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OBTENCIÓN DE LEVADURAS PRODUCTORAS DE BIOETANOL A

PARTIR DE JUGO DE SORGO DULCE [Sorghum bicolor (L.) Moench]

Noé Montes García, María Guadalupe Aguilar Uscanga, Libia E. Díaz Nava, Dulce M. Barradas

Dermitz, Germán Partida Sedas, Ma. Eugenia Cisneros López y Anilú Miranda Medina

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias

Centro de Investigación Regional del Noreste

Campo Experimental Río Bravo

Río Bravo, Tamaulipas, Agosto de 2017

Folleto Técnico Núm. MX-0-330992-45-03-13-09-67

ISBN: 978-607-37-0760-2

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Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación

Lic. José Eduardo Calzada Rovirosa Secretario

C.P. Jorge Armando Narváez Narváez Subsecretario de Agricultura

Lic. Mely Romero Celis Subsecretaría de Desarrollo Rural

Lic. Ricardo Aguilar Castillo Subsecretario de Alimentación y Competitividad

Lic. Marcelo López Sánchez Oficial Mayor

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias

Dr. Luis Fernando Flores Lui Director General

Dr. Raúl G. Obando Rodríguez Coordinador de Investigación, Innovación y Vinculación

M.C. Jorge Fajardo Guel Coordinador de Planeación y Desarrollo

Mtro. E. Francisco Berterame Barquín Coordinador de Administración y Sistemas

Centro de Investigación Regional del Noreste Dr. Sebastián Acosta Núñez

Director Regional

Dr. Jorge Elizondo Barrón Director de Investigación, Innovación y Vinculación

C.P. Everardo Díaz Covarrubias Director de Administración

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Obtención de levaduras productoras de bioetanol a partir de

jugo de sorgo dulce [Sorghum bicolor (L.) Moench]

Dr. Noé Montes García1

Dra. María Guadalupe Aguilar Uscanga2

M.C. Libia Elena Díaz Nava2

M.C. Dulce María Barradas Dermitz2

M.C. Germán Partida Sedas2

Dra. Ma. Eugenia Cisneros López1

M.C. Anilú Miranda Medina2

1Investigador del Programa de Sorgo. Campo Experimental Río Bravo. CIRNE. INIFAP. 2Investigadores del Programa Biocombustibles. Instituto Tecnológico de Veracruz-ITVER.

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Centro de Investigación Regional del Noreste

Campo Experimental Río Bravo Río Bravo, Tamaulipas, México

Agosto, 2017

Folleto Técnico Núm. MX-0-330992-45-03-13-09-67

ISBN: 978-607-37-0760-2

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Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Progreso No. 5, Barrio de Santa Catarina, Delegación Coyoacán, C. P. 04010,

México, D. F. Teléfono (01800) 0882222

Obtención de levaduras productoras de bioetanol a partir de jugo de sorgo dulce [Sorghum bicolor (L.) Moench]

ISBN: 978-607-37-0760-2

Clave INIFAP/CIRNE/A-576

Primera edición 2017

No está permitida la reproducción total o parcial de esta publicación, ni la transmisión de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, fotocopia, por registro u otros métodos, sin el permiso previo y por escrito de la institución.

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Contenido

Página

Introducción 1

El etanol 4

Las levaduras 8

Factores que influyen en la fermentación alcohólica 9

Características deseables en las levaduras 15

Aislamiento de levaduras 15

Proceso para el aislamiento de levaduras a partir de jugo de sorgo dulce

17

Aislamiento de cepas de levaduras productoras de etanol 17

Selección de levaduras osmotolerantes 20

Selección de levaduras con resistencia al etanol 23

Selección de levaduras con termotolerancia 25

Selección de levaduras con actividad killer 27

Identificación de las levaduras seleccionadas 28

Producción de etanol en jugo de sorgo dulce 32

Ventajas de la cepa ITV-S42 34

Agradecimientos 35

Literatura citada 36

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Índice de figuras

Página Figura 1. Sorgo dulce [Sorghum bicolor (L.) Moench]. 2

Figura 2. Jugo obtenido del tallo de sorgo dulce. 6

Figura 3. Diagrama de las etapas de producción de etanol a partir de sorgo dulce.

7

Figura 4. Metodología utilizada para la obtención de cepas de levadura productoras de bioetanol a partir de jugo de sorgo dulce.

18

Figura 5. Morfología macroscópica de algunas de las cepas de levaduras aisladas a partir de la fermentación espontánea de jugo de sorgo dulce.

19

Figura 6. Rendimientos máximos de etanol (Y P/S) obtenidos con cepas aisladas de jugo de sorgo dulce.

20

Figura 7. Efecto de la concentración inicial de glucosa sobre la productividad de etanol (QP) en las cepas de levadura aisladas de jugo de sorgo dulce.

21

Figura 8. Efecto de las diferentes concentraciones de etanol inicial en el medio de cultivo sobre la producción máxima de etanol en las levaduras seleccionadas.

24

Figura 9. Efecto de las diferentes temperaturas evaluadas sobre el consumo de glucosa en las cepas de levaduras seleccionadas.

26

Figura 10. Efecto de las diferentes temperaturas sobre la producción máxima de etanol en las cepas de levaduras seleccionadas.

26

Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos amplificados por PCR de las regiones ITS del ADN nuclear de las cepas de levadura aisladas de jugo de sorgo dulce.

29

Figura 12. Árbol filogenético para las cepas seleccionadas. 31

Figura 13. Producción de etanol de cepas seleccionadas en jugo de sorgo dulce.

33

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Índice de cuadros Página Cuadro 1. Efecto de la concentración inicial de glucosa sobre el

porcentaje de consumo de sustrato en las cepas de levadura aisladas de jugo de sorgo dulce.

22

Cuadro 2. Identificación de la actividad killer en cepas de jugo de sorgo dulce.

28

Cuadro 3. Homologías de las cepas aisladas de jugo de sorgo dulce con diferentes accesiones de P. kudriavzevii reportadas en NCBI.

30

Cuadro 4. Rendimiento y productividad de etanol de las cuatro cepas seleccionadas en jugo de sorgo dulce.

34

Obtención de levaduras productoras de bioetanol a partir de jugo de sorgo dulce 2017

1

OBTENCIÓN DE LEVADURAS PRODUCTORAS DE BIOETANOL A PARTIR DE JUGO

DE SORGO DULCE [Sorghum bicolor (L.) Moench]

Dr. Noé Montes García

Dra. María Guadalupe Aguilar Uscanga M.C. Libia Elena Díaz Nava

M.C. Dulce María Barradas Dermitz M.C. Germán Partida Sedas

Dra. Ma. Eugenia Cisneros López M.C. Anilú Miranda Medina

Introducción

El sorgo dulce [Sorghum bicolor (L.) Moench] es una planta con

altos contenidos de azúcares, almidón y material lignocelulósico

considerado como cultivo C4 de la familia de las gramíneas

(Figura 1). México se encuentra en el tercer lugar en producción

de sorgo granífero en el mundo con el 10 % del total de la

producción mundial (SAGARPA, 2011). Entre sus principales

características están el tener una alta eficiencia fotosintética,

debido a su metabolismo que permite que el sorgo acumule CO2

durante la noche, reduzca la tasa de fotorespiración en presencia

de luz y disminuya la pérdida de agua a través del estoma

(Keeley y Rundel, 2003), siendo uno de los cultivos agrícolas más

resistentes a la sequía, ya que tiene la capacidad de ser

extremadamente eficiente en el uso de agua, de dióxido de

carbono, de los nutrimentos y de la luz solar (Serna-Saldívar,

2010). A pesar de ser originario de zonas tropicales, se adapta

bien a los climas templados, adaptabilidad a suelos pobres y se


2

pueden obtener hasta tres cosechas por año en climas tropicales

(Woods, 2000).

