obtencion de adn a partir de estructuras dentarias …
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OBTENCION DE ADN A PARTIR DE ESTRUCTURAS DENTARIAS PARA IDENTIFICACION HUMANA EN CASOS FORENSES
PIEDAD MALAVER CALDERON
TRABAJO DE TESIS COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL
TITULO DE MAESTRIA EN BIOLOGIA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE POST-GRADO MAESTRIA EN BIOLOGIA
ENFASIS GENETICA HUMANA
BOGOTA, D.C. COLOMBIA 2002
OBTENCION DE ADN A PARTIR DE ESTRUCTURAS DENTARIAS PARA IDENTIFICACION HUMANA EN CASOS FORENSES
PIEDAD MALAVER CALDERON
APROBADO
_______________________________________ Director: Dr. JUAN JOSE YUNIS LONDOÑO. MD
Profesor Asociado Departamento de Patología Facultad de Medicina, Instituto de Genética Universidad Nacional de Colombia
Subdirector de Servicios Médicos Yunis Turbay
_________________________ ________________________ Dra. SANDRA GUTIERREZ. Dr. JAIRO SARMIENTO.
MsC. Universidad Javeriana Especialista en Endodoncia. U. N. _____________________________
Dr. HUGO ALBERTO CARDENAS V. Especialista en Antropología Forense. U. N.
________________________ ______________________________ ANGELA UMAÑA M. MPhill LUIS ALEJANDRO BARRERA. PhD
Decana Académica Director de Post-grados
AGRADECIMIENTOS
Expreso mis más sinceros agradecimientos, al Dr. EMILIO YUNIS TURBAY, director científico de SERVICIOS MEDICOS YUNIS TURBAY, por su valiosa
colaboración, permitiendo que utilizara las instalaciones de su laboratorio
para el desarrollo de este trabajo.
Al Dr. JUAN JOSÉ YUNIS LONDOÑO, muchas gracias por su dedicación y
paciencia durante el desarrollo y culminación de esta tesis que con
generosidad me dirigió.
Agradezco al Dr. CARLOS YUNIS LONDOÑO, BIOMOL, por su
colaboración.
Muchas gracias a cada uno de los miembros de MI FAMILIA, por su apoyo y
estimulo incondicional durante el tiempo de estudio.
Transmito mi gratitud a los doctores, CLARA BERNARDA CIFUENTES Y JORGE HUMBERTO VACA M.
Mi agradecimiento al Dr. HUGO ALBERTO CARDENAS V. Jefe Sección
Criminalística, Cuerpo Técnico de Investigación de la Fiscalía General de la
Nación, Seccional Cundinamarca.
Agradezco a la Dra. MARIA VICTORIA MORA I. Jefe Sección Criminalística,
Cuerpo Técnico de Investigación de la Fiscalía General de la Nación,
Seccional Bogotá.
A JAVIER MOLANO, Fotógrafo, Area de Fotografía y Vídeo, Cuerpo
Técnico de Investigación de la Fiscalía General de la Nación, Seccional
Bogotá.
Agradecimientos para las AUXILIARES DE RADIOLOGIA, Facultad de
Odontología de la Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá.
Agradezco al personal técnico y administrativo de SERVICIOS MEDICOS
YUNIS TURBAY S en C: Sandra Patricia, Cielo, Claudia, Adriana, Myriam, Sandra y Nubia, por su colaboración.
A TOBI por su compañía.
A todas las personas muertas y desaparecidas en Colombia, producto de la intolerancia, el odio y la injusticia, para que el Estado les resarza sus derechos y que los victimarios que se los arrebataron violentamente, paguen por sus crímenes.
A donde van los desaparecidos? Busca en el agua y en los matorrales
Y por qué es que se desaparecen? Porque no todos somos iguales
Y cuando vuelve el desaparecido? Cada vez que lo trae el pensamiento
Cómo se le habla al desaparecido? Con la emoción apretando por dentro.
Rubén Blades(Desapariciones).
MAKTUB
NOTA DE ADVERTENCIA: Reglamento de la Pontificia Universidad Javeriana Art. 23 de la Resolución N° 13 de julio de 1946 "La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por los alumnos en sus trabajos de tesis".
RESUMEN
Este trabajo fue realizado para establecer si los diferentes tejidos dentales
(pulpa, dentina y cemento), son fuente de Acido Desoxirribonucleico (ADN),
en muestras forenses. Se utilizaron 20 dientes obtenidos de exhumación de
cadáveres NN. inhumados en bóvedas en el Cementerio Central de Bogotá.
El tiempo de inhumación de los cuerpos fue de 5 años. De cada estructura
dental se retiro, el tejido pulpar, el cual solo estaba presente en 5 de los
dientes de la muestra, la dentina y el cemento fueron retiradas con pieza de
mano de alta velocidad, utilizando fresas de carburo y refrigeración con agua
estéril. Como control positivo de tejidos dentales se utilizó 3 dientes sanos
extraídos en acto quirúrgico. El ADN se extrajo de las 20 muestras mediante
la técnica de Fenol/Cloroformo/alcohol isoamilico con previa decalcificación
de los tejidos duros con EDTA, y fue cuantificado mediante la utilización de
dos kit comerciales Nano-Blot (Lifecodes Corporation) y Quanti-blot (Applied
Biosystems). Luego fue amplificado utilizando la Reacción en Cadena de la
Polimerasa, para la región hipervariable II (HVII) del ADN mitocondrial
(ADNmt). Después de la amplificación y la electroforesis en gel de agarosa,
se comparo la intensidad de la banda de cada uno de los tejidos. La señal de
ADNmt de dentina fue menor que la del tejido pulpar y la de cemento menor
que la de las dos. Lo que nos sugiere que los odontoblastos y
cementoblastos que componen la dentina y el cemento respectivamente, se
encuentran protegidos por tejidos mineralizados, lo cual hace a las
estructuras dentales y sus tejidos resistentes a los estados de putrefacción y
factores ambientales que sufre el cuerpo inhumado, permitiendo obtener
ADN para ser aplicado en identificación humana en casos forenses.
SUMMARY
This work was made to establish if different dental tissues (pulp, dentine and
cement) are source of Acid Deoxyribonucleic (DNA) in forensic samples. 20
teeth obtained of exhumation of corpse NN. buried in vaults in the Central
Cemetery of Bogotá were used. The time of inhumation of the bodies was 5
years. Of each dental, structure retirement the pulpar tissue, which single was
present in five teeth of the sample. The dentine and the cement was retired
with hand piece of high speed, having used carbide burr and refrigeration with
sterile water. As positive control of dental tissues were used 3 healthy teeth
extracted in surgical act.
The DNA it was extracted of the 20 samples by means of the technique of
phenol-chloroform-isoamyl alcohol with previous decalcification of hard
tissues with EDTA, and was quantified by means of two commercial kits, the
use of kit Nano-Blot (Lifecodes Corporation) and Quanti-blot (Applied
Biosystems). Before it was amplified using the Polymerasa Chain Reaction of
the, for the hypervariable region II (HVII) of the mitochondria DNA (mtDNA).
After the amplification and the electrophoresis in agarosa gel, I compare the
intensity of the band of each one of tissues. The signal of mtDNA of dentine
was minor whom the one of the pulpar tissue and the one of cement smaller
than the one of the two.
What it suggests odontoblastic process and cementoblast, that compose the
dentine and the cement respectively they find protege's by mineralised
tissues, which makes to the dental structures and its resistant tissues to the
states of putrefaction and environmental factors that the buried body
undergoes, allowing to obtain DNA to be applied in human identification in
forensic cases.
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCION. 1 2. MARCO TEORICO 5 2.1 Identificación: definición y métodos. 5 2.2 ADN mitocondrial. 16 2.3 Histología y morfología de la estructura dentaria. 19 2.4 Obtención de tejidos dentarios para extracción de ADN. 32 2.5 ADN en tejido dental. 34 2.6 Técnicas para cuantificación de ADN. 38 3. JUSTIFICACION 44 4. OBJETIVO 46 5. OBJETIVOS ESPECIFICOS 47 6. MATERIALES 486.1 Recolección de la muestra. 48 7. MÉTODOS 50 7.1 Obtención de tejidos dentarios. 50 7.2 Extracción de ADN. 51 7.3 Cuantificación de ADN. 52
7.4 Amplificación de ADN Mitocondrial 60 8. RESULTADOS 63
9. DISCUSION 78 10. CONCLUSIONES 90
11. RECOMENDACIONES 91 12. BIBLIOGRAFIA 93 ANEXOS
INDICE DE TABLAS
Pgs. Tabla 1. Muestras obtenidas de cada uno de los tejidos dentarios. 66 Tabla 2. Muestras utilizadas como control positivo de los tejidos dentarios.
66 Tabla 3. Concentración de ADN en tejido pulpar mediante cuantificación de hibridación con los kits comerciales Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche®) y Nano-blot (Lifecodes Corporation)
67
Tabla 4. Concentración de ADN en dentina mediante cuantificación de hibridación con los kits comerciales Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche® ) y Nano-blot (Lifecodes Corporation)
68 Tabla 5. Concentración de ADN en cemento mediante cuantificación por hibridación con sondas alfa- satélites con los kits comerciales Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche®) y Nano-blot (Lifecodes Corporation). 69 Tabla 6. Distribución de las muestras en la cuantificación con el Kit Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche®) de la membrana de la Figura 1 71 Tabla 7. Distribución de las muestras para la cuantificación con el Kit Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche®) de la membrana de la Figura 2 73 Tabla 8. Distribución de las muestras para la cuantificación con el Kit Nano-blot (Lifecodes Corporation) de la membrana de la Figura 3. 75 Tabla 9. Concentración de ADN de tejidos dentales e intensidad en la señal de amplificación de la Región Hipervariable II de ADNmt por PCR. 76 Tabla 10. Ubicación del patrón de peso molecular y de las muestras de la Figura 4. 77
INDICE DE FIGURAS
Pgs. Figura 1. Fotografía digital de la membrana de cuantificación con el Kit Quanti-blot (Applied Biosystems Roche®). 70 Figura 2. Fotografía digital de la membrana de cuantificación con el Kit Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche®) 72 Figura 3. Negativo de fotografía digital de autoradiografia de cuantificación con el Kit Nano-blot (Lifecodes Corporation). 74 Figura 4. Fotografía digital en negativo del producto amplificado de la región Hipervariable II del ADNmt. 77
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Fotografías digitales de Criminalística de campo, durante el proceso de exhumación de los cadáveres de donde se obtuvo la muestra para el estudio. Anexo 2. Descripción de las características clínicas y radiográficas de las estructuras dentarías utilizadas en este estudio. Anexo 3. Imágenes digitales de fotografías y radiografías de las estructuras dentales, utilizadas en este estudio. Anexo 4. Técnica de corte sagital o por el eje longitudinal del diente para acceder a los tejidos dentarios para extracción de ADN.
INTRODUCCION
Colombia se ha caracterizado por manifestar fenómenos de violencia
crónica a través de su desarrollo histórico, donde la muerte ha dejado de ser
un proceso natural, para transformarse en una realidad sistemática originada
por los diferentes generadores de violencia. El conflicto armado día a día se
presenta con mayor intensidad, las normas internacionales sobre Derechos
Humanos y Derecho Internacional Humanitario, principios que limitan el uso
de la violencia en períodos de conflicto armado(ONU), son violadas
intencionalmente por los grupos en conflicto: guerrilleros, paramilitares,
miembros de las fuerzas armadas y delincuencia común; como consecuencia
se presentan víctimas en tal estado de destrucción corporal, que se hace
imposible su reconocimiento o los cuerpos se encuentran en reducción
esquelética por lo que los métodos tradicionales de identificación humana no
son de mayor utilidad en la identificación fehaciente de personas.
La odontología forense es una de las principales ciencias utilizadas
en la identificación de personas en situaciones donde el tiempo que ha
transcurrido desde la muerte y la destrucción del cuerpo hacen imposible el
uso de otros métodos de identificación, por ejemplo, en casos de restos
fragmentados y únicamente pequeñas porciones de los maxilares con
dientes han sido recuperadas (Pfeiffer, et al, 1998). Dentro de las funciones
que el odontólogo forense debe cumplir está el manejo de víctimas fatales en
caso de desastres masivos, donde la identificación adquiere un papel
relevante. En estos eventos, el trabajo interdisciplinario de diferentes
investigadores, patólogos, antropólogos, odontólogos, radiólogos y técnicos
criminalísticos, origina una labor sincronizada para desarrollar el proceso de
identificación cuyos métodos y clasificación cobran vigencia. El elevado
número de fallecidos y el grado de destrucción corporal (mutilación,
carbonización, esqueletización, putrefacción, entre otros), provocan un gran
impacto en la sociedad y en los familiares de las víctimas lo que produce
dificultades para la identificación. En desastres aéreos, posiblemente los más
universales y frecuentes, hay que añadir una particularidad que es la
presencia de víctimas de diferentes nacionalidades. En este tipo de
accidentes los ocupantes quedan reducidos a fragmentos humanos, la
reconstrucción e identificación no se logra por medio de la dactiloscopia en
todos los casos, debido a la destrucción total o parcial de las manos. De la
misma manera la reconstrucción e identificación odontológica, se enfrenta a
dificultades como:
• Que no exista una historia clínica odontológica ante-mortem.
• Que exista pero que no este actualizada por los tanto la
información es insuficiente con respecto a la cavidad oral.
• El trauma que se produce en el cuerpo, es tan fuerte que los
maxilares se pueden encontrar fracturados, fragmentados y/o se pierden
la mayoría de sus estructuras dentales, lo cual hace que un cotejo
odontológico sea imposible de realizar.
El odontólogo forense se puede enfrentar a cadáveres en reducción
esquelética, en donde las difíciles condiciones en las que se recuperan los
restos, la falta de capacitación y/o de conocimientos en Arqueología y
Antropología forense dan como resultado restos óseos mezclados, que
dificultan su individualización e identificación en el laboratorio. Cuando los
restos óseos han sido recolectados adecuadamente se someten a estudios
de antropología física para establecer la cuarteta básica de identificación que
consiste en determinar: edad, sexo, talla, y patrón racial (Rodríguez, 1994).
Los resultados obtenidos del estudio, se comparan con la información
aportada por los familiares de personas desaparecidas para establecer
correspondencias preliminares de identificación. Para confirmarlas se recurre
al análisis del Acido Desoxirribonucleico (ADN), si no existen registros
médicos y/u odontológicos que conduzcan la identificación fehaciente; para
comparar el perfil genético de la víctima con el ADN de los presuntos
familiares. Cuando solo se dispone de los cráneos individualizados, la mejor
fuente de ADN son las estructuras dentales presentes. Como inconveniente,
los dientes pueden presentar patologías como la caries, restauraciones con
materiales como la amalgama de plata, resinas compuestas o tratamientos
de conductos por lo cual son desechados considerándolos no aptos para
extracción del ADN ya que estas condiciones pueden ser inhibidores en los
procesos de extracción y/o amplificación. Cuando la víctima es menor de
edad, entre los 8 y 16 años los dientes no son utilizados debido a que sus
raíces no han terminado de formarse o sus ápices no han sellado la
comunicación con el medio externo que rodea al diente por lo que el tejido
pulpar no existe o esta contaminado. Sin embargo, las estructuras dentales
han demostrado ser el tejido más duro del cuerpo humano y una excelente
fuente de ADN para ser utilizados en la identificación, al compararlo con otros
tejidos del cuerpo. Las estructuras dentales son resistentes a: Altas
temperaturas, humedad, factores ambientales y especialmente a la
putrefacción. Por lo tanto, el desarrollo de metodologías que permitan
obtener ADN de buena calidad de los diferentes tejidos dentales representa
una excelente alternativa como fuente de ADN. Tradicionalmente, solo la
pulpa dental ha sido utilizada para aislar ADN con fines forenses. Pocos o
ningún estudio ha evaluado la calidad y cantidad de ADN presente en los
demás tejidos que permitan llevar a cabo una comparación genética.
2. MARCO TEORICO
2.1. Identificación: Definición y métodos
La etimología de la palabra identificar proviene del Latín identicus que
significa lo mismo y facere que equivale a hacer, se puede definir que
Identificar, es reconocer sí una persona o cosa es la misma que se supone o
se busca (Manual básico de Lofoscopia, 1997).
El principio de identidad tiene un valor diferenciador, por que si todo
objeto es idéntico a sí mismo, es lógico que se diferencie de los demás, por
lo tanto, identificar es reconocer inequívocamente a una persona, una cosa,
un hecho, con base en sus características inherentes.
