UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATAFACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS

FOTOLUMINISCENCIA DEL INDOL Y DERIVADOS POSIBILIDADES ANALITICAS

Trabajo de Tesis presentado por

LILIANA BRUZZONEPara optar al grado de Doctor en Ciencias Químicas

(Orientación Analítica)

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATAFACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS

FOTOLUMINISCENCIA DEL INDOL Y DERIVADOS POSIBILIDADES ANALITICAS

Trabajo de Tesis presentado por

LILIANA BRUZZONEPara optar al grado de Doctor en Ciencias Químicas

(Orientación Analítica)

1981

A mis padres

INDICE

INTRODUCCION.................................................................................................1

PROPOSITO .................................................................................................. 4

1 PROCESOS FOTOFISICOS GENERALES. MECANISMOS ............................ 5

2 INSTRUMENTAL Y REACTIVOS.............................................................. 17

2.1 Absorción ultravioleta.............................................................. 17

2.2 Excitación y emisión.......................................................................17

2.3 Reactivos...........................................................................................19

2.4 Purificación de los reactivos.................................................. 19

3 CORRECCION DE ESPECTROS.............................................................. 21

4 METODOS DE CALCULO...........................................................................24

4.1 Determinación de rendimientos de fluorescencia................. 24

4.2 Determinación de rendimientos a baja temperatura....................... .. .25/c ia.

4.3 Determinación del tiempo de decaimiento de fosforescen-26

4.4 Cálculo del tiempo de vida media natural y del tiempo

de decaimiento de fluorescencia.............................................26

5 PARTE EXPERIMENTAL........................................................................... 31

5.1 Espectros de absorción..................... ............................................31

5.1.1 Fuerza del oscilador por resolución gráfica de las

bandas................................................................................................42

5.1.2 Análisis de los espectros.......................................................4b

5.2 Espectros de fluorescencia a temperatura ambiente . .53

5.2.1 Análisis de los espectros en ciclohexano..........................59

5.2.2 Efecto de la tempera terra..........................................................62

5.2.3 Efecto de átomos pesados..........................................................66

5.3 Espectros de luminiscencia a 77°K........................................69

5.3.1 Análisis de los espectros.......................................................74

5.3.2 Efecto de temperatura sobre la emisión de fosforescencia...............75

6 INTERPRETACION .......................................................................... 76

CONCLUSIONES ........................................................................... 84

APENDICE......................................................................................... 89

BIBLIOGRAFIA ................................................................................ 98

1

INTRODUCCION

El indol es una molécula de gran importan^

cía analítica ya que es el grupo cromóforo del aminoácido

triptofano. Estudiando sus propiedades espectroscópicas y las

de sus derivados en medios de diferente polaridad se obtienen

parámetros que pueden correlacionarse con las propiedades de

las proteínas y a los cambios que éstas sufren asociadas con

el medio que las rodea.

Existe gran número de trabajos dedicados

al estudio de esta molécula y la variedad de teorías que ex­

plican sus distintas propiedades es peetroscópicas indica la

naturaleza compleja del problema.

La mayoría de los estudios realizados se

basan en el comportamiento observado cuando esta molécula se

disuelve en solventes de diferente polaridad.

Strickland, Horwitz y Billups identi­

ficaron varias de las transiciones vibracionales del indol y

del 3-metilindol provocando perturbación por acción de solver^

tes en los espectros de absorción yf^poder así diferenciar los

corrimientos en las transiciones y , según la termino­

logía de Platt 2 \

Zimmermann y Joop midieron los espec­

tros de polarización de absorción y de fluorescencia. La tran­

sición ^L, está polarizada en la dirección del eje molecular o

más largo y la ^L^ perpendicular a la a lo largo del eje

molecular corto. Los mismos autores dedujeron que la emisión

de fluorescencia se originaba fundamentalmente desde el esta­

do ?l^ pero que una fracción lo hacía también desde el

Song y Kurtin efectuaron medidas de

polarización de luminiscencia y cálculos de orbitales molecu-

¿

lares llegando a la misma conclusión; o sea que la emisión

era dual, proveniente de los estados 1y JL() tanto en sol­

ventes polares como en otros relativamente no polares.( 5)Van Duuren ' ' observó cambios pronuncia­

dos en los espectros de emisión de fluorescencia del indol y

derivados con diferentes solventes, no así en los espectros

de absorción o de excitación de fluorescencia. Este comporta­

miento se debería a la existencia de estados mesoméricos po­

lares que generarían mayores contribuciones en la molécula a£

tivada que en el estado fundamental. Tales estados serían más

sensibles a los cambios de las constantes dieléctricas de los

solventes, produciendo el corrimiento en fluorescencia y no

en absorción.

El corrimiento hacia mayores longitudes

de onda de la banda de fluorescencia del indol cuando se exa­

mina en diferentes solventes, al pasar de no polares a los po^

lares, ha sido atribuido a un incremento en el mohiento dipo­

lar del estado excitado y a una mayor estabilización causada( 6 - 81por interacciones soluto-solvente ' .

También ha sido explicado el corrimiento

en los espectros de fluorescencia por la formación de uniones

hidrógeno entre el indol y las moléculas del solvente(o \

Konev determino que la emisión de

fluorescencia del indol involucraba dos transiciones electró­

nicas ya que al ir de un solvente no polar a uno polar,

además del corrimiento, se producía la desaparición de la ban_

da de fluorescencia de menor longitud de onda, J, y un co­

rrimiento mayor y ensanchamiento en la banda de longitud de

onda más larga, Además postuló que existen procesos de

relajación de solventes y como resultado de ello la banda a

3

mayor longitud de onda estaría formada por la luminiscencia

de moléculas con tiempos de vida mayores.

Walker, Bednar, Lumry y Hum--phries(13) sugieren la existencia de un complejo excitado so­

luto-solvente (exciplex) el cual sería el responsable del

gran corrimiento y pérdida de estructura vibracional de los

espectros de fluorescencia del indol y derivados en solven­

tes polares. Este complejo sería del tipo de transferencia de

carga, en el cual el indol excitado actuaría como dador y el

solvente polar como aceptor.

Varios autores postulan que el

proceso de desactivación no radiativo del estado singlete ex­

citado puede producirse por dos caminos: uno independiente de

la temperatura y otro dependiente de la misma.( 14)Freed y Salmre v 7 obtuvieron espectros

de emisión de fosforescencia del indol y derivados, los cua­

les tenían mayores diferencias entre sí que las halladas en

los espectros de fluorescencia.

La escasa literatura existente referente

a la fosforescencia (4.9) puntualiza que la misma se produci­

ría desde el estado 3L .a.

Las teorías desarrolladas para la expli­

cación del comportamiento espectroscópico del indol y deriva­

dos son varias. Los diferentes datos bibliográficos e inter­

pretaciones demuestran que el comportamiento de estas molécu­

las en estado excitado es complejo.

4

El presente estudio está orientado a:

verificar los diversos datos experimentales, no siempre con­

cordantes, establecidos por diferentes autores relativos al

proceso de absorción del indol (o indoles) en el ultraviole­

ta, a hacer uso de valores que no son accesibles por expe­

riencias en nuestro laboratorio -como los que surgen de pro

cesos que ocurren en la escala de los nanosegundos-. y com­

plementarlos con el estudio de fluorescencia y fosforescencia

bajo efectos perturbadores: solventes, metilación, temperatu­

ra , átomos pesados.

Correlacionando los fenómenos de absor­

ción y emisión será posible intentar interpretar, sobre la

base de los valores encontrados, el proceso en sus aspectos

y dinámico^.

La interpretación, junto con los datos

espectroscópieos, son específicamente importantes en relación

con el comportamiento del triptofano en estado excitado y la

fluorescencia de proteínas.

Además, desde el punto de vista analíti­

co, se pueden adecuar las condiciones para mejorar la sensi­

bilidad y selectividad de las determinaciones que involucren

residuos de proteínas que contengan el grupo cromóforo indó-

1 i co .

5

1 PROCESOS FOTOFISICOS GENERALES. ME CAN ISM O S.

La absorción de luz por una molécula en

fase condensada produce transiciones a estados excitados de

diferentes configuraciones nucleares y electrónicas. EstosJe, los ¡es

estados exhiben distinta reactividad química^y—represen ttm

y'^los caminos por los cuales la energía absorbida es disipada.

Esta serie de procesos tiene como conse-

cuencia la emisión de la energía absorbida en forma parcial

o total (rendimiento ). La emisión parcial es debida a los

procesos competitivos en el estado excitado, que dependen de

los parámetros de estructura mo 1ecu1ar , ínti mamen te asociados

al medio que rodea a la molécula, el solvente, el cual afec­

ta profundamente a los procesos actuando como perturbador,

por lo que el sistema debe ser considerado como una entidad

sol uto-sol ven te.

Todos los mec-a-ni sinos de—l-o-s procesos de

emisión o transferencia de energía pueden ocurrir entre nive­

les excitados de la misma o diferente multiplicidad. El fenó­

meno puede representarse por una serie de caminos que parten

del proceso inicial de la absorción de radiación que lleva a

la molécula (o sistema) a un estado cualquiera singlete exci­

tado vi o rae iona1 mente (vibrónico) para luego ocurrir, como es

el caso casi general, la degradación de la energíadíl nivel

vibracional fundamental del primer estado singlete -e x-c-i-1 a d o .Li/GA'O de')Ln—4st-e proceso de degradación puede ocurrir la emisión de la

radiación como fluorescencia o f osf ores cenci a , según lo condi_

ciona una serie de constantes de velocidad que regulan estos

procesos fotofísicos, algunos dependientes y otros indepen­

dientes de la temperatura.

En general, para una molécula en estado

6

electrónico y vibracional fundamental SQ, los procesos pueden

representarse según el diagrama de Jablonski:

Luego de .alcanzar un estado estacionario,

los procesos fotofísicos que pueden ocurrir se expresan me­

diante las ecuaciones cinéticas siguientes:

diferente multiplicidad.

i. So + fu I , absorción a un estado elec- atrónico singlete excitado. Esta do vibróni co.

ii.★

S1 + calor Relajación vibracional.

ni. S J★

— So + h^f kf[Sj3» fluorescencia.

IV.★

— So kn[sj]» conversión interna.

V.★

So ^So + calor Relajación vibracional.

VI . s/★

“>Tj kg[S/l» cruce entre sistemas de

té rmi c a .

VII .*

b ’ b Relajación vibracional.

VIII. b* *

- b v b k^fSjlexpí- E/RT), activación

térmi ca .

