, lechuga, entre otros (S.F.E. 2016).
6.2. Heterorhabditis-System
El ingrediente activo de Heterorhabditis-System es una cepa seleccionada del
nematodo entomopatógeno Heterorhabditis megidis. Es efectivo para el combate de
larvas de gorgojos de la especie Otiorhynchus sulcatus en el suelo y en los cultivos en
macetas (Biobest 2016).
Los envases del producto se comercializan con contenidos de aproximadamente
5x106 y 5x107 nematodos juveniles que alcanzan para aplicar en un área de 5 m² y 50 m²
respectivamente (Biobest 2016). Durante su formulación los NEP se colocan en envases
con arcilla como material de soporte, del cual se separan al mezclar el producto con agua
al formar una suspensión (Biobest 2016). Los cultivos en los que se puede aplicar
Heterorhabditis-System son los mismos en los que se puede usar Steinernema-System
(S.F.E. 2016).
6.3. Phasmarhabditis-System
Phasmarhabditis-System es un producto cuyo ingrediente activo es una cepa
seleccionada del nematodo biocontrolador Phasmarhabditis hermaphrodita, que ataca
babosas, a las cuales busca en el suelo, las parasita y las y las mata. El producto se aplica
al suelo por medio del riego (Biobest 2016).
Phasmarhabditis-System es comercializado en envases con cantidades de P.
hermaphrodita de 12x106 para aplicaciones en un área de 40 m2 y de 3x107 para
aplicaciones en un área de 100 m² (Biobest 2016). El producto viene formulado en gel
con material inerte, el cual se disuelve al mezclarse con el agua liberando así los
nematodos, que quedan en suspensión después de llevar al tanque de tratamiento y añadir
31
el resto de agua (Biobest 2016). Es apto para ser utilizado en los mismos cultivos de los
casos anteriores (S.F.E. 2016).
6.4. B-Green
El biocontrolador contenido en B-Green es una cepa seleccionada del nematodo
entomopatógeno H. bacteriophora, el cual parasita larvas de escarabajos, principalmente
Phyllopertha horticola; que causan daños en céspedes y campos verdes (Biobest 2016).
Este producto también es idóneo para el combate de otras especies de coleópteros tales
como el gorgojo O. sulcatus. Para un efecto óptimo se requiere que el suelo esté húmedo
y que haya una temperatura mínima de 12°C las cuatro semanas posteriores a su
aplicación (Biobest 2016).
B-Green se suministra en una formulación de gel; dependiendo del envase, contiene
50 ó 500 millones de nematodos juveniles (Biobest 2016). Mezclando con agua se
obtiene una suspensión de nematodos, que debe ser vertida sobre la superficie a tratar.
Los envases de 50 y 500 millones de nematodos permiten respectivamente el tratamiento
de una superficie de 100 m² y 1000 m² (Biobest 2016).
Debido a que los nematodos entomopatógenos se ven afectados por las condiciones
ambientales descritas en el punto 5, existe la necesidad del desarrollo de formulaciones
que protejan estos organismos para garantizar su permanencia en el suelo.
7. Encapsulamiento de nematodos entomopatógenos
En los últimos años la investigación de formulaciones novedosas para el combate
biológico tales como la bioencapsulación, ha aumentado notablemente, debido a una
demanda creciente de agentes de combate biológico microbiano (Vemmer y Patel 2013).
Actualmente existe una gran variedad de métodos de encapsulamiento para la
formulación de agentes biocontroladores, entre ellos los nematodos entomopatógenos
(Vemmer y Patel 2013).
32
La formulación adecuada de los NEP en cápsulas tiene una serie de ventajas sobre
otros tipos de formulaciones de esos organismos. Entre esas ventajas se puede mencionar
la capacidad de prolongar la vida útil de los nematodos, permitir una mejor manipulación
del producto, la disminución del número de aplicaciones y las dosis de aplicación
(Bashan, 1986, 1998, Mc Loughlin, 1994, Cassidy et al. 1996, Vassilev et al. 2001 a, b,
c; Mnyone et al. 2009; Bogantes et al. 2018). Vemmer y Patel (2013) afirman además
que la encapsulación de un biocontrolador dentro de una matriz lo protege de las
agresiones provocadas por el estrés biótico y el abiótico (causados por factores tales
como organismos antagonistas del suelo, contaminantes, estrés mecánico, temperatura,
sequía, luz UV, etc.), proporcionándole una mayor duración de su actividad metabólica
durante el almacenamiento y luego de ser aplicado.
Los materiales utilizados para formar la matriz básica de la cápsula son polímeros
llamados "materiales de cápsula"; entre los cuales se pueden mencionar sustancias
naturales como el alginato, el almidón, la celulosa, la pectina, agar/agarosa, el quitosano,
gelatinas, ceras, y sintéticas como los poliuretanos, poliamidas y polímeros basados en la
sílica (Vemmer y Patel 2013, Bogantes et al. 2018). Otras sustancias que también se
utilizan en las formulaciones son el agua, residuos de ácidos o bases para el ajuste de pH,
contraiones, residuos de disolventes y además suelen usarse de 1 a 5 aditivos para la
mejora del producto (Vemmer y Patel 2013).
La formación de cápsulas por gelación iónica con alginato ha sido muy utilizada
para preparar formulaciones para el combate de plagas (Connick, 1988, McLoughlin,
1994). Este método de encapsulamiento consiste en la formación de un hidrogel como
resultado del contacto de una solución de cationes divalentes con alginatos (Thiele y
Andersen 1955, Thiele y Cordes 1967, Bogantes et al. 2018). Una solución de alginato de
sodio que contiene los biocontroladores vivos se deja caer en una solución con cationes
divalentes que forman una red iónica, luego de lo cual se solidifican las gotitas en su
superficie en cuestión de milisegundos, mediante una gelación ionotrópica, en la cual los
cationes reaccionan con las cargas negativas de las cadenas del polímero, formando así
una estructura tridimensional rígida que contiene agua (razón por la cual se le llama un
33
hidrogel) (Figura 3), a través de la cual los cationes se difundirán en la gotita de líquido,
reticulando desde el exterior hacia el interior de la misma, y formando así cápsulas de
centro gelificado (Vemmer y Patel 2013, Hiltpold 2015, Bogantes et al. 2018). Bogantes
et al. (2018) evaluaron los polímeros alginato, carboximetil celulosa (CMC), pectina y
gelatina para la formación de cápsulas encontrando que únicamente el alginato presentó
las condiciones adecuadas para la formulación del nematodo.
Peters (2016) afirma que las perlas de alginato protegen a los nematodos de la
desecación, de manera que tienen potencial para ser aplicadas como cebo al follaje de los
cultivos; además, la elaboración de formulaciones de alginato de liberación lenta han
sido, en la actualidad, de gran interés para ser utilizadas en el suelo. Sin embargo, se debe
tomar en cuenta la capacidad de este tipo de cápsulas para mantener viables los
biocontroladores contenidos en ellas, en combinación con otros factores externos, tales
como el tiempo, la temperatura, la humedad ambiental, etc. Así por ejemplo, Chaerani et
al. (2001) realizaron un estudio para evaluar el efecto de cápsulas de alginato en la
preservación de la sobrevivencia de nematodos de la cepa H. indica PLR2. Ellos
encontraron que con las cápsulas de alginato los nematodos podían presentar una
viabilidad de hasta un 61,10 % luego de tres meses de almacenamiento a 10 °C; además,
afirmaron que los nematodos sobrevivieron durante 18 semanas a 5 °C y 12 semanas a 25
°C. Umamaheshwari et al. (2005), por su parte, señalaron una sobrevivencia del
nematodo del 100 % hasta cuatro semanas a 5 °C y hasta dos semanas a 25 °C.
34
Figura 3. Método de encapsulamiento de nematodos con alginato de sodio y CaCl2. :
A) juveniles infectivos suspendidos en el polímero polianiónico y goteados
sobre la disolución de catión o polímero policatiónico; B) representación
de una cápsula con nematodos basada en biopolímeros polianiónicos
gelificados. Fuente: Bogantes et al. (2018).