El sorgo dulce se ha considerado para la producción de etanol en

algunos países como complemento energético a los derivados del

petróleo, logrando maximizar la producción del mismo, gracias a

las características que el sorgo posee, tales como la resistencia a

diferentes tipos de suelos, a sus múltiples periodos de cosechas,

a su resistencia a la salinidad, a las inundaciones y sequía,

presenta de 2 a 3 cosechas por año y la cantidad de fertilizante

que requiere es mucho menor en comparación con la caña de

azúcar y el maíz, cultivos que se utilizan actualmente como

materias primas para la producción de biocombustibles

(Almodares y Hadi, 2009).

El sorgo dulce llega a

alcanzar una altura de

hasta 220 cm o más, lo cual

depende de la variedad y

de las condiciones de

cultivo y suelo en que se

siembre.

Figura 1. Sorgo dulce [Sorghum bicolor (L.) Moench].


3

El sorgo dulce tiene un alto contenido de jugo (30 mil L ha-1) y

bagazo (25 t ha-1) siendo un cultivo con grandes oportunidades

para diversos usos, sin embargo, hasta ahora la mayoría de las

aplicaciones en todo el mundo han sido para la obtención de

forraje y jarabes. A partir del uso final que se le da, puede ser

clasificado en sorgo de grano, forrajero, de alta biomasa para la

producción de biomasa lignocelulósica y dulce, donde el jugo de

éste es empleado para producir etanol (Almodares et al., 2008a).

La composición físico-química del sorgo dulce varía según la

variedad, etapa fenológica de la planta y condiciones de cultivo,

teniendo en promedio en un jugo con un contenido en sólidos

totales entre el 14 y 23 °Brix (Almodares y Sepahi, 1996).

El sorgo es un cultivo muy fácil de manejar genéticamente, lo

cual facilita el mejoramiento de las plantas y el desarrollo de

nuevas variedades adaptadas a diferentes regiones en todo el

mundo (Zhang et al., 2010). Almodares y Hadi (2009), sugieren

plantar sorgo dulce para incrementar la producción de

biocombustibles en los países cálidos y secos, para resolver

problemas como el aumento de octano en la gasolina, así como

reducir las emisiones de gases de efecto invernadero, ya que es

un cultivo que se encuentra bien adaptado a diferentes tipos de

climas como tropicales y áridos.

Por sus características, el sorgo dulce puede utilizarse para

desarrollar tecnología con el fin de obtener una serie de

productos de interés con aplicaciones en la industria alimentaria,

farmacéutica, química y bioenergética para la producción de

bioetanol. Este producto puede elaborarse a través de la

transformación de los azúcares presentes en el sorgo por la

acción de diversos microorganismos, a lo que se conoce como


4

fermentación. Se han reportado características deseables en

cepas de levaduras productoras de etanol, como son la

resistencia al etanol, osmotolerancia, termotolerancia y cepas

que presenten actividad killer (Panchal, 1990).

El etanol La utilización del etanol como combustible constituye una opción

para encontrar fuentes alternativas de energías no

contaminantes y renovables. Actualmente la producción de

etanol se lleva a cabo a partir de diversas materias primas, como

son los cultivos agrícolas, los residuos de cosechas, forestales y

los desechos industriales. Los cultivos agrícolas se han situado

como la mejor opción para satisfacer la demanda de etanol

proyectada a gran escala, destacando por su alto contenido de

azúcares: caña de azúcar, remolacha, maíz y sorgo dulce

(Almodares et al., 2008b).

El etanol, bioetanol o alcohol etílico es un compuesto líquido,

incoloro, volátil, inflamable y soluble en agua, cuyas moléculas se

componen de carbono, hidrógeno y oxígeno. Se obtiene de la

fermentación de biomasa rica en contenido de almidones y

azúcares hasta convertir los carbohidratos en alcohol a través de

la acción de microorganismos. Este etanol puede utilizarse como

combustible para automóviles, ya sea puro al 99.3 °GL, o también

en mezcla con gasolina en cantidades variables que van desde un

5 % de etanol hasta un 85 % (Vazquez y Dacosta, 2007). La

reacción biológica que sucede para llevar a cabo la producción de

etanol, que permite degradar los azúcares en alcohol y dióxido

de carbono se representa mediante la reacción:


5

Glucosa (C6H12O6)

Etanol (2C2H5OH) + Dióxido de Carbono (2CO2)

Las tecnologías que se utilizan para su producción se pueden

clasificar de acuerdo con la materia prima que se utilice:

materiales ricos en azúcares simples (caña de azúcar, melaza y

sorgo dulce) y los abundantes en almidón (papa, camote y

cereales), usan una tecnología llamada de "primera generación”

donde el costo de la materia prima representa de un 60 a 80 %

del costo final del bioetanol.

Por otro lado, si el etanol se obtiene a partir de residuos

agrícolas (residuos lignocelulósicos) tales como pasto y en

general materiales fibrosos que están compuestos

principalmente por hemicelulosa, celulosa y lignina, la tecnología

se conoce como de "segunda generación". En este proceso se

requieren etapas adicionales al proceso de primera generación,

ya que es necesario liberar los azúcares monoméricos (en su

mayoría glucosa, xilosa y arabinosa) que se encuentran

atrapados en una matriz que contiene hemicelulosa, celulosa y

lignina, para posteriormente fermentar el material resultante

con microorganismos que tengan la capacidad de asimilar y

fermentar hexosas y/o pentosas.

De acuerdo con la SAGARPA (2011), es posible técnicamente

obtener etanol de cualquier material orgánico que contenga

azúcares, aunque las principales materias primas son la caña de

azúcar y el maíz, a partir de las cuales se genera actualmente más

del 90 % de la producción mundial de etanol. En México se

produce etanol de primera generación a partir de melazas de

caña de azúcar; el uso de ésta materia prima representa una

oportunidad para el sector azucarero, sin embargo, es posible

producirla directamente del jugo de la caña de azúcar. El sorgo


6

dulce es una materia prima que representa una alternativa

aceptable, principalmente porque se cosecha durante todo el año

y tiene un costo de producción mucho menor en comparación

con el de la caña de azúcar. Después de haber extraído el jugo

mediante un molino o trapiche (Figura 2), éste pasa a un proceso

de evaporación, fermentación, destilación y deshidratación para

producir etanol (Figura 3).