La identidad tiene un sentido más amplio que la simple referencia a un
nombre, por que él esta contenido en la identificación y esta es el resultado
de la vida misma enmarcada en la historia personal de un individuo.
Trasladando estos conceptos a las ciencias forenses, se tiene que cada
individuo se distingue de los otros por un conjunto de rasgos externos que
permite reconocerlo e individualizarlo.
La criminalística, estudio de la manera como el hombre delinque, es
una ciencia aplicativa que utiliza los conocimientos técnico-científicos de
otras disciplinas como: Química, Física, Medicina, Odontología, Antropología
y la Biología Molecular entre otras, para ser empleadas en la valoración de
los elementos de prueba. Los sistemas de identificación, como disciplinas
científicas de la criminalística, aplican conocimientos, métodos y técnicas
para identificar en forma inequívoca a personas vivas o muertas.
Los seres humanos por naturaleza, necesitamos para la convivencia
familiar y social, diferenciarnos, distinguirnos unos de otros, de esta manera
logramos individualizarnos y asumir así responsabilidades en nuestro papel
como personas naturales.
El Código Civil Colombiano define que la existencia legal de las
personas se inicia a partir del nacimiento cuando el individuo se separa de la
placenta, y termina con la muerte. Así mismo considera personas naturales a
todos los individuos de la especie humana cualquiera sea su edad, sexo,
extirpe o condición (Código Civil Colombiano).
Colombia en las dos últimas décadas ha sufrido las consecuencias de
desastres naturales y accidentales así como de hechos dolosos producidos
por la mano del hombre en donde se han presentado gran número de
víctimas. Para efectos de identificación los cuerpos se clasifican así:
- Reconocibles e identificables.
- No reconocibles pero identificables.
- Difícilmente identificables.
Los métodos de identificación que tienen fundamento para aplicar
prueba pericial en la administración de justicia de acuerdo con el
procedimiento utilizado se clasifican como:
Métodos comparativos: Carta Dental, Dactiloscopia, ADN.
Métodos reconstructivos: Antropología.
Los métodos comparativos son los más utilizados y para su aplicación
se requieren datos ante-mortem. De acuerdo con la veracidad de los
resultados la identificación se puede definir así:
FEHACIENTE: Aquella digna de toda fe y credibilidad, se puede
comprobar técnica y científicamente de una manera irrefutable desde la
prueba pericial.
INDICIARIO o complementario: la individualización se convierte en un
signo aparente pero al mismo tiempo probable, por lo tanto requiere ser
complementado con otros medios de prueba como el testimonio y el
experticio.
Para obtener óptimos resultados con la aplicación de las técnicas
mencionadas se debe cumplir con las actividades que permitan satisfacer
los siguientes requerimientos:
• Coincidencia absoluta entre la información ante-mortem de la persona
desaparecida y el perfil bioantropológico de los restos.
• Coincidencia entre la ventana de muerte asociada al cadáver y el tiempo
que lleva la persona desaparecida.
• Existencia de indicios o evidencias físicas que indican que los restos
pertenecen a una identidad en particular, tales como prendas de vestir,
documentos, y tratamientos quirúrgicos ante-mortem en el cadáver, entre
otros.
En contextos judiciales se concibe la identificación fehaciente de un
cadáver NN en cualquier estado de descomposición o de unos restos
humanos cuando existe un cotejo decadactilar, dental o de ADN positivos.
A partir de los métodos comparativos podemos definir algunos
términos que frecuentemente se utilizan en forma indiscriminada y debemos
tener en cuenta:
RECONOCIMIENTO: Es la acción de distinguir el cadáver por ciertas
características morfológicas, antropológicas, odontológicas, cromáticas, de
señales particulares físicas como cicatrices, tatuajes o cualquier accidente
anatómico. En personas vivas por su timbre de voz o su modo de vestir,
características que son difícilmente modificables pero que pueden variar de
acuerdo a la evolución del ser humano.
INDIVIDUALIZACION : se concibe como la acción de establecer el
conjunto de características biológicas, físicas y síquicas que diferencian a
una persona de las demás en su especie. Desde el punto de vista de la
criminología es importante para el estudio del comportamiento humano en las
diferentes modalidades de los actos delictivos.
FILIACION: Se puede conceptuar como la acción de registrar el
conjunto de señales personales de un individuo. En criminalística son
utilizadas la fotografía forense y la dactiloscopia. También se define filiación
como el lazo de parentesco entre los padres y los hijos para los casos de
investigación de paternidad.
Los diferentes métodos que a través del tiempo se han desarrollado y
utilizado con fines de identificación han sido diversos.
En un principio se manejaban recursos verbales con nombres y
apellidos, posteriormente se utilizaron recursos escritos como la firma y la
filiación. Durante algún tiempo eran frecuentes las marcas en la piel como
tatuajes o marcas degradantes y ofensivas se utilizaban para identificar a
personas como marineros, delincuentes y otros (Moya y Roldan, 1994).
En 1879, Alphonse Bertillon, ideo la técnica de la antropometría
la cual se basa en las medidas óseas como: talla, brazos en cruz, la longitud
y el ancho de la cabeza entre otras. Igualmente utilizo la fotografía
signaléctica o retrato hablado. Estos métodos no llevan a la certidumbre de la
identificación humana por sí solas (Correa, 1990).
En 1891, Juan Vucetich, basándose en las experiencias de
Malphigi, Purkinge y Meissner, utilizó las huellas dactilares para identificar
a los delincuentes reincidentes. La dactiloscopia cuyo origen etimológico es:
dactilos (dedos) y scopeo (examen, observación, estudio), se basa en una
característica universal y es que todo ser humano tiene huellas digitales y su
fundamento científico está en que son: perennes hasta su total
descomposición, inmutables y diversiformes. Esto hace que sean únicas en
cada persona, por estas propiedades ha sido hasta hoy el método más
utilizado en identificación humana fehaciente (Manual básico de lofoscopia).
Una de sus más importantes ventajas es el hecho de que nunca se ha
encontrado en dos personas detalles idénticos en las crestas. Los gemelos
idénticos tienen patrones similares pero no idénticos (Weedn, 1998). El
reconocimiento de las huellas dactilares como una característica de
identificación se origina miles de años atrás, pero está aumento su
importancia en los años 1800s, cuando se utilizó como evidencia para
condenar autores de crímenes y se ha hecho rutinariamente hasta nuestros
días.
La identificación de personas por medio del análisis de las
estructuras dentales tiene su origen en el incendio del Bazar de la Caridad,
hecho que tuvo lugar en París el 4 de mayo de 1897, el incidente involucró
un incendio de grandes magnitudes. Ese año para el evento se construyó
una barraca rectangular de madera barnizada con el techo de cartón
alquitranado. Se instaló un cinematógrafo, que fue colocado cerca de la
salida, una explosión de su lámpara de gas causó el incendio. En mayo de
1997, se conmemoró el centenario de la tragedia, que marca el suceso
creador de la identificación dental en desastres masivos y fue la oportunidad
histórica para agradecer las guías establecidas por los pioneros, Davenport y
Amoedo. Cuando se logró extinguir el incendio, en diez minutos 126
personas habían perdido la vida bajo el efecto de las llamas y otro número de
personas quedaron heridas, o murieron poco tiempo después. Como muchos
cuerpos fueron severamente quemados, su identificación fue difícil y poco
confiable. Cuarenta de los cuerpos no serian identificados; Albert Hans,
Cónsul de Paraguay, propuso la idea de consultar a los odontólogos de las
víctimas. Como las víctimas eran acaudaladas era probable que la mayoría
hubiese recibido algún tipo de tratamiento dental. Por lo tanto llamó a los
doctores Burt, Brault, Davenport, Ducourneau y Godon entre otros. Mr.
Brault reconoció a uno de sus pacientes por una prótesis parcial removible
hecha de oro con dos dientes de porcelana. Mr. Ducournau hizo una
identificación por el descubrimiento de trazos de una inusual extracción
dental que el recientemente había ejecutado. Mr. Burt identificó una víctima
por medio de dos dentaduras parciales de oro, así como Mr. Michael
descubrió una prótesis parcial de oro con cuatro dientes (tres de los cuales
eran naturales!). Mr. Hungenschmdt utilizó una característica distintiva de
agenesia de un incisivo central superior y Mr. Lombard fue capaz de
reconocer un aparato dental de platino colocado el día anterior.
Indudablemente, fue el doctor I. B. Davenport (DDS, New York in 1877 y
M.D., Columbia University in 1879), una extraordinaria figura de la historia
dental, quien hizo una gran contribución en este caso. Fue él quien identifico
a la Duchess de Alecon (miembro de la familia real Francesa y hermana de
Sissi, Emperatriz de Austria). "En el caso de la duquesa, yo complete dos
archivos dentales con el estado de sus dientes y operaciones ejecutadas
durante diecisiete consultas. Estas cubrieron un periodo de más de dos años.
Con la operación más reciente fechada el día 15 de Diciembre de 1896,
menos de seis meses antes del accidente, yo verifique todos los detalles y
particularidades incluidas en mi archivo". En 1898, el Dr. Amoedo, escribió
un tratado sobre el desastre. Este último tuvo gran importancia por el gran
número de víctimas y porque proporciono el primer texto, sobre el uso de la
odontología en la identificación de víctimas en desastres masivos: "EL ARTE
DENTARIO EN MEDICINA LEGAL".
Este desastre masivo dio a Amoedo y Davenport la oportunidad de
construir la creación de la odontología forense (Evenot, 1996).
A partir del 15 de enero de 1993 por medio de la Ley 38, se
adopto en nuestro país la carta dental como método auxiliar de identificación
de personas. Para lograr la identificación por esta técnica, se hace necesaria
una comparación entre los registros dentales ante-mortem con los obtenidos
post-mortem; no se puede esperar una igualdad del 100%, puesto que las
estructuras dentarías pueden sufrir transformaciones por tratamientos
posteriores y no quedan registrados en una historia clínica odontológica o por
perdida post-mortem de algunas estructuras. Esto dificulta la comparación,
ya que para obtener una plena identificación se necesitan como mínimo 12
puntos coincidentes. A mayor número de concordancias, más exacta la
identificación (Ortiz, 1994). Pero si a pesar de existir estas coincidencias hay
una sola que no coincida y sea relevante la identificación no se dará como
fehaciente.
La introducción de la tecnología del ADN en la identificación
judicial y forense por el profesor ingles Alec J. Jeffreys, en 1984, cambio el
ámbito de la investigación criminal. La utilización del ADN en criminalística ha
sido el avance más importante desde que se estableció el uso de las huellas
dactilares como método de identificación fehaciente. Inicialmente Jeffreys
propuso, utilizar secuencias minisatélites, conformadas por secuencias de 15
a 60 nucleótidos; detectó loci minisatélites utilizando un sistema multilocus
probes (MLP) o sondas multilocus. De esta manera podía obtener un patrón
de bandas electroforéticas. Teniendo en cuenta la alta variabilidad de los
sistemas, Jeffreys sostuvo que la probabilidad de encontrar dos individuos
con el mismo perfil genético de ADN en el planeta era casi nula por lo que lo
denominó "DNA fingerprinting" o "huella genética" (Jeffreys, et al, 1985). El
problema del método era que no permitía establecer frecuencias alélicas en
la población ya que no se sabia de que cromosoma provenía cada fragmento
en particular. Jeffreys junto con Nakamura, propusieron entonces el uso de
sondas de ADN capaces de detectar sistemas de VNTRs en un solo locus,
obteniendo el perfil electroforético de una o dos bandas correspondientes a
cada uno de los alelos que posee un individuo. Este método permitió obtener
patrones reproducibles de bandas electroforeticas simples, a la vez que
permite calcular las frecuencias de los alelos en la población (Jeffreys, et al
1985). En los últimos años las investigaciones sobre secuencias cortas de
ADN repetitivo o STRs (Short Tandem Repeats), conformados por 4 a 6
nucleótidos, aunque son menos porlimórficos que los minisatélites, han
desplazado a los marcadores tradicionales, ya que pueden analizarse un
gran número de ellos simultáneamente en una reacción (Keith and Rudin,
1997).
El análisis de ADN provee un avance significativo en los esfuerzos
para lograr la identidad de personas en la investigación criminal, cuando
estamos frente a cadáveres en reducción esquelética que han sido víctimas
de homicidio, desaparición forzada, genocidio, en casos de suplantación de
identidad o en delitos contra la integridad y el pudor sexual. Igualmente, es
de gran utilidad en eventos donde se presentan desastres de masa por
acción de la fuerza de la naturaleza o en accidentes en medios de transporte.
En estos casos es posible la identificación humana utilizando la tecnología
del ADN, cuando los otros métodos de identificación no son aplicables.
Cuando una identificación con métodos convencionales no es posible,
este material biológico puede proveer el enlace para la identificación. En el
análisis de ADN, se ha demostrado que el método más efectivo para su
amplificación es la reacción de PCR(reacción en cadena de la polimerasa),
ya que se generan grandes cantidades de ADN a partir de muestras
mínimas, amplificando fragmentos de ADN específicos (Erlich, 1989). La
reacción de PCR fue descrita en 1985 por Kary Mullis (Premio Nobel) quien
desarrolló esta técnica la cual se caracteriza por ser altamente especifica y
sensible en la detección de ácidos nucleicos. Una muestra de ADN se
mezcla con los cuatro desoxirribonucleótidos y una polimerasa de ADN
resistente a la temperatura, junto con los dos fragmentos de ADN sintéticos
cortos (cebadores o iniciadores) complementarios de las secuencias de ADN
en los extremos 3' de la región que se quiere amplificar. Los primers son
pequeños fragmentos de ADN que identifican e hibridan al final de una región
blanco deseada para amplificar por PCR y su posterior análisis. Los
oligonucleótidos sirven como iniciadores, a los cuales se añade los
nucleótidos durante los pasos de duplicación.
Los avances en la investigación del genoma humano han generado un
aporte revolucionario al campo de la identificación humana. Es así como el
descubrimiento de marcadores genéticos de alta variabilidad entre los
individuos, y la automatización de datos obtenidos del análisis genético,
hacen posible estudiar vestigios biológicos relacionados con hechos
criminales y cotejarlos con personas involucradas en la investigación judicial,
demostrando su uni-procedencia. Este estudio ofrece a la administración de
justicia una herramienta con un alto nivel de certeza, que al lado de otros
análisis forenses igualmente importantes permiten ofrecer una perspectiva
más objetiva para la investigación del crimen o para la identificación de
personas.
Las pruebas de ADN se soportan en fundamentos biológicos
ampliamente conocidos, principalmente la teoría de la herencia, la evolución
y la dinámica de las poblaciones humanas, que explican la diversidad
existente en nuestra especie actualmente. Es precisamente esta variación
acumulada en el material genético durante la historia de las especies, la que
permite identificar personas en los laboratorios forenses.
2.2 ADN Mitocondrial
El ADNmt, provee una valiosa información en algunos casos forenses.
La probabilidad de obtener ADNmt en muestras pequeñas o degradadas es
mayor que para el ADN nuclear ya que cada célula contiene múltiples
mitocondrias y existen varias copias de ADN mitocondrial. El uso del ADNmt
comparado con el ADN nuclear tiene algunas ventajas como herramienta
forense. El ADNmt es altamente polimórfico y presenta un gran número de
copias (10-10³ copias por célula) permitiendo el análisis de muestras con
cantidades limitadas o ADN degradado (Pääbo, et al, 1998). Esto hace que
sea una fuente ideal de ADN para análisis forense. Por lo tanto músculos,
huesos, dientes, sangre y otros tejidos corporales si se encuentran
degradados por el medio ambiente o el tiempo pueden proveer suficiente
material para tipificación del ADNmt. El ADN mitocondrial, es heredado
únicamente por línea materna, así que su análisis se limita a la existencia de
descendientes o ascendientes por línea materna para el cotejo. El análisis de
ADNmt comienza cuando el ADN genómico total extraído de material
biológico tal como dientes, sangre o cabellos es insuficiente o de mala
calidad. Los casos en que la tipificación del ADNmt daría mejores resultados
para identificación podrían ser:
Cabellos con o sin folículo.
Huesos y dientes que han estado sujetos a largos periodos de
acidez, temperatura o humedad altas.
Manchas o material de escobillado que ha sido previamente
tipificado sin éxito, para marcadores nucleares.
Tejidos (piel, músculos, órganos) que han sido tipificados sin
éxito para marcadores nucleares.
