nuevas alternativas en la producciÓn de la vacuna
TRANSCRIPT
I
NUEVAS ALTERNATIVAS EN LA PRODUCCIÓN DE LA VACUNA
ANTITETÁNICA
Fabio Eduardo Palacios Benavides
Microbiólogo Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C
1 JUNIO DE 2012
II
NUEVAS ALTERNATIVAS EN LA PRODUCCIÓN DE LA VACUNA
ANTITETÁNICA
Fabio Eduardo Palacios Benavides
Microbiólogo Industrial
_________________ _____________________
Ingrid Schuller Janeth Arias Palacios Decana AcadémicaDirectora Carreras de Microbiología
III
NUEVAS ALTERNATIVAS EN LA PRODUCCIÓN DE LA VACUNA
ANTITETÁNICA
Fabio Eduardo Palacios Benavides
Microbiólogo Industrial
_________________ _____________________
Ivonne Gutiérrez RojasJaneth Arias Palacios Directora Trabajo de Grado Par Académico
IV
Nota de Advertencia
"La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia". Artículo 23 de la Resolución N
o13 de
juliode 1946
V
A…mis padres que siempre me
han apoyado en el transcurso de
la carrera, a mi familia y sobre
todo a mis amigos que me han
dado fuerzas para seguir y no
desfallecer en el intento
VI
AGRADECIMIENTOS
Mis agradecimientos a Ivonne Gutiérrez
Rojas por su asesoría y motivación, a
mis padres por su apoyo, a la Pontificia
Universidad Javeriana por brindarme
acceso a los artículos y bases de datos
necesarios para este trabajo, e
innumerables amigos que siempre han
estado al tanto de mí y nunca han
dudado en brindarme su apoyo y
ánimos.
VII
TABLA DE CONTENIDO
1. RESUMEN ......................................................................................................... 1
2. INTRODUCCIÓN, JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .. 2
3. OBJETIVOS ...................................................................................................... 4
3.1 Objetivo General 4
3.2 Objetivos Específicos 4
4. METODOLOGÍA ................................................................................................ 5
5. MARCO TEÓRICO ............................................................................................ 6
5.1 Clostridium tetani 6
5.2 Toxina tetánica 6
5.3 Tétanos 8
5.4 Toxoide tetánico 9
5.5 Vacuna antitetánica 10
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 11
6.1 Alternativas de producción 11
6.1.1. Fragmento antígeno funcional de la toxina tetánica 11
6.1.2 Co - expresión del fragmento C de la toxina tetánica en Escherichia coli y
su evaluación como subunidad candidata para una vacuna antitetánica 13
6.2 Alternativas en formulación 15
6.2.2 Vacuna conjugada con cobalamina 15
6.2.3 Tecnología de encapsulación para la elaborar una vacuna antitetánica de
una sola dosis 18
6.2.4 Administración oral del toxoide tetánico usando biliosomas que inducen
una inmunidad sistémica y de mucosas 20
7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 23
1
1. RESUMEN
En un mundo donde gran parte de su población vive en países en desarrollo, las
epidemias desencadenadas por falta de acceso a inmunización, programas
deficientes de vacunación, entre otras causas aún causan millones de muertos al
año. La Organización Mundial de la Salud coordina desde 1974 programas de
inmunización ampliados en los cuales está incluida la vacuna antitetánica, la cual
se produce inactivando el toxoide tetánico en formaldehído, sin embargo la vacuna
ha demostrado no tener la capacidad de bridar inmunidad protectora a toda la
población, algunos grupos son alérgicos a la vacuna y están expuestos a
numerosos riesgos de salud, es por esto que investigadores alrededor del mundo
vienen trabajando en alternativas de formulación y producción de vacunas que
disminuyan y/o eliminen la necesidad de administrar dosis de refuerzo, el uso de
agujas, del uso de la cadena de frio, explorar nuevas vías de administrar el
compuesto activo de la vacuna el cual garantiza una inmunidad prolongada y una
protección efectiva frente al tétanos.
2
2.INTRODUCCIÓN, JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL
PROBLEMA
El tétanos es una enfermedad producida por Clostridium tetani, produce esporas
las cuales se encuentran en suelos y en el tracto digestivo de seres humanos y
animales (1). Las esporas entran al cuerpo a través de heridas en la piel, donde
germinan y producen la tetanoespasmina, una neurotoxina que viaja por
lossistemas sanguíneo y linfático,hasta llegar al sistema nervioso central. La
tetanoespasmina produce rigidez muscular generalizada,espasmos, fiebre,
hipertensión, taquicardia y sudoración profusa. Los espasmos producidos en los
músculos respiratoriosproducen insuficiencia respiratoria con un bloqueo
neuromuscular (1), la cual si no se trata, conduce a la muerte por falla respiratoria.
La inmunización contra el tétanos es dependiente de anticuerposya sea activa
(vacuna antitetánica) o pasiva (inmunoglobulina antitetánica específica). Las
vacunas se basan en el toxoide tetánico, neurotoxina modificada que induce la
formación de la antitoxina protectora (2).