Figura 2. Jugo obtenido del

tallo de sorgo dulce.


7

TALLO DE

SORGO DULCE MOLIENDA BAGAZO

JUGO

EVAPORACIÓN

FERMENTACIÓN

DESTILACIÓN

DESHIDRATACIÓN Etanol

Anhidro

VINAZAS

Figura 3. Diagrama de las etapas de producción de etanol a partir

de sorgo dulce.

Etanol 96.5 ºGL


8

Las levaduras

Los microorganismos que llevan a cabo la transformación de los

azúcares a etanol son las levaduras, siendo Saccharomyces

cerevisiae la levadura más comúnmente utilizada y la más

estudiada para este tipo de procesos (Díaz-Nava, 2014). Sin

embargo, se ha encontrado que algunos tipos de hongos y

levaduras denominadas como no-Saccharomyces pueden ser

productores de etanol, pero su uso a nivel industrial es aun

limitado debido a que no compiten en cuanto a tolerancia a

etanol, osmotolerancia y actividad killer con respecto a

Saccharomyces (Jolly et al., 2006).

Con el fin de contrarrestar los problemas que se presentan en las

fermentaciones alcohólicas industriales, debido a la inhibición

por etanol, inhibición por sustrato, compuestos tóxicos presentes

en hidrolizados lignocelulósicos y la contaminación microbiana,

es necesaria la búsqueda de cepas de levaduras que presenten

las características deseables para resistir a tales inhibiciones y

que impidan el desarrollo de microorganismos: De no combatir

estos problemas se conllevará a la disminución en la producción

de etanol y a pérdidas económicas en el proceso fermentativo

(Aguilar-Uscanga, 1998).

Según Díaz-Nava (2014), los cultivos puros y autóctonos de

levaduras son más efectivos en las fermentaciones alcohólicas,

debido a que se encuentran adaptados a las condiciones

climáticas de la zona, a la materia prima a fermentar y brindan

características únicas al producto, lo que permite crear

alternativas.


9

Factores que influyen en la fermentación

alcohólica

La fermentación alcohólica es un proceso anaerobio y

exotérmico que permite degradar azúcares en alcohol y dióxido

de carbono. En el proceso de producción de bioetanol se deben

considerar factores importantes que influyen en la fermentación

alcohólica, como lo son las condiciones del medio, el modo de

operación del bioreactor, el medio de cultivo enriquecido con los

nutrientes necesarios y el material biológico con el que se llevará

a cabo la fermentación, siendo las bacterias, hongos y

principalmente las levaduras los microorganismos que se

utilizan. Debido a que las fermentaciones industriales no se

realizan en medios estériles, se presentan problemas por la

contaminación de otros microorganismos en el medio de

fermentación, lo cual genera la producción de metabolitos

secundarios y de compuestos tóxicos, como el ácido acético que

provocan la muerte celular de la levadura implementada

(Aguilar-Uscanga, 1998).

Es necesario tener en cuenta los problemas que puedan

presentarse en los procesos de fermentación alcohólica, uno de

ellos es la inhibición por producto en este caso el etanol, la cual

puede deberse al deterioro de la membrana plasmática, a la

desnaturalización de proteínas intracelulares y a la actividad de

enzimas glicolíticas. Se han reportado concentraciones mínimas

inhibitorias de etanol de alrededor 13 % p/v (Ortiz-Zamora et al.,

2007). Este metabolito actúa inhibiendo el crecimiento y

capacidad fermentativa en las levaduras, las cuales dependiendo

de la cepa que se trate, difieren en su capacidad para tolerar

diferentes niveles de etanol, aunque muchas cepas de levaduras


10

permanecen viables en presencia de concentraciones de etanol

(3-4 % p/v) que son letales para otros microorganismos (Casey y

Ingledew, 1986).

El mecanismo de inhibición por etanol durante las

fermentaciones por lote con cepas de Saccharomyces cerevisiae o

cuando éste se añade al medio de cultivo, ha sido estudiado

extensivamente debido a su complejidad. Nagodawithana et al.

(1977), reportaron que el etanol exógeno, adicionado a cepas de

Saccharomyces cerevisiae, fue menos tóxico que el etanol

endógeno producido por la levadura. Esto puede deberse a que la

velocidad de producción de etanol dentro de las células es

inferior o igual a la velocidad a la que podría ser excretado, lo

cual origina que durante el proceso de fermentación la

concentración de etanol se eleve, y cuando ésta alcanza

aproximadamente un 12 % de volumen, las levaduras tienden a

morir (Panchal y Stewart, 1980; Beaven et al., 1982).

Se ha reportado también que la concentración de etanol dentro

de la célula puede ser mayor que afuera de ésta en ciertas etapas,

especialmente bajo condiciones ambientales como la

temperatura o las altas presiones osmóticas. El aumento de la

temperatura y/o la presión osmótica se han relacionado con el

aumento de las concentraciones intracelulares de etanol y

disminución de la tolerancia de las células al etanol (D’Amore et

al., 1990).

Diferentes efectos de inhibición se manifiestan en la célula

cuando se expone a concentraciones elevadas de etanol, como es

el caso de la inhibición en el crecimiento celular y la viabilidad,

aumentando la muerte celular (Benitez et al., 1983). Brown et al.

(1982) observaron que a concentraciones superiores al 13 % de


11

etanol en el medio, existía una inhibición completa en el

crecimiento de levaduras.

Por su parte, Holzer (1976) observó que en cepas del género

Saccharomyces la concentración máxima tolerada de etanol fue

de aproximadamente 70 g/L. Asimismo, Pina et al., (2004)

mencionan que especies no-Saccharomyces pueden sobrevivir a

las concentraciones crecientes de etanol producido en la

fermentación, con el máximo de tolerancia a 6 % v/v. Sin

embargo, observaron que al efectuar cambios en los lípidos de la

célula, inducidos por ciertas condiciones de cultivo,

incrementaban la adaptación de las levaduras a etanol.

Otro factor que influye en la fermentación es la “inhibición por

sustrato”, ya que a altas concentraciones de azúcar se inhibe el

crecimiento celular y la actividad fermentativa de las levaduras

como resultado de la alta presión osmótica y la baja actividad de

agua (Casey y Ingledew, 1986). Se han reportado que ha

concentraciones de glucosa por arriba de los 160 g L-1 existe ya

inhibición (Ortiz-Zamora et al., 2007).

La inhibición por el azúcar se explica como un fenómeno de

ósmosis. Si una célula de levadura se encuentra en una

disolución de azúcar de presión osmótica más fuerte que la del

contenido de sus vacuolas, la célula será más o menos

plasmolizada (Brown y Oliver, 1982). Cuando las condiciones del

medio extracelular tienen una concentración mayor que la que

existe en el interior celular (hipertónicas), el agua que hay

dentro de la célula sale al medio hipertónico (ósmosis) y la célula

se deshidrata, ya que pierde el agua que la llenaba, reduciendo

así su tamaño. La inhibición por sustrato directo en la capacidad

fermentativa, en general llega a ser significativa si la


12

concentración de azúcares en el medio se encuentra entre 15 a

25 % (p/v) (Jones y Greenfield, 1981).