Como consecuencia de su origen endosimbiótico, el genoma
mitocondrial tiene sus propios sistemas de replicación, transcripción, que
combinan las características de las células procarioticas y eucarioticas. El
ADNmt, es una molécula circular de 16.569 PB, tiene una región D-Loop
(displacement loop), la cual es no codificante en el ADNmt humano. El D-
Loop tiene aproximadamente 1100pb y es un segmento situado entre los
genes mitocondriales tRNApro y tRNAphe y contiene dos regiones
hipervariables HVI y HVII con una longitud de 342 y 268 pares de base
respectivamente (Bodowle, et al , 1999). Esta variabilidad en la secuencia en
cualquiera de las regiones provee un blanco atractivo para los estudios de
identificación forenses. En la identificación forense de ADN las secuencias de
las regiones HVI y HVII del ADNmt siempre son comparadas con una
secuencia de referencia obtenida por Anderson (Anderson, et al, 1981),
analizada y comparada con las muestras de referencia de los familiares. Las
regiones hipervariables pueden ser secuenciadas proporcionando un alto
grado de información para discriminar entre individuos no relacionados.
Desde el genotipo del ADNmt un individuo puede ser considerado haploide
ya que no hay evidencia de recombinación entre las moléculas del ADNmt,
por lo que la secuencia es tratada como un locus simple. La principal ventaja
del ADNmt es que está presente en aproximadamente 10 a 10³ copias por
célula. Esta abundancia aumenta la oportunidad de que algunas copias del
ADNmt sobrevivan en muestras forenses altamente degradadas. El ADN
nuclear, tiene un gran poder en la identificación, pero está presente tan solo
en dos copias por célula (Parsons and Coble, 2001).
La PCR es entonces utilizada para amplificar o crear muchas copias
de las dos regiones hipervariables de la región no codificante del ADNmt,
utilizando primers flanqueantes.
De otra parte, la biología molecular ha aportado las herramientas para
la manipulación del genoma y es posible ahora explorar el nivel más básico
de organización molecular de los genes, y descubrir su contenido informático.
La tecnología reciente de los laboratorios genético-forenses permite el
análisis exacto de fragmentos de ADN y su cotejo, para finalmente crear
grandes bancos de información de utilidad en el control de las conductas
delictivas, donde el genetista y el legislador deben acordar lenguajes
comunes que permitan interpretar adecuadamente los hallazgos genéticos y
reglamentar su uso social.
2.3 Histología y morfología de la estructura dentaría
La cavidad bucal primitiva, o estomodeo, está revestida por
ectodermo. En su cara más profunda toma contacto con el extremo superior
ciego del intestino anterior que esta revestido por endodermo. La unión de
las hojas ectodérmica y endodérmica se denomina membrana bucofaríngea.
A los 27 días aproximadamente, esta membrana se rompe y el estomodeo
establece comunicación con el intestino anterior. Los dientes se desarrollan
a partir de los brotes dentarios que normalmente comienzan a formarse en la
porción anterior de los maxilares superior e inferior y avanzan en dirección
posterior. El brote o folículo dentario consta de tres partes:
•
•
•
El órgano del esmalte: que deriva del ectodermo bucal
La papila dentaría: que deriva del ectomesénquima
El saco dentario: también deriva del ectomesénquima.
El órgano del esmalte produce el esmalte dental, la papila dentaría da
lugar a la dentina y la pulpa y el saco dentario produce el cemento y el
ligamento periodontal.
Desde del punto de vista anatómico los dientes constan de dos partes
principales:
• La corona clínica es la estructura visible en la cavidad oral.
• La raíz que se encuentra alojada en los alvéolos dentales
que hacen parte del hueso alveolar de los maxilares, la cual termina en el
ápice radicular.
• Estas dos están unidas por una depresión llamada cuello.
Aunque los dientes varían considerablemente de forma y tamaño, su
estructura histológica es básicamente similar. El eje estructural de cada
diente está formado por un tejido conectivo mineralizado denominado dentina
la cual rara vez queda expuesta al medio bucal. La corona se encuentra
recubierta por un tejido muy duro de origen ectodérmico llamado esmalte. La
dentina radicular por el contrario se encuentra protegida por un tejido
conectivo calcificado denominado cemento. En el centro de la dentina existe
un espacio interno que recibe el nombre de cámara pulpar. Esta cavidad
contiene un tejido conectivo laxo denominado pulpa dentaría. La pulpa y la
dentina forman una unidad estructural y funcional denominada complejo
dentino-pulpar.
♦ Características de los tejidos dentarios
Esmalte.
El desarrollo del esmalte dental humano involucra una serie de
eventos complejos incluyendo la secreción y degradación de una única
matriz extracelular (Wrigth, et al, 1997). Los ameloblastos progresan a través
de una sucesión de fenotipo celulares ejecutando funciones especializadas
de secreción y regulación. El esmalte, también llamado tejido adamantino o
sustancia adamantina, que cubre a manera de casquete a la dentina en su
porción coronal. Es el tejido más duro del organismo debido a que
estructuralmente esta constituido por millones de prismas altamente
mineralizados que van desde la unión amelodentinal a la superficie externa
que está en contacto con el medio bucal. Su dureza se debe a que posee un
porcentaje muy alto (95%) de matriz inorgánica y muy bajo (1-2%) de matriz
orgánica y (3-5%) de agua. El esmalte presenta algunas características que
lo hacen un tejido único:
•
•
•
Se deriva embriológicamente del ectodermo y se forma a partir del órgano
dental u órgano del esmalte.
La matriz orgánica del esmalte es de naturaleza proteica con agregado de
polisacáridos.
Los cristales de hidroxiapatita del esmalte se hallan empaquetados
densamente y son de mayor tamaño que los de otros tejidos
mineralizados.
•
•
•
•
•
•
Las células secretoras del esmalte, los ameloblastos, una vez formado el
tejido desaparecen durante la erupción dentaría. Esto implica el no-
crecimiento ni nueva aposición de esmalte luego de la erupción.
El esmalte maduro no contiene células ni prolongaciones celulares. Una
vez formado es un tejido acelular, avascular y sin inervación.
El esmalte cuando es alterado por elementos físicos o químicos es
incapaz de repararse, no se reconstruye.
La matriz orgánica cuyo componente más importante es de naturaleza
proteica, constituye un complejo sistema de multiagregados polipéptidicos
que, no han sido totalmente caracterizados. Entre las proteínas presentes en
mayor o menor medida en la matriz orgánica del esmalte durante su
formación se destacan:
Las amelogeninas, son moléculas hidrofóbicas, fosforiladas y glicosiladas
de 25kDa, ricas en prolina, ácido glutamico, histidina y leucina, que
disminuyen a medida que el esmalte madura. Se localizan entre los
cristales de las sales minerales.
Las enamelinas, moléculas hidrofílicas, glicosiladas de 70kDa, ricas en
serina, ácido aspartico y glicina, que se localizan en la periferia de los
cristales formando proteínas de cubierta.
Las ameloblastinas o amelinas que se localizan en la superficie más
externa del esmalte y en la periferia de los cristales.
• La tuftelina, de 50-70kDa, se localiza en la unión amelodentinal al
comienzo de la formación del esmalte.
De otra parte la matriz inorgánica esta constituida por sales minerales
cálcicas básicamente de fosfato y carbonato. Las sales se depositan en la
matriz del esmalte, dando origen a un proceso de cristalización que
transforma la masa mineral en cristales de hidroxiapatita. Los cristales de las
sales minerales son más voluminosos que los de dentina y el tejido óseo y no
parece existir fosfato cálcico amorfo (Wrigth, et al, 1997).
El agua es el tercer componente de la composición química del
esmalte. Se localiza en la periferia del cristal constituyendo la denominada
capa de hidratación o capa de agua adsorbida. El porcentaje de agua en el
esmalte disminuye con la edad (Gómez de Ferrais y Campos Muñoz, 1999).
Complejo dentino-pulpar
El tejido pulpar y dentinario conforman estructural, embriológica y
funcionalmente una verdadera unidad biológica conocida como complejo
dentino-pulpar. El complejo dentino-pulpar es un tejido permeable, tanto
desde él limite entre lo que clásicamente denominamos dentina y pulpa,
como desde él limite amelo-dentinario (Lepkowitz, 1943). Desde el punto de
vista estructural los cuerpos de los odontoblastos se localizan en la interfaz
existente entre la pulpa y la dentina y su prolongación principal o proceso
odontoblástico se ubica en el interior de los túbulos dentinarios, recorriendo
todo el espesor dentinario. Desde el punto de vista embrionario, el tejido
dentinario y pulpar, tienen su origen en la papila dentaría; funcionalmente los
odontoblastos son los responsables de la formación y mantenimiento de la
dentina.
Pulpa:
Desde el punto de vista estructural la pulpa dentaría es un tejido
conectivo de variedad laxa, ricamente vascularizado e inervado. En su
periferia (unión pulpa-predentina) se ubican los odontoblastos, células
especializadas que se encargan de sintetizar los diferentes tipos de dentina.
Por la disposición de sus componentes estructurales, podemos
observar en la pulpa cuatro regiones diferentes desde el punto de vista
histológico. Las zonas identificadas desde la predentina (dentina sin
mineralizar) hacia la pulpa son:
♦ Zona odontoblástica: esta constituida por los odontoblastos en
empalizada. Los cuerpos celulares se conectan entre sí por complejos de
unión tipo desmosomas.
♦ Zona subodontoblástica u oligocelular de weil: se encuentra por
debajo de la anterior, tiene aproximadamente 40μm de ancho, es una zona
pobre en células. Esta bien definida en la región coronaria de dientes recién
erupcionados, pero, suele estar ausente en la región radicular. No se observa
en pulpas embrionarias, ya que se forma tardíamente durante el proceso de
histiogénesis pulpar.
♦ Zona rica en células: tiene una alta densidad celular donde se
destacan las células ectomesenquimáticas y los fibroblastos. Es
predominante de dientes adultos.
♦ Zona central de la pulpa o tejido pulpar propiamente dicho: la
población celular esta representada especialmente por fibroblastos, células
ectomesenquimáticas y macrófagos de localización perivascular (Gómez de
Ferrais y Campos Muñoz, 1999).
Células de la pulpa
♦ Odontoblastos: son las células específicas o típicas del tejido
pulpar. Conforman por su disposición en empalizada la capa odontoblástica.
Los odontoblastos en la región coronaria alcanzan la cifra aproximada de
45.000 por mm², y su número disminuye en la zona radicular. Los
odontoblastos adoptan la forma de células cilíndricas altas (40μm) con
núcleos grandes de localización basal cuando se encuentran en su máxima
actividad secretora. Ultra-estructuralmente presentan un retículo
endoplásmico rugoso muy extenso y el complejo de golgi es muy
desarrollado. El citoplasma posee, además abundantes mitocondrias. Con
respecto a las variaciones de longitud de la prolongación citoplasmática en el
interior del túbulo dentinario, numerosas investigaciones han demostrado que
su extensión promedio puede oscilar entre 0.2 a 0.7mm. El odontoblasto
maduro es una célula altamente diferenciada que pierde la capacidad de
dividirse. Los nuevos odontoblastos que se originan en los procesos
reparativos de la dentina lo hacen a expensas de células mesenquimáticas,
aunque algunos opinan que pueden originarse de fibroblastos pulpares.
♦ Fibroblastos: Son las células más abundantes del tejido
conectivo pulpar, especialmente en la corona, donde forman la capa
denominada rica en células. Tienen gran cantidad de organelas que
intervienen en la síntesis proteica, el núcleo generalmente es elíptico y
presenta uno o dos nucleolos.
♦ Células ectomesenquimáticas: son también denominadas
indiferenciadas, se derivan del ectodermo de las crestas neurales. Es la
población de reserva pulpar por su capacidad de diferenciarse en nuevos
odontoblastos o fibroblastos, según él estimulo que actúe. El número de
células disminuye con la edad. Generalmente se ubican en la región
subodontoblástica o en la proximidad de los capilares sanguíneos, por lo que
se denominan células perivasculares o pericitos.
♦ Macrófagos: se pueden encontrar fijos o libres en el tejido
conectivo. Presentan un núcleo ligeramente excéntrico, el complejo de golgi y
el retículo endoplásmico liso están bien desarrollados, además, se evidencia
retículo endoplásmico rugoso, mitocondrias, abundantes vacuolas y
lisosomas.
♦ Otras células: al examinar el tejido pulpar se pueden encontrar
células como: linfocitos, células plasmáticas y en algunas ocasiones
eosinófilos y mastocitos. Este tipo de células se encuentra cuando hay
procesos inflamatorios (Gómez de Ferrais y Campos Muñoz, 1999).
Dentina:
La dentina, llamada también sustancia ebúrnea o marfil, es el eje
estructural del diente y constituye el tejido mineralizado que conforma el
mayor volumen de la estructura dentaría. El espesor de la dentina varía
según el diente: en los incisivos inferiores es mínimo (de 1 a 1.5 mm),
mientras que en caninos y molares es de 3mm aproximadamente. En la
estructura de la dentina podemos distinguir dos componentes básicos: la
matriz mineralizada y los conductos o túbulos dentinarios que la atraviesan
en todo su espesor y alojan a los procesos odontoloblásticos. Parece claro
que la dentina, al estar perforada por infinidad de túbulos de 19000 a
45000/mm²- permite el paso de sustancias, y que este paso sea en ambas
direcciones, hacia la pulpa y hacia el exterior. El diámetro de los túbulos varia
de 1 a 5mm desde él limite amelo-dentinal hasta las cercanías de la pulpa.
Los procesos odontoblásticos son largas prolongaciones citoplasmáticas de
las células especializadas llamadas odontoblastos, cuyos cuerpos se ubican
en la región más periférica de la pulpa. Los cuerpos de los odontoblastos
están separados de la dentina mineralizada por una zona o matriz orgánica
no mineralizada denominada predentina. En una sección transversal se pude
encontrar de 20.000 - 45.000 procesos odontoblasticos por mm². Estos
procesos contienen numerosas mitocondrias que puede esperarse, deben
estar bien protegidas en el canaliculo dentinal (Mörnstad et al, 1999).
Clasificación histotopográfica de la dentina.
En la dentina se consideran tres zonas:
♦ Dentina del manto o palial: es la primera dentina sintetizada por
los odontoblastos recién diferenciados; tiene 20μm de espesor queda debajo
del esmalte y el cemento.
♦ Dentina circumpulpar: esta forma el mayor volumen de dentina
de la estructura dentaría y se extiende desde la zona del manto hasta la
predentina.
♦ La predentina: es una capa de dentina sin mineralizar, de 20 a
30μm de ancho situada entre los odontoblastos y la dentina circumpulpar.
Esta constituida por prolongaciones citoplasmáticas, con fibras nerviosas
amielínicas y matriz orgánica dentinaria adyacente a los odontoblastos de la
pulpa.
Dentinogénesis.
Es el conjunto de mecanismos mediante los cuales la papila dental
elabora por medio de sus células especializadas, los odontoblastos, una
matriz orgánica que más tarde se calcifica para formar la dentina.
♦ Ciclo vital de los odontoblastos.
Los odontoblastos se diferencian a partir de las células
ectomesenquimáticas de la papila dental, bajo la influencia inductora del
epitelio interno del órgano del esmalte. En su ciclo vital se pueden considerar
las siguientes etapas:
Células mesenquimáticas indiferenciadas. Están localizadas en
la periferia de la papila dental, son pequeñas de forma estrellada con núcleo
grande, escaso citoplasma y pocas organelas. Las células aumentan de
tamaño, conteniendo gran cantidad de organelas, en especial complejos de
golgi y retículo endoplásmico rugoso. Estas adoptan una forma cilíndrica baja
y presentan varias prolongaciones citoplasmáticas apicales que llegan a la
membrana basal. En este momento pasan a ser Preodontoblastos.
Preodontoblastos su índice nucleocitoplásmico es alto, se
ubican próximos unos a otros hasta adquirir un aspecto similar al del epitelio
cilíndrico simple.
Odontoblastos jóvenes. Estos segregan predentina, la cual esta
formada por colágeno, proteoglicanos y algunas sustancias no colágenas.
Cuando la prolongación odontoblástica queda alojada en el túbulo dentinario
de la matriz de dentina recién formada, el odontoblasto que se dirige al
interior recibe el nombre de odontoblasto maduro.
Odontoblastos secretores. Contribuyen con el proceso de
mineralización (formación de dentina circumpulpar) y más tarde disminuyen
en volumen, durante el resto de su vida que es la del diente, favorecen el
mantenimiento de la matriz dentinaria.
En el extremo distal del proceso dentinoblástico cuando el túbulo no
es ocupado por el odontoblasto, aparecen acúmulos de substancias amorfas
y gruesas fibras de colágeno o están totalmente vacíos.