Varios tipos de vacunas basadas en toxoide tetánico han sido desarrolladas,
aquellas que sólo contienen el toxoide (TT); las que contienen además el toxoide
diftérico, en dosis normales (DT), en dosis baja (dT), combinada con difteria y tos
ferina (DTwP, DTaP, dTaP o dTap). Las vacunas combinadas (DPT) han hecho
parte desde 1974 de los programas de vacunación en muchos países con el
programa ampliado de inmunización de la OMS. Sin embargo, candidatos a la
inmunización han demostrado ser alérgicos al toxoide o a algún componente dela
elaboración de la vacuna, mediante mecanismos inmunológicos de tipo I, III y IV,
los cuales se han determinado por medición de IgG específicas frente al toxoide
tetánico por medio de pruebas cutáneas(3). Por estas razones, es importante el
uso de métodos alternos de producción de vacunas con el fin de disminuir los
peligros asociados areacciones locales menores (dolor, eritemas 25-85% de los
casos), formación de nódulos, abscesos estériles (1-10 por cada millón de dosis
administradas), fiebre, dolores y malestar después de las inyecciones de refuerzo,
reacciones anafilácticas y neuritis del plexo braquial las cuales son
3
extremadamente raras (2). Además de disminuir la exposición del personal que
fabrica la vacuna a contraer el tétanos, debido a que en el proceso tradicional se
utiliza una cepa altamente toxigénica del microrganismo patógeno, Clostridium
tetani.
El presente trabajo busca a través de una revisión bibliográfica, integrar diversos
enfoques modernos en la producción de la vacuna antitetánica, tanto en el uso del
toxoide tetánico, como en la formulación y producción de la vacuna mediante
nuevas tecnologías, las cuales además de ser costo efectivas para países en vías
de desarrollo, podrían representar una ventaja en cuanto a almacenamiento,
mantenimiento a temperatura ambiente, única dosis, uso de polímeros
biodegradables, entre otros.
4
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo General
Documentar nuevas alternativas en la producción de la vacuna antitetánica
frente a los métodos tradicionales, mediante revisión bibliográfica.
3.2 Objetivos Específicos
Identificar los diferentes procesos de fermentación, purificación y
formulación utilizados para la elaboración del toxoide tetánico.
Reconocer otras formas de vacunación antitetánica diferentes al toxoide
tetánico.
5
4. METODOLOGÍA
Se analizó y preparó la búsqueda de acuerdo a las palabras clave (toxoide
tetánico, toxina tetánica, vacuna antitetánica, Clostridium tetani)que son los
términos que más artículos arrojaron en lascuatro bases de datosconsultadas
(Science Direct, Medline (Ebsco – Hobst), Medline (Proquest), Springerlink). Se
usaron tanto en español, como en inglés y portugués, abarcando artículos desde
el 2006 al 2012, para un número cercano a 20 artículos seleccionados. Se
utilizaron varias mezclas de los cinco criterios de búsqueda, de la siguiente
manera:
Clostridiumtetani AND tetanus vaccine 45 artículos, de los cuales se discriminaron
8, en la bases de datos Science Direct; para el parámetro Clostridiumtetani AND
tetanus toxoid arrojó 54 artículos de los cuales se escogieron 6, mientras que para
los parámetros Tetanus AND tetanus vaccine en Medline (Ebsco – Host) arrojó una
búsqueda de 23 artículos, de los cuales se escogieron 1 artículo.
Para el criterio de la búsqueda Tetanus toxoid AND Clostridium tetani en la base
de datos Medline (proquest) se escogieron 12 artículos de los cuales se
seleccionaron 3,y paraTetanus toxoid (Science Direct) se escogieron 21 artículos
de los cuales se escogieron 2
Estos artículos cumplieron con los criterios que responden a la pregunta de
investigación en cuanto a control de calidad, inmunización, formulación, patentes
referentes a la elaboración de vacunas antitetánicas así como a las generalidades
del tétanos y la descripción de la enfermedad misma
6
5. MARCO TEÓRICO
5.1 Clostridium tetani
Clostridium tetani es una bacteria Gram positiva anaerobia estricta, de forma
bacilar,formadora de esporas altamente resistentes las cuales requieren de
autoclavado para su destrucción, exposición prolongada al yodo, peróxido de
hidrógeno, formalina o glutaraldehído (9). Clostridium tetani es un microorganismo
de amplia distribución en suelos de zonas cálidas y húmedas a nivel mundial,
presente en el tracto gastrointestinal de seres humanos, animales, y
heces.Produce una neurotoxoinfección aguda y altamente mortal con tasas
cercanas entre 20-50% (8). La dosis letal LD50 en humanos es de2.5ng/kg (11).En
cultivos realizados a partir de heridas, ha sido posible recuperar Clostridium
tetanien aproximadamente un 30% (10).
Al contrario de Clostridium tetani, quees sensible al calor y altas concentraciones
de oxígeno, las esporas de Clostridium tetanison resistentes al calor y a tensiones
ambientales ricas en oxígeno. Estas germinan en el interior del cuerpo en células
vegetativas, las cuales secretan la tetanoespasmina (TeNT) y tetanolisina (TLY)
(12).
5.2 Toxina tetánica
Clostridium tetani, produce una exotoxina proteica,tetanoespasmina, que afecta al
sistema nervioso central, producida a partir de una cadena precursora de
polipéptidos de 150 kDa de naturaleza intracelular la cual puede estar inactiva o
débilmente activa.Su precursor al no contener un péptido de señal, es
posiblemente liberado de la bacteria por un mecanismo de exfoliación de la pared
celular. La prototoxina es proteolíticamente clivada en los residuos Gly449 y
7
Ala456por proteasas de Clostridium o por proteasas exógenas como las
encontradas naturalmente en el intestino (13).
