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Nuevas perspectivas en el diagnóstico de
Clostridium difficile
Evelyn Rodríguez Cavallini
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Pruebas diagnósticas
Detectan productos
de C. difficile
•GDH (glutamatodeshidrogenasa)
•Toxinas A y/o B
Métodos de cultivo
• para detección de CD y confirmar cultivo toxigénico
Detección de genes o deleciones
• RNA 16 S, genes de toxinas, genes GDH, tpi, tcdC
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Detección Prueba utilizada
Toxinas Cultivo celular
Inmunoensayo
PCR
C. difficile Cultivo
PCR
Variantes de
C.difficile
PCR: deleción en tcdC
y toxina binaria
Tipificación
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Inmunoensayos o inmunocromatografías
Los que detectan toxinas A y B: muy baja sensibilidad (desde 50% a 85%)
Si se incluye GDH: hasta 83-90% de sensibilidad
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Estrategia!!!! Evaluar costos
GDH a las muestras sospechosas
Toxinas A y B solo a las muestras positivas por GDH.
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RIDA®QUICK Clostridium difficile Toxin A/B
Es una inmunocromatografía
Emplea anticuerpos contra toxinas A y B marcados con biotina y oro
Si hay reacción AgAc hay migración del complejo y unión con estreptavidina
Si no hay reacción AgAc los Ac marcados con oro impiden la migración
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Técnicas moleculares
Altamente específicas y sensibles
Caras, equipo especial
Detectan el gen y no las toxinas
Algunos detectan deleciones en tcdC
Agunos detectan genes de resistencia a quinolonas
Requieren de entrenamiento de variable complejidad
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PCR tradicional, CR.
Extracción de ADN
Verificación de ARNr16S
Detección de genes tpi, tcdA,
tcdB, tcdC y ctdB
Multiplex 1: tcdA, tcdB y ctdB
Multiplex 2: tpi, tcdC
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RIDA®GENE CD Toxin A/B PCR tiempo real
•Solo detecta genes para toxina A y B
Utiliza fluorocromos
Requiere equipo de PCR RT
•Diferentes ciclos según el equipo
No incluye los reactivos de extracción de ADN
•Señalan marcas específicas
Requiere equipo revelador
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Additional equipment and materials required
DNA-Extraction kit for stool samples or DNA-Extraction system
for stool samples
Real-time PCR Instrument:
QIAGEN: Rotor-Gene Q
RIDA®GENE Color Compensation II
Real-time PCR consumables (plates, tubes, foil)
Centrifuge with a rotor for the reaction vials
-Vortexer
-Pipettes (0.5 – 20 µl, 20 – 200 µl, 100 – 1000 µl)
-Filter tips
-Powder-free disposal gloves
Caro,limitado
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Gene-Xpert, de Cepheid, PCR tiempo real
Gene-Xpert-C.difficile
PCR- Tiempo Real
deteta C. difficile y C. difficile NAP1/027
• toxB, deleción, tox binaria
Resultados en una hora
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De uso en dos hospitales
nacionales en Costa Rica
Caro, $90 por cartucho + equipo
Solo para grandes volúmenes de
muestras
Buena correlación con los pulsotipos, hasta el momento
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Although Xpert can provide rapid laboratory diagnosis of C. difficile and
presumptive 027/NAP1/BI identification in stool within 45 min it is
suggested that positive results be confirmed by formal typing of
cultures. A North American study recently reported five stool samples in
which 027/NAP1/BI was identified by Xpert but not confirmed by two or
more typing methods (PCR ribotyping, pulsed-field gel electrophoresis
[PFGE], and/or restriction endonuclease analysis [REA])
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Genotype C.diff. (PCR isotérmico)
para C. difficile
tpi
para toxigenicidad de la muestra o del
aislamiento
tcdA
tcdB
Para NAP1/027
cdtA/cdtB de tox binaria
tres tipos de deleción en tcdC
mutación en gyrA
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Procedimiento
Extracción de ADN
Amplificación multiplex con
primers marcados con biotina
Hibridación reversa en
membranas recubiertas con
sondas específicas
complementarias a los ADN
amplificados
No incluye reactivos de extracción, ni taq polimerasa.
No requiere equipo de PCR.
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De díficil interpretación!!!!
Muy caro. No hay estudios evaluativos
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AmpliVue (Quidel molecular)
• Amplificación isotérmica llamada amplificación dependiente de helicasa (HDA)
Detección de C. difficile directamente
en la muestra
• Por tratamiento térmico Tampón de lisis para
muestras
•Región conservada de las toxinas
• Sondas marcadas con biotina
Tubo de reacción con primers específcos y
HDA
•Detecta el híbrido sonda-amplicón por conjugación con estreptavidina para la visualización
Cartucho para detección rápida.
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C. diff. toxig C. diff. no toxig No interpretable
La línea C es un
control de
amplificación
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$780, en CR Fácil
Excelente especificidad y
sensibilidad
Importa menos el almacenamiento de la muestra porque no detecta las toxinas
Solo reconce C difficile toxigénico
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¿Es imprescindible usar técnicas moleculares?
103 hospitales en España-
2011
95% utiliza EIA
10% EIA y cultivo
16% cultivo celular
Solo 2% PCR
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Recomendación
Combinar varios métodos de detección
•GDH
• Toxinas
•Genes
Cultivo
•para estudios epidemiológicos
•De sensibilidad a los antibióticos