Debemos tener presente que en un 1mm de dentina encontramos
alrededor de 30.000 células odontoblásticas y teniendo en cuenta que la
dentina esta constituida en un 65% por materia orgánica, entonces tendrá un
gran potencial de células para la obtención de ADN a partir de este tejido
(Gómez de Ferrais y Campos Muñoz, 1999).
Cemento
El cemento es una forma especial de tejido calcificado que cubre
totalmente la superficie de la raíz dental. Es un tejido conectivo mineralizado,
derivado de la capa celular ectomesenquimática del saco o folículo dentario
que rodea al germen dentario. A semejanza del esmalte, el cemento cubre la
dentina únicamente en la porción radicular. Su función principal es anclar las
fibras del ligamento periodontal a la raíz del diente. En el tercio medio
radicular encontramos un espesor de cemento que oscila entre 50μm y
80μm, el cual varia con la edad, debido al deposito continúo y progresivo de
nuevas capas.
• Componentes estructurales del cemento.
El cemento esta formado por elementos celulares, en especial los
cementoblastos, cementocitos y por una matriz extracelular calcificada.
Cementoblastos: se encuentran adosados a la superficie del
cemento del lado del ligamento periodontal. En las raíces en desarrollo suele
haber una capa continua de cementoblastos activos en toda su extensión. En
los dientes que han terminado su formación radicular estas células se
encuentran a partir del tercio medio o solamente en el tercio apical, es decir
en zonas donde hay aposición de cemento secundario. Al microscopio
electrónico los cementoblastos formativos presentan núcleo excéntrico de
forma irregular con uno o dos nucleolos, abundantes mitocondrias, retículo
endoplásmico rugoso y aparato de golgi bien desarrollado. Las
características ultraestructurales indican que los cementoblastos tienen una
elevada actividad de síntesis.
Cementocitos: una vez que los cementoblastos quedan
incluidos en el cemento mineralizado, se les denomina cementocitos, los
cuales se alojan en unas cavidades llamadas cementoplastos o lagunas. Los
cementocitos en general poseen un núcleo pequeño, picnótico y citoplasma
acidófilo. Con el microscopio electrónico de transmisión se puede observar
que presentan pocos organulos citoplasmaticos con algunas mitocondrias.
♦ Tipos de cemento:
• Cemento acelular o primario: comienza a formarse antes de que
el diente erupcione. Se deposita lentamente, de manera que los
cementoblastos que los forman retroceden a medida que secretan y no
quedan células dentro del tejido. Se presenta predominantemente en el tercio
cervical, pero puede cubrir la raíz entera con una capa muy delgada, de unos
50μm adyacente a la dentina.
• Cemento celular o secundario: este tipo de cemento comienza
a depositarse cuando el diente entra en oclusión. Debido a su rápida
formación los cementoblastos quedan incluidos en la matriz transformándose
en cementocitos. Se localiza por encima del cemento acelular, pero por lo
general solo a partir del tercio medio o apical de la raíz. En el tercio apical
suele ser el único tipo de cemento presente. Se deposita durante toda la vida
del diente (Gómez de Ferrais y Campos Muñoz, 1999). Se caracteriza por la
presencia de numerosas lagunas (corpúsculos de cemento) ocupados con
cementocitos, que, por su localización anatómica, están menos expuestos a
daños externos, especialmente a procesos químicos como la oxidación y la
degradación bacteriana (De Leo, et al, 2000).
2.4 OBTENCION DE TEJIDOS DENTARIOS PARA EXTRACCION DE ADN.
Basándose en la anatomía de los dientes humanos y la localización de
las células que protegen potencialmente al ADN, se consideraron tres
técnicas en este estudio. Cada una presenta ventajas y desventajas como a
continuación se exponen.
Acceso endodontico convencional
Según el diente que se esté trabajando se hace la apertura de
acuerdo con los protocolos establecidos en las técnicas de endodoncia, es
decir que si se trata de un molar o premolar se accede a la cámara pulpar por
la superficie oclusal, si es un canino o incisivo se accede por la cara palatina
o lingual dependiendo de sí es superior o inferior respectivamente. Una vez
removido el techo de la cámara pulpar se procede a retirar el contenido de la
cámara pulpar y conducto(s) radicular(es), con limas destinadas para este fin.
Esta técnica presenta dificultad debido a la morfología de la cámara pulpar y
conductos radiculares ya que estos pueden presentar curvaturas que son
difíciles de superar perdiéndose de esta forma el contenido.
Sección Vertical
Se hace un corte o sección a lo largo del eje longitudinal del diente
permitiendo un completo acceso a la cámara pulpar y conductos radiculares.
En caso de dientes multiradiculares se dificulta un poco, pero con buenos
instrumentos de corte fino (fresas odontológicas) y una técnica adecuada se
logra acceder totalmente al tejido blando.
Sección Horizontal
La sección horizontal se realiza haciendo un corte por debajo de la unión
amelocemental permitiendo acceso a la corona y raíz o raíces del diente.
Con esto se mejora el acceso a los conductos radiculares pero como se
explico en la técnica de acceso convencional endodontico, sí los conductos
presentan curvaturas fuertes, se pierde tejido pulpar.
2.5. ADN en tejido dental
Las estructuras dentales han sido utilizadas para obtener muestras de
DNA. Trabajos preliminares sugieren que el ADN se encuentra en los
dientes en suficiente cantidad para el análisis debido a que los tejidos que los
conforman como quedó descrito son lo suficientemente resistentes y
presentan células activas durante el mayor tiempo de vida del mismo.
En el estudio realizado por Sweet (Sweet and Hildebrand, 1998a) se
analizaron 20 muestras (16 molares superiores y 4 inferiores), luego de
pulverizar los dientes en un freezer mill, obtuvieron ADN en un rango entre
0.9 y 97.5ng, cuantificado por la técnica de slot-blot y promediaron estos
valores con el peso de cada uno de los dientes según la nomenclatura
establecida por la Federación Dental Internacional. En la muestra se utilizó
un diente que había sido sometido a tratamiento endodontico del cual
obtuvieron una cantidad adecuada de ADN para la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Teóricamente los dientes sin vitalidad (tejido pulpar) no
serian aptos para la obtención de ADN, pero este estudio demostró lo
contrario cuando se utiliza un protocolo adecuado.
Según la histología dental en los odontoblastos, ameloblastos y
cementoblastos, encontramos mitocondrias en su citoplasma, esto nos indica
que podemos obtener ADN mitocondrial para identificación humana por línea
materna. En el estudio realizado por Ginther (Ginther, et al, 1992) para
identificar unos restos humanos se utilizó ADNmt obtenido de dos dientes
deciduos, (según el estudio antropológico la víctima tenia una edad
aproximada de 14 años) y se comparó con el obtenido de los familiares en
los cuales se tomaron muestras de sangre y de frotis bucal; luego de la
amplificación enzimática y la secuenciación directa de aproximadamente 650
nucleótidos de dos regiones altamente polimorficas de ADNmt, y al comparar
las secuencias obtenidas de los dientes, con las obtenidas de las muestras
de sangre y frotis bucal de los familiares, fueron idénticas. Según estos
resultados, los autores sugieren que los dientes son una excelente fuente de
ADNmt de alto peso molecular que puede ser de gran valor así haya pasado
mucho tiempo o la descomposición del cuerpo este en un estado avanzado
ya que no se ve afectado el ADNmt.
En el estudio realizado por Carracedo (Carracedo, Et al, 1996) para
evaluar los efectos de los factores ambientales para el análisis por PCR de la
pulpa dental; analizaron 570 estructuras dentales. Cuatro de estos fueron
obtenidos de casos forenses, los demás fueron obtenidos de pacientes a los
cuales se les practicó cirugía bucal (exodoncia). Las muestras fueron
sometidas a diferentes factores ambientales como: agua de mar y de río (15
días hasta 6 meses); enterrados en tierra y arena a 20cm (2 a 6 meses),
medio ambiente (2 semanas a 6 meses) y a incineración en un horno para
porcelana dental (ivoclar) de 1 a 2 minutos a temperaturas de: 75°C, 100°C,
200°C, 400°C y 500°C. Para la extracción del ADN utilizaron una resina
quelante. El ADN obtenido fue cuantificado por el Kit DNA DipStick
(Invitrogen Corporation) este kit tiene como desventaja que no especifica sí el
ADN analizado es humano. En las muestras de casos forenses obtuvieron
resultados positivos utilizando el sistema HLA DQA1. Según los resultados
obtenidos llegaron a la conclusión de que los dientes son una excelente
fuente de ADN para la identificación de restos humanos.
En el estudio realizado por Holland (Holland, et al, 1993) utilizando 10
pares de dientes del maxilar inferior derechos e izquierdos extraídos de
pacientes en cirugía bucal, obtuvieron ADN nuclear y mitocondrial, según los
resultados obtenidos concluyeron que si el ADN se encuentra degradado o
en cantidades mínimas, se puede recurrir al ADNmt para identificación de
personas debido al gran número de copias en las células.
El estudio realizado por Mörnstad (Mörnstad, et al, 1999) para
demostrar y semi-cuantificar el ADNmt obtenido de dentina humana y como
se relaciona ésta con la edad, se obtuvieron 21 dientes de personas no
relacionadas con edades que oscilan entre 15 y 85 años, inmediatamente
después de la extracción quirúrgica. Como control utilizaron la pulpa.
Después de la extracción y amplificación de la región HVII del ADNmt, la
cantidad de ADNmt fue semi-cuantificado según la intensidad de las bandas
en el gel. Los resultados demostraron que la cantidad de ADNmt en dentina
decrece con la edad.
En el estudio realizado por Antonio Alonso (Alonso, et al, 2001) para
la tipificación de ADN obtenido de restos humanos esqueletizados, se
describe el trabajo de identificación de personas muertas en las guerras de
Croacia, Bosnia y Herzegovina, con el objetivo de evaluar los sistemas STRs
Múltiplex y Megaplex en ADN aislado de huesos y dientes y cuantificado con
el método de Slot Blot. Demostraron que la cantidad de ADN microbiano
puede interferir con la hibridización de secuencias especificas de ADN
humano en la técnica de Slot blot, produciendo unos falsos negativos en el
resultado de cuantificación de ADN.
Los anteriores autores utilizaron en sus investigaciones dientes
obtenidos en cirugía bucal los cuales fueron sometidos a diferentes factores
ambientales. Solo en algunos casos han utilizado dientes de casos, teniendo
como resultado la obtención de ADN genómico, aunque se puede deducir
que los dientes son mejor fuente de ADNmt.
2.6 TECNICAS PARA CUANTIFICACIÓN DE ADN
Antes de cualquier procedimiento de análisis, es necesario determinar
además de la cantidad de ADN presente, sí este es humano y su calidad
(degradación). La información cuantitativa se usa para calcular la cantidad de
ADN de la muestra que es necesaria para ser utilizada en la amplificación
por PCR (Keith and Rudin, 1997). Las siguientes son algunas técnicas que
se han utilizado para la cuantificación de ácidos nucleicos a través de la
evolución de la biología molecular.
•
•
Detección colorimétrica: se sigue una reacción con reactivos
cromatográficos específicos - no es muy sensible. Este procedimiento
tiene alguna significación histórica pero es rara vez utilizado
(Quantification of DNA, htm).
Electroforesis seguida por cuantificación en densitómetro del ADN en el
gel. Para está técnica es necesaria la coloración con bromuro de etidio,
sybr-green u otro color fluorescente similar. Método muy sensible pero
que únicamente es utilizado para ADN de fragmentos de tamaño
uniforme. Diferentes diluciones, se necesitan para encontrar el rango de
concentración de ADN apropiado. Una ventaja de este método es que
también puede ser utilizado para valorar la extensión de degradación de
la muestra (no hay bandas uniformes en tamaño). No tiene especificidad
de especie (Quantification of DNA, htm).
Espectrofotometría: utiliza luz ultravioleta con una absorción de 260nm,
por lo tanto necesita del espectrofotometro-UV. No demanda demasiado
tiempo por parte del operador. También el radio de absorbancia de
260nm a 280nm puede ser utilizado para indicar una relativa pureza del
ácido nucleico. No diferencia especies (Quantification of DNA, htm).
Detección especifica de fragmentos de ADN por hibridización: estas
técnicas requieren inmovilizar por transferencia el ADN extraído a una
membrana de nitrocelulosa o nylon, seguida de una reacción con una
sonda de hibridización de ácidos nucleicos. Un juego de muestras patrón,
para cantidades conocidas de ADN, se utiliza como referencia en la
comparación. Las muestras se unen permanentemente a la membrana.
La membrana es hibridizada con una sonda la cual reconoce secuencias
presentes en primates superiores y humana. El Slot Blot no provee
información respecto al estado de degradación del ADN. La sonda
utilizada en estos casos esta marcada con una enzima que produce una
reacción química para producir una descarga de luz en presencia de esta.
Este efecto es llamado quimioluminiscencia. Cuando la membrana con la
sonda esta empapada en el químico y es expuesta en una película, las
bandas oscuras corresponden a la región detectada por la sonda. Esto
provee un registro permanente que puede ser analizado visualmente, así
como por un sistema analizador de imágenes de computadora. En el caso
de detección colorimétrica, la oxidación de 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
(cromogen: TMB) catalizado por el horadish peroxidasa resulta en la
formación de un precipitado de color azul directamente en la membrana.
Puede ser muy sensible y requiere reactivos de detección específicos,
mucho tiempo y una serie de diluciones para encontrar la serie correcta.
Sin embargo este ha sido uno de los métodos de mayor uso para
cuantificación de ADN en muestras forenses, por que hace uso de sondas
especificas de regiones repetitivas de ADN humano. En este método la
cantidad de ADN humano es cuantificada, independiente de cualquier
posible contaminación con ADN de otros organismos (Keith and Rudin,
1997). De todos los procedimientos descritos hasta ahora es el único que
es especifico para humanos y primates superiores.
• AluQuantTM (Promega Corporation): utiliza sondas de secuencias
altamente repetitivas en el ADN cromosomal que han sido identificadas
como especificas para humanos. Numerosas especies fueron analizadas
para demostrar la especificidad de AluQuantTM. El sistema provee una
gran sensibilidad, permitiendo una cuantificación de cantidades por
debajo de 0.1ng a 50ng. En esta técnica se utiliza una serie de reacciones
enzimáticas para producir una señal luminiscente proporcional a la
cantidad de ADN humano presente. El sistema permite medir el ADN
humano utilizando sondas de secuencias altamente repetitivas presentes
en el ADN cromosomal, siendo especificas de humano. El sistema no es
afectado por la presencia de ADN de otras especies (Mandreaker, et al,
2001).
• Real-Time Taqman PCR: el proceso Taqman se basa en el principio
PacMan- un juego de computadora introducido hace más de 20 años. El
método se basa en la actividad exonucleasa 5' - 3' de la Taq-DNA
polimerasa, que resulta en una división de fluorescencia de las sondas
marcadas con color durante la PCR. La intensidad de fluorescencia es
medida por un sistema de detección de secuencia (SDS). La sonda se
localiza entre los dos primers de PCR y tiene una temperatura de fusión 10°C
más alta que la de los primers. La cuantificación con esta técnica se basa en
la detección de una señal fluorescente producida proporcionalmente durante
la amplificación del producto de PCR. Una sonda es diseñada para utilizar
una secuencia blanco entre los primers iniciador y reverso. La sonda esta
marcada en el 5' final con un fluorocromo reportero (usualmente 6-
carboxyfluoresceina (6-FAM) y un fluorocromo apagado (6-carboxy-
tetramethyl-rhodamine (TAMRA) adicionado en cualquier posición de T o al
final de 3'. La actividad exonucleasa propia de la Taq degrada la sonda
liberando el fluorocromo reportero. La cantidad de fluorescencia liberada
durante los ciclos de amplificación es proporcional a la cantidad de producto
generado en cada ciclo. En real-time PCR cuando se utilizan dos colores, se
incluye un tercer primer no-extendible entre los primers normales de la PCR.
Esta sonda contiene la marca fluorescente y únicamente durante la
amplificación por PCR esta libera el componente fluorescente. Este sistema
es más sensible que la de un color y puede ser utilizada para detectar desde
unas pocas copias 10-20 de un fragmento particular de ADN. El uso de
controles internos aumenta el número de muestras que pueden ser
analizadas, marcándolos con dos colores de detección método ideal para
experimentos extensos y ensayos de tamizaje, permitiendo a sí mismo la
discriminación alélica también puede ser aplicada en la cuantificación de
ADN genómico proveniente de muestras que presentan cantidades inferiores
a 1ng. Existen muchas ventajas en esta tecnología, pero las más importantes
son: su alta especificidad, sensibilidad y precisión (Grove, 1999).