IX. b + hb kp[Tj]» fosforescencia.

X. b*

— So k [T J , conversión interna.

XI . b* *

-*b —b k£[T7]exp(- E/RT), activación

El proceso fotofísico I es la excitación

electrónica de una molécula que involucra la transición de un

electrón de un orbital molecular en el estado S a un orbital o de un estado electrónico superior excitado vibracionalmente★

Sp transición -vibróniea. En el caso presente la energía de

excitación proviene de radiación óptica, no ionizante, dando

como resultado la absorción de fotones.

El proceso II corresponde a la disipación

de la energía, generalmente por colisión con el medio, condu­

ciendo a la molécula al estado vibracional fundamental del

estado electrónico excitado S., se denomina relajación vibra­do

cional (Rv). Se trata de una transición que involucra un es- - 13 -11tado electrónico. El proceso es del orden de 10 a 10 se

g undos.

El proceso III se denomina fluorescencia

y es la desactivación con emisión de radiación desde el nivel

vibracional fundamental del estado singlete excitado electró­

nicamente Sj a cualquier nivel vibracional del estado funda­

mental SQ. El proceso está determinado por una constante de- 9 - Rvelocidad k^ y es del orden de 10 a 10 segundos.

El proceso IV representa una relajación e^

lectrÓnica, transición isoenergética, en este caso entre el

nivel vibracional fundamental del estado electrónico excitado

3

a cualquier nivel vibracional excitado del estado electrónico

fundamental. Se denomina conversión interna (CI) y está deter

minado por una constante k .nEl proceso V es relajación vibracional

del estado fundamental.

El proceso VI, también es una relajación

electrónica; es una conversión que está prohibida por spin

desde el estado singlete al estado triplete cercano excitado

vibraciona1 men te , transición isoenergética. Se produce por un

proceso de acoplamiento vibracional, igual que en conversión

interna y su constante de velocidad k^es del orden de la de Ib

fluorescencia. Se denomina cruce entre sistemas y puede o no

ser activada por átomos pesados.

El proceso VII es relajación vibracional

del estado triplete.

El proceso VIII corresponde a la activa­

ción térmica de niveles vibracionales del estado singlete ex­

citado que aumenta la probabilidad de acoplamiento con nive­

les vibraciona1 es de cualquier otro estado, k^ es el pre-expo/

nencial para este proceso dependiente de la temperatura.

El proceso IX es la desactivación con ra­

diación del nivel triplete fundamental a cualquier nivel vi­

bracional excitado del estado singlete fundamental. El proce­

so se den omi na fosforescencia, es regido por una constante k p-4 y es del orden de 10 a varios segundos.

El proceso X es de conversión interna re­

gido por una constante de velocidad km y es seguido por el

proceso V de relajación vibracional.

El proceso XI es de activación térmica

de la molécula en el estado triplete más bajo, que puede, en

J

algunos casos, ser suficiente para poblar el nivel singlete

excitado y producir emisión de radiación denominada fluores­

cencia retardada, k? es el factor pre-exponenci a 1.

La relación entre el número de fotones

emitidos a fotones absorbidos define el rendimiento de la emi_

siÓn(^, fluorescencia ((^) o fosforescencia (^p) •

Si se quiere determinar la eficiencia de

la emisión de fotones, se debe medir la pérdida de población

del estado excitado en función del tiempo y la cantidad de fo

tones absorbidos por la sustancia irradiada. Esta última, 11 a_

mada intensidad de la radiación absorbida, se expresa como el

número de fotones absorbidos por segundo y está relacionada

con la ley de Beer por intermedio de la intensidad de la luz

incidente, IQ, mediante la ecuación Ifl = IQ(l-10 ) donde

£ es la absortividad molar de la sustancia, c la concentración

molar y 1 la longitud del camino Óptico.

En el caso menos general en que el fenóme_

no esté representado por los procesos I a III, toda la luz

absorbida es emitida, o sea (|)f = 1 ; se tiene entonces que:

De la ecuación (1) se define:

y la integración de la ecuación (2):

Lsj1 = Lsol exp (4)

10

define el tiempo de vida medio como el tiempo requerido para que bJ = TsJ/e , de aquí que:

En este caso particular, en que toda la

energía absorbida es emitida, el tiempo de vida medio es el

tiempo de vida medio natural o radiativo,; el proceso de

emisión no está afectado por otros procesos competitivos,

siendo la constante de velocidad la radiativa, k^.

En realidad, ocurre en forma general que

la energía es distribuida entre todos los procesos fotofísi-

cos regulados por los siguientes parámetros de decaimiento

desde S j :

donde e corresponde a datos experimentales.

La luz absorbida:

Reemplazando en la ecuación (3):

De las ecuaciones (5), (6) y (7) se tiene:

Es de interés, para la interpretación de

los procesos y para distinguir la morfología molecular en el

estado excitado respecto del fundamental, hacer una considera­

ción según la forma en que se obtiene el valor del tiempo de

vida natural. Cuando^0 se calcula mediante la medida experi-

11

Otra manera de obtenerlo es mediante la integración del es­

pectro de absorción ( •

Los dos valores pueden diferir, porgue

es obtenido de la fuerza de la absorción y está íntegra­

mente asociado a la molécula en estado fundamental y'Co es

calculado sobre la base de las propiedades de la molécula en

estado excitado (ecuación 9). Cualquier diferencia en sus va_

lores demostraría algún cambio de configuración en el estado

exc i tado.

El proceso VI representa el fenómeno de

transferencia de energía a un estado de diferente multiplicó

dad, regulado por una constante de velocidad k^, mediante el

cual se consigue poblar el estado triplete excitado cuando

su valor compite con la constante de fluorescencia. Este es­

tado excitado, de tiempo de vida largo y altamente reactivo,

es de fundamental importancia en las reacciones fotoquímicas

dentro de la química orgánica. Es desactivado en estado con-

densado, generalmente por colisión, llegando al estado funda­

mental por un proceso de conversión interna regido por una

constante de velocidad k .mSe define la vida media radiativa de fo£

forescencia como:

(10)

y teniendo en cuenta el proceso de desactivación, la constan^

te del proceso total:

mental de y del rendimiento c uán t i co (J)f, se lo indica co-

(9)

12

(ID

y el tiempo de decaimiento:

(12)

Como en el caso de fluorescencia, la ecua

ción del rendimiento queda expresada por:

(13)

además de una ecuación que expresa el rendimiento en la p o ó 1 a_

ción del estado triplete , que es directamente proporcional

al producto del tiempo de decaimiento de fluorescencia

por la constante de velocidad del proceso de transferen ci a

de energía entre ambos sistemas de diferente multiplicidad

(14)

En un medio rígido (de un vidrio transpa­

rente), la constante kn puede despreciarse:

(15)

(16)

Utilizando las ecuaciones (13), (10),

(16) y (12) se obtienen:

(17)

(18)

13

A bajas temperaturas la emisión de fluo­

rescencia ocurre desdo a niveles vibraci on a 1 es del estado

electrónico fundamental. El espectro de fluorescencia puede

consistir en una serie de bandas cuyas diferencias en ener­

gía caracterizan los diferentes modos vibraci on a 1 es de la mo

lécula sin excitar, generalmente vibraciones C - C y C - H.

Cuando se aumenta la temperatura se produce un ensanchamien­

to del espectro con pérdida de estructura. Este efecto pro­

duciría la población de niveles vibrae iona1 es excitados del★

nivel electrónico superior Sj con una energía E^ en exceso

respecto a la correspondiente al nivel vibracional fundamen­

tal del estado electrónico excitado Sj.

Si Ej es la energía de activación del es^

tado singlete excitado, la nueva ecuación que define al esta_

do estacionario es:

Operando matemáticamente se obtiene:

(22)

= kf + kp + + k^ exp(- Ej/RT)

kf + kn + kg + k? exp(' E ;/RT)

14

donde:

Kj es una constante que representa a los procesos independien­

tes de la temperatura en el intervalo estudiado.

A temperaturas del nitrógeno líquido (77°K)

se eliminan ciertos caminos no radiativos y la emisión desde

el nivel singlete aumenta en intensidad al mismo tiempo que

ocurre la emisión desde el nivel triplete fundamental T.»

dando lugar al fenómeno de fosforescencia.

Un efecto de elevación de temperatura a

partir de estas condiciones produce la población de niveles

vibracional es del estado triplete. Estos niveles pueden con­

tribuir a la emisión fosforescente o puede ocurrir que la e-

nergía de activación E£ sea suficiente para alcanzar a poblar

el estado singlete, dando como resultado una emisión de la

misma energía que la de fluorescencia con un valor del pará­

metro de decaimiento del orden del de fosforescencia, denomi-(15) nada fluorescencia retardada ' .

La constante de velocidad del decaimien­

to de la fosforescencia está representada por:

(23)

Reemplazando la ecuación (11) en la (23)

y tomando la inversa:

(24)

Operando se obtiene, por ecuación (12):

(25)

La medida de la eficiencia de fluorescen­

cia y tiempos de decaimiento de la fosforescencia en función

de la temperatura permitiría obtener valores de constantes de

velocidades y energías de activación de los procesos no radia_

ti vos .

Cuando en el sistema existe una molécula

extraña, el proceso que puede ocurrir se representa mediante:

Este proceso está regulado por la constan^

te kq que puede ser calculada mediante la ley de Stern - Vol-

mer (16).

La intensidad de la luz absorbida cuando

existe una molécula extraña:

la que combinada con al ecuación (3) resulta:

(26)

rescenci a

Si se considera^ la eficiencia de fluo-

en ausencia de la sustancia extraña, de las ecuacio

nes (7) y (26) se obtiene:

(27)

siendo K$v 1 a cons tan te de Stern Volmer, la cual, cuando se

ib

conoce el tiempo de decaimiento de la fluorescencia,

calcular el valor de la constante k^:

permi te

(28)

17

2 INSTRUMENTAL Y REACTIVOS

2 . 1 Absorción ultravioleta

Los espectros de absorción de las molécu­

las estudiadas fueron registrados en un espectrofo tóme tro

Bausch Si Lomb 600 E y las longitudes de onda medidas con una

aproximación de 1 nm. Ancho de banda: 0,5 nm.

2.2 Excitación y emisión

Los espectros de excitación y emisión

fueron estudiados con un es pectrofotof1uorómetro Aminco Bow­

man SPF convencional equipado con fuente de xenón de

150 vatios, espejo condensador elipsoidal y fotómetro propor­

cional con fototubo multiplicador RCA 4837.