La neurotoxina activa se compone de dos cadenas conectadas por un puente
disulfuro. La cadena pesada (Cadena H, 100kDa) es responsable de la unión a las
células neuronales y de la translocación de la cadena liviana (Cadena L – 50KDa)
en la neurona, siendo la parte catalítica de las neurotoxinas; contiene el motivo
zinc enlazante compuesto de dos anillos imidazólicos His-Glu-X-X-d-His con un
enlace de hidrógeno unido a una molécula de ácido glutámico, en el cual, el
átomo de Zn es coordinado por otra molécula de ácido glutámico conservada en
todas las neurotoxinas clostridiales. El residuo Glu coordina a la molécula de agua
directamente implicada en la hidrólisis proteolítica (13).Las células se lisan
liberando la toxina, por lo cual la proteasa de Clostridium tetani rompe un enlace
peptídico y forma el puente disulfuro del dominio N, obteniéndose dos cadenas de
polipéptidos, también unidas por enlaces no covalentes, unidas en formas de
muescas (12)
Estudios cristalográficos han revelado la esctructura cristalográfica del dominio C-
terminal de la tetanoespasmina, compuesta de tres distintos dominios: una cadena
L que contiene hélices α y hebras β que incluyen un motivo de unión zinc
catalítico; el extremo N-terminal el cual es parte de la cadena H (Hn), que forma
dos hélices α usualmente largas altamente retorcidas y el dominio C-terminal de la
cadena H (Hc), conformada por dos subdominios involucrados en el
reconocimiento del receptor (13).
El subdominio Hn es altamiente conservado entre las neurotoxinas clostridiales, en
cambio el subdominio Hc es muy variable entre las neurotoxinas clostridiales, este
subdominio (en especial el residuo His1293) se une a la porcion oligosacárida de
los poligangliósidos (13).
8
Estos subdominios producen una unión de alta afinidad,un subdominio se une a
una glicoproteína, mientras que el otro subdominio se une a los
polisialogangliósidos de membrana (13)
La tetanoespasminalleva a cabo la hidrólisisde la Proteína de Membrana Asociada
a Vesículas (PMAV/sinaptobrevina), equipadas con ATPasas de tipo vacuolar, las
cuales crean un gradiente de protones,que conduce específicamente el transporte
de las vesículas,facilitando la exocitosis celular en conjunto con una docena de
proteínas reguladoras llamadas SNARE.Las membranas vesiculares se fusionan
con la membrana plasmática, y difunden su contenido en el medio circundante
(11).La tetanoespasmina bloquea la neuroexocitosis e impide la liberación de
neurotransmisores como el ácido - γ - aminobutírico (GABA) en las sinapsis
interneuronales, al tiempo que bloquea la liberación de la acetilcolina en las
sinapsis neuromusculares.
5.3Tétanos
Las esporas de Clostridium tetani entran al cuerpo a través de rupturas cutáneas
ybajo condiciones anaeróbicas favorables como heridas sucias y necróticas
produce tetanoespasmina(1), esta afecta el sistema nervioso central, alterando la
sinapsis de las neuronas motoras del sistema nervioso central (SNC), falla la
coordinación de los reflejos motores y la contracción muscular, produciéndose los
espasmos tetánicos (5).
El tétanos tiene un periodo de desarrollo entre 0 - 60 días, con un promedio de 7
días(2).En más del 80% de los casos, el tétanos se presenta como una
enfermedad espasmódica generalizada, en la cual los primeros rasgos
característicos son rigidez muscular facial (trismo, risa sardónica),espasmo en los
músculos de la espalda (opistótonos), cuello, irritación en la faringe, disfagia y
rigidez muscular abdominal; suceden a una rigidez muscular generalizada,
acompañada de espasmos, temblores, fiebre, hipertensión, taquicardia y
9
sudoración profusa (9).El tétanos también puede presentarse como una
complicación asociada a quemaduras, infecciones puerperales, infecciones in situ
asociadas a cirugías y muñones remanentes del cordón umbilical en tétanos
neonatal. Clínicamente puede presentarse en cuatro formas: generalizada,
localizada, cefálica y neonatal. El tétanos produjo en 2009 cerca de 257
000muertes anuales de neonatos en países en desarrollo (11).
5.4 Toxoide tetánico
El proceso convencional para la elaboración de la vacuna antitetánica usando el
toxoide tetánico, comprende cepas toxigénicas de C. tetani, en un medio líquido
que favorece la producción de la toxina y su posterior extracción mediante
ultrafiltración en membranas, posteriormente, se inactiva con formaldehídoy fases
subsiguientes de purificación yesterilización.Para aumentar su inmunogenicidad
se adsorbe el toxoide sobre sales de aluminio o calcio, precipitándose tanto con
sulfato de amonio, como por precipitación alcohólica, adsorción y desorción en
gel.Se administra intramuscularmente,induciendo la formación de una antitoxina
protectora. Su potencia se expresa en unidades internacionales (UI) de protección
determinada en cobayos o ratones inmunizados expuestos a la toxina tetánica (2).