Las levaduras resistentes a altas concentraciones de azúcar se

denominan osmotolerantes ya que son capaces de adaptarse a

potenciales de agua bajos y a presiones osmóticas elevadas.

Existen varias respuestas fisiológicas de las levaduras al ser

expuestas a elevadas concentraciones de azúcares, incluyendo

flujo de salida de agua intracelular, la reducción del volumen de

la vacuola, aumento en los intermediarios glicolíticos, y la

acumulación de osmolitos en el citosol (Pitt y Hocking, 2009).

Las levaduras osmotolerantes presentan ciertas propiedades que

les permiten la adaptación a condiciones de potencial de agua

reducido. La principal es la capacidad de acumular en su interior

polioles (arabitol, manitol, arabinitol o glicerol) implicados en la

osmorregulación, y que al acumularse en niveles altos, protegen

a las enzimas intracelulares en condiciones de estrés (Deak y

Beuchat, 1996).

Se ha reportado que la máxima concentración tolerante de

glucosa para levaduras del género Saccharomyces ha sido de 200

g/L (Ortiz-Zamora, 2006; Walker, 1998). Sin embargo, algunas

cepas han sido capaces de crecer a concentraciones alrededor de

250 g/L, pero debido a la elevada concentración de sustrato

inicial en el medio, la velocidad de producción disminuye

(Walker, 1998). En este contexto, Ingledew (1995) observó los

inconvenientes de la presión osmótica y logró fermentar mostos

de cereales, cuyos contenidos de azúcares reductores fueron

superiores a 300 g L-1, obteniendo rendimientos de alcohol de

hasta 23 % (v/v). El método de Ingledew es usado en las

industrias de la fermentación alcohólica, ya que buscan trabajar


13

con elevadas concentraciones iniciales de azúcares. Para poder

trabajar con este tipo de tecnología se requieren cepas

osmotolerantes y que resistan altas concentraciones de etanol.

La contaminación microbiana es otro factor que influye en la

fermentación debido a que los procesos de fermentación

industriales no son estériles, y pueden permitir el desarrollo de

otros tipos de microorganismos que compiten por los azúcares,

produciendo compuestos orgánicos indeseables para la calidad

final del alcohol, que a su vez resultan ser tóxicos para las

levaduras (Camargo et al., 1990).

La contaminación por bacterias no representa un problema tan

grave ya que puede ser controlada por medio de antibióticos

adicionados al medio de cultivo. Sin embargo, en caso de

encontrarse levaduras no deseables en el proceso de

fermentación, que puedan fomentar la aparición de metabolitos

secundarios, es necesario recurrir a otras alternativas, como el

uso de cultivos de levaduras que presenten actividad killer, las

cuales ayudarán a controlar el crecimiento de levaduras no

deseadas.

Se han propuesto varios mecanismos para explicar la actividad

antagonista de levaduras hacia otras levaduras, y estos incluyen

la producción de toxinas killer y otras proteínas y péptidos

inhibidores, la competencia por los nutrientes y el espacio, la

producción de glucanasas líticas de la pared celular de hongos y

quitinasas, la producción de metabolitos tóxicos, e inducción de

reacciones de resistencia o de defensa de hongos (Punja y

Utkhede, 2003).


14

La producción de etanol y la actividad killer son propiedades

importantes en la selección y comercialización de levaduras, ya

que ponen a consideración el hecho de que las levaduras

probablemente tienen mayor potencial como agentes de control

biológico (Degre, 1993).

En la industria es importante utilizar levaduras que crezcan a

temperaturas elevadas. Lo anterior debido a que las

fermentaciones industriales suelen llevarse a cabo en ambientes

expuestos a altas temperaturas, que aunado al calentamiento de

los medios de fermentación por las reacciones metabólicas

exotérmicas, provoca un incremento de temperatura en los

fermentadores que puede llegar a superar los 40 °C, provocando

estrés térmico y disminuyendo la productividad de etanol

(Hernández et al., 1986).

El uso de levaduras termotolerantes permite abaratar el proceso,

ya que se evita el uso de sistemas de enfriamiento costosos. Otras

ventajas de la utilización de altas temperaturas en el proceso de

producción de etanol son el aumento de la productividad, la

reducción de los riesgos de contaminación y una mayor facilidad

en la recuperación del producto (Fleet, 2006).

El concepto de levaduras termotolerantes varía en la literatura,

según D’Amore et al., (1990) las levaduras termotolerantes son

aquellas capaces de crecer a temperaturas superiores a 40 °C.

Las especies de levaduras más resistentes al calor incluyen

Saccharomyces cerevisiae, Pichia membranifaciens, Pichia

anomala, Pichia galeiformis, Candida albicans, Clavispora

lusitania, Issatchenkia orientalis y Schizosaccharomyces pombe

(Lee et al., 1993). En otros reportes se consideran

termotolerantes a las levaduras con crecimiento en el rango de


15

33-35 °C y termófilas a las levaduras capaces de crecer a

temperaturas superiores a 48 °C (Morimura et al., 1997).

Características deseables en las levaduras Las características deseables en las levaduras para producir

bioetanol son: fácil propagación, genéticamente estables,

resistentes a compuestos tóxicos, capacidad de utilizar varios

sustratos, resistentes a bajos pH, ser deficiente respiratoria,

ácido tolerantes, osmotolerantes, resistentes a etanol,

termotolerantes y poseer actividad killer (Panchal, 1990).

Aislamiento de levaduras El aislamiento de levaduras ha sido de vital importancia para la

obtención de cepas de interés en las fermentaciones alcohólicas.

Seleccionar cepas adecuadas de levaduras autóctonas para cada

tipo de proceso fermentativo podría llevar a mejorar la calidad

del producto deseado (Barnett et al., 2000).

Las levaduras han sido tradicionalmente aisladas a partir de

pulpa de fruta y el zumo industrializado, así como de otros

alimentos naturales o procesados. Esto se debe a su asociación

con sustratos azucarados y la consiguiente participación en

diversos procesos de fermentación (Trindade et al., 1999).

Se han reportado una gran cantidad de aislamientos de levaduras

a partir de diferentes materiales como jugos, melazas, variedades

de plantas y fermentación de vinos. Los criterios utilizados para

la selección de cepas consisten en una sucesión de pruebas para

determinar la ausencia o presencia de determinados caracteres


16

que se consideran importantes para el proceso de fermentación

(Carvajal-Barriga et al., 2011).

Se han realizado trabajos de aislamiento de levaduras utilizando

melaza de caña de azúcar, y tomando como criterio de selección

la producción de etanol, resultando ser capaces de tolerar

concentraciones de etanol entre 5 y 10 % (v/v) (Salcedo-

Cárdenas, 2008). A partir de la fermentación de jugo de marañon

se lograron obtener cepas de levadura que lograron crecer a

concentraciones de 15 (p/v) de glucosa y toleraron

concentraciones de etanol de 10 % (v/v) (Osho, 2005).