El sistema condensador elipsoidal aumenta

la sensibilidad del equipo convencional y la resolución de

los espectros de excitación y emisión.

El sistema consiste en una fuente de xenón

y dos espejos: uno es el condensador elipsoidal y el otro es

uno plano que dirige la radiación condensada hacia el equipo

a través de una ranura variable. Por medio de este sistema se

disminuyen las fluctuaciones debidas a la oscilación del arco

de la lámpara de xenón ya que los dos espejos rotan la imagen

del arco 90° con respecto a su eje original. La oscilación

del arco se mueve así a lo largo de la ranura en lugar de ha­

cerlo a lo ancho de la misma manteniendo aproximadamente cons­

tante las condiciones de la excitación.

El fotómetro proporcional varía la sensi­

bilidad del fototubo multiplicador en forma inversa a las va­

riaciones en la intensidad de la radiación de excitación debi_

Id

das a las fluctuaciones del arco de la lámpara.

La radiación de excitación pasa a través

de un divisor de haces: parte penetra al compartimiento de la

muestra y la otra porción es desviada, sin atravesar la celda,

alternándose ambos haces mecánicamente en su incidencia sobre

el fototubo multiplicador.

Durante la fase I la radiación de fluores_

cencía de la muestra pasa por el monocromador de emisión y el

fototubo produce una señal. Al continuar girando el alterna­

dor, la radiación de fluorescencia se bloquea y la porción de

radiación de excitación que había sido desviada llega al foto

tubo (fase II). La señal resultante es retenida momentáneamen­

te y llevada a un amplificador diferencial de referencia don­

de se compara con un potencial fijo. Si las dos señales son

iguales, no hay variación en la salida del amplificador dife­

rencial y no es necesaria ninguna corrección en el potencial

del fototubo. Si la intensidad de la lámpara de xenón varía,

se producirá una variación en la señal de salida del amplifi­

cador diferencial de referencia. Esta señal modificará el po­

tencial del fototubo, o sea la sensibilidad del mismo, hasta

que la señal en el amplificador diferencial sea igual a la de

referencia fija, manteniéndose sin cambio la salida del ampli_

fi ca dor di feren ci a 1.

Esta corrección requiere aproximadamente

150 mi 1 isegundos, lo que es considerablemente mucho menor que

la constante de tiempo del registrador X-Y, por lo que no se

observan cambios.

La escala de longitudes de onda del mono­

cromador de emisión se calibra con una lámpara de mercurio de

baja presión tipo lapicera. La calibración de la escala de

19

longitudes de onda del monocroma dor de excitación se realiza

después de calibrado el de emisión, colocando en la celda una

suspensión de sulfato de bario en agua y encontrando el máxi­

mo de dispersión para distintas posiciones del monocromador

de emisión.

2.3 Reactivos

La pureza de las especies usadas para la

investigación de su luminiscencia debe ser muy alta ya que

cualquier sustancia extraña podría atenuarla.

Los solventes empleados también deben ser

muy puros. En las medidas absorciométricas un criterio de pu­

reza suficiente es que no absorba en la región espectral de

estudio.

En las medidas fosforimétricas, además de

las condiciones anteriores, el solvente debe formar vidrios

transparentes a la temperatura del nitrógeno líquido y poseer

la capacidad de disolver los compuestos de interés.

Los solventes empleados en el presente es_

tudio fueron de diferente polaridad y constante dieléctrica,

cicloñexano (yu= 0, £ = 2,0) y alcohol etílico (yU-= 1,66 ,

E = 24,5). Para efectuar la calibración del equipo Arninco

Bowman SPF se empleó etilenglicol como disolvente de la roda-

mina B.

2.4 Purificación de los reactivos

Alcohol etílico 8

El alcohol de 95% se mantuvo a reflujo

durante varias horas con 25 ml/1 de I^SO^ 12N y luego se des_

tilo. El destilado se trató con 20 g de KOH y 10 g de AgJO^

por litro y fue destilado nuevamente. Este destilado se man­

20

tuvo durante una semana sobre amalgama de aluminio activada,

se filtró y destiló.

Ci elohexano

Reactivo Matheson, Coleman & Bell calidad

es pectroscópica ; se utilizó sin tratamiento adicional de puri

f i c a c i ó n .

E t i lenglicol

Reactivo Merck, se utilizó sin tratamien­

to de purificación.

S u1 fa to de quinina

Reactivo Merck, se recristalizó como d i h i_

drato en H^SÜ^ 0,05 M seguido por dos recristalizaciones en

agua. Se secó a 100°C.

Rodamina B

Reactivo BDH, se recristalizó en una solu

ción de éter-benceno (1+1).

Indol (Fluka) (p.f. 52 ,0 °C - 52,4oC) y 2-meti1indol (Aldrich)

(p.f. 58,0oC-58,2°C) fueron recristalizados en éter de petró­

leo y luego sublimados al vacío.

3-meti 1 i ndol

Reactivo Fluka, fue recrista1 izado en he£

taño y luego sublimado al vacío (p.f. 9 5 ,0° C-9 5,3° C) .

L(_) triptofano

Reactivo Carlo Erba, fue recristalizado

en una solución de etanol-agua (1+1) (p.f.292,5°C d.)

Yoduro de sodio

Reactivo Cario Erba, fue utilizado sin

purificación adicional.

¿1

3 _de_ e_sp_ectros

Los espectros de excitación y emisión re­

gistrados por la mayoría de los espectrofotof1uorómetros son

aparentes.

A fin de obtener el espectro verdadero de

un compuesto es necesario calibrar el equipo, ya que el espe£

tro obtenido es una resultante de la geometría óptica, de la

intensidad de la fuente de excitación en función de la longi­

tud de onda y de la sensibilidad del fotodetector.

El método utilizado para la corrección de(19) ambos espectros fue el desarrollado por Meluish x .

Se utiliza una solución concentrada de ro

damina B (3 g/1 en eti 1 eng1 i col ) como pantalla fluorescente

empleando el accesorio frontal de fluorescencia.

Se registra el espectro de excitación de

fluorescencia con el monocromador de emisión colocado a 640 nm.

Este espectro es la respuesta combinada de la lámpara y del

monocromador: Q(X).

Para calibrar el sistema de detección se

reemplaza el contador cuántico por un espejo recientemente

aluminizado y se mide la energía reflejada: R(A).

El factor de calibración para obtener los

espectros de emisión verdaderos es:

¿¿

Q(A): respuesta a la energía del contador cuántico.

M(X): transmisión de la ventana de la celda en que se mide la

respuesta del contador.

R(X): respuesta del monocromador-fototubo a la energía refle­

jada.

B(X): ancho de banda del monocromador de emisión.

W(A): reflectancia del espejo a 1umi nizado.

Para longitudes de onda mayores de 400 nm,

se interpone una placa de vidrio a la salida del monocromador

de excitación para absorber el segundo orden de radiación.

Cuando se determina R(X) se debe fijar

exactamente el espejo aluminizado, cualquier movimiento intro

ducirá error en R(^). Se registra la emisión para cada valor

de longitud de onda de excitación, prácticamente cada 10 nm,

obteniéndose una distribución en forma de pico agudo. La al­

tura del pico es el valor de R(A) y el ancho medio el de B (A ) .

Dado que se trabaja con red de difracción, B(X) es constante.

Los espectros de excitación se corrigie­

ron multiplicando cada valor de intensidad registrada a una

determinada longitud de onda por el factor correspondiente

en 1 a curva de Q(A ).

Las curvas de S(X) y Q(A) se muestran en

la figura 1.

Z3

Figura 1. Curvas de calibración

............ Q(X)-----------s(A)

24

En el método seguido se debe tener cuida-

4 METODOS DE CALCULO

4 • 1 Determinación de rendimientos de fluorescencia

Se utilizó el método propuesto por Parker(20)y Rees k . Para ello se determinan los espectros de emisión

de fluorescencia de soluciones de la sustancia en estudio y

de una sustancia de rendimiento cuántico conocido, bajo las

mismas condiciones instrumentales.

Como la emisión de fluorescencia es pro­

porcional a IQc1 y, por consiguiente, al área integrada del

espectro de fluorescencia corregido, se cumple:

donde:

2 y 1 identifican muestra y referencia respectivamente.

£: absortividad molar a la longitud de onda de excitación,

(p: rendimiento de fluorescencia.

c: concentración.

1: camino óptico.

Como sustancia de referencia se utilizó

sulfato de quinina disuelto en N. Se tomó como va­

lor del rendimiento, para una longitud de onda de excitación

de 366 nm, el dado por Meluish de 0,55.

Cuando se utilizan solventes distintos al

agua se debe corregir por la diferencia en los índices de re­

fracción. El valor del rendimiento debe ser multiplicado por

n2(so 1 vente)/ n2(agua) ^22’.

Precauci ones

do de no cometer errores debidos a: efecto de filtro interno,

uso de luz de excitación no monocromática, apagado por oxíge­

no. La ecuación mencionada sólo es aplicable en condiciones

de absorción muy pequeña de luz. Se utilizaron soluciones muy

diluidas, con absorbancias menores de 0,05. Para evitar erro­

res en la medida de la absorbancia se usaron celdas de 100 mm

de camino óptico. Antes de cada ensayo se eliminó el oxígeno

disuelto mediante el burbujeo con nitrógeno (99,998%).

4.2 Determinación de rendimientos a baja temperatura

Los espectros de emisión a baja temperate

ra y las curvas de decaimiento de fosforescencia se obtuvie­

ron haciendo uso del accesorio de fosforescencia El fun.

damento del método empleado para la determinación es el mismo

que el descripto en la sección anterior operando a la temper^

tura del nitrógeno líquido (77°K) y midiendo primero a esa

temperatura y después a temperatura ambiente. El valor de ab­

sorbancia empleado posteriormente en el cálculo es el medido

a temperatura ambiente.

En el caso especial de los indoles los

espectros de fluorescencia y fosforescencia no se solapan y

por consiguiente es posible calcular las áreas correspondiera

tes a cada proceso en forma individual.

Precauci ones

Además de las requeridas para el caso de

la fluorescencia se debe tener cuidado de evitar la formación

de burbujas en el nitrógeno líquido, por cuanto podrían pro­

vocar la difusión de la radiación de excitación.

Una vez registrado el espectro de emisión

a baja temperatura, se deja equilibrar el sistema a la tempe-

Zb

ratura ambiente, y sin mover la celda, a fin de mantener inal

terada su posición, se mide nuevamente el espectro de emisión.