El toxoide tetánico puede resistir exposición a una temperatura aproximada de
20°C durante meses y el almacenamiento a 37°C durante algunas semanas, sin
embargo al exponerse a una temperatura de 56°C la vacuna que contiene el
toxoide tetánico, pierde su potencia en menos de dos horas (2). Las vacunas
deben almacenarse a una temperatura de 2-8°C, haciendo necesario el
mantenimiento de la cadena de frío hasta su administración, ya que las vacunas
pierden rápidamente su potencia al transportarse fuera de los rangos de
temperatura prescritos (6).
10
5.5 Vacuna antitetánica
La protección contra el tétanos es dependiente de anticuerpos y sólo puede
lograrse mediante inmunización activa (vacuna) o pasiva (inmunoglobulina
antitetánica específica).La vacuna combinada (DPT), destinada especialmente
para niños menores de un año, fue incluida en los programas de vacunación de
larga duración de la Organización Mundial De La Salud (OMS) desde la
concepción de estos programas en 1974 (2). Sin embargo, estudios de
inmunogenicidad determinaron un efecto tiempo decreciente; por lo que expertos
recomendaron la administración de dosis posteriores en un periodo de 10 años.
Actualmente la OMS recomienda en su calendario de vacunación infantil 5 dosis:
serie primaria de 3 dosis de DTP3 (DTwP o DTaP) administrada en el periodo de
lactancia (niños menores de un año), se complementa con una dosis de refuerzo
(entre los 4 y los 7 años) y otra durante la adolescencia (entre los 12 y 15 años)
(2). Otro esquema de vacunación propuesto se detalla a
continuación:“Vacunación 1ria:1ª dosis, 2ª dosis:tras 1-2 meses, 3ª dosis:tras 6-12
meses de la 2ª dosis. Min 40UI/0.5ml. Dosis de recuerdo: cada 10 años.
Vacunación asociada a heridas: heridas menores y limpias, estado de vacunación
desconocido o transcurridos más de 10 años desde el último refuerzo: revacunar.
Heridas mayores o sucias: vacuna + inmunoglubulina antitetánica”(7).Sumados a
los efectos de inmunogenicidad decreciente, también sedeben considerar los
efectos secundarios (seguridad, control de calidad variable, retención de la
inmunidad), así como el costo-efectividad, facilidad de uso y administración (11).
11
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Dentro de los métodos de producción alternosse encuentran la
microencapsulación (permiteel empaquetamiento demúltiples antígenos mediante
el uso de proteínas recombinantes), péptidos sintéticos, ADN recombinante, uso
de esporas bacterianas como vehículos para el transporte y liberación de la
vacuna, la co-expresión de fragmentos de la toxina tetánica en Escherichia
colijunto con tiorredoxina y nuevos adyuvantes altamente compatibles con el
antígeno, algunos de estos métodos incluyen: conjugados con el toxoide,
fragmentos antígeno funcionales (FAF) a partir de la toxina tetánica,
microencapsulación con ácido poliláctico (PLA)junto al toxoide
tetánico;tecnologías de producción en estudio y desarrollo de la vacuna
antitetánica cuya finalidad eslaobtención de un producto de liberaciónprolongada y
controlada del toxoide, generando el desarrollo de una respuesta inmune efectiva,
productora de anticuerpos frente al tétanos.Sin embargo, el desarrollo de estas
alternativas promisorias, en muchas de ellas como los FAF debe determinarse la
estabilidad del compuesto en periodos prolongados de tiempo, además que aún
no son alternativas que compitan en costo – beneficio con la vacunación
tradicional aún empleada.
6.1 Alternativas de producción
6.1.1. Fragmento antígeno funcional de la toxina tetánica
Morihiro Matsuda(2002) identificó un fragmento antígeno funcional de la toxina
tetánica (FAF), basado en estudios e información previa de la secuencia de
nucleótidos, así como la secuencia de aminoácidos de la toxina tetánica;
determinó las regiones epítopes de la toxina tetánica y generó péptidos sintéticos
a partir de fragmentos de ADN codificantes para la toxina tetánica (17).
12
Matsuda obtuvo ocho secuencias de aminoácidos, de las cuales seleccionó la
secuencia obtenida al separar un enlace peptídico que conectaba dos secuencias
parciales de aminoacidos, unidas a dos residuos de cisteína participantes en la
formación del puente disulfuro,presente en el extremo N- terminal de la toxina, por
lo cual el puente disulfurofue clivado en conjunto con los enlaces no covalentes
entre los grupos unidos por el puente disulfuro de la toxina tetánica (17).
Para ello usó la cepa de Clostridium tetaniHarvard H47 subcepa Biken– ATCC
10779, una cepa que tiene la habilidad de producir altas concentraciones de toxina
tetánica.Matsuda (2002) usó la subcepa Biken tanto para la obtención de la toxina
tetánica, como para la extracción del plásmido ADN codificante.
Transformóel plásmido digiriéndolo con las enzimas de restricción StuI-Bsp
HI,obteniendo un fragmento de 2.7kb codificante para FAF, este fragmento se
insertó y se ligó al vector pSN508de Escherichia colipara generar un vector de
expresión recombinante, el cual se insertó en E. coli CSH26 transformando esta
cepa, en una cepa productora de una gran cantidad de FAF, el cual
posteriormente fue purificado (17).
Matsuda obtuvo el FAF, una molécula con un peso entre 90 -110 KDa, obteniendo
una inmunopotencia sustancialmente similar a la de la toxina tetánica (1±0.2)
obtenida en un ensayo en paralelo entre la vacuna con FAF y la vacuna
convencional conel toxoide tetánico, sometiendo ambas vacunastanto a una toxina
con un LD50 conocido, así como la determinaciónde la dosis letal mínima en
ratones OF1(17).