Por otra parte, también es posible crear cápsulas inversas, las cuales se
caracterizarán por tener centro líquido (Hiltpold 2015). En este caso se procede a gotear
la disolución del catión con los nematodos suspendidos en ella (Figura 4) sobre la
disolución del alginato. Al igual que como ocurre al gotear el biopolímero sobre la
disolución catiónica, la superficie de la gota se solidifica y hay entrecruzamiento de las
cadenas del alginato a causa de la formación de enlaces coordinados entre el catión y los
grupos carboxilo de éstas, lo que produce cápsulas con estructura tridimensional
(Hiltpold 2015). Este método de encapsulamiento hace que los cationes se difundan
35
desde el centro de las cápsulas hacia afuera, produciendo de esta forma el centro líquido
característico de las mismas (Hiltpold 2015).
Figura 4. Método de encapsulamiento de nematodos con alginato de sodio y CaCl2:
goteo de la suspensión de CaCl2 sobre la disolución de alginato. Fuente:
Bogantes et al. (2018), con modificaciones.
Bogantes et al. (2018) evaluó la formulación de cápsulas inversas goteando cloruro de
calcio sobre alginato y PAAHCl (policlorhidrato de alilamina) + Ca2+ + Fe3+ sobre
carboximetilcelulosa. Sin embargo, no logró formar cápsulas con los reactivos utilizados.
Al respecto, Hiltpold et al. (2012) encontraron que las cápsulas de centro líquido se
pueden obtener agregando xantano a la solución de CaCl2, ya que este reactivo evita la
formación de filamentos cuando la disolución utilizada es muy fluida, propiciando así la
formación de esferas.
36
8. La polilla grande de la cera Galleria mellonella Linnaeus, 1756
La especie Galleria mellonella o polilla grande de la cera (conocida en el idioma
inglés como “greater wax moth”), es un insecto perteneciente al Orden Lepidoptera y a la
Familia Pyralidae, en la cual se encuentra una amplia cantidad de especies, lo que la hace
una de las más numerosas familias dentro de los lepidópteros (Rodríguez 2015). El
nombre común de este insecto se debe a su alimentación, ya que consume la cera, la miel
y el polen de los panales de abejas y, además, construye galerías y puede llegar a destruir
por completo las colmenas, todo lo cual lo convierte en una de las plagas más importantes
de los apiarios en muchas partes del mundo (Lloret 2006). Ésta es una especie muy
utilizada en estudios de patología y fisiología de insectos (Lloret 2006).
La clasificación taxonómica de Galleria mellonella es la siguiente (UniProt 2018):
Reino Metazoa
Filo Arthropoda
Clase Hexapoda
Subclase Pterygota
Orden Lepidoptera
Superfamilia Pyraloidea
Familia Pyralidae
Subfamilia Galleriinae
Género Galleria
Especie Galleria mellonella
Los diferentes estados de G. mellonella son cuatro, a saber, huevo, larva, pupa y
adulto. Todos los estadíos larvales son susceptibles a la infección por el nematodo.
El ciclo de vida de G. mellonella puede variar dependiendo de las condiciones
ambientales; éste puede acelerarse considerablemente bajo condiciones ambientales
óptimas tales como temperaturas altas más o menos constantes (de 26 °C a 38 °C) y una
37
mayor humedad relativa (75% a 85%), completando todas sus etapas en 30 a 60 días
(Goodman 2003, Neira 2006, Rodríguez 2015). Por otra parte, cuando las condiciones
son desfavorables, por ejemplo, con temperaturas bajas, el ciclo puede completarse en 5
meses (Goodman 2003, Neira 2006).
Las palomillas hembras colocan los huevos en las celdas de las colmenas
(Goodman 2003). En condiciones óptimas, los huevos eclosionan de 3 a 5 días después
de la postura (Williams 1990). Las larvas que salen de los huevos se caracterizan por
tener fuertes mandíbulas y son muy activas; éstas crean túneles y galerías que envuelven
con seda (Goodman 2003). Una vez que la larva está lista para convertirse en pupa, se
envuelve dentro de un capullo de seda tejido por ella (Goodman 2003). La duración del
estado de pupa es de 8 a 15 días aproximadamente; luego de dicho periodo ocurre la
emergencia del adulto (Goodman 2003).
Luego de haber emergido del capullo, las palomillas hembras y machos buscan
aparearse; para ello la hembra emite feromonas que atraen al macho, el cual al percibirlas
busca a la hembra y, una vez que la ha encontrado, ocurre la cópula (Goodman 2003).
Después de haber tenido lugar el apareamiento, la hembra realiza la puesta de huevos,
iniciándose así un nuevo ciclo de vida para esta especie (Goodman 2003).
Se ha encontrado que G. mellonella es muy susceptible a los nematodos
entomopatógenos, de modo que cuando ésta es infectada por NEP muestra síntomas
claramente distinguibles; esta característica, junto con otras ventajas que proporciona la
larva tales como ser criadas con facilidad y su alta disponibilidad, la hacen ideal para ser
utilizada en estudios en los que se desea probar la eficacia de productos a base de NEP
para el combate de plagas (Bogantes 2016). Por otra parte, Stock y Goodrich (2012)
recomiendan inoculaciones de nematodos de Heterorhabditis en larvas de G. mellonella a
razón de 20 JI por larva, en el cultivo in vivo.
A continuación, en la Figura 5 se muestra una fotografía de una larva de G.
mellonella.
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Figura 5. Larva de G. mellonella. Fuente: Martiré (INPN 2018).
METODOLOGÍA
1. Localización de la investigación
La investigación fue llevada a cabo en el Centro de Investigaciones Agronómicas
(CIA) de la Universidad de Costa Rica, en San Pedro de Montes de Oca. Los
experimentos respectivos se realizaron en las instalaciones del Laboratorio de
Microbiología Agrícola del CIA.
La metodología que a continuación se describe está basada en parte en los
procedimientos seguidos por Goud et al. (2010) y Bogantes et al. (2018).
2. Material biológico
2.1. Organismos utilizados
Se utilizó el nematodo Heterorhabditis sp. (especie nueva en proceso de
denominación) de la cepa CIA-NE07, obtenido de la colección de cepas del Laboratorio
de Microbiología Agrícola (Vidaurre 2016). También se utilizaron larvas de G.
mellonella de un pie de cría perteneciente a dicho Laboratorio, el cual se ha mantenido
39
mediante la reproducción de los adultos obtenidos dentro de dicho pie de cría y la
incorporación al mismo de más individuos provenientes de apiarios.
2.2. Cría del material biológico
2.2.1. Galleria mellonella
Para la cría de G. mellonella, se suministró a las larvas el sustrato alimenticio
necesario para su crecimiento y desarrollo, el cual debió cambiarse con regularidad (cada
semana como mínimo). Dicho alimento se obtenía mezclando afrecho con una cantidad
de miel suficiente para humedecer ligeramente el cereal, utilizando, de esta forma, una
proporción aproximada de 55 g a 60 g de miel por cada 100 g de afrecho. El sustrato
viejo era extraído del recipiente en el cual se encontraban los insectos, separando
cuidadosamente las larvas y las pupas del mismo, y se dejaban las larvas con el sustrato
más reciente. Las pupas encontradas se pasaban a otro recipiente para evitar que las
larvas las dañaran por canibalismo.
2.2.2. Heterorhabditis sp.
Para mantener las poblaciones de nematodos de Heterorhabditis sp. se realizar
inoculaciones a larvas de estadios avanzados de G. mellonella o de insectos de la familia
Tenebrionidae (Orden Coleoptera), tomando con una pipeta Pasteur 1 ml de suspensión
de agua desionizada con nematodos que habían sido guardados en botellas de vidrio
esterilizadas, la cual era luego rociada sobre cuatro o cinco larvas contenidas en un plato
Petri de 8,5 cm de diámetro con dos discos de papel filtro en el fondo; este procedimiento
se realizó según la cantidad de larvas requeridas para los experimentos. Posteriormente se
les colocaba las tapas a los platos Petri y se guardaban en la oscuridad por alrededor de
una semana, para dar tiempo a que las larvas murieran por la infección.