4 . 3 Determinación del tiempo de decaimiento de fosforescencia

Se establecieron las curvas de decaimien­

to de fosforescencia intercalando en el camino óptico de la

radiación de excitación un interruptor mecánico.

No es necesario usar el cilindro rotato­

rio ya que los tiempos de decaimiento son largos y los espec­

tros de fluorescencia y fosforescencia están separados entre

ellos.

Temperaturas comprendidas entre 77°K y la

ambiente fueron alcanzadas permitiendo que la temperatura de

la muestra se elevase lentamente por evaporación del nitróge­

no líquido. Las temperaturas fueron medidas insertando una

termocupla en la celda.

La intensidad de la emisión de fosfores­

cencia se gráfico versus tiempo en un registrador con base de

tiempo (velocidad: 0,2 pulg/s).

4.4 Cálculo del tiempo de vida media natural y del tiempo

de decaimiento de fluorescencia

Se utilizó el método propuesto por Strick­

ler y Berg ^3) empleando la fórmula:

donde:

X°a : tiempo de vida media natural,

g^ : estado degenerado inferior,

g^ : estado degenerado superior.

27

en transiciones s i n g 1 e te - s i n gl e te .

n : índice de refracción a la longitud de onda media de la

banda de fluorescencia.(é d 1 n >7 : integral bajo la banda de absorción electrónica.

Vf Zprom

(I (3)d3= ---- =----------- — : valor recíproco del término medio

lU)ds _3Sf en el espectro de fluorescencia.

Los espectros de absorción se integraron

en forma gráfica por el método de Simpson utilizando una com­

putadora Monroe 1656.

Para facilitar los cálculos en las medi­

das de rendimientos y tiempos de decaimiento se utilizó un

programa por computación. El programa, denominado CINEF

fue escrito en lenguaje FORTRAN IV para una computadora

IBM 360.

En la figura 2 se representa el diagrama

de flujo con la siguiente secuencia: hasta el punto (1) son

leídos y controlados todos los datos referentes a la curva de

calibración. Estos son introducidos según un orden determina­

do y cualquier alteración será detectada e indicada, luego de

lo cual el procesamiento se detendrá. Los pasos siguientes

hasta el punto (2) son semejantes a la secuencia anterior pe­

ro referidos al espectro que se desea corregir.

Si hasta aquí no ha habido inconvenientes,

los datos introducidos son listados y comienza la ejecución

de la corrección propiamente dicha.

La subrutina INTERP es una interpolación

parabólica progresiva que puede alcanzar hasta el grado cua­

tro; en ella se fija el error deseado y durante el procesa-

¿ó

miento éste progresará hasta el grado necesario (siempre que

no sea mayor que cuatro) para que el valor obtenido tenga un

error menor al indicado. En esta parte, dicha subrutina inter

pola el valor del factor de corrección para cada longitud de

onda introducido como dato en el espectro problema.

A continuación se lleva a cabo la correc­

ción de la intensidad de la emisión para cada punto y se tra­

baja en número de onda, nm~^, en lugar de longitud de onda.

Con el fin de precisar el trazado del es­

pectro se vuelve a llamar a la subrutina INTERP para obtener

valores cada 0,01 nm”^.

El espectro así obtenido se regulariza( 2 5 por cuadrados mínimos según el concepto aplicado por Golayv

En las secuencias siguientes se llevan a

cabo dos integraciones gráficas por el método de Simpson usan_

do la subrutina que ya posee la biblioteca de programas de la

máquina.

La primera integración es I (s ) d donde

I es la intensidad de la fluorescencia corregida: la segunda

es \ (ñ ). d Ñ . El cociente de ambas da el valor de

que interviene en la fórmula de Strickler y Berg para

la obtención del tiempo de vida natural de un estado excitado

electrónicamente por integración del espectro de absorción.

El espectro corregido es impreso gráfica­

mente luego de normalizado, lo que permite obtener como resul_

tado el factor de normalización y el área del espectro.

Conjuntamente con el espectro se imprime

un listado de los valores interpolados y los grados utiliza­

dos, esto hace posible un examen rápido de la efectividad del

proceso y del espaciamiento entre puntos. Si el grado es cero

significa que la longitud de onda de la curva de calibración

y del espectro coinciden y no se lleva a cabo la interpola­

ción; si el grado es cuatro, los puntos a tomar deben estar

más próximos. Esta subrutina permite elegir los puntos toma­

dos como datos en el espectro con entera libertad, sin que

sea necesario mantener un AAconstante, ni que haya coinciden^

cia con la longitud de onda de calibración.

29

30

Figura 2. Diagrama de flujo correspondiente al programa CINEF.

31

5 P A R T F EXPERIMENTAL

5 . 1 Es pe ctr o_s_ de absorción

Se registration los espectros de absorción

en ciclohexano y etanol en el intervalo

33000 y 40000 cm'1.

co in prendido entre

En las figuras 3, 4 y 5 se muestran los

espectros en ambos solventes del indol, 3-metil indol y 2 - m e t i 1_

indol normalizados en los respectivos máximos de absorción.

En las figuras 7 y 8 se observan los es­

pectros de los tres indoles estudiados en ciclohexano y eta-

nol respectivamente. En la figura 8 se incluye el espectro

del L( jtriptofano. Se han

de ordenadas para apreciar

desplazado los valores

las frecuencias de las

absolutos

distintas

bandas.

Todos los espectros se barrieron con soli¿ _ 5

ciones aproximadamente 5.10 M en celdas de 100 mm de camino.

El indol en fase vapor muestra un espec­

tro con estructura fina lo cual ha permitido a Strickland y

colaboradores determinar la secuencia vibrónica de las

bandas.

Comparando las posiciones de las bandas

de los compuestos disueltos en ciclohexano con las obtenidas

en fase vapor se trató de identificar las transiciones a las

cuales corresponden.

Todos los espectros demuestran alguna ana

logia en lo que respecta a la energía de las transiciones, p£

ro se observan ensanchamientos de las bandas y variaciones en

los contornos por efecto del solvente.

Las transiciones correspondien tes al indol

se dan en la tab la 1.

32

Luego de identificadas las bandas en ci­

clohexano es posible compararlas con las obtenidas en etanol

(tabla 2) .

Tabla 1. Comparación de las posiciones de las bandas del indol di suelto en ciclohexano con las correspon­dientes en fase vapor.

NP: no resueltas, HP: no nuras

Ciclohexano v a no r (Strickland)

Designación (cm -1) Designación ( cm -1)

0 -0 34750 0-0 '4, 3 5 248

í°+ 907 36155

0 + 950 '4, 35700 >9 + 968 'L6 362 16

Io + 989 36237

0 + 1100 '4 ? 35850 0 + 1120 ?o 36368

0 + 1300 '4 36050 0 + 1313 36561

Q .-0 JLa 36050 0-0 36 56 1

0 + 700 a 36750 NR 0 + 750 3 7 3 1 1 HR

0 + 1000 ’la 37050 NR 0 + 1000 'l

a 3 7 56 1 HP

0 + 1250 'la 37300 HP 0 + 1700 33261 Kip

9 + 2100 38250 HP 0 + 2450 3)011 HP

Tabla 2. Comparación de las posiciones de las bandas del indol disuelto en etanol con las corresnondi en tes en ciclohexano.

Etanol Ciclohexano

Designación (cm”1) Des i g nac i ón \) (cm"1) Av(cm”1)

9-0 ’l,5 34650 0-0 >L„ 347 50 100

0 + 930 35600 0 + 950 '4, 35700 100

0-0 ’la. 35900 0-0 ’l

a 36050 150

0 + 700 ’la 36600 0 + 700 JL

a 367 50 150

Figura 3. Espectros de absorción del indol en:

------------------ ciclohexano

------------------ etanol

33

34

El espectro del 3-meti 1 indol es más difí­

cil de interpretar que el del indol debido a que las bandas a

mayores longitudes de onda son el resultado de un solapamien-

to de las dos transiciones. No obstante, efectuando el mismo

tipo de análisis que el practicado para el caso del indol, se

determinaron las transiciones correspondientes a las bandas

más características (tabla 3).

Tabla 3. Comparación de las posiciones de las bandas del

3-metilindol disuelto en ciclohexano con las corres_

pondientes en fase vapor.

Ciclohexano Vapor (Strickland)

Designación *9 (cm-1) Designación ^(cm"1)

0-0 34500 0-0 34831

0-0 'l 34500 0-0 'l 35510a a0 + 950 35450 0 + 980 3 581 1

0 + 1400 35900 0 + 1340 36171

0 + 2100 36600 0 + 2100 36931

0 + 27 50 37250 0 + 2800 'l.0

376 31

Las tres últimas bandas pueden ser solapami en tos de 'La

La única banda posible de identificar en

etanol es la de 34450 cm"1 que correspondería a la de

34500 cm"1 en ciclohexano.

El 2-meti 1 indol no fue estudiado por

Strickland. En la tabla 4 se dan las transiciones correspon­

dientes a las distintas bandas observadas considerando los mo

délos del indol y del 3-metilindol.

35ab

sorb

anci

a rela

tiva

Figura 4. Espectros de absorción del 3-metilindol

en :

-----------------ci clohexano

---------------- etanol

36

El espectro del 2-meti 1 indo 1 (figura 5)

sufre variaciones similares a las producidas en el indol cuan

do se cambia de solvente. La banda 0-0 se puede determi­

nar considerando el aumento de su intensidad relativa en eta­

nol respecto a ciclohexano, por analogía con lo ocurrido en

el caso del indol (tabla 5).

Tabla 4. Posiciones de las bandas del 2-metilindol disuelto

en ciclohexano.

Designación (cm"1)

0-0 34800

0 + 900 1 35700

0 + 1050 35850

0 + 1400 36200

0-0 ’la 36200

0 + 800 'la 37000

0 + 2200 37000

0 + 2800 37600

0 + 3150 379 50

Las dos últimas bandas pueden ser solapamientos de \ y ^L,el O

Tabla 5. Comparación de las posiciones de las bandas del

2-metilindol disuelto en etanol con las correspon­

dientes en ciclohexano.

Etanol Ciclohexano

Designación ^ (c m 1) Designación (cm 1) A^ (cm-1)

o-o ’l,o0-0 ’l

a

34700

36100

0-0 TLb

0-0 JLa

34800

36200

100

100

37

Figura 5. Espectros de absorción del 2-metilindol en:

-----------------ci clohexano

---------------- etanol

38

Se registró el espectro de absorción del

L(_)triptofano sólo en etanol (figura 6) debido a su insolubi­

lidad en ciclohexano. Se observó que dicho espectro coincide

aproximadamente con el del 3-metilindol, lo que permite supo­

ner que las transiciones son las mismas para las dos sustan­

cias.