Para evaluar los efectos adversos y la inmunopotencia de la vacuna con FAF,
Matsuda realizó un test de anafilaxis cutánea pasiva en ratones. En conejillos de
indias llevó a cabo tests intradérmicos;en ambos ensayos in vivo observó una
reacción alérgica retardada en comparación con el toxoide tetánico usado en la
13
vacuna convencional, la inmunopotencia fue evaluada en ratones según un
método por puntos si: el animal muere en el primer día obtiene 0 puntos, si el
animal muere en el segundo día obtiene 1 punto, si el animal muere al tercer día
obtiene 2 puntos, si el animal muere o exhibe síntomas serios (convulsión tónica,
dificultad para caminar, angustia respiratoria) entre el 4to y 7mo día obtiene 3
puntos, si el animal sobrevive durante una semana con síntomas leves (parálisis
local de los músculos adbominales en el sitio opuesto a la inyección) observando
al animal colgado de su cola, obtiene 4 puntos y finalmente si animal sobrevive
durante una semana sin síntomas obtiene 8 puntos (17)
Las observaciones de los ensayos intradérmicos en conejillos de indias, realizado
porMatsuda(2002)durantelas 4 semanas después de la inmunización en el sitio de
la inyección,evidenciaron la formación de eritemas y el endurecimiento o necrosis
del tejido cutáneo. En cuanto al tratamiento con FAF no obtuvoreacciones
intradérmicas adversaso estas fueron notablemente ligeras en comparación con
los conejillos de indias a los que se les administró la vacuna convencional (17)
El trabajo de Matsuda provee una vacuna con un solo antígeno en el cual el FAF
es el ingrediente activo, tanto como preparación absorbente, u en forma de
liofilizado o en forma de vacuna combinada junto a DPT, DT u otros antígenos
vacunales, por lo que la vacuna está lista para ser empaquetada en ampolletas o
viales, ser distribuida donde sea requerida con efectos adversos reducidos y
manteniendo una inmunopotencia similar a la dela vacuna antitetánica
convencional.
6.1.2 Co-expresión del fragmento C de la toxina tetánica en Escherichia coli y su evaluación como subunidad candidata para una vacuna antitetánica
El receptor de unión de la toxina tetánica (THc), el cual media en la unión de la
toxina tetánica a las células nerviosas, es una subunidad candidata para una
14
vacuna contra el tétanos. Yu et al. (2011), construyeron un gen sintético
codificante para THc, altamente expresado en Escherichia coli coexpresando
thiorredoxina (Trx) (18).
Elaboraron el gen THc sintético (1296 pb), a partir de tres bloques con
oligonucleótidos sintéticos por PCR de fusión, codificante de 432 aminoácidos
(884 -1315, ~50kDa) de la porción C-terminal, de la cadena pesada de la toxina
tetánica. Los bloques fueron subclonados en plásmidos pTIG-Trx obteniendo el
plásmido recombinante pTIG-Trx-THc, en el cual se redujo el contenido de A+T
(52%), contiene codones sinónimos frecuentemente empleados en E. coli BL21.
Para identificar el peso molecular y la reacción con anticuerpos específicos para la
toxina tetánica, usaron Western blots, obtuvieron un alto nivel de expresión
altamente soluble (15-30% de la proteína celular) (18).
Purificaron la subunidad THc, a partir de la pasta celular de E. coli BL21 por
cromatografías tanto de afinidad, la cual capturó eficientemente el fragmento THc
y el producto de la fracción, conteniendo aproximadamente el 70% de esta en
SDS –PAGE; como de intercambio catiónico, que capturó eficientemente la
proteína THc y removió los contaminantes asociados, la cual en SDS – PAGE
mostró aproximadamente una pureza del 98% para la proteína, obteniendo una
banda de (50kDa) inmunorreactiva al análisis Western blot (18).
Para evaluar la eficacia de la subunidad THc, vacunaron intradérmicamente
ratones, tanto con la subunidad THc como con el toxoide, monitoreándolos
serológicamente en simultáneo, obtuvieron títulos medios más altos para los
anticuerpos de la subunidad THc, en comparación a los obtenidos de ratones
inmunizados con el toxoide tetánico. Tanto para los ratones inmunizados con la
subunidad THc como los inmunizados con el toxoide, obtuvieron perfiles IgG
isotipos similares, con IgG1 predominantes, productores de respuestas humorales
tipo Th2, logrando una protección completa (sobrevivencia) al enfrentarse a una
15
dosis 10000 veces del 50% de la dosis letal (LD50) de la toxina tetánica
biológicamente activa 3 semanas después de la última inyección (18).
Posteriormente re-enfrentaron los ratones con dos o tres dosis de la neurotoxina,
mucho más altas (100000 LD50), sin muertes de ningún animal o de síntomas de
envenenamiento, las dos dosis con el toxoide tetánico proveen protección parcial
en comparación con la subunidad THc. En el suero obtenido del ELISA usado para
el ensayo in vivo, los títulos de anticuerpos neutralizadores aumentaron con el
número y dosis de vacunaciones, obteniendo títulos ≥0.25UI/ml, indicando que
una cantidad mol equivalente de la proteína THc, induce una respuesta humoral
fuerte en comparación con el toxoide tetánico, al ofrecer una potente protección
contra altas dosis de la toxina tetánica; posteriormente al llevar a cabo el ensayo
en fase sólida, el suero anti THc inhibió la unión del THc al gangliósido GT1b,
provocando una respuesta inmunológica contra la toxina tetánica, la proteína THc
expresada y purificada mantiene su conformación funcional activa siendo capaz de
ser desarrollada como vacuna candidata para la prevención del tétanos (18).
