Caracterización de Macromoléculas

Técnicas para la determinación del Peso Molecular, Tamaño Molecular y Estructura Molecular

 La determinación precisa del Peso Molecular es una

componente clave de todos los experimentos de caracterización macromolecular. Por ejemplo, para proteínas, la determinación del peso molecular confirmará el nivel de purificación y aislamiento de la proteína y el grado de agregación. Para polímeros, el peso molecular, es un determinante fundamental de muchas propiedades físicas como la rigidez, resistencia, viscoelasticidad y dureza. Malvern Instruments proporciona soluciones adecuadas para la determinación del peso molecular, tamaño molecular y estructura molecular de todos los tipos de macromoléculas - desde una

rápida estimación del peso molecular de una proteína usando unos pocos µl de muestra a la caracterización completa de la distribución de pesos moleculares y conformación de polisacáridos complejos o polímeros sintéticos. Gel Permeation Chromatography/Size Exclusion Chromatography (GPC/SEC) es la mejor técnica para la caracterización rápida y real del peso y estructura molecular para todo tipo de macromoléculas - proteínas, polímeros naturales y sintéticos. Sea su interés en un sistema completo o en un detector adicional para mejorar un sistema, Malvern ofrece la gama más completa para todas las necesidades de caracterización GPC/SEC de sus macromoléculas. En el corazón de éste conjunto están los sistemas GPC/SEC de Viscotek, incluyendo el

potente sistema "TDAmax" con el software "OmniSEC". Proteínas          Polímeros

Peso molecular absolutoComposición oligomérica y agregación Tamaño de proteína y densidadComposición conjugadaSegundo coeficiente virial

 

Peso molecular absolutoDistribución de peso molecularRamificación y estructuraTamaño molecularComposición del copolímero

Para el caso de polímeros sintéticos y macromoléculas naturales desnaturalizadas, consistentes en general en moléculas carentes de estructura específica, se puede decir que las fuerzas intramoleculares son muy débiles. Como consecuencia existirán muchas configuraciones (ó conformaciones) posibles para la molécula, que posean la misma energía, y que por consiguiente son igualmente probables. La situación se presta a definir parámetros relativos al tamaño y estructura, de carácter estadístico: distancia media extremo-extremo, y radio de giro medio

 

Estas magnitudes se pueden calcular teoricamente para un modelo teórico: el “random coil” ó cadena aleatoria, también denominado ovillo estadístico. El modelo se construye teóricamente utilizando “monómeros” teóricos, o eslabones de la cadena, que podrían ser de una longitud equivalente al enlace, ó molécula que se repite para construir la macromolécula. Cada eslabón se une al anterior adoptando una orientación al azar, salvo por las restricciones impuestas por los enlaces químicos. El resultado final es un ovillo aleatorio, ó “random coil” 

La distancia media extremo-extremo  se define como la raiz cuadrada de la media de los cuadrados de las distancias extremo-extremo (marcada en la

figura con una linea discontinua para una configuración particular): <h> = ( <h2> ) 1/2

El radio de giro medio = RG = ( <R2> )1/2, siendo R =  mi ri2 / mi, donde mi es cada elemento de masa separado a una distancia ri del centro de masas de la molécula. Los resultados teóricos del tratamiento estadístico del “random coil” resultan en fórmulas que nos dan la distancia media extremo-extremo y el radio de giro medio. Para la distancia se obtiene <h> = cte Ma. Donde cte es una constante que depende de la longitud del “monómero” utilizado en la construcción teórica, de los ángulos de enlace que se hallan permitido, y del tipo de interacciones que existan con el disolvente, y a es una constante que oscila entre 0.6 y 1, dependiendo de la “flexibilidad” admitida para el polímero. Ambas constante se pueden medir experimentalmente, sobre todo a partir de medidas de viscosidad, de forma que se pueden contrastar siempre los resultados teóricos con las medidas experimentales. Una fórmula explicita relaciona la distancia media extremo-extremo y el radio de giro medio: RG = <h2> / 6.

Microscopía (o también sin tilde «microscopia»)1 es el conjunto de técnicas y métodos destinados a hacer visible los objetos de estudio que por su

pequeñez están fuera del rango de resolución del ojo normal.