En los últimos años, especies de levaduras denominadas no-

Saccharomyces han adquirido más relevancia debido a su

contribución tanto en la fermentación de alimentos como de

bebidas. Entre algunos de estos géneros de levaduras destacan

Hanseniaspora, Kluyveromyces Candida, Issatchenkia, Pichia y

Metschnikowia, que han sido aisladas de fermentaciones de sidra

y vino, productos lácteos, embutidos y varias fermentaciones de

vegetales (Fleet, 2006; Barata et al., 2008).

La biotecnología en levaduras es un campo en crecimiento,

donde nuevas especies y sus capacidades fisiológicas, son

potencialmente útiles en la búsqueda de nuevos productos. Uno

de los campos más prometedores relacionados con la

caracterización y la identificación de la diversidad de levaduras

tiene que ver con el posible uso de ellas en la producción de

nuevas enzimas y productos químicos (Carvajal-Barriga et al.,

2011).


17

Proceso para el aislamiento de levaduras a partir de jugo de sorgo dulce

El proceso que se ha propuesto para obtención de cepas de

levadura productoras de bioetanol a partir de jugo de sorgo

dulce se presenta en la Figura 4, el cual incluye una selección

primaria y una selección secundaria. La obtención de nuevas

cepas fermentadoras permitirá hacer una fermentación más

eficiente y aprovechar de manera más global los recursos o

sustancias que se encuentran en el jugo del sorgo dulce o de

cultivos bioenergéticos.

De acuerdo con Díaz-Nava (2014) inicialmente se extrajo jugo de

sorgos dulces, los cuales en este caso fueron procedentes del

Campo Experimental Cotaxtla, Veracruz dependiente del INIFAP,

entre los que figuran RB-Cañero, RB-PSD02, SBA-25, SBA22, RB-

Norteño, RB-Huasteco y las cruzas SBA25xIndu, SBA25xSureño,

SBA25xRB-Cañero, SBA25xPSD02, SBA25xTopper, SBA25xTheis,

SBA22xRB-Cañero, SBA22xPSD02, SBA22xDulce y

SBA22xSureño. Posteriormente se realizó el proceso de

obtención de cepas de levadura productoras de bioetanol en dos

etapas: a) aislamiento y b) selección de las cepas que presentan

características osmotolerantes.


18

Figura 4. Metodología utilizada para la obtención de cepas de

levadura productoras de bioetanol a partir de jugo de sorgo dulce.

Diferentes variedades de

sorgo dulce

Fermentación espontanea de

jugo

Extensión en placa

36 h;30°C

Etanol Y P/S

> 0.35 g/g

Selección primaria

36 h; 30°C

250 rpm

Selección secundaria

Osmotolerancia 100, 150, 200 g/L

LEVADURAS PRODUCTORAS DE ETANOL


19

Para el aislamiento de levaduras se tomó en cuenta como criterio

de selección “la caracterización del jugo de sorgo dulce”

utilizando solo las variedades que presentan altas

concentraciones de azúcares totales. Estos jugos seleccionados

se fermentaron de manera rápida a 30 °C y 250 rpm durante 36

h. Se toma 1 mL del jugo fermentado y se preparan diluciones 1x

10-4 y 1x 10-5 cel/mL, las cuales son sembradas por medio de la

técnica de siembra en placa por expansión, en un medio de

cultivo que contiene 20 g/L glucosa, 10 g/L extracto de levadura,

20 g/L agar-agar y 0.1 g/L de antibiótico.

En este estudio se aislaron 60 cepas de levaduras productoras de

bioetanol y las concentraciones de bioetanol producido por estas

cepas de levaduras fueron mayores a 6 g L-1 a partir de 20 g L-1

de sustrato inicial. En la Figura 5 se muestran algunas de estas

cepas y su morfología celular.

Figura 5. Morfología macroscópica de algunas de las cepas de levaduras aisladas a partir de la fermentación espontánea de jugo de sorgo dulce.

Para la selección de cepas se tomaron del microorganismo

aislado tres muestras y se disolvieron en matraces de 250 mL,

los cuales contenían 100 g L-1 de medio sintético (20 g L-1


20

glucosa, 5 g L-1 KH2PO4, 2 g/L (NH4)2SO4, 0.4 g L-1

MgSO4•7H2O, y 1 g L-1 de extracto de levadura).

Las muestras se incubaron por 12 h a 30 °C y 250 rpm.

Posteriormente se tomó una muestra y se inoculó en un segundo

matraz 6x106 células viables mL-1 en las mismas condiciones. Se

analizó el crecimiento, consumo de glucosa y producción de

bioetanol a las 0, 7, 14 y 21 h, mediante cromatografía líquida de

alta resolución (HPLC) y se seleccionaron 22 cepas de levaduras

en base a su capacidad de producir etanol y rendimiento

superior a 0.35 g/g (Figura 6).

Figura 6. Rendimientos máximos de etanol (Y P/S) obtenidos con

cepas aisladas de jugo de sorgo dulce (Díaz-Nava, 2014).

Selección de levaduras osmotolerantes Para llevar a cabo la selección de levaduras osmotolerantes,

Díaz-Nava (2014) utilizó las levaduras seleccionadas y las probó

en medios sintéticos variando las concentraciones de glucosa de

100, 150 y 200 g L-1. Para disminuir la fase de adaptación del


21

microorganismo al medio de cultivo de fermentación, la levadura

fue activada por medio de un precultivo. Los resultados

obtenidos mostraron que solo 18 de ellas (Figura 7) fueron

capaces de adaptarse y de crecer a altas concentraciones de

sustrato (hasta 200 g L-1). Estas concentraciones pueden ser

comparadas con las evaluadas por Ortiz-Muñiz et al., (2010) para

una cepa de levadura aislada de melaza de caña de azúcar

(Saccharomyces cerevisiae ITV-01), la cual presentaba

característica osmotolerantes a concentraciones entre 100-200 g

L-1.

Figura 7. Efecto de la concentración inicial de glucosa sobre la productividad de etanol (Qp) en las cepas de levadura aisladas de jugo de sorgo dulce (Díaz-Nava, 2014).

Las levaduras al ser expuestas a condiciones hipertónicas (mayor

concentración de soluto en el medio externo) presentan una

tendencia termodinámica para equilibrar la concentración de

solutos dentro y fuera de la célula. Puesto que en éstas

condiciones el agua fluye hacia el exterior de la célula, ésta se

deshidrata y su crecimiento se ve inhibido (Strehaiano et al.,

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Qp

(g

/Lh

)

Cepas productoras de etanol

100 g/L 150 g/L 200 g/L


22

2006). Se observó que conforme aumentaban las

concentraciones iniciales de sustrato en el medio, disminuía el

porcentaje de consumo de glucosa. Esto puede deberse a que a

medida que la concentración de azúcar inicial en el medio de

cultivo aumenta (Cuadro 1), la fase de latencia se prolonga, la

viabilidad celular durante la fase de latencia disminuye y la

cuenta de células viables durante la fermentación se reduce

(Díaz-Nava, 2014).