La vacuna elaborada redujo el tiempo de fabricación en comparación con la
vacuna convencional y simplificó el proceso técnico asociado, ya que una
subunidad recombinante elimina la necesidad del cultivo de Clostridium tetani o la
purificación de la toxina tetánica, y mantiene la unión al gangliósido, e indujo
respuestas inmunes protectivas contra la toxina tetánica, seguida de inmunización
parenteral en ratones, lo cual constituye una opción de uso en humanos con
menores dosis de refuerzo asociadas
6.2Alternativas en formulación
6.2.2Vacuna conjugada con cobalamina
Doyle et al. (2010), desarrollaron una vacuna usando la cobalamina conjugada con
el toxoide tetánico activo, la cobalamina(molécula de 13 KDa), provee una
16
administraciónoral del toxoide tetánico, aprovechando el mecanismo de
administración de la cobalamina y/o sus derivados (adenosilcobalamina,
cianocobalamina, aquocobalamina, glutationilcobalamina, hidroxicobalamina,
cianocobalamina carbanálido, 5-ο-metilbencilcobalamina, desdimetilmonoetilamida
y análogos metilamida de todos los compuestos anteriormente nombrados), esta
ingresa por via oral, llega al estómago donde el factor intrínseco (una proteína
necesaria para la absorción de la cobalamina), transporta junto con la cubilinala
cobalamina, al ileón proximal del intestino y posteriormente; el factor intrínseco,
transporta la cobalamina al torrente sanguíneo.Los receptores celulares
mediadores de la endocitosis internalizan la cobalamina procedente del torrente
sanguíneo, donde se convierte en cobalamina biodisponible. La vacuna
conjugadabuscasuperar losdos obstáculosde la entregaentérica del medicamento:
protegerlasustancia biológicamente activade la proteólisisgastrointestinal y evitar
tanto la absorción comolatoma celular de la cobalamina por los enterocitos en el
lumen del intestino(19).
Doyle et al. (2010) evaluaron la estabilidad de las cadenas liviana y pesada del
toxoide tetánico por modelado molecular, en el cual la respuesta inmune no se vio
afectada indicando la estabilidad de la proteína, por la conservación de la
geometría y plegamiento nativo, específico para las cadenas laterales de lisina, en
la formación del bioconjugado con cobalamina y garantiza su estabilidad
condiciones extremas, concluyendo que estructura α/βde la cadena liviana se
mantiene estable, y considerando por medio de la determinación cristalográfica,
los residuos de lisina superficie accesibles, como el único grupo significativo de
residuos de lisina en el diseño del bioconjugado (19).
Las simulaciones de dinámica molecular elaborados por Doyle et al (2010)
sugieren que el toxoide tetánico actúa como epítope conformacional con mínimos
plegamientos incluso a elevadas temperaturas, por lo cual permite predecir la
unión de la cobalamina al toxoide tetánico y racionalizar la adición de numerosas
moléculas de cobalamina que no interfieran con la actividad del toxoide tetánico.
17
Como modeloin vitrose utilizó la línea celular BeWo coriocarcinoma humana, en la
cual, la concentración del conjugado se determinó por Bradford, desarrollando
posteriormente experimentos de microscopía confocal y un ELISA, para
determinar la actividad biológica del bioconjugado usando diferentes
concentraciones de suero monoclonal de ratón anti toxoide tetánico obteniendo
una curva de calibración lineal hasta una concentración de 10L/ml del toxoide
tetánico. El ELISA control y el ELISA del bioconjugado,se compararon mediante
un ensayo con Bradford para cada concentración de la proteína, este número se
comparó con el Bradford elaborado para el toxoide tetánico de partida, donde el
proporción de floculación Lf en µg dio 0.32, siendo más baja la proporción para los
bioconjugados que el material de inicio del toxoide tetánico; ambos se expusieron
a la unión con el factor intrínseco por espectroscopía de absorción electrónica,
indicando un incremento en la absorción (19).
Los estudios realizados para evaluar la actividad in vitro de la cobalamina
concluyeron que el bioconjugado no interrumpe el reconocimiento de la
cobalamina, por otra parte, el factor intrínseco es crucial para que el toxoide
tetánico efectivamente llegue al torrente sanguíneo. Las células humanas con
receptores de cubilina son las encargadas de internalizar el conjugado cobalamina
– toxoide tetánico, expresado en el tracto gastrointestinal, tomado por las células
epiteliales del ileón (19)
El bioconjugado evita los efectos secundarios asociados a vías no invasivas de
administración, como la administración nasal y/o pulmonar; por lo cual la
cobalamina es necesariamente co-administrada, y posee una acción de larga
duración, aprovecha la recirculación enterohepática de la cobalamina prolongando
el tiempo de residencia de la sustancia biológica activa, el toxoide tetánico en el
torrente sanguíneo (19).