39ab

sorb

anci

a rela

tiva

Figura 6. Espectro de absorción del tri p tofano

en etanol.

40ab

sorb

anci

a

Fi gura 7. Espectros de absorción del (1) indol, (2) 2-inetil-

indol y (3) 3-metilindol en ciclohexano.

5.1.1 Fuerza del oscilador por resolu c i ó n g r áfiea de las

bandas .

Es posible determinar la intensidad de u-

na transición sobre la base de la fuerza del oscilador, f (26),

el cual puede alcanzar el valor unitario para la máxima proba­

bilidad de la transición.

La fuerza del oscilador se calcula median­

te la expresión conocida:

f = 4,319. 10’9 Jí di

en que /£ di es la intensidad integrada de la banda correspon­

diente del espectro de absorción y es la frecuencia (cm~^) .

El cálculo de las fuerzas de los oscilado­

res de las bandas y para el indol y sus derivados, a

causa de su solapamien to, requieren ser resueltas descontando

sobre el espectro, la absorción correspondiente a cada una de

ellas.

Como ejemplo del procedimiento se dan en

la figura 9 las bandas y halladas para el indol disuel­

to en ciclohexano.

En las tablas 6 y 7 figuran los valores

obtenidos en ambos solventes para las fuerzas de los oscila­

dores y los momentos de transición de las bandas ^L^ y ^L^

de las sustancias en estudio suponiendo el mismo tipo de sola^

pami en to.

En la tabla 8 se indican las relaciones

de las fuerzas de los osciladores de las bandas y L^ en

los mismos solventes.

43

LOO O O

Figu

ra 9. R

esol

ució

n grá

fica d

e las b

anda

s L y L,

del ind

ol en

cicl

ohex

ano

44

«3- en o •—<

oj cm en cj

lo en eno >—•

o o

en -3- m•-< o

o o

ena)

caj

-ac oe endJU í-o o

enO</)

Tabl

a 6. Fuerz

as de

l osci

lado

r oara

la ba

nda L

del ind

ol y s

us de

rivad

os.

en o

■cro >

O O O LO loLO LO co en

o o o o en • LO LO en en

S- cu

•U

en o en

>

oT9c

2- m

etilin

dol

3480

0 0,

013

0,9

350

3460

0 0,

009

3- m

etilin

dol

3459

0 0,

021

1,1

750

3435

0 0,

012

L, -tri

ntof

ano

3425

0 0,

012

45

Tabla 8. Relación entre las fuerzas del oscilador de las

bandas y del indol y sus derivados en fun­

ción del solvente.

^^Sol vente

Compuest o^\^^

Ci el oh exano

f 'L? f \

Etanol

f ’>V f ’Lfa

Indol 11.1 12,0

2-meti1indol 11,6 16,6

3-meti1indol 4,4 13,2

L( jtriptofano 6,2

46

5.1.2 Análisis de los espec tros

En general se observa que las transicio­

nes son más sensibles a las perturbaciones por efecto del

sol vente que las ^L^.

Los espectros ultravioleta de las sustan­

cias estudiadas en un determinado solvente y de cada uno de

los compuestos en los dos solventes usados, exhiben una carac

terística fundamental, la banda de mayor longitud de onda su­

fre muy pequeños cambios respecto a la energía e intensidad

y las mayores variaciones aparecen a partir de los 36000 cm"^

en el sentido de las frecuencias decrecientes.

De los solventes estudiados el ciclohexa­

no es el que produce menos alteraciones en los espectros de

absorción lo que cabe atribuir a su no polaridad.(9)

Según Konev ' cuando se pasa de solu­

ciones en hidrocarburos a solventes más polares el máximo co­

rrespondiente a bajas longitudes de onda sufre un gran corri­

miento (700 cm"l) hacia el rojo; en cambio, el máximo a lon­

gitudes de onda mayores se corre muy poco (150 cm”*). La in­

terpretación de Konev es que se producen uniones hidrógeno en_

tre las moléculas del indol y las del solvente.

Observando la tabla 2 se advierte que en

los sistemas estudiados no se produce el gran corrimiento po£

tulado por Konev; el corrimiento se encuentra dentro de los

150 cm”l. La discrepancia surge del hecho de que en el cálcu­

lo de los valores encontrados, dicho autor solo computó los

máximos de absorción sin tener en cuenta el estado vibracio­

nal al cual pertenecían.

Si se consideran los máximos para el in­

dol disuelto en ciclohexano (37300 cm *) y en etanol

47

(36600 cm el corrimiento da el mismo valor que encontró Ko

nev ( 700 cm’1) .

El corrimiento de los máximos (únicos va­

lores susceptibles de ser comparados) del 3-metilindol en ci­

clohexano (35900 cm y en etanol (35500 cm’h es de 400 cm~^,

menor que en el caso indol, lo que estaría indicando que se

produce un gran solapamiento de las bandas y *.

En cambio, para el 2-metilindol, el corri_

miento de los máximos en ciclohexano (37600 cm’^) y en etanol

(36750 cm es de 850 cm comparable al del indol.

Los estudios sobre polarización de los es_

pectros de absorción 9) han permjtido llegar a esta­

blecer que la banda a mayor longitud de onda del indol en ci­

clohexano es una transición con una leve superposi­

ción de la banda en la zona de mayor longitud de onda.

Si suponemos que los dos primeros máximos

corresponden a la misma banda, determina por resolución

gráfica la frecuencia vibracional, la que da un valor de apro

ximadamente 900 cm”^ para las sustancias disueltas en ciclo­

hexano y muy próximo a este valor para las disueltas en eta­

nol (tab 1 a 9 ) .

Los espectros fueron medidos con una reso

lución de 0,5 nm que corresponde a + 50 cm en la región ba­

rrida.

48

Tabla 9. Frecuencias vibraciona1 es de la banda L, . b

^^\So^ven teCiclohexano Etanol

Compuest (cm"1) *9 (cm"1)

Indol 0 + 940 0 + 975

2-meti1indol 0 + 820 0 + 900

3 - m e t i 1 i n d o 1 0 + 830 0 + 890

L(_)tri ptofano 0 + 760

Esta vibración de intensidad fuerte co­

rrespondería a la de 980 cm 1 dada por Strickland en metilci_

clohexano y a la que Hollas caracterizó a 907 cm’1 en fa_‘

se vapor.

Yamamoto y Tanaka en sus estudios en_

cuentran que el cristal de indol exhibe prácticamente el mis­

mo espectro que el del compuesto en solución y una frecuencia

vibracional de 850 cm"1 para la banda Esto está de acuer

do con lo anterior y si se tiene en cuenta que Kaneda y Tana-(29)ka k 7 han establecido que la molécula de indol es muy plana,

se puede concluir que la conformación del estado fundamental

en solución es la misma que la del cristal, lo que además es­

taría de acuerdo con el hecho probado y conocido de que cuan­

to más plano es el estado fundamental más estructurado resul­

ta el espectro de absorción.

Se observa también que las dos frecuen­

cias vibraci ona 1es de menor energía de cada sustancia en los

dos solventes ensayados, permanecen aproximadamente constan­

tes (tab 1 a >).

Analizando las relaciones de las fuerzas

de los osciladores (tabla 8) en ciclohexano se observa que

49

los valores son parecidos para el indol y el 2-metilindol y

mucho menor para el 3-meti1indol , lo cual corroboraría que en

este solvente la banda a 34500 cm es un solapamiento muy

grande de ^L y ^L^, en concordancia, por lo demás, con lo ob

servado anteriormente.

La relación de las fuerzas de los oscila­

dores de las dos bandas en el L(-) triptofano es mucho menor

que los valores alcanzados en los otros derivados; cabe atri-

buir este efecto al aumento de la fuerza del oscilador de . oEl solapamiento también determina un au­

mento en el ancho medio de la banda, en el caso del espectro

del indol cuando se pasa de ciclohexano a etanol como solven­

te, y en el del 3-metilindol respecto al del indol ambos en

ciclohexano.

Valeur y Weber en un trabajo recien

te, midieron los espectros de excitación polarizados, selec­

cionando, por medio de filtros, el nivel desde el cual se on

gina la transición. Consiguen de esta manera resolver el es­

pectro en las dos bandas y de las moléculas de tripto

fano y de indol disueltos en propi 1 eng1 i co 1. La figura 10 re­

presenta en forma comparativa la resolución del espectro estu_

diado por el método simple usado en nuestro laboratorio y el

que usaron los autores.

Ambos espectros están en plena correspon­

dencia y dan una frecuencia vibracional de 0 + 760 cm Lo

mismo sucede en el caso del indol en ciclohexano; para éste

la frecuencia vibracional hallada en nuestro estudio es de

0 + 940 cm~l. Los valores siempre resultan muy próximos a las

dos frecuencias dadas por Strickland que son de 0 + 730

cm”1 y 0 + 980 cm .

50

Figura 10. Resolución gráfica de las bandas y

Jl_b para el Ljtriptofan o .

a) Método de Valeur y Weber.

b) Método usado en el laboratorio.

bl

En general se puede decir qirc los espec­

tros de absorción del L_jtripto fa no y del indol en solución

están constituidos por dos transiciones bien características

en la zona estudiada; una banda *a mayor longitud de onda,

con cierto solapamiento de que es posible resolver grá­

ficamente con cierta seguridad y una transición para la

cual es muy aventurado establecer una analogía con la fase

vapor.

En solventes diferentes, la banda so a - lapa con la en un grado que depende de la polaridad de

aquellos.

Puede observarse que los dos estados cum

píen, aun en solución, lo que está demostrado para los espec

tros respectivos en fase gaseosa, a saber: que el primer es­

tado da una banda aguda y que el segundo es mucho más ancho,

con el agregado de que en este caSo, el ensanchamiento vibró

nico no alcanza a anular la estructura vibracional.

La conservación, en lo sustancial, de la

forma y contorno de las bandas demuestra que la sustitución

afecta poco la geometría molecular y no hay prácticamente e-

fee to i n d u c t i v o del grupo metilo sobre la frecuencia v i b r a c i o_

nal de 1 a banda y solamente con alcance limitado sobre

1 a s de 1 a banda ’l .a

Se puede decir también que en el indol

y derivados estudiados la interacción se produce entre dos

estados del mismo tipo orbital, es decir, los dos electrones

del heteroátomo contribuyen a la estructura electrónica Tí,

la transición es Tí - TT como en el pirrol, dando como resul­

tado que se conserve el modelo vibrónico del estado excitado.