Una vez que las larvas habían muerto, se lavaron con agua desionizada con ayuda
de una pizeta y se rociaron con alcohol de 70 %, repitiendo este procedimiento tres veces,
40
luego se secaron con papel absorbente. Los cadáveres fueron colocados en trampas
White, que consistían en tapas de platos Petri plásticos de 5 cm de diámetro ubicadas
dentro de un plato Petri de vidrio de 9 cm de diámetro. Al plato interno se le colocaron
dos discos de papel filtro seco sobre el que se pusieron de dos a cuatro larvas de G.
mellonella. Posteriormente se adicionaron aproximadamente 9 ml de agua desionizada
dentro del plato grande de manera que no se mojara el plato interno. Los platos Petri
grandes se cubrieron con sus respectivas tapas y se guardaron en la oscuridad dentro de
cajas plásticas.
Las trampas fueron revisadas después de 1 semana para ver si los JI habían migrado
hacia el agua, lo cual podía detectarse al observar una turbiedad blanquecina evidente en
el agua y observando también al estereoscopio los nematodos contenidos en las trampas.
De esta forma, al comprobar altas densidades de población de nematodos en las trampas,
éstos eran extraídos y colocados en botellas de vidrio esterilizadas para su posterior
utilización.
3. Formación de cápsulas de Alginato-Ca y Ca-Alginato con tres
concentraciones de nematodos
Se utilizaron dos metodologías para la formación de cápsulas: goteando el alginato
de sodio sobre cloruro de calcio (Alginato-Ca), con lo cual se generaron perlas con el
centro gelificado, y goteando el cloruro de calcio sobre la disolución de alginato de sodio
para formar cápsulas de centro líquido (Ca-Alginato).
3.1. Formación de cápsulas de Alginato-Ca con tres concentraciones de
nematodos
Se prepararon soluciones de alginato de sodio al 4,0 % (p/v) en agua desionizada,
con mezcla continua de 10 a 15 minutos. Se prepararon además suspensiones de 2000
JI/ml, 3000 JI/ml y 4000 JI/ml, cada una de las cuales se mezcló con la solución de
alginato correspondiente para obtener una concentración final de alginato al 2,0 %. Esta
41
preparación fue utilizada para obtener las cápsulas con centro gelificado, para lo cual, con
ayuda de una micropipeta, se procedió a gotear el alginato con agitación constante, sobre
una disolución de cloruro de calcio dihidratado (CaCl2∙2H2O) al 4,4 % (p/v) preparado
con agua desionizada, para obtener cápsulas de alginato de calcio de aproximadamente
0,4 cm de diámetro, dentro de las cuales se encontraban los nematodos. Para lograr
obtener cápsulas con dicho diámetro, se utilizó una punta de micropipeta de 1–10 ml a la
cual se le había realizado un corte de aproximadamente 0,5 cm desde su parte más
estrecha. Las cápsulas se dejaron en reposo en la solución durante aproximadamente 30
minutos, y posteriormente se les realizaron lavados en un colador con agua desionizada.
3.2. Formación de cápsulas de Ca-Alginato con tres concentraciones de
nematodos
Se realizaron varias pruebas para la obtención de cápsulas de Ca-Alginato con
características deseables, tales como: forma esférica, consistencia lo suficientemente dura
para no deformarse al contacto con superficies planas y diámetro de aproximadamente
0,4 cm. Dichas pruebas fueron llevadas a cabo antes de iniciar los experimentos con los
nematodos.
Para preparar las cápsulas de centro líquido, se evaluaron disoluciones de alginato
de sodio de 0,5 %, 2,5 %, 3,5 % y 4,5 % (p/v) en agua desionizada con mezclas de
CaCl2∙2H2O al 2,0 %, 3,0 %, 4,0 % y 6,0 % (p/v) con o sin xantano al 0,4 % en agua
desionizada, de acuerdo con lo que se observa en el Cuadro 1. Dicho Cuadro muestra las
concentraciones de los diferentes reactivos utilizados, la altura de goteo y el tipo de
micropipeta empleada.
42
Cuadro 1. Primeras pruebas de preparación de cápsulas de Ca-Alginato.
Prueba CaCl2
(g/100 ml)
Alginato
(g/100 ml)
Xantano (0,4
g/100 ml)
Altura de
goteo
(cm)
Micropipeta
utilizada
1 2,0 2,5 no 5 1-10 ml
2 2,0 3,5 no 5 1-10 ml
3 2,0 4,5 no 5 1-10 ml
4 2,0 0,5 no 5 1-10 ml
5 2,0 0,5 si 5 1-10 ml
6 2,0 0,5 si 1 1-10 ml
7 2,0 0,5 si 1 0,5-10 μl
8 2,0 0,5 si 5 0,5-10 μl
9 3,0 0,5 si 1 0,5-10 μl
10 3,0 0,5 si 5 0,5-10 μl
11 4,0 0,5 si 5 0,5-10 μl
12 6,0 0,5 si 5 0,5-10 μl
13 6,0 0,5 si 5 1-10 ml
14 2,0 0,5 si 1 10-100 μl
15 2,0 0,5 si 5 10-100 μl
Nota: el orden de las pruebas en el Cuadro 1 corresponde al orden cronológico en que se llevaron
a cabo.
En las pruebas de la 1 a la 4 se utilizaron todas las concentraciones ya mencionadas
de alginato con 2,0 % de CaCl2, pero no se adicionó xantano a las suspensiones de CaCl2;
posteriormente comenzó a utilizarse dicho reactivo en las demás pruebas. Como puede
verse en el Cuadro 1, tanto las distancias de goteo del cloruro de calcio con respecto a la
disolución de alginato como el tipo de micropipeta usada variaron entre las diferentes
pruebas en las que se incluyó el xantano esto con el fin de probar con cuál de dichas
variaciones se formaban cápsulas con el diámetro requerido (aproximadamente 0,4 cm).
Se aumentaron además las concentraciones de CaCl2 en las pruebas 9 a 13, luego de lo
cual se volvió a emplear la concentración del 2,0 % de este reactivo; sin embargo, la
concentración de alginato con la que se trabajó la mayoría de las veces, a partir de la
prueba 5, fue la de 0,5 %.
43
Otro cambio realizado durante el tiempo en que se llevaron a cabo las pruebas de
formación de las cápsulas consistió en pasar de utilizar un plato Petri de un diámetro
aproximado de 13,8 cm a un beaker de 1000 ml, con el objetivo de aumentar la
profundidad de la disolución de alginato y favorecer la formación de las cápsulas con una
mayor distancia de caída.
Se eligió el procedimiento en el que se obtuvieron cápsulas con las características
deseadas, que consistió en el goteo de 2,0 g/100 ml de CaCl2 con xantano (0,4 g/100 ml)
sobre el alginato (0,5 g/100 ml) -concentraciones que coincidieron con las recomendadas
por Hiltpold et al. (2012) para dichos reactivos- con la micropipeta de 0,5-10 µl y a 1 cm
de altura de goteo sobre el alginato, ya que se formaron cápsulas esféricas de 0,4 cm de
diámetro.
Durante la elaboración de las cápsulas con nematodos, el xantano y el cloruro de
calcio se mantuvieron en agitación continua de 10 a 15 minutos para mezclarlos bien con
el agua desionizada. Las diferentes concentraciones de nematodos utilizadas en las
suspensiones de Ca y xantano fueron de 2000 JI/ml, 3000 JI/ml y 4000 JI/ml.
Una vez obtenidas las diferentes mezclas, se procedió a gotear, para cada
concentración de nematodos, la suspensión de CaCl2 con JI sobre la solución de alginato.
Las cápsulas en formación con los nematodos se dejaron en la solución durante
aproximadamente 4 minutos para obtener el tamaño de cápsulas deseado, y seguidamente
fueron lavadas en la forma previamente descrita en el punto 3.1.
Las cápsulas fueron utilizadas en las evaluaciones de sobrevivencia de JI de
Heterorhabditis sp. CIA-NE07. Debido a que el alginato se acabó luego de haber
realizado dichas evaluaciones, hubo que sustituirlo por otra marca del producto. Primero
se evaluó el uso del alginato Tica Algin SQ 933; sin embargo, este reactivo presentó el
inconveniente de que las cápsulas no se formaron adecuadamente, ya que su estructura
resultaba ser muy frágil al no solidificarse lo suficiente. Dado este problema, se evaluó
posteriormente el uso de alginato marca Sigma-A. En el caso de este reactivo, para lograr
44
la formación de las cápsulas hubo que aumentar la concentración del alginato respecto al
utilizado previamente, tal y como se describe en el cuadro 2.