18
Esta alternativa ofrece numerosas formas de administración de la vacuna
antitetánica, de una manera segura, confiriendo inmunogenicidad, al aprovechar el
mecanismo de administración de cobalamina, por lo que la hace una alternativa
paraserempleada en países en desarrollo y en especial en poblaciones como
niños, bajo formas como chicles, jarabes, entre otras.
6.2.3Tecnología de encapsulación para la elaborar una vacuna
antitetánica de una sola dosis
Las sales de aluminioson uno de los pocos adyuvantes usados en vacunas
capaces de generar una respuesta inmune fuerte, pero con limitada antígeno -
compatibilidad e incapaz de generar la inducción de respuestas inmunológicas en
las células T citotóxicas en infecciones de origen viral y de origen parasitario (4).
Es por esto que el uso de micropartículas ha despertado un interés creciente,
debido a su habilidad potencial de co-encapsular antígenos múltiples, inducir tanto
respuestas imnunes contra antígenos inmunológicamente débiles,como en
lascélulas T citotóxicas, respuestas lo suficientemente estables para ser
administrada oral, nasal o parenteralmente. En la formulación de estas vacunas se
utiliza el método de evaporación de múltiples solventesen emulsión, basado en
ácido poliláctico (PLA) biodegradable,el cual ha sido usado extensamente en
productos farmaceúticos comerciales de liberación atenuada (4).
El tamaño de las micropartículas en el sistema de vacunación afecta la tasa de
liberación del toxoide tetánico y la inmunogenicidad, obteniendo partículas de
22.8µm, más del 90% de ellas menores al tamaño deseado, (100µm de diámetro),
en aquella formulación a la cual se Baxendale et al (2011)adicionaron trehalosa al
1% (p/p), no produjo cambios detectables en la morfología de las micropartículas
ni en su tamaño. El proceso de microencapsulación para elaborar esta vacuna
debe enfrentar: la presencia de elevadas fuerzas de cizalla, lenta exposición a
19
solventes orgánicos y la presencia de interfases acuosas/orgánicas que pueden
resultar en la degradación y perdida de la inmunogenicidad del toxoide tetánico (4)
Las micropartículas actúan como adyuvantes sintéticos, estimuladores de la
inmunidad de células dendríticas y las células T, ademáspueden bioconjugarse
con señales moleculares específicas de peligro.La formulación de sales minerales
de aluminio en conjunto con polímeros absorben eltoxoide tetánico y lo liberan en
forma de ráfaga (superior al 80% de la carga de la formulación), potenciando una
respuesta inmune superor a bajas dosis (0.1 Lf) en comparación a la causada por
el antígeno soluble (10Lf) (4).
La vacuna de una sola dosis antitetánica, fue manufacturada usando el proceso
NanoMixTM,en el cual utiliza dióxido de carbono supercrítico (scCO2), para
encapsular a alta potencia bajas dosis de medicamentos, en matrices de
micropartículas producidas a temperatura ambiente y libre de solventes. Este
proceso aprovecha el hecho que el scCO2 en polímeros como el PLA seincorpore
a esteproduciendola liquefacción del PLA. Bajo estas condiciones el toxoide
tetánico liofilizado se mezcla con el polímero en estado líquido y esta mezcla al
pasar a través de un atomizador de baja presión, haceque el CO2 retorne a su
estado gaseoso, solidificando el polímero en gotas que contienen el toxoide
tetánico, las microparticulas injectables del polímero son producidas y pueden ser
administradas por vía subcutánea o intra - muscular (4)
Para valorar la factibilidad de la encapsulación del toxoide tetánico en partículas
de PLA, se evaluaron un rango de formulaciones in vivo en ratones hembras
Balb/cdivididas en 6 grupos, donde los tratamientos se inyectaron
subcutáneamente,comparandola respuesta inmune inducida de una vacuna
comercial con sales de aluminio, administrada en múltiples ocasiones durante 154
días. A partir de los tratamientos in vivo de los ratones Balb/c evaluaron la
respuesta IgG anti toxina tetánica a partir de: la pre-dosis, días 14, 42, 70, 112, y
154 por ELISA. Obtuvieron el título máximo de anticuerpos por densidad óptica a
20
los 42 días para el tratamiento con el toxoide tetánico en micropartículas y con
sales de aluminio, con un ligero decrecimiento a los 70 días y 112 días con títulos
mejorados a los 154 días, los títulos inducidos para la anti toxina tetánica IgG se
incrementaron sucesivamente y significativamente después de cada sangrado. La
formulación de microparticulas del toxoide tetánico con la dosis mas alta del
toxoide en la formulación, fue capaz de inducir titulos similares o mayores a los
titulos anti toxoide tetánico IgG a los inducidos a la formulación del toxoide con
sales de aluminio como adyuvante, de las cuales siguieron dos inyecciones de
refuerzo a los días 28 y 56 (4).
De esta manera el proceso NanoMixTMes un proceso capaz de encapsular los
antígenos de la vacuna en micropartículas de polímero a una dosis elevada,
manteniendo la antigenicidad y bioactividad, la liberación prolongada del antígeno
es mantenida y la vacuna puede ser liofilizada, lista para ser reconstituida antes de
ser aplicada en programas de inmunizacion, mantiene un periodo de vida útil
mayor a la vacuna convencional, por lo cual no es necesario mantener cadenas de
frío desde que se adquiere la vacuna hasta su administración, abarantando costos
en los programas nacionales de inmunización.