Si bien el microscopio es el elemento central de la microscopía, el uso del mismo se requiere para producir las imágenes adecuadas, de todo un

conjunto de métodos y técnicas afines pero extrínsecas al aparato. Algunas de ellas son, técnicas de preparación y manejo de los objetos de estudio,

técnicas de salida, procesamiento, interpretación y registro de imágenes, etc.

Exceptuando técnicas especiales como las utilizadas en microscopio de fuerza atómica, microscopio de iones en campo y microscopio de efecto túnel, la

microscopía generalmente implica la difracción,reflexión o refracción de algún tipo de radiación incidente en el sujeto de estudio.

Microscopía óptica (microscopía de luz clásica), consiste en hacer pasar luz visible de una fuente (difractada,reflejada o refractada en el sujeto de estudio) a través de lentes ópticos simples o

múltiples, para lograr una vista ampliada de la muestra.2

 La imagen resultante puede ser detectada directamente por el ojo humano, impresa en una placa fotográfica o registrada y mostrada

digitalmente (y eventualmente almacenada en algún soporte digital). En la fig. mo1 puede verse un microscopio estereoscópico (adecuado principalmente para una visión binocular directa).

Imágenes de microscopio electrónico :

Fibra de poliester(MEB).  

Granos de polen(MEB).  

Imagen de Diatomea5000X (MEB).  

Nemátodo parásito de la soja con falso color (MEB).  

Cabeza una hormiga (MEB).  

Fibra de amianto(MEB).  

Ojo de Euphausia superba (MEB).  

Cuerpo de unamosca de la fruta(MEB).  

Ojo de una mosca de la fruta (MEB).  

Sangre humana (MEB).  

Microscopia electrónica de barrido (SEM).

Estructuras cristalinas.Estructuras de fracturas.

Estructuras en perfiles y películas.Estudio de inclusiones, aglomerados y huecos

en matrices poliméricas.

Microscopia electrónica de transmisión (MET).Estudio de la forma de cristales.

Estructuras fibrilares.

Difracción de rayos X (DRX). Porcentajes de cristalinidad.

Medida de dimensiones de cristales.Estudio de fases en mezclas poliméricas.

Agregados moleculares.

A modo de resumen muy general, podemos decir que desde un punto de vista estructural existen dos tipos de macromoléculas: Aquellas que en disolución no adoptan una conformación definida, y que en estado sólido forman sólidos amorfos, ó sólo parcialmente cristalinos; y aquellas que adoptan configuraciones concretas (a-hélices, láminas , etc.,), perfectamente definidas, y consecuencia de fuerzas intramoleculares específicas. Al primer tipo pertenecen la mayor parte de los polímeros sintéticos, mientras que las macromoléculas naturales en estado nativa suelen pertenecer al segundo. Una característica de estas últimas es que son susceptibles de desnaturalización en el laboratorio, convirtiéndose generalmente en macromoléculas del primer tipo, carentes de estructura definida.

Microscopía Electrónica , aplicaciones avanzadas e imagen tridimensionalEste microscopio electrónico permite la localización y reconstrucción tridimensional a nivel ultraestructural, tanto empleando muestras incluidas en resinas como criomuestras. Por ello, no sólo es de aplicación en áreas relacionadas con la morfología como la reconstrucción 3D de orgánulos celulares sino que también es de interés en la caracterización de macromoléculas en áreas relacionadas con bioquímica y biología molecular.

MICROSCIPIA 

1.0 Generalidades El microscopio hizo posible conocer los mundos de dimensiones ínfimas, entre ellos la célula, base de la vida. Los microscopios son aparatos que, en virtud de las leyes de formación de imágenes ópticas aumentadas a través de lentes convergentes, permiten la observación de pequeños detalles de una muestra dada que a simple vista no se percibirían. Surge en el siglo XVII los microscopios compuestos, utilizados por el holandés Antonie van Leewenhock en el estudio de la microfauna de los estanques y charcas, unidas a las de Robert Hooke, establecieron la microscopia como poderosa herramienta científica. Zacharias y Hans Janssen construyeron en los años 1590's el primer microscopio registrado.