Primero se aumentó la concentración del alginato a 1 % (1,0 g /100 ml); se
procedió a gotear el CaCl2 sobre dicho reactivo contenido en un plato Petri de
aproximadamente 13,8 cm de diámetro a 1 y 5 cm de altura y con micropipetas de 0,5-10
μl, 10-100 μl y 100-1000 μl. Luego se utilizó una concentración de 1,5 % de alginato (1,5
g /100 ml) y se procedió de igual forma que la anterior. Para ambas concentraciones del
reactivo fue necesario hacer descender las gotas de CaCl2 a través de la disolución del
biopolímero con ayuda de una espátula, ya que la viscosidad del mismo causaba que éstas
se quedaran en la superficie. Se dejaron las cápsulas en la solución de alginato por
periodos de tiempo variables (entre 1 minuto y 30 minutos, dependiendo de la prueba),
vigilando que las cápsulas se mantuvieran en dicha sustancia el tiempo suficiente para
que éstas llegaran a tener un volumen de unos 0,4 cm de diámetro. Luego las cápsulas
fueron sacadas del plato Petri y se lavaron con agua desionizada.
Las cápsulas de la prueba 11 (Cuadro 2) fueron, finalmente, las elegidas. Éstas se
utilizaron en el experimento de evaluación de la mortalidad de larvas de G. mellonella
por los nematodos. Para realizar el encapsulamiento de los nematodos se procedió de la
forma ya descrita en este mismo apartado, con la excepción de que solamente se
encapsularon juveniles infectivos a concentraciones de 3000 y 4000 JI/ml; esto debido a
que ya se habían evaluado cápsulas con 2000 JI/ml en la investigación llevada a cabo por
Bogantes et al. (2018), aunque con resultados satisfactorios, no se alcanzó el 100% de
mortalidad por lo que esta vez se decidió estudiar el efecto de concentraciones más altas
de nematodos sobre los insectos.
45
Cuadro 2. Pruebas de preparación de cápsulas de Ca-Alginato utilizando una nueva
calidad de alginato de sodio, marca Sigma-A.
Prueba CaCl2
(g/100 ml)
Alginato
(g/100 ml)
Xantano
(g/100 ml)
Altura de
goteo (cm)
Micropipeta
utilizada
1 2,0 1,0 0,4 1 0,5-10 μl
2 2,0 1,0 0,4 5 0,5-10 μl
3 2,0 1,0 0,4 1 10-100 μl
4 2,0 1,0 0,4 5 10-100 μl
5 2,0 1,0 0,4 1 100-1000 μl
6 2,0 1,0 0,4 5 100-1000 μl
7 2,0 1,5 0,4 1 0,5-10 μl
8 2,0 1,5 0,4 5 0,5-10 μl
9 2,0 1,5 0,4 1 10-100 μl
10 2,0 1,5 0,4 5 10-100 μl
11 2,0 1,5 0,4 1 100-1000 μl
12 2,0 1,5 0,4 5 100-1000 μl
4. Evaluación de la sobrevivencia de diferentes concentraciones de 2000
JI/ml, 3000 JI/ml y 4000 JI/ml de NEP en cápsulas de Alginato-Ca y Ca-
Alginato
Se evaluó la sobrevivencia de los nematodos en cápsulas de Alginato-Ca y de Ca-
Alginato, utilizando las concentraciones de 2000 JI/ml, 3000 JI/ml y 4000 JI/ml. Para
cada tratamiento, se procedió a colocar 10 cápsulas en un tubo Eppendorf de 2 ml, y se
agregó agua desionizada hasta llegar a un volumen de 1 ml en el mismo; posteriormente
se realizaron las evaluaciones de la sobrevivencia de los NEP el día siguiente a la
colocación de las cápsulas en los tubos. Se utilizaron 5 tubos Eppendorf por tratamiento,
y las 10 cápsulas en cada tubo constituyeron una repetición. En total se contó con 6
tratamientos.
Cada unidad experimental fue procesada mediante el método destructivo, que
consistió en disolver por aparte los grupos de 10 cápsulas con citrato de sodio 0,5 M y
Triton X-100 al 0,1 %, conforme al procedimiento descrito por Goud et al. (2010), con
46
algunas modificaciones realizadas por Bogantes et al. (2018). Dichas modificaciones
consistieron en lo siguiente: se añadió a las cápsulas en el tubo 0,5 ml de citrato, se
agitaron en un vortex durante 15 segundos, y se dejaron las cápsulas en reposo durante 1
hora; luego se realizó otra agitación en el vortex por 30 segundos y se dejó en reposo
durante 1 hora; transcurrido ese tiempo se procedió a realizar una agitación manual para
comprobar que las cápsulas se disolvieron totalmente. Una vez realizado el
procedimiento anterior, se tomaron por aparte 100 μl de cada solución y se distribuyó
dicho volumen sobre una cuadrícula de 0,2 cm2 por cuadro, y se hicieron observaciones
al estereoscopio para determinar la cantidad y la sobrevivencia de los nematodos. De esta
forma, se registró el número de nematodos vivos y muertos, y se analizó la sobrevivencia
según concentración y método de encapsulamiento (Bogantes et al. 2018).
Para el análisis estadístico de los porcentajes de sobrevivencia de los nematodos, se
realizó una prueba de Kruskal-Wallis. Se utilizó el programa estadístico Infostat; el nivel
de significancia fue del 5 %.
5. Evaluación del efecto de nematodos Heterorhabditis sp. a
concentraciones de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml sobre la mortalidad de
Galleria mellonella para las cápsulas de Alginato-Ca.
Se prepararon las cápsulas Alginato-Ca en la forma anteriormente descrita en el
punto 3.1.
Se tomaron grupos de 5 platos Petri que fueron primero desinfectados con alcohol,
y seguidamente se colocó en cada plato un par de discos de papel de filtro; los discos
fueron luego humedecidos rociando tres veces agua desionizada sobre ellos con ayuda de
una botella con pulverizador manual. Larvas de G. mellonella de 1,5 cm a 2 cm,
aproximadamente fueron colocadas en los platos, a razón de 5 larvas por plato. Se
colocaron además las cápsulas en 2 cantidades diferentes, a saber, 2 y 5 cápsulas por
larva, de modo que a cada grupo de 5 platos Petri con larvas de G. mellonella
correspondió un tratamiento de nematodos encapsulados, que incluyó una de las dos
47
concentraciones de JI estudiadas (3000 JI/ml y 4000 JI/ml) y una de las dos cantidades de
cápsulas por larva determinadas. Se incluyó además un tratamiento testigo que consistió
en platos Petri con 5 larvas cada uno, sin agregar cápsulas. En total hubo 5 tratamientos,
cada uno de ellos con 5 repeticiones (5 platos Petri).
Una vez establecidos los tratamientos, éstos fueron puestos por aparte en bolsas
plásticas, que fueron luego cerradas y colocadas dentro de una caja plástica previamente
desinfectada con alcohol, y se mantuvieron a temperatura ambiente (alrededor de 25 ºC).
Al día siguiente se procedió a evaluar la mortalidad de las larvas, contando el número de
larvas muertas por los nematodos; esto se realizó diariamente hasta completar los 10 días
después de la inoculación. Las larvas muertas por la infección causada por los nematodos
fueron identificadas con base en los cambios de coloración que mostraron en el tiempo,
pasando del color característico de la larva viva (larva color crema o parda), a
coloraciones desde el rosado o levemente anaranjado a anaranjado, rojo, morado y
finalmente hasta negro o morado muy oscuro.
Los datos obtenidos fueron posteriormente sometidos a un análisis estadístico con
la prueba de Di Rienzo, Guzmán y Casanoves (DGC), a un nivel de significancia del 5 %,
utilizando el programa Infostat.
6. Evaluación del efecto de nematodos Heterorhabditis sp. a
concentraciones de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml sobre la mortalidad de
Galleria mellonella para las cápsulas de Ca-Alginato.
Se elaboraron las cápsulas Ca-Alginato en la forma descrita en el punto 3.2.
