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OpsonofagocitosisOpsonofagocitosisOpsonofagocitosis
Carlos Andrés Palma LlanosCarlos Andrés Palma LlanosAlumno de la Carrera de Tecnología Médica Mención
Bioanálisis Clínico, Hematología y Banco de Sangre
Opsonofagocitosis (OPA)• Qué es una Vacuna
• Fundamento de la técnica
C
CC
C
FcR
CR
Receptores FcFcR Afinidad por Igs Distribución Función
celular
Abbas. Inmunología Celular y Molecular. 2004
• Ratones sin la cadena γ del FcγR presentan una deficiencia en la defensa mediada por anticuerpos contra los microorganismos
Abbas. Inmunología Celular y Molecular. 2004
IFN- γ + FcγR
OPA
• Ensayo Clásico por Conteo (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology)
• Citometría de Flujo (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology)
• Fluorometría (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology)
• Métodos microcópicos (sólo mencionado)
Bacterias (target)
• Streptococcus pneumoniae (16)
• Haemophilus influenzae b (2)
• Neisseria meningitidis (1)
• Enterococcus faecalis (2)
• Staphylococcus aureus (2)
OPA clásico(estandarización CDLI.4.4.415-422. 1997 )
Streptococcus pneumoniae (target)CDC
4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F
•Caldo Todd-Hewitt
•420 nm DO 0,5-
0,6
•-70ºC
•1000 UFC/20 ul
Muestras De Suero
• 37 (6 de prevacunación y 31 de post vacunación)
• Vacuna conjugada de polisacárido14-Valente <n=10> o 23-Valente <n=21>
• -70ºC (200ul)
• Sandoglobulina al 6%(referencia)
• Medición de IgG total por ELISA
CPS (10ug/ml)490 nmEstandar suero 89-SF
Células HL-60(efectoras)
• Promielocitos leucemoides
• Maduración
cultivo celular 6x10E5 células /mlANTIBIÓTICOSnitroblue tetrazolium
Opsonofagocitosis
• Efector/blanco (400:1)
• Preparación células efectorasObtención pellet4x10E5 / 40 ulResuspender en buffer de OPA
• 20 ul muestra por pocillo (para cada serotipo)
• 8 diluciones seriadas al doble (1:8 a 1:1024)
• DUPLICADO
• 20 ul de suspención bacteriana (1000 UFC)
• 37ºC 5%CO2, 15’
OPSONIZACIÓN
• 40ul de células HL-60 diferenciadas (4x10E5)
• 45 minutos a 37ºC con mezclado horizontal (220 rpm)
Fagocitosis
•10 ul suero conejo bebé (Complemento)
Happytreefriends.com
• 5 ul en agar Todd-Hewitt
• Toda la noche (60 UFC de base) T0
• Celda de Control complemento (s/Ac’s)
• Celda de control de la fuente de complemento (56ºC)
• Títulos de OPA (≥50% de muerte) son el recíproco de la dilución
Complemento T0
±20%
e.j. 1:8 8
• También se realizó con leucocitos de sangre periférica
• Análisis de Receptores por Citometría
CR1,CR3,FcγRI, FcγRII, FcγRIII,CD15
Algunos resultados…
Sin alteración en la OPA
OPA por FACSCDLI. 5.5.703-710.1998
• Streptococcus pneumoniae
• Suero de prevacunación contiene altos niveles de anticuerpo polisacárido C (C-PS)
• Bacterias con subcultivo 3 veces• Inactivación por calor, alcohol y formaldehído
• marcadas con una solución de fluoresceína isotiocianato (0,5 mg/ml)
• antisuero de conejo
• antisuero humano (56ºC)
• Complemento humano
• PMN de sangre periférica (efector)
OPA por FACS
OPA por FACS…
• Suero (56ºC) y Complemento [2%]
• S.pneumoniae 2.5x10E6 (fuente)
• 30 minutos de opsonización
• 2.5x10E6 PMN
• 30 minutos de fagocitosis
• Fijación con p-formaldehído en tubos FACS
• Análisis por FACScan
• FITC-positivo
• Corrección con FITC-positivo del pocillo s/anticuerpos
• Cálculos por regresión lineal en 25% de FITC-positivo
• Se acopla a la técnica clásica• Una centrifugación • Pellet celular y bacterias dejadas en suspensión• 20ul en placa hija con 40ul de “alamar blue”• Incubación 5-6h• Pocillo de control de complemento lea ≥20,000unidades de fluorescencia
• 530/590 nm para excitación/emisión• Bacteria cambia el indicador de azul a lavanda
OPA por FluorometríaCDLI.12.10.1238-1342.2005
• Los títulos de OPA se determinan como el recíproco de la dilución con ≤50% de la
fluorescencia media detectada en el control del complemento en ausencia de
anticuerpos del suero pero con otros reagentes.
Algunas publicaciones
• Neisseria meningitidis y diferencia bactericida y opsonofagocítica de las distintas subclases de IgG en ratones para un epítope . Scandinavian Journal of Immunology.59, 34-39, 2004
• Enterococcus faecalis usando probióticos como inductores de anticuerpos. Infection 33, 377-379. 2005
• Staphylococcus aureus por relación con infección nosocomial y multirresistencia. IAI 73.10. 6752-6762. 2005
• IgA como opsonina para el neumococo. J. Clin. Invest. 104: 1139-1147. 1999• Niños VIH positivo vacunados contra el neumococo generan niveles similares de anticuerpos IgG que niños sanos, pero la opsonofagocitosis muestra un decrecimiento estadísticamente significativo. CDLI.12.1.165-170.2005
Discusión y Conclusión
• Comparar los niveles de respuesta entre diferentes grupos
etarios, socioculturales, étnicos, etc. JID. 189. 2077-2084. 2004• Presenta variaciones dependientes de recursos
• Pero misma fundamento
• Destacado rol de S.pneumoniae
• Diferenciación entre nivel de Ac’s y funcionalidad
• Posible uso masivo en el futuro
• Comparación mundial Vacunas más específicas