Cuadro 1. Efecto de la concentración inicial de glucosa sobre el porcentaje de consumo de sustrato en las cepas de levadura aisladas de jugo de sorgo dulce (Díaz-Nava, 2014).

Cepa

Concentraciones glucosa (g L-1)

Cepa

Concentraciones glucosa (g L-1)

100 150 200 100 150 200

Consumo de Glucosa (%) Consumo de Glucosa (%)

S1 99.80a * 63.61a 59.46ad S26 99.98a 70.11f 55.15bd

S2 98.12ac 56.00bd 56.50bd S27 100a 77.97g 56.28bd

S5 78.30b 63.47a 65.27c S30 100a 74.92g 52.56f

S6 99.07ac 56.76b 56.90d S35 100a 77.16g 48.44g

S8 100a 65.41a 58.98a S41 99.32a 86.66h 68.09h

S11 100a 68.14c 58.08d S42 100a 79.97g 54.55bd

S16 100a 64.48a 65.21c S43 100a 76.14g 51.89f

S17 97.94ac 64.48a 55.49bd S44 100a 75.32g 45.86g

S18 94.87c 56.05bd 55.70bd S49 34.51d 26.54i 28.76i

S19 97.94ac 53.06de 55.20bd S51 34.77de 34.18j 17.08j

S23 38.87d 50.69e 13.47e S64 65.87e 57.52b 42.18k

Cepas con letra similar dentro de cada columna son estadísticamente iguales según Tukey 0.05

No obstante esto no indica que las levaduras aisladas de jugo de

sorgo dulce hayan inhibido su crecimiento y producción de


23

etanol en el proceso fermentativo, puesto que a diferencia de

Holzer (1976) y Moulin et al. (1984) quienes observaron que, a

concentraciones por arriba de 100 g L-1, la producción de etanol

y el crecimiento celular se veían inhibidos. En el caso de Díaz-

Nava (2014) las cepas aisladas de jugo de sorgo dulce

mantuvieron su capacidad fermentativa a 200 g L-1. Sin embargo,

las cepas S23, S49, S51 y S64 presentaron una productividad de

etanol y bajos consumos de glucosa en las tres concentraciones

iniciales de glucosa evaluadas.

Selección de levaduras con resistencia al etanol

En cuanto a la resistencia a etanol, diversos autores han

determinado la relación entre la actividad fermentativa en

ausencia y en presencia de una concentración dada de etanol. A

partir de ésto, se evaluó el efecto del etanol en las 18 cepas

osmotolerantes y a diversas concentraciones de etanol (0, 3, 6, 9

% v/v). Lo anterior debido a que se ha reportado que el nivel

máximo de etanol producido a diferentes concentraciones de

etanol inicial en el medio, es un criterio para definir la tolerancia

a etanol. Este criterio ha sido aplicado preferentemente a

especies de Saccharomyces empleadas en fermentaciones tipo

sake (Casey y Ingledew, 1986).

En la Figura 8 se aprecia que en ausencia de etanol al inicio de la

fermentación, las concentraciones máximas se encontraban

alrededor de 20 g L-1, y a medida que se incrementa la

concentración inicial en el medio, la producción de etanol

disminuyó, mostrando que a 9 % de etanol inicial la producción

de etanol fue nula (Díaz-Nava, 2014). Esto podría deberse a que

el sitio de acción del etanol es la membrana plasmática, tal como


24

lo menciona You et al., (2003). Diversos autores concluyen que

las moléculas de etanol penetran al interior de la membrana

citoplasmática, alterando la permeabilidad y la fluidez de ésta,

con lo que se ocasiona la muerte de las levaduras (Jirku, 1991;

Stevens y Servaas-Hofmayr, 1993).

Figura 8. Efecto de las diferentes concentraciones de etanol inicial en el medio de cultivo sobre la producción máxima de etanol en las levaduras seleccionadas (Díaz-Nava, 2014).

Selección de levaduras con termotolerancia

Los fenómenos relacionados con la termotolerancia y la

tolerancia a etanol de las levaduras han sido investigados por

diversos autores (Ingram y Buttke, 1984; D’Amore et al., 1990),

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

S1 S2 S5 S6 S8 S11 S16 S17 S18 S19 S26 S27 S30 S35 S41 S42 S43 S44

Pro

du

ccio

n m

áxim

a d

e e

tan

ol (

g/L)


0% 3% 6% 9%


25

quienes han sugerido que la tolerancia a etanol y a altas

temperaturas interactúan entre sí, es decir, las concentraciones

elevadas de etanol disminuyen la temperatura óptima de

crecimiento y el aumento de la temperatura incrementa el efecto

inhibitorio del etanol.

Díaz-Nava (2014) al evaluar el efecto de la temperatura sobre el

consumo de glucosa (Figura 9) y la producción de etanol (Figura

10) en siete cepas seleccionadas, observaron que tanto el

consumo de glucosa como la producción de etanol se mantienen

constantes hasta los 38 °C, con consumos de glucosa del 100 % y

concentraciones máximas de etanol de 20 g L-1. De acuerdo con

Piper (1995), el mecanismo de respuesta celular al estrés por

temperatura y por etanol es esencialmente similar y consiste en

cambios en la composición lipídica de las membranas

plasmáticas. También se observó que se produce una notable

disminución en la producción de etanol, al ser expuestos a 40 °C,

lo que puede estar relacionado con lo reportado por Sohn et al.

(1994) quienes mencionan que ciertas levaduras son capaces de

crecer hasta temperaturas de entre 40-45 °C pero su capacidad

fermentativa disminuye o desaparece por arriba de los 40 °C.


26

Figura 9. Efecto de las diferentes temperaturas evaluadas sobre el consumo de glucosa en las cepas de levaduras seleccionadas (Díaz-Nava, 2014).

Figura 10. Efecto de las diferentes temperaturas sobre la producción máxima de etanol en las cepas de levaduras seleccionadas (Díaz-Nava, 2014).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

S6 S16 S18 S30 S41 S42 S43

% C

on

sum

o d

e G

luco

sa


30°C 34°C 36°C 38°C 40°C

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

S6 S16 S18 S30 S41 S42 S43

Pro

du

cció

n m

áxim

a d

e e

tan

ol (

g/L)


30°C 34°C 36°C 38°C 40°C


27

En cuanto a los rendimientos de producto, Díaz-Nava (2014)

observó valores entre 0.33-0.38 g/g para todas las cepas

evaluadas. Sin embargo, la productividad de etanol mostró una

notable disminución, observándose que hasta 38 °C las cepas

presentaban productividades entre 0.8-1 g Lh-1 y que al ser

expuestas a 40 °C disminuían hasta en un 50 %. Esto ha sido

observado previamente por Hernández et al., (1986), quienes

reportan que debido al calentamiento de los medios de cultivo

por las reacciones exotérmicas y por la temperatura ambiental,

las temperaturas en los biorreactores alcanzan los 40 °C,

provocando estrés térmico y disminuyendo la productividad.