Hasta ahora no existía un método exacto para la cuantificación directa
del ADNmt, con los avances del la biología molecular se ha utilizado la
técnica de Real-Time PCR en algunos estudios como el efectuado por N.
Von Wurmb-Schwqark (Von Wurmb-Schwqark et al, 2002), que evalúa la
precisión y confiabilidad de la técnica para cuantificar el número de copias
sin delecionar del genoma mitocondrial y determina la frecuencia de la
deleción de 4997 pares de bases en longitud asociada con la edad, en ADN
humano del músculo iliopsoas de 42 muestras tomadas durante la necropsia
de personas de edad conocida. En este estudio se encontró que el aumento
del producto de PCR se detecta fluorimétricamente por aumento de la unión
con el SYBR Green I, después de cada ciclo. En sus conclusiones opinan
que el método provee una estimación precisa del número de copias de
ADNmt; así esto representa un mejoramiento en la exactitud y confiabilidad
en los resultados, sobre los métodos tradicionales semi-cuantitativos y
cualitativos.
JUSTIFICACION.
Dada la ausencia de trabajos que sustenten la representatividad científica
de los procesos de identificación fehaciente por medio del ADN dental en
casos forenses se adelanto la presente investigación.
Las cifras de desaparecidos (2.397**), así como las víctimas NN.s
(2.173*) durante el año 1999 se han incrementado para el año 2002
(desaparecidos (3.087*), víctimas NN.s (8.442*)) lo que hace necesario la
implementación de técnicas de identificación a partir del análisis del ADN
obtenido de estructuras dentarías, las cuales se conservan íntegros a pesar
de la putrefacción, las altas temperaturas y en muchas ocasiones son la
única fuente de material para lograr la identidad de una persona.
Según su composición y estructura los dientes poseen el tejido más duro
del cuerpo humano, lo cual los hace altamente resistentes a agentes nocivos
tales como: fenómenos cadavéricos (putrefacción), a las condiciones de
suelos, altas temperaturas (hasta 1100° C), traumas, humedad, fauna que
se encuentre en el medio ambiente y al paso del tiempo (Sweet and
Hildebrand, 1998b). Esta característica de resistencia de los dientes los
convierte en una excelente fuente de ADN con fines de identificación
* Información suministrada por la Sección de identificación de Víctimas NN.s y Personas Desaparecidas, del Cuerpo Técnico de Investigación de la Fiscalía General de la Nación.
humana, sin importar las condiciones las que se hayan sometido durante la
vida de la persona(ante-mortem), los momentos que rodearon la
muerte(peri-mortem) y las que se identifiquen afectaron la destrucción del
cuerpo(post-mortem).
OBJETIVO
Obtener ADN de tejidos dentarios (pulpa, dentina, cemento) para
establecer si la cantidad y calidad es apta para identificación humana en
casos forenses.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Determinar cual de las técnicas para acceder al tejido pulpar es la más
eficiente sin producir alteraciones por recalentamiento, debido a la acción
de instrumentos cortantes.
2. Establecer un protocolo para la extracción de ADN de los diferentes
tejidos dentarios (dentina y cemento) ya que no siempre se encuentra
presente el tejido pulpar.
3. Comparar la cantidad y calidad del ADN obtenido de la dentina y el
cemento con el obtenido del tejido pulpar.
4. Demostrar que las estructuras dentarías (dentina y cemento) son fuente
de ADN aunque no este presente la pulpa.
MATERIALES
6.1 Recolección de la muestra.
La muestra fue obtenida durante la exhumación administrativa
ordenada en el año 2000, para el traslado de los cadáveres NN. Inhumados
en bóvedas en el cementerio central de Bogotá D.C. durante el año 1995.
Todos los decesos fueron producto de muerte violenta, algunos se
encuentran en investigación y en otros casos la investigación precluyó.
Se obtuvieron un total de 20 estructuras dentales entre molares,
premolares, caninos e incisivos, tanto del maxilar superior como inferior,
derechos e izquierdos recolectados al azar.
El procedimiento de criminalística de campo que se utilizo fue el
siguiente:
♦ Fijación fotográfica.
♦ Exhumación de los cadáveres y obtención de la muestra.
♦ Embalaje de cada uno de los dientes en bolsas de papel manila. Se
rotularon, con la siguiente información para mantener la cadena de
custodia: Fecha de inhumación, fecha de exhumación, proceso,
autoridad, diente N°, bóveda de procedencia, bóveda y pabellón de
destino, sexo(indeterminado).
♦ Remoción de materiales adheridos a la superficie externa del diente
utilizando agua destilada y curetas de uso odontológico estériles.
♦ El embalaje en bolsas de manila y luego en bolsa plástica para
mantenerlos refrigerados hasta el inicio de los análisis. En el anexo 1, se
observan algunas fotografías del trabajo de criminalística de campo,
debido a que la totalidad del archivo está compuesto de 10 cassettes de
vídeo aproximadamente, de 3 horas cada uno.
Descripción de las estructuras dentales utilizadas en este estudio
(Muestra)
Se realizó descripción clínica y radiográfica de cada uno de los dientes
utilizados, su procedencia (número del protocolo de necropsia o en su
defecto número de bóveda), fecha de inhumación del cadáver, fecha de
exhumación del mismo, peso y longitud de cada diente. Anexos 2 y 3.
Los dientes fueron pesados en una balanza y medidos con un
calibrador Hopex Quality Tools, Vernier Caliper 150X0. O5MM
6"X1/128INCH. Para las radiografías se utilizo película Kodak Ectachrom y
se procesaron en revelador automático Ajoveco. Se utilizó la técnica
radiográfica de paralelismo. Se tomaron fotografías del diente y de la
radiografía con una cámara digital Sony Mavica y se archivaron en una
computadora qbex Kronos p-6000.
METODOS
7.1 OBTENCIÓN DE TEJIDOS DENTARIOS
Por la facilidad de manipulación para obtener los tejidos dentarios
(pulpa, dentina, cemento) de las técnicas descritas, se decidió para este
estudio utilizar la técnica de sección vertical. El procedimiento que se siguió
para la obtención de cada tejido fue el siguiente: se coloca la estructura
dental sobre un soporte plástico, el cual presenta una ranura que lo sostiene
por la raíz, allí ubicado, con una pieza de mano de alta velocidad y una fresa
de carburo troncoconica (700 SS, White), se hace una ranura por la
superficie oclusal, irrigando con jeringa y agua destilada, y se sigue por el eje
longitudinal del diente, hasta acceder a la cámara y conducto(s) radicular(es),
(anexo 4). En los casos en que se encontró tejido pulpar este se retiró con
cucharilla estéril colocándolo directamente en un tubo eppendorf (QSP) de
2ml (anexo 4). Una vez retirado el tejido blando tanto de cámara pulpar como
de los conductos radiculares, el siguiente paso es recolectar la dentina
presente en la estructura dental. Para lograr este objetivo se procedió de la
siguiente forma: con una pieza de mano de alta velocidad, refrigerando con
agua estéril y utilizando una fresa troncocónica (700 SS, White), se hizo
desgaste desde la superficie interna (cámara y conducto(s) radicular) al
exterior del diente aproximadamente 5mm antes de la superficie externa del
diente. El polvo de dentina se recolectó directamente a un tubo eppendorf de
2ml. Para retirar el agua que queda dentro del tubo, este se dejó en reposo
hasta que se decantó totalmente la dentina y el agua se retiró con aguja y
jeringa estéril (anexo 4). Para la recolección del cemento radicular una vez
retirada la dentina del interior del diente, se hizo un desgaste del tercio apical
radicular, iniciando en el ápice, con una fresa zecrya, refrigerando con agua
estéril directamente a un tubo eppendorf de 2ml. Al igual que en la dentina, el
cemento se dejó decantar y se retiró el agua con aguja y jeringa estéril
(anexo 4).
7.2 EXTRACCION DE ADN
Una vez obtenidos cada uno de los tejidos del diente, se siguió el
siguiente protocolo:
⇒ Se hicieron dos lavados con EDTA (0.5 M, pH 8.0) centrifugando a
10.000rpm por 5 minutos, para los tejidos duros.
⇒ Se agregó 1ml de buffer de extracción (Tris-HCl 10mM, EDTA 10mM,
NaCl 50mM, SDS 2% (w/v) (pH 8.0) y 15μL de proteinasa K ( 10mg/mL,
Lot# 128448, Promega) se incubó toda la noche a 56°C.
⇒ Se centrifugó la muestra a 10.000rpm durante 5 minutos, el sobrenadante
se recolectó y se colocó en un tubo eppendorf que contenía un volumen
igual (1000µl) de fenol/cloroformo/alcohol isoamilico (25:24:1). Se mezcló por
inversión hasta obtener una solución homogénea. Se centrifugó por 15
minutos a máxima velocidad. Se hicieron tres extracciones para cada
muestra. Luego se retiró el sobrenadante y se llevó a un tubo eppendorf que
contenía alcohol cloroformo/alcohol isoamilico (24:1), se mezcló por inversión
hasta obtener una mezcla homogénea. Se centrifugó durante 5 minutos a
2.000 rpm. Se recolectó el sobrenadante y se llevó a tubos Centricon 100,
Amicon (millipore Canadá, Toronto, ON) se agregaron 2ml de agua
destilada, se centrifugó por 15 minutos a 2.000rpm, se hicieron tres lavados.
El último lavado se hizo con buffer 1XTE pH 8.0 (Promega Corporation) se
dejaron 100µl en la parte superior del tubo, este se invirtió y se centrifugó
por 5 minutos a 2.000rpm, se recolectó en tubos eppendorf y se congeló a -
4°C.
Para equilibrar el fenol se siguió el siguiente procedimiento: se licúo el
fenol a 68°C, se tomó igual cantidad de buffer 0.5M de Tris·Cl pH 8.0 y fenol
(para análisis, Merck) se agitó y se dejó reposar hasta que las dos fases se
separaron. Luego se retiró la fase acuosa y se agregó buffer 0.1M Tris·Cl pH
8.0 en igual cantidad al fenol. Se agitó, se dejó en reposo hasta que el fenol
baje. Se hicieron los lavados necesarios hasta obtener un pH mayor a 7.8 de
la fase fenolica (Maniatis, et al, 1989).
7.3 CUANTIFICACION DE ADN
Aislado el ADN (genómico y mitocondrial), para establecer cantidad de
ADN obtenido de la muestra, se utilizó el kit para cuantificación de ADN,
QuantiBlot (part° N808-0114. Lote C07168, Applied Biosystems, Roche® ). El
procedimiento se basa en la hibridización de una sonda de oligonucleótido
biotinilada para muestras de ADN inmovilizadas en una membrana de nylon.
La sonda de este kit es complementaria a una secuencia especifica de ADN
alfa satélite en el locus D17Z1 (cromosoma 17). La subsecuente unión de un
conjugado de enzima: HRP-SA a la biotina puede ser detectada por métodos
colorimétricos o quimioluminiscentes. En el caso de la detección
colorimétrica, la oxidación de 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (cromogen: TMB)
catalizado por el horseradish peroxidase resulta en la formación de un
precipitado de color azul directamente en la membrana. Alternativamente,
para la detección quimioluminiscente la oxidación del luminol, reactivo
catalizado por la peroxidasa resulta en la emisión de fotones que son
detectados en una película autoradiográfica estándar. En ambos casos la
cantidad de ADN es determinada por la comparación visual de la intensidad
de la señal de los valores estándares de ADN humano. La técnica no provee
información respecto al estado de degradación del ADN.
Este es un procedimiento designado para cuantificación de ADN
humano en cantidades inferiores a 50ng, el kit provee rangos de 0.15 a
10.0ng.
♦ Procedimiento de Slot Blotting/Inmovilización de ADN
Preparación de reactivos:
⇒ Se hizo una dilución seriada del ADN estándar A (provisto en el kit) en
buffer TE (10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA pH 8.0) como sigue:
•
•
•
•
•
•
•
Se marcaron 7 tubos de 0.65ml de A - G.
Se transfirieron 120µL del ADN estándar A en el tubo marcado A.
Se alicuotaron 60µL de buffer TE en cada uno de los seis tubos restantes
marcados de B-G.
Se agregaron 60µL del ADN estándar A (tubo A) a los 60µL de buffer TE
en el tubo B.
Se adicionaron 60µL del ADN estándar B diluido (tubo B) a los 60µL del
buffer TE en el tubo C.
Se continuo la dilusión seriada hasta el tubo G.
Se determinó el número de muestras a analizar incluyendo los siete
estándares de ADN humano, dos calibradores y un blanco (Spotting
Solution: 0.4N NaOH, 25 mM EDTA, 0.00008% Bromothymol Blue). Se
alicuotaron 150µL de Spotting solution en tubos para reacción de PCR
para cada una de las muestras a analizar.
⇒ Se dio vortex a cada uno de los estándares de ADN y a los dos
calibradores.
⇒ Se agregaron 5µL de ADN de cada una de las muestras a analizar en los
tubos que contenían Spotting solution.
⇒ Se corto un segmento de membrana Biodyne B y se marcó en la parte
superior para orientación de la misma. Se colocó la membrana en una
cubeta que contenía 50mL de pre-weeting solution (0.4N NaOH, 25mM
EDTA). Se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos.
⇒ Se elaboró el registro de las muestras en la planilla de trabajo.
⇒ Utilizando fórceps, se removió la membrana y se colocó en el aparato de
Dot-blot y ajustándolo.
⇒ Utilizando una pipeta para cada muestra, se pipeteó cada muestra dentro
de los diferentes pozos del aparato de Dot-blot.
⇒ Una vez colocadas las muestras en el centro de cada pozo del aparato de
Dot-blot, se aplicó vacío. Se dejó el vacío hasta que todas las muestras
pasaron a través de la membrana. Se inspeccionó que cada una de las
muestras mostrara un punto uniforme de color azul. Se Retiró el vacío.
⇒ Se desensambló el aparato de Dot-blot, y se procedió inmediatamente a
la hibridización de la membrana.
♦ Hibridización de la membrana
La siguiente sección involucra la hibridización de la sonda Biotinyladed
QuantiBlot D17Z1 para muestras de ADN inmovilizado en una membrana de
nylon, la cual se une a un conjugado de enzima: HRP-SA.
• Pre-hibridización:
Se transfirió la membrana a 100mL de solución de hibridización (5X
SSPE, 0.5%w/v SDS) precalentada. Se agregaron 5mL de 30% de H2O2.
Luego se rotó a 50°C y de 50-60 rpm, durante 15 minutos y se retiró de la
solución.
• Hibridización:
Se agregaron 30mL de solución de hibridización a la membrana. Luego
se agregaron 20µL de la sonda QuantiBlot D17Z1 a la solución de
hibridización. Se rotó a 50-60 rpm, a 50°C durante 20 minutos.
⇒ Se lavó la membrana vigorosamente en 100mL de wash solution (1.5X
SSPE, 0.5%w/v SDS) por algunos segundos y se retiró la solución.
El siguiente paso corresponde a la adición del conjugado HRP-SA. El
volumen a utilizar depende del esquema de detección escogido, en este
estudio se utilizó la detección colorimétrica.
• Stringent Wash/Conjugation
Se Agregaron 30mL de Wash Solution precalentada a la cubeta que
contiene la membrana. Se inclina la cubeta y se agregó el conjugado de
enzima HRP-SA, en este caso se adicionaron 180µL para la detección
colorimétrica. Se Rotó a 50°C y 50-60 rpm por 10 minutos. Se Eliminó la
solución.
⇒ Se lavó la membrana vigorosamente por 1 minuto en 100mL de wash
solution precalentado, por rotación entre 100-125 rpm a temperatura
ambiente. Se eliminó la solución y se lavó nuevamente por un minuto. Se
eliminó la solución.
⇒ Se lavó la membrana nuevamente adicionando wash solution
precalentado, rotando a temperatura ambiente por 15 minutos. Se eliminó
la solución.
⇒ Finalmente se lavó la membrana en 100mL de buffer citrato. Se eliminó la
solución.
• Detección colorimétrica
Se preparó la solución reveladora de color con los siguientes reactivos:
30mL de buffer citrato, 1.5mL de Chromogen: TMB Solution y 30µL de 3% de
H2O2.
⇒ Se Agregó la solución reveladora a la membrana en la cubeta.
⇒ Se Rotó a temperatura ambiente por 30 minutos entre 50-60 rpm. Se
eliminó el líquido.
⇒ Se detuvo el revelado del color, lavando en agua desionizada (100mL),
durante 5-10 minutos. Se repitió tres veces.
⇒ Se fotografío la membrana estando húmeda.