En los espectros del Lj_jtriptofa no y del

52

3-metilindol en etanol se observa que las bandas -i mayor lon­

gitud de onda sufren un corrimiento hacia el rojo con respec

to al indol o al 2-metilindol conservando básicamente su c o n_

torno.

Esta estabilización del estado excitado

no puede ser atribuida a una transferencia de carga con el

grupo ácido aceptor del triptofano ya que el 3-meti 1 indo1 ex

hibe un espectro análogo sin tal posibilidad; en todo caso

esto demuestra la relevancia de la posición 3 a la estabili-(31)zación cuando el H es sustituido v .

Esta propiedad y la planaridad del grupo

cromóforo quedan demostradas en el estudio de Rivero y cola­

boradores sobre la estructura cristalina del complejo

de transferencia de carga entre escatol y tetracianoeti1eno.

53

5 • 2 Espectros de fluorescencia a temperatura ambiente.

Los espectros de emisión de fluorescencia

a temperatura ambiente se registraron termostatizando a 25°C

el compart i mi en to donde se aloja la celda.

Las soluciones empleadas para correr los

espectros de fluorescencia fueron las mismas usadas para los

espectros de absorción.

Todos los espectros de fluorescencia co­

rregidos se han representado, en forma normalizada, conjunta­

mente con los espectros de absorción. Es importante destacar

que el espectro de excitación corregido se extiende entre los

límites correspondien tes al de absorción y coincide en su as­

pecto vibracional con éste.

En ciclohexano se observa una cierta es­

tructura en el contorno de la banda de fluorescencia además

de tener una imagen especular parcial respecto al de absor­

ción; por lo tanto se ha tratado de establecer la concordan­

cia entre las frecuencias vibraciona1 es de ambos espectros.

En las figuras 11, 12 y 13 se representan

los espectros del indol, 3-metilindol y 2-metilindol disuel­

tos en ciclohexano. Las flechas indican las frecuencias vi b ra_

cionales de la banda de menor energía asignada a la transi­

ción ?Lfa <—4A del cristal de indol.

En la tabla 10 figuran los valores de los

parámetros de fluorescencia de los compuestos citados disuel­

tos en ciclohexano.

Cuando se utiliza etanol como solvente

se observa que los espectros de emisión de fluorescencia ca­

recen completamente de estructura y sus máximos se desplazan

hacia frecuencias menores.

54

En la tabla 11 figuran los valores de los

parámetros de fluorescencia de los compuestos estudiados di­

sueltos en etanol, cuyos espectros se dan, conjuntamente con

los de baja temperatura, en las figuras 18, 19, 20 y 21.

55

Figu

ra 11.

Esoect

ros de

abso

rció

n y de

emis

ión a

25°C

del ind

ol en

cicl

ohex

ano.

56

rdU

cn

CM

57

ea i )E|9j eioueqjosqe

Figu

ra 13.

Espect

ros de

abso

rció

n y de

emis

ión d

el 2-m

etilin

dol en

cicl

ohex

ano.

o oLO CXI

<T3

58

Tabl

a 10. Pa

rám

etro

s de flu

ores

cenc

ia de

l indol

y de

rivad

os en

cicl

ohex

ano

(1)

W.B

. de La

uder

y Ph

. Wahl

, Bio

chim

. Biop

hys.

Acta

, 243

, 153 ( 19

7 1)

(2)

M.S

. Wal

ker, T

.W. Be

dnar

, R.Lu

mry

y F.

Hum

phrie

s, Ph

otoc

hem

. Phot

obio

l., 14,

147 (19

71)

(3)

En la

biblio

graf

ía no

se han

enco

ntra

do va

lore

s para

los tiem

pos de

deca

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e los d

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e figu

ran e

n la tab

la son

valo

res c

alcu

lado

s y po

r cons

igui

ente

no ap

licab

les

59

5.2.1 Análisis de los espectros en ciclohexano.

La imagen especular parcial de la figura

11 se observa en la figura 14,donde se hacen coincidir las

alturas de las bandas 0-0 de absorción y de fluorescencia,

proyectando luego el espectro sobre la línea de simetría.

Los picos a 34750 cm'1 correspondientes

a la transición 0-0 ^L^ en absorción y en fluorescencia son

coincidentes y el pico a 35700 cm 1 en absorción corresponde^

ría a la inflexión observada a 33750 cm'1 en fluorescencia.

La frecuencia vibracional de esta banda arroja un valor de

1000 cm 1 para el estado fundamental, en correspondencia con

la frecuencia vibracional en absorción, que daba un valor de

940 cm’l por resolución del espectro (Tabla 9).

Las frecuencias del máximo de fluorescen^

cia a 33500 cm’^ y la inflexión a 32500 cm"1 pueden ser com­

paradas con las de absorción a 36050 cm'1 y 37050 cm’1 respe£

tivamente correspondientes a la transición \ . Estas ener:

gías difieren en los espectros de emisión y absorción en el

mismo intervalo: 1000 cm'1.

La transición correspondiente a 36750 cm'-

en absorción no se observa en el espectro de fluorescencia,

supuesto que deba existir a 32800 cm 1.

Considerando la simetría parcial de los

espectros, el origen de la transición JL^ se encontraría a

34775 cm"1, muy cercana a la transición 0-0 1L^ (34750 cm b.

El corrimiento de Stokes para la banda

0-0 ^L es de 2550 cm'1.d

Se estudiaron los otros compuestos efec­

tuando el mismo tipo de consideraciones.

Figura 14. Proyección del espectro de absorción

sobre el de fluorescencia del indol

en c i elonexano .

61

Para el 3-metilindol la energía a 34100

cm 1 en el espectro de fluorescencia correspondería a la de

34500 cm 1 en absorción (el origen de la transición esta­

ría en 34300 cm'1).

Si el máximo de la emisión de fluorescen^

cia corresponde a la transición \^(3^800 cm’1) y de la absor_

ción a 34500 cm 1 a 1 a misma transición, el origen de la ban­

da estaría en 33650 cm-1 o sea a mayor longitud de onda

que la 0-0 1 .

El corrimiento de Stokes para la banda

0-0 es de 400 cm"1, y para la banda 0-0 es de 1 700 cm"1

Para el 2-metilindol, el pico a 34300 cm 1

en absorción se corresponde con el hombro a 34350 cm"1 en

fluorescencia, por lo cual el origen de la transición es­

taría en 3457b cm"1.

El hombro a 33400 cm"1 en fluorescencia

se halla a 950 cm"1 del de 34350 cm"1 y se corresponde con

el pico a 35700 cm”1 en absorción, que se halla a 900 cm 1 del

de 34300 cm"1, lo cual significa que corresponden a la misma

transición 1 .

El máximo a 33000 cm"1 en fluorescencia

correspondería al pico a 36200 cm”1 en absorción y la infle-

ción a 32200 cm"1 en fluorescencia con la de 37000 cm"1 en

absorción, serían transiciones \ .

El origen de la banda 1La estaría en

34600 cm"1, con lo cual el origen de esta transición sería el

mismo que el de la 1.

El corrimiento de Stokes para la banda

0-0 es de 450 cm’1 y para la banda 0-0 JL es de 3200 cm 1L) a

62

5.2.2 Efecto de la temperatura

El efecto de la temperatura sobre la emi­

sión de fluorescencia fue estudiado en el intervalo de 2 0 °C

a 60°C. Con la medida experimental del rendimiento de flúores

cencia se determinó la energía de activación.

En la figura 15 se muestra la variación

del rendimiento de fluorescencia con la temperatura para el

indol y el L(_jtriptofano disueltos en etanol. El aumento de

la temperatura afecta las velocidades de los procesos de des­

activación en solventes polares. En ciclohexano no se ha en­

contrado variación con la temperatura en el rendimiento de

fluorescencia.

Con la hipótesis de la existencia de dos

caminos de desactivación del estado excitado es posible calcu

lar la energía de activación para el proceso dependiente de

la temperatura, mediante la ecuación (22) que expresada en

forma logarítmica resulta:

La

valores en la ecuación

a 1 representar

constante Kse

hasta conseguir

obtiene introduciendo, . (33,34)la mejor recta

debe ser considerado como aproximado ya que

El valor de K

existe la posibi

1 idad de incurrir en errores sistemáticos en su evaluación.

En la figura 16 se muestran las rectas ob

teñidas para el indol y el L_jtriptofano disueltos

El trazado de la recta obliga a

en etanol.

despreciar

el valor de Kj, lo que indica que el proceso de desactivación

es únicamente dependiente de la temperatura.

(31)

63

2

Figura 15. Variación del rendimiento de

con la temoeratura del (1)

°C

fluorescencia

indol v

trintofano en etanol.

64

En la tabla 12 se muestran los valores ha

liados para las energía de activación y las constantes corres

pondi entes .

En el caso del ciclohexano (solvente no

polar), al ser el oroceso de desactivación independiente de

la temperatura, la ecuación (22) se simplifica ya que

= Kj , lo que conduce a valores de > 1 para los

compues tos estudiados, lo que significa que k < k n + k .

Tabla 12. Resultados experimentales correspondientes a la

ecuación (22) para el apagado de la fluorescencia

en etanol por efecto de la temperatura, = 0.

Compuesto K2(cm

Indol 52,4 700

2-me ti 1 i n do 1 25,0 600

3-met i 1indol 22,9 600

L( jtriptofano 3568,8 1400

ka.1C'9 (sJ11(1)

k¿.exn( -E,/RT)

(25°C)

4.1 1,4. 108

3,2 1,8. 108

2,9 1,9. 108

256 .9 3.5 108

(1) Valores calculados con 7^ de tabla 11

Figura 16. Representación gráfica de la aplicación

de la ecuación (31) para el

( 1) indol y

(2) L( jtriptofano en etanol, Kj 0

66

5.2.3 Efecto de átomos pesados

La eficiencia de fluorescencia en un sis­

tema puede disminuir debido a la presencia de ciertas sustan­

cias que producen apagado.

La cinética del apagado en soluciones se

describe mediante la ley de S tern-Volmer (ecuación 27). Grafi_

cando la relación de eficiencias de fluorescencia en función

de la concentración de átomo pesado que produce el apagado,

se obtiene una recta cuya pendiente es la constante de Stern-

Volmer, X $ v , con la cual se calcula la constante de apagado,

kq, (ecuación 28). El valor de esta constante determina si el

proceso está controlado di fus i ona linen te, para lo cual es necc

sario que el tiempo de vida del estado excitado sea mayor de

10 1 segundos. En este caso, las constantes de apagado deoen-

den de la viscosidad del solvente y de la temperatura.