Según algunos investigadores (D’Amore et al., 1990; Lee et al.,

1993) las levaduras termotolerantes son aquellas capaces de

crecer a temperaturas superiores a los 38 °C, por lo tanto se

considera que las cepas seleccionadas que fueron aisladas de

jugo de sorgo dulce, presentan termotolerancia a 40 °C, ya que su

capacidad fermentativa persiste.

Selección de levaduras con actividad killer

Las levaduras killer o sus toxinas se pueden utilizar como

agentes de control biológico contra patógenos de las plantas,

descomposición de alimentos, hongos, levaduras y bacterias

(Hernandez et al., 2008). El que una cepa de levadura presente

actividad killer es muy importante en la fermentación para

impedir el desarrollo de los microorganismos indeseables en el

proceso, ya que disminuye el riesgo por contaminación de otras

cepas de levaduras. En este caso, Díaz-Nava (2014) evaluó siete

cepas con carácter osmotolerante, resistentes a etanol y

termotolerantes, con el fin de determinar si alguna de ellas


28

presentaba actividad killer, encontrando que solamente la S30 y

la S42 presentaron actividad killer (Cuadro 2). Este resultado

podría estar indicando la presencia de la toxina killer en

poblaciones autóctonas de levaduras aisladas del sorgo dulce.

Cuadro 2. Identificación de la actividad killer en cepas de jugo de sorgo dulce (Díaz-Nava, 2014).

Cepa Actividad Killer

S6 - S16 - S18 - S30 + S41 - S42 + S43 -

El fenómeno killer en levaduras fue demostrado por primera vez

en cepas del género Saccharomyces (Bevan y Makower, 1963),

pero más tarde se encontró que se distribuye en varios géneros

de levaduras.

Identificación molecular de las levaduras seleccionadas

De las 60 levaduras aisladas de la fermentación espontánea de

jugo de sorgo, se realizó la identificación molecular de siete de

ellas que presentaron características deseables en las

fermentaciones alcohólicas, como osmotolerancia, resistencia a

etanol, termotolerancia y actividad killer. Esta identificación se

llevó a cabo a través de la amplificación de la región ITS1-5.8S

rADN-ITS2 por medio de oligonucleótidos iniciadores (ITS1 e


29

ITS4), de donde se obtuvieron fragmentos que correspondían a

bandas únicas que oscilaban alrededor de los 600 pares de bases,

las cuales concuerdan con los tamaños reportados para cepas de

levaduras. En la Figura 11 se puede apreciar el tamaño de los

fragmentos el cual fue determinado por medio de electroforesis

en gel de agarosa.

Tamaño de

fragmentos

(pares de

bases)

Cepas de levadura

FIGURA 11. Electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos

amplificados por PCR de las regiones ITS del ADN nuclear de las

cepas de levadura aisladas de jugo de sorgo dulce. (M=Marcador de

tamaño conocido). (Díaz-Nava, 2014).

Por medio de secuenciación del DNA (USSDNA), se obtuvieron

secuencias que fueron comparadas con las secuencias de

referencia reportadas en el Banco de Genes (GenBank®, 2017)

utilizando la base de datos del Centro Nacional de Información

Biotecnológica (NCBI, National Center for Biotechnology

Information) y haciendo uso del Programa informático de

600 pb 600 pb


30

alineamiento de secuencias de tipo local (BLAST, 2017). Las

homologías resultantes se presentan en el Cuadro 3.

Cuadro 3. Homologías de las cepas aisladas de jugo de sorgo dulce con diferentes accesiones de Pichia kudriavzevii reportadas en NCBI (Díaz-Nava, 2014).

Cepa Descripción % Homología No. Acceso (Genebank)

S6 Pichia kudriavzevii

98 FJ231424


97 KC765129


98 KC765129


99 AB467300


99 EU315754


99 JQ083432


99 FJ231423

P. kudriavzevii fue descrita por primera vez como Issatchenkia

orientalis pero se ha clasificado como P. kudriavzevii en 1965,

este tipo de levadura se puede encontrar en el suelo, frutas y en

diversas bebidas fermentadas. Hasta ahora, se ha asociado

principalmente con el deterioro de los alimentos para causar

biofilms superficiales en productos de bajo pH (Kurtzman et al.,

2011).


31

El análisis de las siete cepas reveló alrededor del 99 % de

similitud con la especie Pichia kudriavzevii. Se elaboró con esta

información un árbol filogenético (Figura 12) utilizando el

método de Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987) y 1000 réplicas

para obtener el valor de remuestreo o Bootstrapping.

FIGURA 12. Árbol filogenético para las cepas seleccionadas (Díaz-Nava, 2014).

En la Figura 12 se muestra a la cepa ITV-S43 ubicada en un nodo

vecino a la cepa de referencia I. orientalis isolate NCL 42 con un

valor de bootstrap del 100 % (Díaz-Nava, 2014), la cual fue

aislada de la flora de diferentes variedades de uvas para la

producción de vinos en India. Sin embargo, esta misma cepa se

separó de otra cepa de referencia P. cecembensis isolate G11 en

un nodo (89 % Bootstrap).

P. kudriavzevii ITV-S43

I. orientalis isolate NCL 42 FJ231423

P. cecembensis isolate G11 EU315764

P.kudriavzevii ITV-S41

I. orientalis isolate G15 EU315754



P. kudriavzevii voucher ITV123 KC765129

P. kudriavzevii AB467300


I. orientalis isolate NCL 45 FJ231424


P. kudriavzevii JQ083432

P.kudriavzevii ITV-S30

Rhizoctonia bataticola strain JAI-MB13 JQ954880

100

99

95

89

99

85

61

100

99

98

51

55


32

La cepa seleccionada P. kudriavzevii ITV-S41 a su vez se separó

de todas éstas en un nodo adyacente a las ya mencionadas con

un valor de Bootstrap del 99 %. Las cepas ITV-S16 e ITV-S18 se

vieron agrupadas en un nodo vecino a la cepa de referencia P.

kudriavzevii ITV 123 aislada de la fermentación del cacao (valor

de Bootstrap 100 % y 61 %, respectivamente).

Se observa que la cepa ITV-S6 mostró un valor de Bootstrap con

la cepa de referencia I. orientalis isolate NCL 45 de 99 %. Las

cepas ITV-S42 e ITV-S30 se agruparon en nodos vecinos a todas

las cepas ya mencionadas con un valor de Bootstrap de 55 %.

Este árbol fue enraizado con la cepa Rhizoctonia bataticola JAI-

MB13 lo que ayuda a identificar que las cepas seleccionadas solo

se agruparon con las cepas de referencia del género Pichia.

Se conocen aislamientos de esta cepa de levadura a partir de una

cerveza de sorgo molido en Costa de Marfil (N'guessan et al.,

2011). Chan et.al., (2012) reportó que P. kudriavzevii es de gran

interés en la industria biotecnológica ya que contiene algunas

enzimas involucradas en procesos para la producción de

bioetanol y fitasas que se utilizan como fertilizantes para

aumentar la absorción de fósforo por las plantas.