6.2.4 Administración oral del toxoide tetánico usando biliosomas que
inducen una inmunidad sistémica y de mucosas
Los antígenos proteicos administrados por vía oral son expuestos a un ambiente
hostil en el tracto gastrointestinal por enzimas digestivas, y rangos de pH 1 - 7.5,
son empaquetados en vesículas surfactantes no iónicas protectoras, formuladas
con sales biliares (biliosomas), contra la degradación que permiten la
administración del antígeno en las células responsables de generar respuestas
inmunes locales y sistémicas (20).
Los biliosomas hacen parte de los sistemas de entrega en las mucosas entre los
cuales están los niosomas transcutáneos, microesferas orales y nasales de poli-D,
21
L ácido láctico-co-glicólico (PLGA). Conformados por un sistema de vesículas
bicapa lipídicas, incorpora sales biliares y atrapa un espacio acuoso donde
candidatos a vacunas solubles pueden ser atrapados, e inducir una respuesta
inmune significativa después de la administración oral. Los biliosomas tienen una
alta resistencia a la disrupción de las sales biliares, por lo cual tienen propiedades
adyuvantes inherentes, han demostrado inducir respuestas sistémicas y de
mucosas caracterizadas por anticuerpos IgG e IgA respectivamente en las células
del intestino (20).
Se usaron ratones inmunizados oralmente con el toxoide tetánico (40 o 200 µg
dosis/ratón, 4 dosis en total). La dosis alta del toxoide tetánico encapsulado de
200 µg indujo en un estudio de tres semanas, los mismos niveles de IgG1 al
observado con el toxoide tetánico subcutáneo sin encapsulación a una dosis <50
µg. Todas las dosis tanto las atrapadas en biliosomas como la no atrapadas
comparadas, causaron un aumento en las células positivas para IgA en el intestino
delgado, principalmente en los 15 cm iniciales (20).
Mann et al. (2006) midieron el atrapamiento del toxoide tetánico en el biliosoma y
determinaron su forma y estructuraesférica cristalina: la dosis de 200 µg/ratón
produjo títulos específicos de anticuerpos IgG1 para un pos tratamiento de tres
semanas, pero no inducen una respuesta específica para IgG2a en comparación
con datos de respaldo.Para las IgA en las células de las mucosas, las
formulaciones de 40 y 200 µg/ratón resultaron en un incremento en los títulos de
IgA en secciones de 0 – 5 y 10 – 15 cm en el tracto gastrointestinal comparados
con controles sin tratar, y sin un incremento significativo en el plasma celular de
las células intestinales, con respecto al control en la sección de 20 – 25 cm,
indicando que la absorción del antígeno ocurre tempranamente en el intestino.
Para evaluar el tránsito y resistencia de los biliosomas,radioetiquetaron estos con
insulina I-125: después de 4 horas el biliosoma estaba localizado en el estómago,
pero después de las 24 horas este se localiza tanto en el estómago como en el
intestino, por lo cual se demostraron que los biliosomas son capaces de proteger
22
la proteína contenida en ellos del ambiente hostil del estómago y ser capaces de
producir la IgA (20).
Demostrando que el toxoide tetánico es capaz de inducir respuesta en los
linfocitos Th2 por la producción de IgG1, inducidos únicamente con a 200µg/dosis
y no a 40µg/dosis. El biliosoma no produjo anticuerpos IgG2a contra el toxoide
tetánico, pero si induce la respuesta de linfocitos Th2, siguiendo dos diferentes
vías para producir IgA, dependiente de interleucinas y factores como el TGF-β,
mediadas por la producción de IFN-γ en linfocitos Th1. Esta alternativa surge
como respuesta a la administración parenteral en la cual se remplace el uso de las
agujas y pueda disminuir los casos de mortalidad asociados a tétanos neonatal y
materno en países en desarrollo, siendo una forma de transmitir inmunidad pasiva
de la madre al niño por nacer (20).
Actualmente en el campo de la salud humana y la epidemiología a diario se
publican numerosos estudios en los cuales los avances tecnológicos recientes
permiten abaratar costos, masificar medicamentos de una forma que antes no era
posible; gracias a la internet, el trabajo de grupos interdisciplinarios a nivel
internacional puede ser compartido para ser retroalimentado, y ser sujeto de
cambios de ser necesario, el uso de enfoques nuevos y complementarios algunos
de los pocos aquí detallados son consistentes en que el uso de agujas causa
traumatismos a las poblaciones sujetas de vacunación, en especial niños; por lo
cual la administración oral es el modo de administración preferido para inmunizar a
los candidatos a inmunización. Además, las vacunas en estudio y desarrollo hacen
énfasis en prescindir de la cadena de frío, muchos de los países en desarrollo son
países de climas cálidos y tropicales en los cuales a menudo el suministro de
electricidad es intermitente y poco confiable, además de la necesidad cada vez
mayor del uso de insumos biodegradables, de fácil administración que utilicen
mecanismos que los organismos ya usan eficientemente, concluirá en un abanico
amplio de opciones en la cual el criterio de la autoridad de salud debe ajustarse a
las necesidades locales y a los presupuestos, esto sin querer decir que la
23
protección frente a la toxina tetánica para unos sea mejor que para otros,
garantizando estándares máximos para todos los sujetos de vacunación y así
puedan disminuirse la mortalidad y morbilidad asociadas al tétanos.
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