La constante de velocidad de un proceso (35)controlado di fusi on a 1 men te es v .

Aj : viscosidad del solvente en poises.

Básicamente pueden existir dos mecanismos

mediante los cuales se pierde la energía en forma colisional:

aumento del cruce entre sistemas o transferencia electrónica.

En el presente trabajo se estudió el efec

to producido por el agregado de yoduro de sodio a soluciones

de un indol en etanol. Se observó que la forma del espectro

de emisión de fluorescencia no variaba, pero sí disminuía su

intensidad. La disminución de la fluorescencia es debida al

I" que actúa como átomo pesado; el Na + no produce apagado.

Las concentraciones de yoduro de sodio se

67

mantuvieron lo suficientemente bajas como para que no exis­

tiera absorción de la luz de excitación.

En la figura 17 se adopta el indol para

ejemplificar la representación gráfica de la ley de Stern-Vol

me r.

En la tabla 13 se dan los valores halla­

dos para las constantes de apagado del indol y derivados di­

sueltos en etanol a 25°C. El apagado del

I" en etanol es despreciable.

L(-) tri pto fan o por

Se puede observar que los valores encon­

trados son comparables con el de la constante de control di-

fusional calculada mediante la ecuación (32):

Tabla 13. Resultados experimentales del apagado de la

fluorescencia por efecto del Jal en etanol a 25°C.

(1) Valores calculados con de tabla 11.

Com pues to K (M1)S V 7

k .10'9(M'1 s'1) (1)

Indol 19.1 4,1

2-meti 1 i ndo 1 11.2 3,5

3-meti1 indol 6.1 1,9

Figura 17. Representación qráfica del efecto

del I” sobre el indol en etanol.

6 9

5.3 Espectros de luminiscencia a 7 7°K.

Los espectros de emisión y las curvas de

decaimiento se barrieron usando el accesorio de fosforescen­

cia y enfriando con nitrógeno líquido.

Las curvas de decaimiento de la fosfores­

cencia se obtuvieron interrumpiendo la radiación de excitación

(280 nm) y graficando la intensidad versus tiempo para la lon­

gitud de onda de emisión corres pond i en te a la banda 0-0 en el

espectro de fosforescencia.

En las figuras 13, 19, 20 y 21 se repre­

sentan los espectros de absorción y emisión a temperatura am­

biente y el espectro de emisión total en etanol a 77°K de los

compuestos estudiados.

Los parámetros de emisión a 77°K se mues­

tran en la tabla 14.

Tabla 14. Parámetros de la luminiscencia del indol y deriva­dos a 7 7 ° K en etanol (excitación: 280 nm).

Fluorescenci a

Compuesto^em (cm’1)

' i

í i i

1 i

1 i

(^77°K‘^293°K)

Indol 31100 32600 33850 0,79 2100

2-meti1 i ndol 30800 31650 32800 0,68 1900

3-meti1indol 30500 31550 33300 0,69 2900

Lj jtriptofano 30700 31750 0,60 2050

Fosforescencia

Compuesto <pp p( s

Indol 24700 23900 23100 22200 21800 20600 0,12 6,6

2-metil­indol

25050 24250 23450 22600 22050 20550 0,17 6,2

3 - m e t i 1 - indol

24000 22700 21400 20100 0,13 5,1

L( _) trin­to í a n o

24600 23900 23200 22200 21800 20600 0,15 6,6

-H.0

J_________ I__________I----------------LCO UDCD CD ° CD

EAHB|3J PEPISU3|UJ Figu

ra 18.

Espect

ros de

abso

rció

n y em

isió

n a 25

°C ----

---- y d

e emis

ión a

77°K

-------

-- del

indo

l en et

anol

71

72

-M.0

cm o Fi

qura

2 0. Esp

ectro

s de ab

sorc

ión y

emis

ión a

25°C

-------

-y de

emis

ión a

7 7 °

K--

-----

----

- del 3-

met

ilindo

l en

EA I |e|9J PEPISU9JUI

7 3-H

.0

I CD

J__________ I------------------ L-oo coCD O O

I CXJ o Fi

qura

21. Esp

ectro

s de ab

sorc

ión y

emis

ión a

25'C --

-----

- V de

emis

ión a

77°K

-------

-- de

l L,_v

tript

ofan

o

BAI)E|9J pEpiSU9|UI

74

5.3.1 A.nálisis de los espectros

Enfriando a 77°K?los máximos de emisión

de fluorescencia de todos los compuestos experimentan un efec

to batocrómico muy grande.

Analizando el espectro del indol, aparece

un máximo a 32600 cm 1 con un corrimiento de 2100 cm"1 resoe£

to al de 25°C. A su vez, aparecen dos vibraciones bastante

bien resueltas a ambos lados del mismo: una a 33850 cm"1 y o-

tra a 31100 cm"1.

Para los derivados, los espectros de fluo­

rescencia a 77°K también demuestran estructuras parecidas a

la del indol, sufriendo corrimientos de 2000 cm'1 resoecto a

los de 25°C, excepto en el caso del 3-metilindol cuyo máximo

se desolaza unos 3000 cm”1 (tabla 14).

Los espectros de fosforescencia muestran

varios picos bien definidos (tabla 14) con energías e intensi_

dades del mismo orden. Lo mismo ocurre con resoecto a la dis­

tribución vibracional si se excita a otra longitud de onda.

La orimer vibración corresponde a la t r a £

sición 0-0 3l .d

Cuando se agregó yoduro de sodio, los es­

pectros mantuvieron sus aspectos vibraciona1 es y no hubo va­

riación en las intensidades.

Los espectros corregidos de excitación a

77°K presentan enerqías iguales que las de los mismos a 25°C,

lo que indica que el efecto de temneratura sobre el espectro

de absorción es nrácticamente nulo.

7 5

5.3.2 Efecto de temperatura sóbre la emisión de fosforescencia.

En la figura 22 se muestra la recta obte­

nida para el indol disuelto en etanol cuando se representa la

ecuación (25) en forma logarítmica en función de la inversa

de la temperatura.

El valor de la energía de activación encon

trado fue de 0,29 kcal/mol y el del nreexnonenci a 1 (k^) de

Figura 22. Representación gráfica de la aplicación de

la ecuación (25) para el indol en etanol.

76

6 INTE RP RETAC IOM

Por el análisis efectuado del espectro de

emisión del indol en ciclohexano, se asigna la transición 0-0

a la banda de mayor energía por coincidir con la oanda 0-0 en

absorción; este so 1apamien to es una confirmación de que los

estado de equilibrio fundamental y excitado tienen la misma

conformaci ón.

Si consideramos la transición 0-0 de ab­

sorción en el cristal a 34250 cm \ se observa que está des­

plazada 500 cm 1 hacia el rojo respecto a la absorción corres^

pondiente en solución.

Está bien establecido por estudios de sol

vación, que las transiciones en solventes no polares están co

rridas hacia mayores frecuencias respecto a transiciones en

el cristal cuando las moléculas de soluto tienen la misma con

formación de equilibrio que el estado cristalino.

El efecto de solvente no polar es prácti­

camente nulo y el nivel de emisión puede considerarse como un

nivel Franck-Condon , indicando también que el momento dipolari 4

de la transición L. <— A - es el mismo.o f

Además, el espectro de excitación corregí

do coincide en sus rasgos característicos con las dos transi­

ciones <— y <—4Ay y existe una relación especular

parcial con el espectro de emisión, el cual no carnoia en su

contorno con la longitud de onda de la excitación, lo que in­

dica la población de los dos niveles !La y

El desol azaini en to de la banda \ muestra a.

un corrimiento de 2500 cm’1, lo que está de acuerdo con lo es

tablecido por varios autores (3¿,37) respect0 a que e] moaen-

77

to dipolar de la transición es mayor que el de la ?L,a !o

De lo expuesto, se puede tomar como origen

de la banda L, a 34750 cm y de la banda a 34775 cm’^.o a

El origen de la banda es un valor ra­

zonable comparado con el dado por Mani y Lombardi

3b232 cm en su estudio del espectro electrónico del indol

en fase gaseosa, por lo que el solvente tendría el efecto de

correr la banda en aproximadamente 500 cm~^.

La banda \ de 36050 cm en absorción a

está en franca coincidencia con la banda ^L dada por Kadiri, a r

(30)Martinaud y Cazeau-Dubroca los cuales recientemente hi­

cieron un estudio de las bandas del indol a distintas tempera

turas.

El cromóforo metilado en posición 2 ó 3

demuestra pérdida de estructura en los espectros de emisión

en ciclohexano.

La banda 0-0 en indol se transforma en un

hombro con frecuencia muy cercana a la transición 0-0 en ab­

sorción, siempre corrida unos cientos de cm'^ hacia el azul

con respecto al cristal del indol; esto hace suponer que no

hay diferencias entre la conformación de equilibrio en el es­

tado cristalino del indol y estos derivados.

Las frecuencias vibraciona1 es correspon­

den aproximadamente a las del indol, el rendimiento de fluo­

rescencia es prácticamente el mismo y sólo se nota un ensan­

chamiento de la banda de emisión dando una indicación del so­

lapamiento de niveles superiores y de que existe un cambio en

la relación de los niveles que emiten.

El 2-metilindol presenta un corrimiento

de Stokes mayor que el 3-metilindol, lo que puede atribuirse,

78

además del efecto inductivo, a la posible interacción del

grupo metilo con los hidrógenos en posición 1 y 3, lo que da-

ría un balance de repulsión estérica y estabilización por re-

sonancia.

Para el 3-meti1indol . el origen de la banda :fL^ estaría en 34300 cm" 1 y e1 déla 'l

a en 33650 cm -1

Para el 2 -me ti 1 i n do 1 , el origen de la ban

da 1i L^ estaría en 34575 cm" 1 y e1 déla 'la en 34600 cm -1

Los espectros de emisión en etanol a tern-

pe ra tura amb i en te no poseen estructura ; por lo tanto es d i f í -

ci 1 extraer conclusiones de ellos.

Los rendimientos de fluorescencia a 77°K

se acercan a un valor parecido para todos ellos, lo que indi­

ca la eliminación del mismo tipo de proceso no radiativo.

El corrimiento hacia el azul puede deber­

se a que la matriz de vidrio bloquea parcialmente la rotación

del estado excitado y la emisión puede considerarse desde el

estado Franck-Condon.