Se tomaron grupos de 5 platos Petri que se prepararon en la forma descrita en el
punto 5. En cada plato se colocaron 5 larvas. Se colocaron además las cápsulas en
cantidades de 2 y 5 cápsulas por larva, de modo que a cada grupo de 5 platos Petri con
larvas de G. mellonella correspondió un tratamiento de nematodos encapsulados, que
incluyó una de las dos concentraciones de JI elegidas (3000 JI/ml y 4000 JI/ml) y una de
48
las dos cantidades de cápsulas por larva. Se incluyó además un tratamiento testigo que
consistió en platos Petri con 5 larvas cada uno, sin agregar cápsulas. En total hubo 5
tratamientos, con 5 repeticiones cada uno (5 platos Petri).
Una vez establecidos los tratamientos, éstos fueron puestos por aparte en bolsas
plásticas, que fueron luego cerradas y colocadas dentro de una caja plástica previamente
desinfectada con alcohol, y se mantuvieron a temperatura ambiente (alrededor de 25 ºC).
Al día siguiente se procedió a evaluar la mortalidad de las larvas, contando el número de
larvas muertas por los nematodos; esto se realizó diariamente hasta completar los 10 días
después de la inoculación. Para identificar las larvas muertas por el nematodo, se
procedió de la misma forma descrita en el punto 5.
Los datos obtenidos fueron luego sometidos a un análisis estadístico con la prueba
DGC, a un nivel de significancia del 5 %, utilizando el programa Infostat.
49
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. Formación de cápsulas de Alginato-Ca y Ca-Alginato con tres
concentraciones de nematodos
En las pruebas 1 a 4 del Cuadro 1, en las que se utilizaron concentraciones de 0,5
%, 2,5 %, 3,5 % y 4,5 % de alginato, se obtuvieron cápsulas deformes (con formas de
sacos huecos o gotas alargadas), suaves y con diámetros mayores a 0,4 cm. Resultados
similares fueron obtenidos al gotear la solución de CaCl2 con el xantano sobre el alginato
al 0,5 % a 1 cm y a 5 cm de altura (pruebas 5 y 6), ya que se formaron hidrogeles grandes
y muy blandos. En todos estos casos se utilizó una micropipeta de 1-10 ml, lo cual
influyó en el diámetro de las cápsulas.
En el caso de la prueba 8, en la que se utilizaron las menores concentraciones de
CaCl2 y de alginato, con adición de xantano y a 5 cm de altura de goteo, se llegaron a
formar gotas pequeñas y huecas. En este caso los goteos se realizaron utilizando una
punta de 0,5-10 μl.
Por otro lado, con el uso de las concentraciones mayores que 2,0 g/100 ml de CaCl2
se formaron cápsulas de diámetros mayores que 0,4 cm, muchas de las cuales presentaron
forma alargada (forma de gota), especialmente cuando se utilizó la altura de goteo de 5
cm sobre la superficie de la solución de alginato, aunque esta deformidad también fue
observada en las cápsulas con concentración de 3,0 g/100 ml al utilizar la altura de goteo
de 1 cm. Las pruebas 14 y 15 también se caracterizaron por dar como resultado cápsulas
de diámetros mayores que 0,4 cm, al gotear la menor concentración de CaCl2 con puntas
de micropipeta de 10-100 μl. En la Figura 6 se presentan las imágenes de algunas de las
cápsulas que se obtuvieron en dichas pruebas.
Los mejores resultados se obtuvieron al gotear 2,0 g/100 ml de CaCl2 con los 0,4
g/100 ml de xantano sobre el alginato a la concentración de 0,5 g/100 ml, utilizando la
50
micropipeta de 0,5-10 μl y a 1 cm de altura de goteo (prueba 7), ya que se formaron
cápsulas esféricas de 0,4 cm de diámetro.
Figura 6. Cápsulas obtenidas en pruebas de optimización del método de formación
de cápsulas de centro líquido (Ca-Alginato): A) cápsulas con forma de
saco huecas; B) cápsulas con forma esférica al estar sumergidas en agua
desionizada; C) cápsulas aplanadas sobre una superficie sólida, señaladas
dentro de los círculos; D) cápsulas con forma de gota.
En referencia al uso del xantano en la formulación de cápsulas inversas, es posible
observar, con base en los resultados obtenidos, que la inclusión de este reactivo en la
disolución de CaCl2 fue fundamental para propiciar la formación de hidrogeles más
esféricos en lugar de estructuras filamentosas, tal y como lo señalaron Hiltpold et al.
(2012). Así mismo, la imposibilidad de Bogantes et al. (2018) de adquirir cápsulas de Ca-
alginato al 1,2 % puede ser explicada por la falta de adición del xantano o de algún otro
reactivo similar en la disolución de CaCl2, ya que tales autores reportaron haber usado
dicha disolución sin haberle agregado ninguna otra sustancia.
La estructura molecular del alginato y la del xantano pueden tener un efecto
considerable sobre la forma que toman las cápsulas de centro líquido. Las moléculas del
alginato, una sal derivada del ácido algínico, se caracterizan por tener una estructura
lineal; dichas moléculas poseen grupos carboxilo que se distribuyen a lo largo de su
estructura (Figura 7). Por otra parte, la molécula del xantano presenta una estructura muy
ramificada, cuya cadena principal está formada por enlaces 1-4 de β-D-glucosa idénticos
a los que se encuentran en la celulosa; a su vez, una de cada dos glucosas en dicho
51
esqueleto está unida por un enlace 1-3 a una cadena lateral corta que contiene dos
manosas y un ácido glucurónico entre ellas y residuos de ácido pirúvico unido a
aproximadamente la mitad de las manosas terminales de las cadenas laterales de la
molécula (Nussinovitch 1997) (Figura 7). Como se observa en la primera imagen
correspondiente al xantano en la Figura 7, no existen grupos iónicos en las grandes
ramificaciones con moléculas de D-glucosa a los cuales puedan unirse los iones de otras
sustancias, mientras que en las cadenas laterales se encuentran grupos carboxílicos,
entrecruzables con los cationes de Ca+2.
Ahora bien, cuando se gotea el CaCl2 sin ningún otro reactivo sobre el alginato, los
cationes de Ca+2 se unen fácilmente a los aniones COO- de las moléculas del alginato en
enlaces coordinados gracias a la estructura lineal de éste, de modo que se crean los
entrecruzamientos de manera apresurada, dando como resultado que no haya tiempo
suficiente para que las esferas de centro líquido sean debidamente formadas. En
contraste, al agregar xantano a la disolución de CaCl2, los cationes de Ca+2 forman
enlaces con los grupos COO- del xantano en las cadenas laterales de su estructura; al
gotear luego la mezcla sobre el alginato, la parte ramificada carente de iones del xantano
actúa como una barrera que evita que ocurra un rápido entrecruzamiento entre el alginato
y los cationes de Ca+2 debido al gran volumen de dichas ramificaciones de glucosa; esa
mayor lentitud con que se lleva a cabo dicho proceso permite que transcurra el tiempo
suficiente para que se formen las cápsulas de Ca-Alginato de manera adecuada, lo cual
explicaría a su vez el centro líquido que las caracteriza y su consistencia más suave que la
consistencia de las cápsulas de centro gelificado.
Es importante indicar que aunque se obtuvieron los resultados más aceptables con
la concentración de 2,0 g/100 ml de CaCl2, la consistencia de las cápsulas no fue lo
suficientemente dura, ya que al colocarlas sobre una superficie plana, los hidrogeles
tendieron a aplanarse después de haber transcurrido algunos minutos (Figura 6). Con
respecto a esto, se debe destacar la importancia de contar con cápsulas resistentes a la
deformación al contacto con superficies sólidas, puesto que este hecho podría provocar
una disminución de la capacidad de retención de los nematodos dentro de los hidrogeles.
52
Figura 7. Estructuras moleculares de los biopolímeros de alginato y xantano.
Arriba: estructuras lineales de biopolímeros de alginato. Abajo:
estructura ramificada del xantano: estructura química general (A);
conformación helicoidal en vista perpendicular (B) y paralela (C) al eje
de la hélice. Fuente: Nussinovitch (1997), con modificaciones.