Producción de etanol en jugo de sorgo dulce Dado que es importante en la industria etanolera de contar con

cepas que muestren osmotolerancia, termotolerancia y actividad

killer, Díaz-Nava (2014) evaluó cuatro cepas del género P.

kudriavzevii en jugo de sorgo dulce para evaluar su capacidad

fermentativa, utilizando el sustrato del cual fueron aisladas.


33

En la Figura 13 se observa la producción de etanol de las cuatro

cepas seleccionadas en jugo de sorgo dulce.

Figura 13. Producción de etanol de cepas seleccionadas en jugo de sorgo dulce (Díaz-Nava, 2014).

Las cuatro cepas seleccionadas presentaron un comportamiento

cinético similar, ya que alcanzaron su máxima producción de

etanol, de 35 g L-1, a las 24 h, y el consumo de azúcares totales en

ese mismo tiempo fue superior al 50 % de la concentración

inicial, que corresponde a 80 g L-1, aproximadamente. La

sensibilidad al etanol de las levaduras aisladas de jugo de sorgo

dulce puede deberse a que pertenecen al género Pichia, las cuales

presentan una baja tolerancia al etanol, que es entre 30-35 g L-1

(Delgenes et al., 1998).

En el Cuadro 4 se muestran los rendimientos y productividades

de las cepas de Pichia kudriavzevii que fueron seleccionadas.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 4 8 12 16 20 24

Pro

du

cció

n m

áx

ima

de

eta

no

l (g

/L

)

Tiempo (h)

S6

S16

S30

S42


34

Cuadro 4. Rendimiento y productividad de etanol de las cuatro cepas seleccionadas en jugo de sorgo dulce (Díaz-Nava, 2014).

Cepa Rendimiento

YP/S

(g g-1)

Productividad

Qp

(g Lh-1)

Pichia kudriavzevii ITV-S6 0.38 1.47




En cuanto a los rendimientos de etanol (Y P/S), no mostraron

diferencias en ninguna de las cuatro cepas, todas oscilaban

alrededor de 0.4 g g-1, con una pequeña diferencia en la ITV-S42,

la cual proporcionó alrededor de 0.47 g g-1. Sin embargo en

relación a la productividad de etanol (Qp), las cepas S6 y S42

presentaron valores de alrededor 1.5 g Lh-1 en comparación con

las cepas S16 y S30 quienes obtuvieron valores 1.25 y 1.08 g Lh-1,

respectivamente.

Ventajas de la cepa ITV-S42 Según Hasunuma y Kondo (2012) las cepas de P. kudriavzevii

producen 35 % más etanol a 40 °C con 150 g/L de glucosa y 200

% más a 45 °C que la cepa convencional de S. cerevisiae. La cepa

seleccionada de P. kudriavzevii (ITV-S42) al presentar

termotolerancia promueve de acuerdo con Hasunuma y Kondo

(2012) las siguientes ventajas:


35

Reducción de costos de la enzima.

Reducción de costos de enfriamiento.

No se requiere unidad de enfriamiento.

Mejoramiento de la eficiencia de hidrólisis.

Reducción en el riesgo de contaminación.

Evaporación continúa de etanol del mosto bajo presión

reducida.

Puede ser utilizada en países tropicales.

Tiene aplicación potencial en la obtención de etanol de

segunda generación, debido a la mayor descomposición

de las cadenas de lignina y celulosa cuando son

sometidas a altas temperaturas.

Se considera que la cepa de Pichia kudriavzevii (ITV-S42) hará

una contribución significante al mejoramiento y eficiencia en el

proceso de obtención de bioetanol a partir del jugo de sorgo

dulce.

Agradecimientos

Este folleto y su contenido es producto del apoyo económico del

Fondo SAGARPA-CONACYT a través del proyecto 173411

“Mejoramiento genético de sorgo dulce para generar variedades

con alto rendimiento agronómico y alto contenido de azucares

para la producción de bioetanol.”


36

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Centros Nacionales de Investigación

Disciplinaria, Centros de Investigación

Regional y Campos Experimentales

Sede de Centro de Investigación Regional

Centro Nacional de Investigación Disciplinaria

Campo Experimental

Comité Editorial del CIR-Noreste

Presidente Dr. Jorge Elizondo Barrón

Secretario

Ing. Hipólito Castillo Tovar

Vocales Dra. Diana Yemilet Ávila Flores

Dr. Jesús Loera Gallardo MC. Moisés Ramírez Meraz

Dr. Reinaldo Méndez Aguilar Dr. Mauricio Velázquez Martínez

Revisión Técnica

Dr. Edwin Javier Barrios Gómez Investigador del Campo Experimental Zacatepec

Código INIFAP MX-0-330992-45-03-13-09-67

La presente publicación se terminó de imprimir en el mes de agosto de 2017 en los talleres de Imprenta Print House, Col. Centro, C. P. 88900, Cd. Río Bravo,

Tamaulipas, México

Su tiraje consta de 1000 ejemplares

Campo Experimental Río Bravo

Dr. Martin Espinosa Ramírez Jefe de Campo

Lic. Ma. Cristina Briceño Niño

Jefa Administrativa

INVESTIGADOR PROGRAMA DE INVESTIGACIÓN SILVA SERNA MARIO MARIN AGROMETEOROLOGÍA Y MODELAJE ÁLVAREZ OJEDA MARÍA GENOVEVA BIOTECNOLOGÍA ALVARADO CARRILLO MANUEL FERTILIDAD DE SUELOS Y NUTRICIÓN VEGETAL ORTIZ CHAÍREZ FLOR ELENA FERTILIDAD DE SUELOS Y NUTRICIÓN VEGETAL ESPINOSA RAMÍREZ MARTÍN FERTILIDAD DE SUELOS Y NUTRICIÓN VEGETAL BUSTAMANTE DÁVILA ALEJANDRO JOSÉ HORTALIZAS CASTILLO TOVAR HIPÓLITO MAÍZ DE LA GARZA CABALLERO MANUEL MAÍZ HERNÁNDEZ MARTÍNEZ ROSENDO MAÍZ REYES MÉNDEZ CÉSAR AUGUSTO MAÍZ CORTINAS ESCOBAR HÉCTOR MANUEL OLEAGINOSAS ANUALES GONZÁLEZ QUINTERO JAVIER OLEAGINOSAS ANUALES MAGALLANES ESTALA AGUSTÍN OLEAGINOSAS ANUALES GARZA CEDILLO RUBÉN DARIO PASTIZALES Y CULTIVOS FORRAJEROS DÍAZ FRANCO ARTURO SANIDAD FORESTAL Y AGRÍCOLA LOERA GALLARDO JESÚS SANIDAD FORESTAL Y AGRÍCOLA MAYA HERNÁNDEZ VÍCTOR SANIDAD FORESTAL Y AGRÍCOLA RODRÍGUEZ DEL BOSQUE LUIS ÁNGEL SANIDAD FORESTAL Y AGRÍCOLA ALEJANDRO ALLENDE FLORENCIA SOCIOECONOMÍA MONTES GARCÍA NOÉ SORGO CISNEROS LÓPEZ MA. EUGENIA SORGO

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