La diferencia de 1250 cm"1 para el indol,

es una vibración del estado fundamental. La banda de mayor e-

nergía a 33850 cm"1 está separada 800 cm 1 de la banda a

34650 cm”1 del espectro de absorción en solución. El promedio

da un valor de 34250 cm"1, en coincidencia con la transición

0-0 del cristal, lo que indicaría una pérdida de la energía

por desactivación vibracional representada por 400 cm

El gran corrimiento de los máximos a las dos

temperaturas extremas estudiadas indica que la reorientación

del solvente a baja temperatura es parcialmente impedida.

Si se toma el origen de las bandas como

el promedio de los máximos de absorción y emisión da un valor

79

nara el indol a 25°C de 33550 cm’*, muy próximo a la vibración

de mayor energía del espectro de emisiÓrr a 77°K; nara el 2-me­

tilindol, 3-metilindol y el triptofa no el origen correspon

dería a 33225, 33050 y 32600 cm respectivamente.

En general, los espectros a baja tempera­

tura tienen una imagen especular con el espectro de absorción.

El espectro de emisión del trintofano a

77°K tiene una característica: pierde la estructura en la zo­

na de mayor energía de la banda, la frecuencia vibracional

que existe en los otros compuestos desaparece y el efecto de

temperatura es mucho mayor. Esto se manifiesta sobreponiendo

los espectros de emisión a las dos temperaturas, oudiendo así

observarse que a 77°K hay una contracción de la banda, lo que

no ocurre en los demás compuestos. Además, el espectro es la

réplica especular de la región identificada como en el es

pectro de absorción, indicando que este estado es el mayor e-

mi s or .

Salvo esta característica del trintofano,

los demás compuestos tienen espectros de emisión muy semejan­

tes en solventes no polares a 25°C y polares a 77°K.

Comparando los tiempos de vida radiativa

y los obtenidos por absorción (tabla 10 y 11) se observa que

sólo guarda relación con la polaridad del solvente: aumen

ta en etanol y es del mismo orden para los diferentes comoues^

tos en cada solvente; mientras que'Up, por el contrario, mués

tra una disminución cuando se nasa de ciclohexano a etanol .

En ciclohexano se observa que Tp es mayor

quet° : unas seis veces en indol y aproximadamente el doble en

I os otros deri vados.

En cambio, en etanol y son anro-

80

ximadamente del mismo orden para el indol suponiéndose que lo

mismo ha de suceder para los otros derivados.

La diferencia encontrada para el indol en

ciclohexano puede interpretarse que las transiciones que invo­

lucra la fluorescencia emiten en una relación distinta a la

que corresponde a las fuerzas de los osciladores en absorción.

Además, esto está de acuerdo con la imagen

especular parcial que se ha encontrado entre los dos espectros

a que se ha hecho referencia en la sección 5.2.

En solvente polar como etanol, el despla­

zamiento masivo de la banda hacia mayor longitud de onda

colocaría a esta banda a menor energía que la ^L^» de ahí que

la emisión podría considerarse proveniente principalmente de

esta transi ci ón .

La energía de activación del triptofano

en alcohol respecto del proceso de apagado de la emisión, en

el orden de temperatura estudiado, indica una constante de ve_

locidad (tabla 12) mayor que la de los otros compuestos, pero

dentro del orden de la constante de velocidad de la fluores­

cencia .

El valor del factor de frecuencia es de

1011 para el triptofano y 109 para los otros compuestos. El

valor de 1011 se aproxima más a los procesos permitidos que

a los prohibidos; por lo tanto, esta energía de activación co

rrespondería a la desactivación por conversión interna (kp)

involucrando algún modo vibracional del estado excitado, cami_

no que lleva a una disminución del rendimiento de fluorescen­

cia.

El triptofano presenta el menor valor de

en un medio como etanol y conjuntamente el menor valor de

di

4>f (tabla 11).

Teniendo en cuenta que el rendimiento y

decaimiento de la fosforescencia de los compuestos son prácti

camente iguales, los dos caminos posibles de desactivación se

rían k y k ; si se aplica la fórmula

de <$>t.

La diferencia de energía entre el primer

estado singlete excitado y el primer estado triplete da un va_

lor de aproximadamente 8000 cm"^ para todos los compuestos.

La energía de activación calculada dió

100 cm 1 (0,29 kcal/mol) con un factor de frecuencia muy pe­

queño. La separación entre los niveles singlete (sp y triple-

te (T|) es un valor grande para que el proceso de transferen­

cia de energía s ea di recto al nivel T^; por lo tanto debe exis­

tir un nivel superior con modos vibraciona1es solapados con

los de o , lo cual facilita este tipo de transferencia,

explicándose así que el rendimiento de fosforescencia sea

igual en todos los compuestos. Asimismo, el bajo valor de la

energía de activación indica una desactivación independiente

de la temperatura —>SQ.

Los valores obtenidos de los picos e in­

flexiones en los espectros de estos compuestos se han compara­

do con el espectro Raman del indol dado por Heckman y

con el espectro del cristal dado por Zuclich (tabla 15).

Las frecuencias vibraciona1es que corresponderían al estado

fundamental son las mismas, lo que indicaría que el efecto de

la sustitución no afecta la conformación de este estado. La

ello indicaría un incremento

82

frecuencia más fuerte, de 1600 cm‘^, para indol corresponder

a la vibración OC del ciclo bencénico dado por Bellamy

aunque la vibración de deformación del grupo >.*iH tiene la

misma energía.

Tabl

a 15. Com

para

ción

de la

s frec

uenc

ias v

ibra

cion

a1 e

s obte

nida

s para

el in

dol y

deriv

ados

con las

de

l cris

tal de

indol

y de

l espe

ctro

Raman

(40).

d4

CONCLUSIONES

La investigación sobre la polarización d

la absorción y la emisión del indol, realizada por varios au( 3 4 9 )tores * ’ , y el estudio efectuado por nosotros sobre 1

espectros de excitación correqidos (absorción) que can una i

magen especular respecto al de emisión, es un argumento más

que confirma que los dos niveles están emitiendo simultánea­

mente.

El cambio de la frecuencia de excitación

no altera la distribución de intensidades de los esnectros y

además las medidas experimentales realizadas por varios auto

res que han encontrado una curva exponencial de decaimiento

de la fluorescencia, todo lo cual concurre a concluir que e-

xiste un estado de equilibrio térmico entre los niveles

y en todos los compuestos estudiados.

La absorción de luz en estos derivados

conduce a la población de dos estados muy cercanos energetic

mente de una dada multiplicidad ñor lo que presentan nroniec

des luminiscentes que no son comunes a todas las moléculas.

Los fenómenos de emisión pueden ser renr

sentados por medio de dos procesos: uno desde un estado Frar

Condon, que se produciría en solventes no polares o polares

estado vitreo, y otro que se produciría en solvente nolar a

temperatura ambiente, donde hay una fuerte reorientación del

mismo con el estado ^L .a

Si se supone que se alcanza el equilibri

a través de una coordenada de relajación vibracional y una c

ordenada función de la reorientación del solvente, los procc

sos se pueden representar, sin hacer distinción entre los es

85

tados, de la siguiente manera:

en ciclohexano o en solventes polares en estado vitreo y

en solventes polares a temperatura ambiente.

r representa la coordenada de reorientación por el solvente

y v la de relajación vibracional.

En sol ven tes no polares, la banda de absor

ción a mayor energía está compuesta por

po r

dos frecuencias viora-

850 cm 1. Esta bandacionales bien definidas y separadas

asignada a la transición es bi

po cromóforo y resiste cualquier perturbación por efecto del

en es pee i fi ca del gr u-

solvente o temperatura (según se lo na comprobado por medio

del espectro de excitación). La modificación de esta banda en

el solvente polar es debida al corrimiento que sufre la tran­

sición IL^ <— 7A al ser perturbada por solvente o sustitución,

lo que la hace solapar en mayor o menor medida hasta un punto

tal que esta transición puede llegar a ser la de menor energía.

Las características de los espectros y los

parámetros derivados de la fluorescencia son propiedades úti­

les para controlar los cambios que ocurren en el medio que ro­

dea a las proteínas, principio de aplicación en el campo bio­

lógico, ya que ellas presentan las propiedades luminiscentes

del aminoácido del cual derivan.

De los resultados obtenidos se puede infe­

86

rir que el mejor solvente de los dos usados para el estudio

de estos derivados es el etanol cuando se trabaja a 77°K. A

esta temperatura la sensibilidad de la emisión es diez veces

superior a la de la temperatura ambiente y cien veces respec­

to a la que se alcanza en absorción.

Los espectros de fluorescencia a 77°K son

característicos de cada derivado, con máximos de emisión d i f £

rentes para cada uno de ellos y son análogos a los que se ob­

tienen en solventes no polares a tempera tura ambiente.

Los máximos de emisión en etanol a tempe­

ratura ambiente son también carae terísti eos de cada derivado.

El efecto de apagado por I sobre el ren­

dimiento de la fluorescencia a temperatura ambiente, con una

constante de Stern-Vo 1 mer determinada, es un elemento más de

juicio para la identificación de los compuestos.

La característica que iiiani fiesta el

de yoduro, a diferencia de los

Ltriptofano de mantener constante el valor del rendimiento

de fluorescencia en presencia

otros derivados considerados, permitiría desarrollar un méto-

do analítico de de te rmi n ac i ón de aquél en presencia de alguno

de los otros.

Los espectros luminiscentes han permitido

obtener una serie de parámetros asociados con el estado exci­

tado de los compuestos estudiados (tabla 16). Sobre la oase

de ellos, se representan en la figura siguiente los valores

obtenidos para la molécula del L_jtriptofano en etanol.

88

89

APENDICE

Programa CINEF

C INEF CEFIMCICN DE VAR IABLES

NPUNT : NUMERO OE PINTOS DE LA CURVA CE CALIERACICNFOTCT : TIPO DE FOTOTUBOFC : FACTORES DE COFRECCICNRLC : LONG. DE ONDA DE LCS FACT. DE CCRRECCICNNPROBL : NUMERO DE PROBLEMA (IDENTIF ICATCRIC)ITERM : NUMERO DE PUNTOS DEL ESPECTRO PRCBUERAFUI : INTENSIDAD DE FLUORESCENCIARUF : UONG. DE ONDA DE FLUORESCENCIANOTA : UOS VAUORES DE UAS VARIABUES DEBEN SER INTPOCUCIDOS EN ORDEN DECRECIENTE DE LONGITUDES DE ONDA

90

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