Por otra parte, en cuanto a las pruebas realizadas con el alginato Sigma-A, se
obtuvieron cápsulas de tamaños de 0,4 cm al realizar los goteos con alginato al 1,0 % y
53
con las micropipetas de 0,5-10 μl y de 10-100 μl, luego de haber transcurrido entre 1 y 2
minutos, mientras que con la micropipeta de 100-1000 μl los diámetros siempre fueron
mayores que el requerido. Cuando se utilizó alginato al 1,5 %, se observó que con las
micropipetas de 0,5-10 μl y de 10-100 μl se formaron cápsulas de diámetros mucho
menores que 0,4 cm. Dichas cápsulas mantuvieron un tamaño menor al deseado, aun
habiendo estado en la solución de alginato hasta por 30 minutos, mientras que al utilizar
la micropipeta de 100-1000 μl las cápsulas se mantuvieron en la solución durante 1
minuto; ese tiempo fue suficiente para la obtención de hidrogeles de 0,4 cm de diámetro.
Se observó además que a una altura de goteo de 5 cm, las cápsulas tendieron a
tomar forma de gotas alargadas o sacos, para ambas concentraciones del reactivo. Con
respecto a la altura de goteo de 1 cm, con la concentración de alginato al 1,0 % se
formaron esferas con extremos un tanto estrechos con las micropipetas de 0,5-10 μl y de
10-100 μl, y sacos deformes con la micropipeta de 100-1000 μl, mientras que con el
empleo del reactivo al 1,5 % dicha altura de goteo fue más favorable para la formación de
las cápsulas.
La prueba en la que se empleó alginato al 1,5 % con goteo de CaCl2 a 1 cm de
altura y micropipeta de 100-1000 μl (Cuadro 2) fue la que dio los mejores resultados , ya
que las cápsulas obtenidas presentaron el tamaño requerido y una forma más esférica,
además de presentar una consistencia más sólida y menos tendiente a la deformación; de
hecho, su calidad en este último aspecto fue incluso mejor que la de las cápsulas de Ca-
alginato empleadas en el experimento de sobrevivencia de los nematodos. Al respecto,
Hiltpold et al. (2012) señalan que las cápsulas de Ca-Alginato obtenidas por ellos en sus
experimentos (utilizaron gluconolactato de calcio en lugar de cloruro de calcio),
presentaron una consistencia gomosa que no resistiría a la presión en la maquinaria
utilizada por los productores en el campo, razón por la cual han continuado investigando
para encontrar alguna formulación alternativa con la cual se logre formar hidrogeles de
mayor dureza, para poder ser aplicados a gran escala en el futuro. Por su parte, Singh et
al. (2006) y Bogantes et al. (2018) notaron una relación entre el aumento de la dureza de
54
cápsulas de alginato y una creciente concentración del biopolímero en la composición de
las mismas.
2. Evaluación de la sobrevivencia de diferentes concentraciones de NEP
en cápsulas de Alginato-Ca y Ca-Alginato
Los resultados obtenidos de la prueba de Kruskal-Wallis para los porcentajes de
sobrevivencia de los nematodos en cada tratamiento se presentan en el Cuadro 3. De
acuerdo con lo observado en el Cuadro 3, no hubo diferencias estadísticas significativas
en la sobrevivencia de los nematodos cuando se utilizaron los dos métodos de formación
de cápsulas y las diferentes concentraciones de JI (p = 0,2048). Con base en los
resultados, se concluye que los porcentajes de sobrevivencia de los nematodos en las
cápsulas fueron muy similares entre sí para todos los tratamientos evaluados. Se debe
notar además, que todos los tratamientos presentaron porcentajes de sobrevivencia
promedio mayores al 92 %.
55
Cuadro 3. Porcentajes de sobrevivencia promedio de los nematodos contenidos en
las cápsulas de Alginato-Ca y Ca-Alginato con concentraciones de 2000 JI/ml, 3000
JI/mL y 4000 JI/mL de nematodos de Heterorhabditis sp.
Tratamiento % Sobrevivencia Número de
JI/Cápsula
Alginato-Ca 2000 JI/ml 93,3 108bc
Alginato-Ca 3000 JI/ml 95,5 119bc
Alginato-Ca 4000 JI/ml 96,4 215c
Ca-Alginato 2000 JI/ml 92,8 27a
Ca-Alginato 3000 JI/ml 95,8 27a
Ca-Alginato 4000 JI/ml 96,4 49ab
p-valor p= 0,2048 p= 0,0001
Valores de p > 0,05 no son significativamente diferentes.
Valores con la misma letra no son significativamente diferentes.
Desde el punto de vista práctico estos resultados implican dos situaciones, primero
que los nematodos presentan una muy alta sobrevivencia independientemente de su
número y forma de preparación, y segundo que pueden ser aplicados un día después de
formulados.
Los resultados de este estudio coinciden con lo reportado por Bogantes et al.
(2018), que logró obtener cápsulas con nematodos viables cuando los hidrogeles se
elaboraron con alginato goteado sobre la solución de calcio. Los autores encontraron
para estas cápsulas una sobrevivencia alta de los nematodos durante 5 semanas, mientras
que no se lograron formar cápsulas inversas.
Por otro lado, Goud et al. (2010) en un estudio en el que evaluaron el efecto de la
temperatura de almacenamiento sobre 9 diferentes concentraciones de nematodos de
Heterorhabditis indica en cápsulas de centro gelificado, encontraron que al incrementar
56
la concentración y el período de almacenamiento, la viabilidad de los JI disminuyó en
todas las temperaturas estudiadas. Sin embargo, también observaron que a la menor
temperatura evaluada (10 ºC), la sobrevivencia de los nematodos fue la más alta. Los
nematodos a las concentraciones de 1000 JI/ml, 2000 JI/ml y 4000 JI/ml mostraron
mortalidades de 1,35 %, 1,5 % y 2,36 % con 10 ºC a los 7 días después de iniciada la
investigación. Estos valores de mortalidad fueron menores que los obtenidos en este
experimento y mayores que los obtenidos por Bogantes et al. (2018) utilizando cápsulas
con las concentraciones de 2 %, 3 % y 4 % de alginato.
Cabe destacar que la mayor cantidad promedio de nematodos encapsulados fue de
215 individuos (Cuadro 3), los cuales fueron extraídos de las cápsulas de centro
gelificado formadas a partir de la suspensión de alginato con 4000 JI/ml; este tratamiento
se diferenció significativamente del número de nematodos presente en las cápsulas
inversas. Por otra parte, las cantidades promedio de nematodos retenidos por las cápsulas
de Alginato-Ca de 2000 JI/ml y 3000 JI/ml fueron 108 y 119, respectivamente, mientras
que el total promedio de Heterorhabditis sp. contenidos en las cápsulas de Ca-Alginato
de 2000 JI/ml, 3000 JI/ml y 4000 JI/ml fueron de 27, 27, y 49 individuos. Tales datos
sugieren que si bien en esta investigación se eligió para las cápsulas preparadas por
ambos métodos un mismo diámetro, 0,4 cm de acuerdo a lo utilizado por Bogantes et al.
(2018), éste no determinó el número de nematodos retenidos en las cápsulas, ya que las
perlas inversas contuvieron un número menor de JI que las de centro gelificado; esto
sugiere que el método de encapsulamiento influye en el número de organismos que
pueden ser capturados en el interior de las cápsulas. De esta forma, es posible que la
consistencia más viscosa de la suspensión de alginato mantenga más aglomerados a los
nematodos cuando se forman las cápsulas de Alginato-Ca, que cuando se forman los
hidrogeles de centro líquido al gotear la suspensión de CaCl2 con los nematodos sobre el
alginato. Otra posible explicación es que se diera una mayor salida de los nematodos en
cápsulas inversas debida a su menor dureza, esto pudo haber ocurrido durante la
elaboración de las mismas, ya que se colocaron en agua antes de ser transferidas a los
tubos Eppendorf.
57
Por otro lado, Bogantes et al. (2018) encontró al determinar el número de JI
encapsulados utilizando suspensiones de nematodos de diferentes concentraciones, 40
nematodos/cápsula para la concentración de 500 JI/ml, 101 nematodos/cápsula para 1000
JI/ml y 246 nematodos/cápsula correspondientes a la concentración de 2000 JI/ml; estos
valores fueron mayores a los obtenidos en este estudio. Esto se debe probablemente a que
el número de nematodos encapsulados fue determinado por dichos investigadores el
mismo día, mientras que en este ensayo el procedimiento se realizó un día después de
elaboradas las cápsulas; también puede deberse a diferencias en el procedimiento para
elaborar las cápsulas (agitación de la suspensión de nematodos, forma de goteo, etc.).