⇒ Para la fotografía se utilizo una cámara digital Sony Mavica con disketes
fuji film (mf2hd) y se guardo en la memoria de una computadora qbex
Kronos P-6000.
La otra técnica utilizada para la cuantificación de las muestras utilizada
en este estudio fue el nano-blot, con un kit de Lifecodes Corporation,
Stanford, CT. Es un procedimiento designado para cuantificar ADN humano
de nivel bajo (nanogramos) en muestras de cantidad limitada. El método de
detección consiste en una breve hibridización y una sonda marcada con
oligonucleótidos de ADN repetitivo a una membrana que contiene
estándares de ADN y las muestras problema. Se utilizo la sonda D17Z1, la
cual esta marcada con fosfatasa alcalina, sensible al Lumiphos 480,
permitiendo que se visualice el ADN que se une a la sonda. Los estándares
de ADN utilizados están en rangos de 40ng a 0.675ng.
Nano-blot
⇒ Se preparó un segmento de membrana Hybond N+ (Amershan
Corporation).
⇒ Se remojó el aparato de Dot-blot en hipoclorito de Sodio por 10 minutos
para destruir cualquier ADN existente.
⇒ Se enjuagó el aparato de Dot-blot con agua desinoizada en abundancia.
⇒ Se elaboró el registro de muestras en la planilla de trabajo.
⇒ Utilizando un plato de 96 pozos, se colocaron 3µl de NaOH 10N, en los
pozos donde se van a colocar las muestras a analizar.
⇒ Se utilizó un 10% de cada una de las muestras y se completó a un
volumen de 100µl con agua destilada.
⇒ Se prepararon todas las muestras y los controles de concentraciones
conocidas
⇒ Se incubaron las muestras por 10 minutos en hielo.
⇒ Se remojó la membrana con agua desionizada.
⇒ Se remojó la membrana en solución denaturalizante (0.5N NaOH, 0.5M
NaCl) por 5 minutos.
⇒ Se colocó la membrana en el aparato de Dot-blot y se aplicó vacío para
asegurar que funcionara bien.
⇒ Se añadieron los 103ul de los controles y las muestras en cada pozo.
⇒ Se aplicó vacío
⇒ Se enjuagó cada pozo con 100µ l de solución denaturalizante y se aplicó
vacío.
⇒ Mientras el vacío actúo, se desensambló el aparato de Dot-blot y con
pinzas se levantó la membrana y se colocó en 2XSSC por 5 minutos.
⇒ Se horneó a 80°C por 1 hora, para fijar el ADN.
Hibridización
⇒ Se preparó buffer quick light: 90ml de agua desionizada, 10ml de quick
light 10X.
⇒ Se prepararon los reactivos Wash I y Wash II (Lifecodes Corporation).
Wash I wash II
600ml wash componente A 70ml wash componente A
750ml wash componente B 500ul wash componente B
13.65ml agua desionizada 9460ml de agua desionizada.
⇒ Los reactivos se incubaron a 55°C por 90 minutos antes del uso.
⇒ Se colocó la membrana en un contenedor limpio con 25ml de wash I
precalentado y se dejó humedecer perfectamente.
⇒ Se retiró el del wash I y se añadió buffer de hibridización con la sonda
D17Z1(5ml de buffer y 5ul de sonda).
⇒ Se incubó a 55°C por 10 minutos.
⇒ Se eliminó el buffer y la sonda y se añadió wash I. Se incubó a 55°C por
10 minutos.
⇒ Se elimino el wash I y se añadió wash II, se incubó durante 10 minutos a
55°C
⇒ Se eliminó el wash II y a temperatura ambiente se incubó en Quick light
buffer por 1 minuto.
⇒ Se colocó la membrana en los folderes de exposición y se aplicó
Lumiphos 480. Se sellaron los bordes del folder.
⇒ Se incubó a 37°C por 2 horas.
⇒ Se expuso la membrana con película fotográfica (fuji film) en oscuridad
por 1 hora.
⇒ Se compararon las señales de las muestras con los controles de
concentración de ADN conocida para su estimación.
7.4 AMPLIFICACION DEL ADN MITOCONDRIAL
El ADNmt se amplificó según lo descrito por Vigilant (Vigilant et al, 1989).
La región HIV2 del ADN mitocondrial se amplificó utilizando el set de
primers, L29 y H408 (Vigilant, et al, 1989) en un volumen final de 50 ul. Las
condiciones de reacción contenidas en 5-10 ul de DNA, 10 mM Tris-Cl pH
9.0, 50 mM KCl, y 0.1% Triton X-100, 250 uM de dNTPs, 1.5 a 2.5 mM
MgCl2, 60 ug de BSA y 10 unidades de Taq polimerasa (Promega
Corporation, Madison, WI). Todas las amplificaciones fueron llevadas a un
termociclador PTC100VG (MJ Research, Watertown, MA). En las
amplificaciones se incluyó una muestra para control negativo (no-ADN) así
como un control positivo (ADN no ancestral).
Protocolo:
⇒ Se añadió a un tubo de PCR, 100-200ng de DNA (10µl), se incluyeron
dos controles positivos (uno diente extraído en cirugía y otro de sangre
total) y un control negativo (agua).
⇒ Se ajustó con agua destilada a un volumen de 30µl
⇒ Por cada muestra se añadió cada uno de los siguientes componentes
para elaborar la mezcla maestra, más un 10% adicional:
Buffer 10X 5µl
Primer izquierdo 3µl
Primer derecho 3µl
dNTPs 4µl
MgCl2 3µl
H2O 0.1 - 0.5 µl
Taq Polimerasa 0.25 - 0.5µl
BSA 0.4µl
⇒ Se añadió una gota de aceite mineral y se taparon los tubos.
Programa de denaturación:
⇒ Un paso de denaturación inicial a 94°C por 5 minutos
⇒ 35 ciclos de denaturación a 93°C por 45 segundos, un annealing a 55°C
por 1 minutos, un paso de extensión a 74°C por 3 minutos
⇒ Un paso de extensión final de 72°C por 10 minutos.
La amplificación del ADNmt se verificó con un corrido electroforético:
⇒ Se preparó un gel de agarosa al 3% (2% nusieve, 1% seakem) en buffer
1X TBE.
⇒ Se mezclaron por cada muestra 5µl de buffer de carga 2X y 5µl del
producto amplificado. Buffer de corrido 1X TBE con bromuro de etidio
(5µl/100ml de buffer stock 10mg/ml)
⇒ Se montaron las muestras en el gel, se utilizó el marcador de peso
molecular (Phix 174 Hae III, Promega, Corporation) (500ng) para
confirmar el tamaño del fragmento amplificado.
⇒ Se corrió la electroforesis a 100v por 1 hora.
⇒ Se observó en un lector de geles automático. FMBIO II multi-view, Hitachi.
8. RESULTADOS
Se emplearon 20 dientes, de los cuales se obtuvieron 45 muestras
discriminadas así: 5 pulpas, 20 dentinas y 20 cementos. El peso promedio de
los dientes utilizados fue de 1.56gr ±0.4 (Tabla 1).
Como control positivo de los tejidos dentales, se dispuso de tres dientes
extraídos en acto quirúrgico, que no fueron sometidos a ningún efecto
ambiental. El peso promedio fue de 2.0gr ±0.16 (Tabla 2).
Para verificar la calidad de ADN de las muestras problema, se evalúo una
alicuota de cada muestra de ADN en electroforesis en gel de agarosa al
0.6%, sin observarse señal en ninguna de las muestras.
En la Tabla 3 se resume la concentración de ADN en tejido pulpar,
mediante la cuantificación con el kit Quanti-blot (Applied Biosystems,
Roche® ) y el kit Nano-blot (Lifecodes Corporation). El promedio obtenido fue
de 0.88 ± 0.3. El rango fue 0.075 -0.675.
En la Tabla 4 se resume la concentración de ADN en dentina mediante la
cuantificación con el kit Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche® ) y el kit
Nano-blot (Lifecodes Corporation). El promedio obtenido fue de 2.8± 0.56. El
rango obtenido fue 0.135 -1.
En la Tabla 5 se resume concentración de ADN en cemento mediante la
cuantificación con el kit Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche® ) y el kit
Nano-blot (Lifecodes Corporation). El promedio obtenido fue de 2.4± 0.5. El
rango obtenido fue 0.135 -1.
La Figura 1 corresponde a fotografía digital de la membrana de
Cuantificación con el kit Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche® ). La
distribución de muestras en la membrana se resume en la Tabla 6.
La Figura 2 corresponde a fotografía digital de membrana de
cuantificación con Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche®), en la cual se
incluyen muestras de tejido óseo forense. La distribución de las muestras en
la membrana se resume en la Tabla 7.
La Figura 3 corresponde a negativo digital de autoradiografia de
Cuantificación con el kit Nano-blot (Lifecodes, Corporation). En la Tabla 8 se
registra la distribución de las muestras.
En la Tabla 9 se resume la concentración e intensidad en la señal de
amplificación de la región hipervariable II de ADNmt por PCR, de cada una
de las muestras de los diferentes tejidos dentales.
La Figura 4 corresponde a fotografía digital en negativo del producto
amplificado de la región la región hipervariable del ADNmt. Del total de
muestras aisladas se utilizaron 22 muestras seleccionadas al azar para la
amplificación de la región control II del ADNmt, obteniéndose resultado
positivo de amplificación en las muestras: 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
16, 18, 19, 33, 43, 47, 36, 37, 38, 39, 40. La banda obtenida comparada con
el marcador de peso molecular Phix 174 Hae III (Promega Corporation)
correspondiente a una banda de peso molecular de 480 pb tal como se
espero con base en la secuencia amplificada. La ubicación de las muestras
en cada carril se registra en la Tabla 10.
Tabla 1. Muestras obtenidas de cada uno de los tejidos dentarios (FDI: Federación Dental Internacional)
Protocolo Diente N° FDI Peso/gr Pulpa Dentina Cemento
6580 13 1,3 + + +3201 35 1,3 + + +513 36 2,4 - + +
5795 38 2,2 - + +5537 13 1,3 + + +6580 11 1,1 - + +1453 25 1,1 - + +124 23 1,6 - + +
6503 23 1,3 - + +ScSJo 32 23 1,3 + + +
4327 13 2,3 - + +4986 13 1,2 - + +4568 23 1,9 - + +3201 34 1,1 + + +4439 46 2 - + +513 27 2,1 - + +
4915 23 1,4 - + +3948 16 2 - + +3917 13 1,2 - + +
ScSJ 45 25 1,1 - + +Promedio 1,56
DS 0,45
Tabla 2: Muestras utilizadas control positivo de los tejidos dentarios.
Diente N° Peso/gr Pulpa Dentina Cemento18 2 + + +28 2,2 + + +38 1,9 + + +
Promedio 2DS 0,16
Tabla 3. Concentración de ADN en tejido pulpar mediante la cuantificación con el kit Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche® ) y el kit Nano-blot (Lifecodes Corporation).
Protocolo Muestra N° Concentración ADN ADN/ng/ulControl + 1 40 8
5537 3 2,5 0,5ScSjo(23) 6 0,675 0,1353201(34) 4 0,135 0,6756580(13) 5 0,375 0,0753201(35) 7 0,675 0,135513(36) - - -
5795 - - -6580(11) - - -
1453 - - -124 - - -6503 - - -4327 - - -4986 - - -4568 - - -4439 - - -
513(27) - - -4915 - - -3948 - - -3917 - - -
ScSJ 45 - - -Promedio 0,88 0,3
Rango mínimo 0,075Rango maximo 0,5
DS 0,3
Tabla 4. Concentración de ADN en dentina mediante la cuantificación con el kit Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche® ) y el kit Nano-blot (Lifecodes Corporation).
Protocolo Muestra N° Concentración ADN ADN/ng/ulControl + 9 20 4
4986 10 5 15795(38) 11 5 1
4568 14 0,675 0,1351453 16 0,675 0,1353948 17 0,675 0,1354439 18 2,5 0,5
3201(34) 19 2,5 0,5ScSjo(32) 22 5 1513(36) 15 - -
5537 29 - -6580(11) 25 - -
124 24 - -6503 28 - -4327 12 - -
513(27) 21 - -4915 27 - -3917 13 - -
ScSJ 45 20 - -6580(13) 26 - -3201(35) 23 - -Promedio 2,8 0,56
Rango mínimo 0,135Rango maximo 1
DS 0,6
Tabla 5: Concentración de ADN en cemento mediante la cuantificación con el kit Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche® ) y el kit Nano-blot (Lifecodes Corporation).
Protocolo Muestra N° Concentración ADN ADN/ng/ulControl + 31 40 8
4915 37 1,25 0,254439 45 2,5 0,54568 47 5 16503 48 0,675 0,135
3201(34) 49 2,5 0,56580(13) 51 - -3201(35) 33 - -513(36) 35 - -
5795 43 - -5537 38 - -
6580(11) 50 - -1453 34 - -124 36 - -
ScSJ 44 - -4327 39 - -4986 40 - -
513(27) 42 - -3948 52 - -3917 41 - -
ScSJ 45 46 - -Promedio 2,4 0,5
Rango mínimo 0,135Rango maximo 1
DS 0,6
Figura 1. Fotografía digital de la membrana de Cuantificación con el kit Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche® ). En la columna 1 de A-G se encuentran ubicados los estándares de ADN en cantidades decrecientes de 10-0.156ng. En la columna 2 en A- B se ubican los calibradores 1 y 2 respectivamente. En el punto D2, se ubica el control positivo de tejido pulpar; C3 corresponde a control positivo de dentina; D6 control positivo de cemento. Las muestras problema se encuentran ubicadas desde E2 a D8. La flecha roja indica una muestra que presenta una cantidad de ADN menor al mínimo estándar.
Tabla 6. Distribución de las muestras en la cuantificación con el kit Quanti-blot (Applied Biosystems Roche® ) de la membrana de la figura 1.
1 2 3 4 5 6 7 8 A 10ng Cal- 1 6 14 22 30 38 46 B 5ng Cal -2 7 15 23 31 39 47 C 2.5ng 8 16 24 32 40 48 D 1.25ng 1 9 17 25 33 41 49 E 0.625ng 2 10 18 26 34 42 50 F 0.3125ng 3 11 19 27 35 43 51 G 0.156ng 4 12 20 28 36 44 52 H C- 5 13 21 29 37 45
Figura 2. Fotografía digital de la membrana de Cuantificación con el kit Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche® ). En la columna 1 de A-G se encuentran ubicados los estándares de ADN en cantidades decrecientes 10-0.156ng. En la columna 2 en A- B se ubican los calibradores 1 y 2 respectivamente. En la posición C2 y D2, se ubican controles positivos de tejido pulpar; las posiciones B3 y C3 corresponde a control positivo de dentina; en A6 y B6 controles positivos de cemento. Las muestras ubicadas en la columna 9, hileras C, D, E y F corresponde a tejido óseo forense.
Tabla 7. Distribución de las muestras para la cuantificación con el kit Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche® ) de la membrana de la figura 2.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 A 10ng Cal-1 7 15 23 31 39 47 A68
B 5ng Cal-2 8 16 24 32 40 48 A69
C 2.5ng 1 9 17 25 33 41 49 A70
D 1.25ng 2 10 18 26 34 42 50 A31
E 0.625ng 3 11 19 27 35 43 51 B06
F 0.312ng 4 12 20 28 36 44 52 B72
G 0.156 5 13 21 29 37 45 A66 C23
H C- 6 14 22 30 38 46 A67 DD93
Figura 3. Negativo de fotografía digital de autoradiografia de Cuantificación con el kit Nano-blot (Lifecodes, Corporation). En la columna 1 de A-H se ubican los estándares de ADN en cantidades decrecientes de 40 a 0.675 ng. La posición B1 control negativo. Las muestras problema se ubican en las posiciones D4 a H7. En las columnas 2 y 3 hileras A, B, C, D, E, F, G y H corresponden a tejido óseo forense. La flecha roja indica cantidad inferior de ADN en la muestra, comparado con el estándar mínimo.
Tabla 8. Distribución de las muestras para la cuantificación con el kit Nano-blot (Lifecodes, Corporation) de la figura 3.
1 2 3 4 5 6 7
A 40 K39 W64 X78 5 26 4
B K40 W65 X79 48 18 28
C 20 W94 X80 25 7 15
D 10 F707 W95 9 35 17 12
E 5 F707CA W96 2 16 45 51
F 2.5 F708 X75 31 49 21 34
G 1.25 F714 X76 19 52 33 39
H 0.675 A37 X77 10 43 23 50
Tabla 9. Concentración de ADN de tejidos dentales e intensidad en la señal de amplificación de la región hipervariable II de ADNmt por PCR.