Con base en los resultados obtenidos en esta parte, para los ensayos posteriores se
eligieron las concentraciones más altas, a saber, 3000 JI/ml y 4000 JI/ml.
3. Evaluación del efecto de las concentraciones de 3000 JI/ml y 4000
JI/ml de nematodos Heterorhabditis sp. a las dosis de 2 y 5 cápsulas por
larva sobre la mortalidad de Galleria mellonella para ambos métodos de
encapsulamiento
A continuación, se muestra en el Cuadro 4 los resultados del análisis estadístico
DGC en cuanto a la relación del efecto de dos concentraciones de nematodos de
Heterorhabditis sp. y dos dosis de cápsulas de Alginato-Ca con la mortalidad de larvas de
G. mellonella ocurrida durante los primeros 5 días de evaluación de los tratamientos
(valores acumulados), ya que todas las larvas evaluadas habían muerto a los 5 días de
evaluación, con excepción del testigo.
Como se observa en el análisis, no hubo diferencias significativas entre los tres
tratamientos que presentaron los mayores valores de mortalidad promedio acumulada de
G. mellonella, mientras que el tratamiento en el que hubo una menor mortalidad difirió
significativamente de aquellos; dicho tratamiento corresponde a la combinación de 2
cápsulas/larva de Alginato-Ca con la concentración de 3000 JI/ml, es decir, la menor
58
dosis de cápsulas con la menor concentración de nematodos empleada. De igual forma,
en la Figura 8 se aprecia que la mortalidad promedio acumulada de larvas de G.
mellonella son muy similares entre las concentraciones de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml a la
dosis de 5 cápsulas por larva y entre éstas y el tratamiento de 2 cápsulas por larva con
4000 JI/ml, mientras que con la dosis de 2 cápsulas por larva con 3000 JI/ml se observa
un acumulado de mortalidad que visiblemente difiere de los otros valores.
Cuadro 4. Relación del efecto de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml de nematodos
Heterorhabditis sp. y dosis de 2 y 5 cápsulas por larva de hidrogeles de Alginato-Ca
con la mortalidad promedio acumulada de larvas de Galleria mellonella obtenido
para 5 días de evaluación de los tratamientos.
Valores de p > 0,05 no son significativamente diferentes.
Valores con la misma letra no son significativamente diferentes.
La mortalidad acumulada ocurrida en las larvas debida a la infección por
nematodos es comparada también en la Figura 8 con la mortalidad acumulada debida a
otras causas en las larvas del tratamiento testigo, la cual fue de un valor de 0,8; se
observa en dicho caso que la diferencia entre los tratamientos en que se utilizaron los
nematodos y el tratamiento testigo es alta, lo cual confirma la eficacia de los nematodos
para infectar a las larvas de G. mellonella y causarles la muerte.
Tratamiento Mortalidad promedio
acumulada
2 cáps. Alginato-Ca 3000 JI/ml 48,8a
2 cáps. Alginato-Ca 4000 JI/ml 60,0b
5 cáps. Alginato-Ca 3000 JI/ml 59,2b
5 cáps. Alginato-Ca 4000 JI/ml 56,8b
Valor de p p= 0,0329
59
Figura 8. Efecto de las concentraciones de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml de nematodos
Heterorhabditis sp. y a las dosis de 2 y 5 cápsulas de Alginato-Ca por larva
sobre la mortalidad promedio acumulada de larvas de Galleria mellonella,
para 5 días de evaluación de los tratamientos.
En la Figura 9 puede observarse la cantidad de días que tardaron todas las larvas de
G. mellonella en morir debido a la infección provocada por los nematodos de
Heterorhabditis sp. en los diferentes tratamientos con cápsulas de Alginato-Ca, y se
comparan dichos resultados con la mortalidad promedio de las larvas del testigo ocurrida
por otras causas durante cada uno de los 10 días de evaluación. Como se aprecia en el
gráfico 9, las larvas de G. mellonella comenzaron a morir a partir del día 2 por los
nematodos liberados de las cápsulas. Por otra parte, la muerte de todas las larvas en todos
los tratamientos con cápsulas de Alginato-Ca fue completada el quinto día de evaluación,
como se ha mencionado con anterioridad; sin embargo, en el día 4 puede verse cómo en
el tratamiento T2 (5 cápsulas de 3000 JI/ml por larva) el 100 % de las larvas ya había
muerto.
60
El tratamiento T3 (2 cápsulas de 4000 JI/ml por larva) es una excepción, ya que
hubo una larva en una de las repeticiones que murió sin haber presentado infección por
los nematodos, razón por la cual el porcentaje de mortalidad promedio en dicho
tratamiento se muestra en el gráfico como del 96 %. Sin embargo, como ya se indicó
antes, esto no presentó una diferencia significativa con respecto a los tratamientos T2 y
T4; de hecho, se encontró que en este tratamiento en particular, hubo un mayor
porcentaje de mortalidad en el segundo día de evaluación, en comparación con los demás
tratamientos.
Figura 9. Efecto de las concentraciones de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml de nematodos
Heterorhabditis sp. y a las dosis de 2 y 5 cápsulas de Alginato-Ca por larva
sobre la mortalidad promedio de larvas de Galleria mellonella a través del
tiempo. T1 = 2 cápsulas de 3000 JI/ml por larva; T2 = 5 cápsulas de 3000
JI/ml por larva; T3 = 2 cápsulas de 4000 JI/ml por larva; T4 = 5 cápsulas
de 4000 JI/ml por larva; Testigo = 0 cápsulas por larva.
61
Con respecto al tratamiento T1 (2 cápsulas de 3000 JI/ml por larva), puede verse
una apreciable diferencia en la mortalidad de las larvas causada por los nematodos en el
tercer día de evaluación, en comparación con los demás tratamientos con cápsulas, ya que
dicha mortalidad fue del 40 %, mientras que en los otros tratamientos ésta se encontraba
entre el 68 % y el 84 %. No obstante, al día siguiente la cantidad de larvas muertas
registradas para T1 se elevó hasta un 88 % de mortalidad, lo cual comprobó su eficacia,
muy similar a las de T2, T3 y T4. Tomando en cuenta esto, se hace la observación de que
la diferencia significativa de T1 sobre la mortalidad de G. mellonella a los 5 días de
evaluación con respecto a los otros tratamientos (Cuadro 4) puede deberse al bajo
porcentaje de mortalidad que causó dicho tratamiento sobre las larvas de G. mellonella en
el día 3.
En el Cuadro 5 se muestran los resultados obtenidos del análisis estadístico DGC en
cuanto al efecto en la mortalidad de las larvas de Galleria mellonella de los nematodos
encapsulados correspondientes al método de encapsulamiento Ca-Alginato (valores
acumulados), para los primeros 5 días de evaluación.
62
Cuadro 5. Relación del efecto de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml de nematodos
Heterorhabditis sp. y dosis de 2 y 5 cápsulas por larva de hidrogeles de Ca-Alginato
con la mortalidad promedio acumulada de larvas de Galleria mellonella obtenido
para 5 días de evaluación de los tratamientos.
Variable p
Número de cápsulas 0,1439
Tipo de cápsulas 0,8290
Número de cápsulas x Tipo de cápsulas 0,6665
Valores de p > 0,05 no son significativamente diferentes.
Al igual que en el caso de los tratamientos T2, T3 y T4 de Alginato-Ca, los resultados
observados en el Cuadro 5 muestran que no hubo diferencias significativas entre los
tratamientos con las cápsulas de Ca-Alginato a las diferentes concentraciones de
nematodos y dosis o número de cápsulas por larva, lo cual puede también comprobarse al
observar los resultados de mortalidad promedio acumulada de G. mellonella por
Heterorhabditis sp. en el gráfico de la Figura 10. En dicho gráfico se muestra también la
mortalidad de las larvas en el tratamiento testigo ocasionada por otros factores, la cual
presentó un valor acumulado de 3,2, mientras que en todos los tratamientos con los
juveniles infectivos la mortalidad provocada por éstos a los 5 días de evaluación fue
mayor de un valor de 60.
63
Figura 10. Efecto de las concentraciones de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml de nematodos
Heterorhabditis sp. y a las dosis de 2 y 5 cápsulas de Ca-Alginato por larva
sobre la mortalidad promedio acumulada de larvas de Galleria mellonella,
para 5 días de evaluación de los tratamientos.
La Figura 11 muestra el comportamiento de la variable de mortalidad en G.
mellonella para todos los tratamientos de cápsulas Ca-Alginato y testigo evaluados por
día, durante los 10 días de evaluación. Al igual que como ocurrió con los tratamientos de
Alginato-Ca, en este caso también comenzó a haber muerte de larvas desde el segundo
día de evaluación, lo cual puede verse en todos los tratamientos, excepto en el testigo.
A diferencia de los tratamientos de Alginato-Ca, en el gráfico de la Figura 11 se
muestra que ya en el día 3 ha muerto el 100 % de las larvas en uno de los tratamientos
con cápsulas de Ca-Alginato, específicamente en el tratamiento T6 (5 cápsulas de 3000
JI/ml por larva). Sin embargo, así como lo observado en los tratamientos con cápsulas de
64
Alginato-Ca, es en el día 5 donde se da la mortalidad total de las larvas en todos los
tratamientos con nematodos encapsulados.
También es interesante notar que en el día 2 los porcentajes de mortalidad se
muestran más altos con el uso de las cápsulas de centro líquido que al utilizar las cápsulas
de los tratamientos de Alginato-Ca, ya que en el presente gráfico se observan
mortalidades de más del 40 %, mientras que en la Figura 9, los porcentajes de larvas
muertas no alcanzan el 30 % en ninguno de los tratamientos.
Así mismo, en la Figura 11 se aprecia que en el segundo día de evaluación el
tratamiento T8 (5 cápsulas de Ca-Alginato por larva con concentración de 4000 JI/ml)
presentaba el mayor porcentaje de larvas muertas, un 64 %, el cual superaba por un 20 %
más a los demás tratamientos con nematodos, en cada uno de los cuales había un 44 % de
individuos de G. mellonella muertos por la infección; sin embargo, la mortalidad en T8
fue ligeramente superada al tercer día por el tratamiento T6 (5 cápsulas de Ca-Alginato
por larva con concentración de 3000 JI/ml por larva), en el que, como ya se ha dicho, se
dio el 100 % de mortalidad en ese día.
65
Figura 11. Efecto de las concentraciones de 3000 JI/ml y 4000 JI/ml de nematodos
Heterorhabditis sp. y a las dosis de 2 y 5 cápsulas de Ca-Alginato por
larva sobre la mortalidad promedio de larvas de Galleria mellonella a
través del tiempo. T5 = 2 cápsulas de 3000 JI/ml por larva; T6 = 5
cápsulas de 3000 JI/ml por larva; T7 = 2 cápsulas de 4000 JI/ml por
larva; T8 = 5 cápsulas de 4000 JI/ml por larva; Testigo = 0 cápsulas por
larva.
Bogantes et al. (2018) encontraron al realizar ensayos evaluando diferentes dosis de
cápsulas de centro gelificado y utilizando concentraciones de 250 JI/ml 500 JI/ml y 1000
JI/ml, que a mayor cantidad de JI mayor efecto en la mortalidad de G. mellonella; este
efecto únicamente fue observado en nuestro caso con el tratamiento T1 (2 cápsulas de
Alginto-Ca por larva con concentración de 3000 JI/ml) al evaluar la mortalidad de las
larvas de G. mellonella a los 5 días de evaluación, ya que no hubo diferencias entre
concentraciones en el resto de los tratamientos. Esto se debe probablemente a que en este
experimento se utilizaron concentraciones mayores de JI que en el realizado por Bogantes
et al. (2018), con las que se alcanzó la mortalidad de todas las larvas.
66
Con base en los resultados obtenidos del análisis estadístico realizado para los
tratamientos de Alginato-Ca, se concluye que, al no haber diferencias significativas entre
los tratamientos T2 (5 cápsulas con 3000 JI/ml por larva), T3 (2 cápsulas con 4000 JI/ml
por larva) y T4 (5 cápsulas con 4000 JI/ml por larva), y al haber demostrado ser efectivos
en causar la mortalidad de las larvas de G. mellonella en poco tiempo, se elige el
tratamiento T3 como el más adecuado para la preparación de hidrogeles con centro
gelificado, al ser el tratamiento en el que se empleó un menor número de cápsulas. Por
otra parte, si lo que se toma en cuenta es la ocurrencia de la mortalidad de todas las larvas
en el menor tiempo posible, se eligiría el tratamiento T2, al causar el 100 % de
mortalidad en menos cantidad de días que los demás tratamientos.
Así mismo, con base en la ausencia de diferencias significativas entre los
tratamientos de Ca-Alginato con respecto a su efecto sobre la mortalidad de las larvas de
G. mellonella se eligiría el tratamiento T5 (2 cápsulas con 3000 JI/ml por larva), debido a
que representa la menor concentración de nematodos y la menor cantidad de cápsulas por
larva. Sin embargo, si se desea elegir el tratamiento con el cual se observó la muerte de
todas las larvas en la menor cantidad de días, se elegiría el tratamiento T6 (5 cápsulas con
3000 JI/ml por larva).
En general, tanto los tratamientos de Alginato-Ca como los de Ca-Alginato
demostraron una alta efectividad en la sobrevivencia de los nematodos de
Heterorhabditis sp. y sobre la mortalidad de G. mellonella. En un experimento que
consistió en evaluar la eficiencia en el campo de NEP de Heterorhabditis bacteriophora
sobre el gusano de la raíz del maíz Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera:
Chrysomelidae), Hiltpold et al. (2012) encontraron que, aunque las plantas de maíz
utilizadas en su investigación recibieron significativamente menos daño por el insecto
cuando los nematodos fueron aplicados mediante aspersión con agua y utilizando
cápsulas de centro líquido, en comparación con los tratamientos testigo, las raíces de las
plantas en las que se utilizaron las cápsulas con nematodos recibieron un daño aun
significativamente menor que en el caso en que se aplicaron los nematodos por aspersión;
de esta forma, los investigadores resaltaron el gran potencial del uso de NEP en el control
67
de esta plaga. Dichos autores también observaron que, en otro experimento llevado a
cabo por ellos en el laboratorio, los nematodos fueron capaces de romper las paredes de
diferentes grosores de las cápsulas de centro líquido para infectar exitosamente larvas de
G. mellonella, durante el periodo de una semana.
Pese a lo mencionado en el párrafo anterior, en la presente investigación se
encontraron dificultades en la formulación de las cápsulas de Ca-Alginato que aún deben
de solucionarse, en contraste con la formulación de los hidrogeles de Alginato-Ca. Es por
ello que, desde el punto de vista práctico, se prefiere utilizar las cápsulas de Alginato-Ca
para el combate de plagas.
68
CONCLUSIONES
Las cápsulas inversas que presentaron las mejores características fueron las
elaboradas con 1,5 % de alginato, 0,4 % de xantano y 2,0 % de CaCl2.
Es necesaria la adición de xantano para lograr la formación de las cápsulas inversas.
Los nematodos de Heterorhabditis sp. CIA-NE07 presentaron una alta sobrevivencia
en los dos tipos de cápsulas estudiadas.
Ambos tipos de cápsulas demostraron ser muy efectivos sobre la mortalidad de G.
mellonella.
Las cápsulas de centro gelificado presentaron una mayor capacidad de captura de
nematodos, y una consistencia más rígida que las cápsulas inversas.
Las cápsulas de centro gelificado se pueden producir con mayor facilidad que las
cápsulas de Ca-Alginato.
Desde el punto de vista práctico, se prefieren los hidrogeles de centro gelificado para
el control de plagas.
Se considera que aún es necesario perfeccionar el método de formulación de
hidrogeles de Ca-Alginato para el uso de NEP encapsulados.
69
RECOMENDACIONES
Continuar haciendo pruebas para la obtención de cápsulas de Ca-Alginato para una
consistencia más sólida; esto implica la experimentación con nuevas concentraciones
de los reactivos utilizados, así como la búsqueda y el estudio de otros materiales que
podrían adicionarse a la formulación de los hidrogeles.
Evaluar la sobrevivencia de los nematodos encapsulados durante un periodo de
tiempo mayor al empleado en esta tesis, incluyendo temperaturas de almacenamiento
variables.
Evaluar el efecto de los nematodos encapsulados sobre plagas de interés agrícola.
70
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