Tejido
Muestra
ADN concentración
(ng/ul)
ADNmt
Pulpa 3 0.5 Fuerte
Pulpa 5 0.075 Fuerte
Pulpa 4 0.675 Fuerte
Pulpa 6 0.135 Fuerte
Pulpa 7 0.135 Fuerte
Dentina 10 1 Fuerte
Dentina 11 1 Fuerte
Dentina 12 0 Débil
Dentina 13 0 Débil
Dentina 14 0.135 Fuerte
Dentina 16 0.135 Fuerte
Dentina 17 0.135 Ninguna
Dentina 18 0.5 Débil
Dentina 19 0.5 Débil
Cemento 33 0 Débil
Cemento 43 0 Débil
Cemento 47 1 Débil
Cemento 36 0 Débil
Cemento 37 0.25 Fuerte
Cemento 38 0 Débil
Cemento 39 0 Débil
Cemento 40 0 Débil
Fig. 4 Fotografía digital en negativo del producto amplificado de la región la región hipervariable del ADNmt. El ADN fue extraído, de tejidos dentales (pulpa, dentina y cemento) de dientes procedentes de cadáveres inhumados en bóvedas durante un periodo de tiempo de 5 años. De izquierda a derecha, carril 1: escalera de marcador de peso molecular Phix 174/Hae III en el carril 2 se ubica el control positivo tejido pulpar, carriles 3-7 muestras de tejido pulpar; carril 8 control positivo dentina, carril 9 muestra dentina, carril 10 escalera; carriles 11-18 muestras de dentina; carril 19 escalera; carril 20 cemento control positivo, carriles 21-22 muestras de cemento. Segunda hilera: carril 1 escalera, carriles 2-7 muestras de cemento, carril 8 control positivo de ADN extraído de sangre total, carril 9 control negativo, carril 10 escalera peso molecular.
Tabla 10. Ubicación de escalera de peso molecular y de las muestras de la figura 4.
CARRIL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22FILA 1 E PC+ 3 4 5 6 7 9 10 E 11 12 13 14 16 17 18 19 E 31 33 43
FILA 2 E 47 36 37 38 39 40 JJY C- E
9. DISCUSIÓN
Los odontólogos juegan un importante papel en el equipo de necro-
identificación, para el correcto manejo de la evidencia de origen dental en
cada caso, lo que representa una importante fuente de información con el
objeto de lograr la identidad de la víctima.
Para lograr este propósito, la odontología forense, emplea técnicas como
la comparación de registros dentales ante-mortem con los post-mortem y el
análisis y comparación de imágenes radiográficas, entre otros. Cuando no
se cuenta con la información ante-mortem o esta es insuficiente, se recurre
a técnicas de biología molecular, que aumentan la eficiencia y certeza de la
identificación. A pesar de ser una excelente herramienta, las técnicas
convencionales no deben ser abandonadas (Ginther, et al, 1992).
Para el estudio se utilizaron 20 estructuras dentales, provenientes de
cadáveres inhumados en bóvedas. En solo cinco de ellos se encontró tejido
pulpar con aspecto de momificación. El tejido pulpar es un tejido blando que
pese a encontrarse protegido por tejidos duros, se ve afectado por los rigores
del proceso de putrefacción hasta su total descomposición, desapareciendo o
como en este caso momificándose. En el estudio realizado por Pötsch
(Pötsch, et al, 1992) se reporta que cuando los dientes son extraídos y
almacenados a temperatura ambiente, se produce una rápida deshidratación
del tejido pulpar, esta desecación se considera la explicación de los buenos
resultados obtenidos de ADN recuperado de tejidos momificados. En el
mismo estudio se observó, que cuando los dientes se encuentran sueltos
dentro del alvéolo, se crea un microambiente que permite el paso de
humedad hacia el tejido pulpar, produciéndose la putrefacción. Cuando en el
sitio de inhumación de un cuerpo hay circulación de aire y el ambiente es
seco, se presentan condiciones ideales para la momificación de tejidos
blandos (Sorg and Haglund, 1997) como se observó en algunos de los
cadáveres exhumados, algunos de ellos utilizados en este estudio. En
estudios previos (Carracedo et al,1996)(De Leo, et al, 2000) (Holland, et al,
1993)(Pfeiffer, et al, 1998)(Sweet, D., Hildebrand, D., 1998a) los dientes
fueron obtenidos en acto quirúrgico y sometidos a diferentes factores
ambientales, para la posterior recuperación del tejido pulpar del cual
obtuvieron ADN en cantidad suficiente para ser amplificado y en algunos
casos secuenciado. Para nuestro caso los dientes estuvieron sometidos a
las condiciones ya expuestas de los fenómenos cadavéricos tempranos y
tardíos (Vivas, 1994) subsecuentes al ambiente propio del cementerio central
de Bogotá, además del contacto con la flora y fauna cadavérica; así, el tejido
pulpar es afectado debido al acceso natural que se tiene a través del foramen
apical, que es la comunicación con el medio externo.
De las técnicas utilizadas para el acceso a los tejidos dentarios, en este
estudio se optó por la técnica de sección vertical por el eje longitudinal del
diente, considerándose como la más apropiada ya que permite recolectar,
completamente el tejido pulpar cuando está presente. El desgaste para la
recolección de dentina y cemento es de fácil aplicación y la morfología
radicular no se ve afectada debido al uso de instrumentos de corte fino
conservándose parcialmente la morfología del diente siendo esto una ventaja
cuando la estructura dental hace parte de la evidencia. Sin embargo, se
deben llevar a cabo todos los estudios previos necesarios como análisis
radiográficos, cotejos de cartas dentales ante-mortem y post-mortem entre
otros, antes de alterar los dientes por este procedimiento.
Para la extracción de ADN de los tejidos duros del diente se realizó una
decalcificación previa con EDTA (0.5M, pH 8.0) durante 5 minutos. Para la
lisis y extracción de ADN se siguió el mismo procedimiento en tejido pulpar,
dentina y cemento. En el estudio realizado por Pfeiffer (Pfeiffer, et al, 1998),
sometieron la totalidad del diente pulverizado a cuatro días de
decalcificación, lo que afecto la cantidad de ADN obtenido, por tanto opinan
que se obtienen mejores resultados al omitir este paso. Sin embargo, en otro
estudio (Ramos et al, 1995) sometieron las muestras a 8 minutos de
decalcificación y no reportaron inconvenientes con la decalcificación y
cantidad de ADN obtenido. Los resultados obtenidos en el presente trabajo
indican que la cantidad de ADN obtenida cuando la muestra se somete a
decalcificación no se ve afectada si se utilizan tiempos cortos que evitan la
perdida de material orgánico con este procedimiento.
Para el proceso de cuantificación y análisis de ADN obtenido, se utilizaron
dos procedimientos de cuantificación: Nano-blot (Lifecodes Corporation) y
Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche®). Con el protocolo de Nano-blot se
logro una mejor hibridización de la sonda D17Z1 con el ADN de las muestras
problema, como se observa en la Figura 3. En este kit, la sonda D17Z1 esta
marcada con fosfatasa alcalina que al reaccionar con el Lumiphos 480 que
desdoblado produce una señal quimioluminiscente. Su sensibilidad en la
señal quimioluminiscente persiste por horas o días permitiendo al usuario
obtener múltiples exposiciones para optimización de la señal de imagen.
Según el origen de las muestras a cuantificar, el tiempo de exposición
permite ser variado de 1-2 minutos hasta 2 horas o más, esta flexibilidad en
el tiempo de exposición de la película con la membrana, permite que
muestras con bajo contenido de ADN, como en este trabajo puedan ser
visualizadas.
El kit Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche®) utiliza la sonda D17Z1
marcada con biotina. Una vez se lleva a cabo la hibridización, es necesario
incubar la membrana con un anticuerpo conjugado de estreptavidina-HRP
(peroxidasa de rábano), el cual, si la sonda se unió al ADN el anticuerpo
permitirá llevar a cabo la reacción colorimétrica desdoblando el compuesto
tetrametilbenzidina (Chromogen:TMB) dando un color azul en las muestras.
Los resultados obtenidos mediante la utilización de este kit mostraron una
débil señal en los estándares proveídos por la casa fabricante, a pesar de
segur cuidadosamente las recomendaciones del fabricante. La prueba fue
repetida varias veces obteniendo siempre el mismo resultado. Se optó por
crear estándares propios adicionales con diluciones a partir de ADN obtenido
de la línea celular K562 (Promega, Corporation). Los resultados obtenidos
aunque mejoraron, no fueron óptimos. Esto planteó la posibilidad de que la
sonda D17Z1 del kit Quanti-blot (Applied Biosystems, Roche®) presentara
algún grado de degradación dada la baja señal obtenida con los estándares,
o que alguno de los reactivos utilizados para la hibridización presentara
problemas.
Los datos obtenidos por comparación visual de las muestras problema
con los estándares de ADN, en las pruebas con el kit Nano-blot (Lifecodes
Corporation) muestran que la dentina y el cemento comparados con el tejido
pulpar dan resultados similares a éste (Tablas 3, 4 y 5). Este resultado,
puede deberse a degradación del tejido pulpar en piezas dentales de interés
forense. Los resultados al procesar las estructuras dentales en el presente
estudio le dan soporte a dicha hipótesis ya que solo se encontró tejido pulpar
en 5 de las 20 estructuras dentales (25%). Por otro lado, dado que el tejido
pulpar puede quedar expuesto a través del forámen apical, la acción de
agentes infecciosos y agentes químicos presentes en el sitio de inhumación
favorecen la degradación de dicho tejido. Otra de las causas para explicar
este resultado es que cuando se produce una irritación del tejido pulpar o hay
una presencia de una fuerza oclusal excesiva , la cámara pulpar puede verse
obliterada por la aposición de dentina secundaria secretada por los
odontoblastos ubicados entre la predentina y la zona rica en células
minimizando la cantidad de tejido pulpar y aumentando el número de células
en los canaliculos dentinales. Sin embargo, al no contarse con la historia
clínica ante-mortem de estos individuos, no es posible evaluar si la ausencia
de tejido pulpar haya sido causada por irritación crónica. Otro factor que
debemos tener en cuenta es que a medida que aumenta la edad de un
individuo, los procesos odontoblásticos se retraen y producen una
calcificación de los canaliculos dentinales, resultando en una esclerosis de la
dentina, proceso fisiológico que se inicia en el ápice de la raíz y puede
involucrar la totalidad del diente. Nuevamente es poco probable que la
ausencia de tejido pulpar, se relaciona con la edad del individuo, ya que la
gran mayoría de estructuras analizadas correspondían a individuos de
mediana edad con base en los hallazgos antropológicos. Esto último
sugiere, que algunos procesos odontoblásticos o parte de sus organelas
queden atrapados dentro de los canaliculos dentinales calcificados, lo que
aumenta la resistencia del tejido a los factores propios de la putrefacción
disminuyendo la posibilidad que las células allí atrapadas y su ADN sea
alterado o degradado por estos factores. El cemento al igual que la dentina,
es un tejido calcificado y sus células, los cementoblastos una vez han
terminado su función quedan retenidos en el cemento mineralizado
denominándose cementocitos, además de encontrar en este tejido atrapadas
también fibras del ligamento periodontal. Estas características de dureza y
resistencia propias de la dentina y cemento por la mineralización de la que
son objeto, los hacen más resistentes a la acción lábil de hongos, bacterias y
otros factores inherentes a la putrefacción.
El resultado de cuantificación de ADN humano proveniente de muestras
forenses, se puede ver afectado por la existencia de ADN bacteriano, tal
como ha sido demostrado previamente en el estudio de Alonso (Alonso, et al,
2001) en dicho estudio la presencia de ADN microbiano (μg) en altas
concentraciones, interfirió en la unión de la sonda D17Z1 al ADN humano
arrojando resultados falsos negativos. El presente estudio no evalúo la
presencia de ADN microbiano en las muestras analizadas. Podría pensarse
que la ausencia de señal de hibridización con la sonda D17Z1 podría
deberse a contaminación bacteriana concomitante para lo cual, se deberán
llevar a cabo estudios adicionales.
En la cuantificación realizada en este estudio se incluyeron algunas
muestras de tejido óseo forense, con miras a evaluar si existía inhibición en
la hibridización con la sonda D17Z1. Como se aprecia en la figura 3
columnas 2 y 3 existe hibridización de la sonda D17Z1 con las muestras
obtenidas de tejido óseo y su señal permite ser cuantificada por
comparación visual con los estándares de ADN. Mientras los otros no
pudieron ser cuantificados apropiadamente debido a la ausencia de señal,
probablemente debido a la baja concentración de ADN obtenido de los
diferentes tejidos dentales, lo que es determinado por la comparación con el
ADN obtenido a partir de las diferentes muestras de tejido óseo analizado.
De todas formas hay que tener en cuenta que la cantidad promedio que se
utilizó de hueso pulverizado para la extracción de ADN es de 4gr y el peso de
un diente promedio pulverizado es de 1.77gr (Sweet, D., Hildebrand, D.,
1998a).
En el estudio de Mörnstad (Mörnstad, et al, 1999) la cuantificación del
ADN obtenido se llevo a cabo a partir del producto de PCR amplificado y no a
partir del ADN genómico, lo cual aumenta la efectividad de cualquier método
de cuantificación. Sin embargo, si no se utilizan controles apropiados y los
datos no son normalizados, los resultados obtenidos de la sola amplificación
pueden verse afectados por acciones inhibitorias como: contenido de ADN
en la muestra inicial, concentración de sales, etc.
Para obtener con exactitud la cantidad de ADN en muestras de difícil
cuantificación como lo son las muestras forenses, se deben implementar
técnicas de alta efectividad para muestras en las que se presume se tenga
baja cantidad de ADN, teniendo la posibilidad de que exista degradación del
ADN en la muestra. Actualmente se cuenta con la técnica de reacción en
cadena de la polimerasa en tiempo real (Real-Time PCR), que se podría
aplicar en muestras utilizadas en estudios forenses, para lograr mayor
exactitud y efectividad en la cuantificación del ADN. Esta tecnología
relativamente nueva provee un amplío rango para detectar secuencias
especificas con una excelente sensibilidad y precisión. Los ácidos nucleicos
pueden cuantificarse utilizando este sistema de detección sin los procesos de
análisis post-PCR tales como hibridización, lo que evita la manipulación del
producto amplificado. Al utilizar sondas internas marcadas con fluorescencia,
la sensibilidad para la cuantificación aumenta y provee una relación lineal
entre el número de copias y él número de ciclos de amplificación (valor CT).
Asimismo, la hibridización líquida aumenta la especificidad del sistema, frente
a las técnicas de hibridización con fijación del ADN a una membrana
(Belgrader, et al, 1998).
Mediante esta tecnología, se pueden diseñar y examinar ADN o ARN,
utilizando uno o dos colores fluorescentes en el sistema de detección. Uno
de los fluorocromos de los utilizados en Real-Time PCR se intercala en el
ADN. Este sistema es más sensible que los sistemas de detección en gel o
en membrana, de esta manera múltiples genes pueden ser analizados en
uno o varios templetes. Recientemente, esta metodología ha sido utilizada
en la cuantificación y detección de muestras con bajo contenido de ADN
(Alonso et al, 2002). En dicho trabajo, el sistema se aplicó a la cuantificación
de ADNmt y ADN nuclear humanos basados en la actividad 5' exonucleasa
de la Taq polimerasa utilizando sondas TaqMan MGB en un sistema ABI
PRISM 7900HT de Real-Time PCR. En la cuantificación de la región
hipervariable I del ADNmt, el sistema se aplicó con éxito a extractos de ADN
obtenidos de restos óseos que habían resultado negativos en ensayos
convencionales de cuantificación de ADN humano por hibridización con
sondas alfa-satélites. Así mismo, para la cuantificación del ADN nuclear fue
amplificado el fragmento del gen de la Amelogenina que es utilizado en la
mayoría de los laboratorios de genética forense y la detección mediante dos
sondas taqman del fragmento específico del cromosoma X y del fragmento
específico del cromosoma Y de forma simultánea. Con los resultados
obtenidos concluyen que el sistema permite cuantificar con muy alta
sensibilidad la cantidad total de ADN nuclear y realizar simultáneamente la
determinación de sexo.
Debido a la ausencia de ADN genómico obtenido a partir de la mayoría
de los tejidos dentales analizados, se optó por evaluar la presencia de
ADNmt en dichas muestras. Estudios previos han demostrado que el
ADNmt presenta diversas ventajas sobre el ADN genómico en estudios
forenses. El ADN mitocondrial es una molécula circular lo cual la hace más
estable y resistente a influencias externas, evitando su degradación (Parsons
and Coble, 2001). Los resultados indican que la amplificación del ADNmt es
muy sensible en dientes, provenientes de cadáveres en estado de
momificación y/o esqueletización o de restos antiguos (Ramos, et al, 1995).
En una célula se pueden encontrar entre 1.000 y 10.000 copias de ADNmt,
mientras que en el ADN genómico solo se encuentran dos copias alélicas
por cada gen (Johns and Cornblath, 1991). El contenido de regiones
altamente polimorficas en la región D-loop del ADNmt lo hace apropiado para
identificación de personas en casos forenses. El ADN mitocondrial tiene una
herencia matrilineal esto permite que la secuencia de los restos humanos
susceptibles de identificación sea comparada con cualquier familiar por vía
materna. Sabemos que las poblaciones humanas exhiben un alto grado de
polimorfismo en el ADNmt y la secuenciación es informativa en casos de
identificación forense(Bodowle, et al, 1999). En el estudio realizado por
Mörnstad (Mörnstad et al, 1999), los autores lo proponen como un estudio
piloto, al utilizar dentina de dientes en condición sana obteniendo
amplificación de la región hipervariable II del ADNmt planteando a sí mismo
se pruebe la efectividad de la dentina en dientes de cuerpos descompuestos
y esqueletizados
En este estudio la región hipervariable II del ADNmt, fue amplificada por
PCR para los tres tejidos dentarios, analizada llevando una alicuota del
producto de PCR a electroforésis en gel de agarosa. En este estudio a pesar
de tener cantidades mínimas o no detectables de ADN genómico en la
cuantificación, se logro la amplificación de ADNmt de las muestras
analizadas, observándose una señal intensa en las muestras de tejido pulpar,
de menor intensidad en dentina y una señal más débil en el cemento. El
resultado obtenido de amplificación de ADNmt a partir de la dentina,
contradice la afirmación de que este tejido es acelular como se indica en el
trabajo realizado por De Leo (De Leo, et al, 2000). Debemos tener en cuenta
que en el tejido dentinal se tienen entre 20.000 a 45.000 procesos
odontoblásticos por mm², es decir que podrían existir entre 40.000 y 90.000
copias de ADN genómico y probablemente entre 20.000.000 y más de
450.000.000 de copias de ADN mitocondrial.
Con los resultados de amplificación de la región hipervariable II del
ADNmt, se demuestra que la dentina al igual que el cemento son tejidos
protectores de sus células precursoras, que permiten se conserven y sean
fuente de ADN.
Los resultados obtenidos en este estudio, evidencian que el diente y los
tejidos que lo componen son fuente de ADN, a pesar de haber estado
sometidos a los procesos de putrefacción y que el ADN aislado de tejidos
dentales, especialmente de dentina y cemento, contiene ADN que permite la
amplificación del ADNmt que puede ser utilizado en la identificación de
personas.
La importancia de la identificación de víctimas en situaciones propias de
guerra o conflicto interno, como el que actualmente vive Colombia, involucra
asuntos no sólo humanitarios, legales de las víctimas y sus sobrevivientes,
así como también aspectos científicos para identificación de los cadáveres.
La aplicación de la tecnología del ADN en la odontología forense
representa una herramienta de identificación cuando no son aplicables otros
métodos.
10. CONCLUSIONES
1. Los tejidos dentarios pulpa, dentina y cemento son fuente de ADN útil en
la identificación forense. Los dientes y los tejidos que los conforman, por
su resistencia protegen sus células, siendo asimismo fuente de ADN.
2. La presencia de tejido pulpar no es necesaria para obtener ADN a partir
de piezas dentales.
3. La técnica de corte sagital, con pieza de mano de alta velocidad
refrigerada para acceder a los tejidos dentarios, es de fácil manejo y
permite una adecuada recolección de cada uno de ellos.
4. Los métodos de cuantificación de ADN genómico con base en la
hibridización con sonda D17Z1, no detectaron el ADN presente en las
muestras de pulpa, dentina y cemento utilizadas en este estudio.
5. Pese a no tener resultados de cuantificación de ADN genómico en un
buen número de las muestras analizadas, se logro la amplificación de la
región hipervariable II del ADNmt en las muestras de pulpa, dentina y
cemento.
11. RECOMENDACIONES
1. Someter las muestras de ADN de este estudio, a amplificación de
marcadores autosómicos, por ejemplo STRs, para comprobar que a pesar
de tener bajas concentraciones de ADN o de no haber sido visibles en la
cuantificación, permiten ser analizadas con estos sistemas ampliamente
utilizados en la identificación genética de personas.
2. Realizar un estudio para evaluar como se ve afectada la dentina cuando
en los dientes se han realizado tratamientos de endodoncia, ya que en
ese procedimiento se utilizan productos tipo blanqueador (hipoclorito de
sodio) que pueden disminuir la efectividad del tejido.
3. Evaluar en un estudio dientes con materiales de restauración como
amalgama de plata, resinas compuestas, coronas entre otros, para probar
si la dentina se ve afectada por la presencia de estos materiales en la
extracción y amplificación del ADN.
4. Para muestras que contengan bajas concentraciones de ADN, se debe
desarrollar un método de cuantificación de ADN genómico y mitocondrial.
5. Evaluar por métodos moleculares la presencia de secuencias de
microorganismos para determinar si la ausencia de señal en la
cuantificación con la sonda D17Z1 se debe a su efecto inhibitorio.
6. Evaluar los efectos de la edad en la cantidad de ADN extraído de
dentina.
7. Evaluar sí la cantidad de ADN obtenido de cemento se ve afectada por la
enfermedad periodontal.
8. Utilizar el estereoscopio para lograr diferenciar de manera microscópica la
separación entre la dentina y el cemento dental.
12. BIBLIOGRAFÍA
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ANEXOS
Anexo 1. Fotografías de criminalística de campo, proceso de exhumación de los cadáveres de donde se tomo la muestra del estudio
Fotografía de conjunto de los restos del cadáver. Momificación en extremidades inferiores.
Fotografía de detalle de la bóveda.
Fotografía de detalle del cráneo. Fotografía de semi- conjunto de cráneo y tórax.
Fotografía de conjunto de cráneo y tórax
Fotografía de detalle Maxilar Inferior Fotografía de detalle Maxilar Superior
Fotografía de semi-conjunto, embalando el diente en bolsa de manila, debidamente rotulada.
Fotografía de semi-conjunto, retirando el diente del maxilar
Fotografía de detalle, de la bolsa de manila sellada y rotulada.
Fotografía de detalle, estructura dental dentro de la bolsa de manila.
Anexo 2. Descripción de las características clínicas y radiográficas de las estructuras dentales utilizadas en el estudio. Protocolo Diente Caract. Clínica Caract. Radiológica
6580
13
F.Inhumación. 29/10/95 F.Exhumación. 21/07/00 Peso: 1.3 gr Longitud: 2.4 cm Corona: faceta de desgaste en el borde incisal con exposición de Dentina. Líneas de fractura en esmalte. Raíz: recta con ligera inclinación distal en tercio apical.
Total formación coronal y radicular. Conducto radicular amplio, ápice cerrado.
3201
35
F.Inhumación: 26/07/96 F. Exhumación: 28/07/00 Peso: 1,3gr Longitud: 2,3 cm Corona: en su cara vestibular presenta tres cúspides una vestibular y dos linguales. Se observa faceta de desgaste en superficie vestibular. Surco principal con pigmentación. Raíz: recta, cónica, larga.
Se observa total formación de la corona y raíz. Cámara pulpa pequeña. Conducto radicular amplio hasta el tercio medio y se estrecha hacia el ápice. Apice cerrado.
513
36
F.Inhumación: 18/07/95 F. Exhumación: 28/07/00 Peso: 2,4gr Longitud: 2,28 cm Corona: presenta cinco cúspides en su cara oclusal:
Total formación coronal y radicular. La cámara pulpar y los conductos radiculares son estrechos en cada una de las raíces. Apices cerrados.
tres vestibulares, dos linguales. Faceta de desgaste que involucra esmalte Raíz: dos raíces, una mesial y una distal. La raíz mesial por su superficie lingual presenta erosión.
3201
34
F. Inhumación: 26/07/96 F. Exhumación: 28/07/00 Peso: 1,1gr Longitud: 2.23 cm Corona: presenta dos cúspides una vestibular y una lingual. En la superficie vestibular se observa faceta de desgaste que afecta es esmalte. Raíz: recta, cónica y larga.
Total formación coronal y radicular. La cámara pulpar es pequeña, conducto radicular amplio. Cierre apical.
5795
38
F. Inhumación: 28/09/95 F. Exhumación: 23/07/00 Peso: 2.2gr Longitud: 1.71 cm Corona: cinco cúspides, tres vestibulares dos linguales. Raíz: presenta una raíz mesial y una distal, con ápices abiertos.
Se observa total formación coronal con características normales. Cámara pulpar amplia. Las raíces tienen formación de tercio gingival y tercio medio, sin total formación del tercio apical. Apices abiertos.
5537
13
F. Inhumación: 26/09/95 F. Exhumación: 21/07/00 Peso: 1,3gr Longitud: 2.64 cm Corona: faceta de desgaste en el borde incisal con exposición de dentina. Raíz: recta, cónica y larga.
Total formación coronal y radicular. Cámara pulpar pequeña, conducto radicular amplio. Cierre apical.
6580
11
F.Inhumación. 29/10/95 F.Exhumación. 21/07/00 Peso: 1.1 gr Longitud: 2 cm Corona: Faceta de desgaste en borde incisal. Raíz: recta, cónica.
Total formación coronal y radicular. Cierre apical.
1453
25
F.Inhumación: 31/08/95 F.Exhumación. 25/07/00 Peso: 1.1 gr Longitud: 2.0 cm Corona: en su cara oclusal presenta dos cúspides una vestibular y una palatina. Facetas de desgaste que afectan el esmalte. Raíz: una única raíz corta, gruesa y cónica.
Total formación coronal y radicular. Cámara pulpar pequeña. Conducto radicular amplio que se estrecha en el ápice. Apice cerrado.
124
23
F.Inhumación: 26/01/96 F.Exhumación. 28/07/00 Peso: 1.6 gr Longitud: 2.72 cm Corona: faceta de desgaste incisal, que afecta esmalte y dentina. Raíz: recta, cónica y larga.
Total formación coronal y radicular. Cámara pulpar pequeña, conducto radicular amplio que se estrecha en el ápice. En el tercio medio del conducto se observa imagen radiopaca
Se observa mancha de color marrón oscuro compatible con caries radicular.
compatible con calcificación pulpar. Cierre apical.
6503
23
F.Inhumación: 10/11/95 F.Exhumación. 21/07/00 Peso: 1.3 gr Longitud: 2.83 cm Corona: desgaste incisal con exposición de dentina. En la cara palatina se observa faceta de desgaste desde el borde incisal hasta el cíngulo. Raíz: recta, con inclinación distal del tercio apical.
Total formación coronal y radicular. Conducto radicular amplio. Cierre apical.
ScSJo 32
23
F.Inhumación: 11/08/95 F.Exhumación. 13/07/00 Peso: 1.3 gr Longitud: 2.8 cm Corona: Desgaste incisal con exposición de dentina. La vertiente distal presenta obturación al parecer resina. Raíz: recta, cónica y larga. Presenta erosión en tercio gingival en vestibular y palatino.
Total formación coronal y radicular. En la superficie vestibular se observa imagen radiolucida compatible con la restauración descrita clínicamente. Cámara pulpar pequeña con conducto radicular amplio que se estrecha en tercio apical. Apice cerrado.
4327
13
F.Inhumación: 11/08/95 F.Exhumación. 13/07/00 Peso: 2.3 gr Longitud: 3 cm Corona: faceta de desgaste en vertiente distal. Raíz: recta con inclinación vestibular del tercio apical. Se observa erosión en tercio cervical.
Se observa total formación coronal y radicular. Conducto radicular amplio que se estrecha en el ápice. Apice radicular cerrado.
4986
13
F.Inhumación: 31/08/95 F.Exhumación. 18/07/00 Peso: 1.2 gr Longitud: 2.4 cm Corona: faceta de desgaste incisal que involucra esmalte y dentina. Raíz: recta de forma cónica. Apice cerrado.
Total formación coronal y radicular. El borde incisal presenta imagen plan compatible con el desgaste incisal descrito. La cámara pulpar es pequeña , conducto radicular amplio, que se estrecha en el tercio apical. Cierre apical.
4568
23
F.Inhumación: 3/08/95 F.Exhumación. 13/07/00 Peso: 1.9 gr Longitud: 2.95 cm Corona: faceta de desgaste en superficie incisal con exposición de dentina. En la superficie distal presenta caries pequeña. Raíz: larga, cónica y recta, con leve desviación distal.
Total formación coronal y radicular. Cámara pulpar amplia, conducto radicular amplio que se estrecha en el ápice. Cierre apical.
4439
46
F.Inhumación: 18/07/95 F.Exhumación. 12/07/00 Peso: 2.0 gr Longitud: 2.2 cm Corona: presenta cinco cúspides por su cara oclusal, tres vestibulares, dos linguales. Desgaste en los lomos de las cúspides vestibulares y en el lomo de la cúspide mesolingual. Raíz: tres raíces una mesial y dos dístales, fusionadas entre sí.
Total formación coronal y radicular. Cámara pulpar pequeña. Conductos radiculares estrechos con cierre apical.
513
27
F.Inhumación: 18/07/95 F. Exhumación: 28/07/00 Peso: 2,1gr Longitud: 2,07 cm Corona: la superficie oclusal presenta tres cúspides, dos vestibulares y una lingual. Faceta de desgaste en cara oclusal cúspide distal y vertiente distal de la cúspide palatina. Caries en superficie vestibular. Raíz: raíces fusionadas. Cónica, recta. El tercio gingival presente erosión por sus caras distal y palatina.
Total formación coronal y radicular. Cámara pulpar amplia, conducto radicular amplio. Apice sellado.
4915
23
F.Inhumación: 11/08/95 F. Exhumación: 18/07/00 Peso: 1.4 gr Longitud: 2,66 cm Corona: faceta de desgaste en el borde incisal con exposición de dentina. Raíz: recta, cónica, larga, con leve inclinación distal.
Total formación coronal y radicular. Cámara pulpar pequeña, conducto radicular amplio que se estrecha en el ápice. Cierre apical.
3748
46
F.Inhumación: 18/07/95 F. Exhumación: 12/07/00 Peso: 2.5 gr Longitud: 2,2 cm Corona: cuatro cúspides, dos vestibulares y dos palatinas. Presenta tubérculo de carabelli. En la superficie mesial se observa caries pequeña. Raíz: tres raíces: dos vestibulares, una palatina.
Total formación coronal y radicular. Cámara pulpar pequeña. Conducto radicular de raíz palatina amplio con cierre apical. Los conductos radiculares mesovestibular y distovestibular son estrechos con cierre apical.
3917
13
F. Inhumación: 18/05/95 F. exhumación: 11/07/00 Peso: 1.2 gr Longitud: 2,6 cm Corona: faceta de desgaste en vertiente mesial y distal que involucra únicamente esmalte. Raíz: recta, cónica, con leve inclinación del tercio apical.
Se observa total formación coronal y radicular amplio hasta el tercio medio y se angosta hacia el ápice. Cierre apical.
B45SJo
25
F. Inhumación: 11/08/95 F. exhumación: 11/07/00 Peso: 1.1 gr Longitud: 2,3 cm Corona: Presenta dos cúspides, una vestibular y una palatina. Faceta de desgaste en esmalte. Raíz: una raíz recta, cónica, larga.
Total formación coronal y radicular. Cámara pulpar amplia al igual que el conducto. Cierre apical.
Anexo 3. Fotografías y radiografías de las estructuras dentales, utilizadas en este estudio.
6580
3201/35
513
3201/34
5537
5795
6580
1453
124
6503
4327
32 SJo
4568
4986
513
4439
4915
3748
B45SJo
3917
Anexo 4. Técnica de corte sagital o eje longitudinal del diente para acceder a los tejidos dentarios para extracción de ADN.
6 5 8 0 P
Corte sagital o eje longitudinal del diente, con pieza de mano de alta velocidad y fresa de carburo 700 SS White.
Recolección de tejido pulpar, en tubo eppendorf raspando, con cucharilla.
6 5 8 0 D
6 5 8 0 C
Recolección de dentina con pieza de mano de alta velocidad y fresa de carburo 700 SS White.
Recolección de cemento con pieza de mano de alta velocidad y fresa zecrya