2.0 Tipos de Microscopios Optico Confocal Electrónico de Transmisión Electrónico de Barrido Microscopía de campo próximo - De barrido efecto túnel - De fuerzas atómicas Microscopio estereoscópico

Campo claro :La muestra se observa más oscura que el campo que la rodea. Campo oscuro: Posee un condensador paraboloide, hace que los rayos luminosos no penetren directamente en el objetivo, sino que iluminan oblicuamente la preparación. De contraste de fase: Se basa en modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, los cuales producen contrastes notables en la preparación. De fluorescencia: La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir luz propia cuando inciden sobre ellas radiaciones energéticas, tratar el material biológico con flurocromos facilita la observación al microscopio . Tipos de Micoscropio óptico

La muestra se observa más oscura que el campo que lo rodea. Microscopio de campo claro

La muestra se observa brillantemente iluminada sobre un fondo oscuro. Microscopio de campo oscuro

Microscopio de contraste de fases Se observa una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad. El material denso aparece brillante, mientras que las partes de la célula que tienen una densidad cercana al agua (citoplasma) aparecen oscuras. Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar microorganismos.

Microscopio óptico de fluorescencia Una molécula que fluorece emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz ultravioleta. Microscopio compuesto modificado con una fuente de radiaciones ultravioletas y un filtro. Se usan colorantes que emiten luz visible cuando se bombardean con rayos UV.

Microscopio confocal Se usa para estudiar la estructura de los materiales biológicos. Emplea un sistema de iluminación con rayo láser que es muy convergente y, en consecuencia produce un punto de barrido muy poco profundo. Se utiliza un sistema de espejos para mover el rayo láser a través del espécimen, iluminando un solo punto por vez. Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con este rayo móvil y se guardan en una computadora. Luego se puede llevar la imagen a un monitor de alta resolución. Este método tiene la ventaja de que se pueden tomar imágenes de la muestra en cortes muy finos. Las regiones fuera de foco se restan de la imagen mediante un programa para dar una definición máxima a la imagen. Es posible también crear imágenes múltiples a diferentes profundidades dentro del espécimen y realizar reconstrucciones tridimensionales.

En 1932, Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio electrónico a base de lentes electrostáticas, ese mismo año Knoll y Ruska dan a conocer los primeros resultados obtenidos con un microscopio electrónico Siemens, construido con lentes magnéticas. Así nace el microscopio electrónico, en 1936 ya se ha perfeccionado y se fabrican microscopios electrónicos que superan en resolución al microscopio óptico. Utiliza un flujo de electrones en lugar de luz. Consta fundamentalmente de un tubo de rayos catódicos, en el cual debe mantenerse el vacio. Microscopio Electrónico

Permiten estudiar la estrutura celular. La resolución y el aumento son mayores. Los virus, y los objetos más pequeños, como las macromoléculas solamente pueden verse a través del microscopio eléctronico. El Microscopio electrónico consta de: * Un filamento de tungsteno (cátodo) que emite electrones. * Condensador o lente electromagnética, que concentra el haz de electrones. * Objetivo o lente electromagnética, que amplía el cono de proyección del haz de luz. *Ocular o lente electromagnética, que aumenta la imagen. *Proyector o lente proyectora. que amplía la imagen. * Pantalla fluorescente, que recoge la imagen para hacerla visible al ojo humano. Aplicaciones

Microscopio Electrónico de Transmisión Utiliza un chorro de electrones en lugar de luz visible para definir el objeto. Requiere que se aumente el contraste por sombreado metálico utilizando un metal pesado. Pasos para la preparación de rutina de los especimenes en la microscopia electrónica de transmisión Fijación con glutaraldehído. Lavado con un buffer. Fijación con tetróxido de osmio. Fijar piezas detejidos no mayores de 1mm 3 Microfotografía electrónica de Transmisión de paredes celulares.

Microscopio electrónico analítico de transmisión de alta resolución JEOL-2000 FXII Permite observaciones de hasta 0,28 nm. de resolución. Puede focalizar el haz de electrones hasta 2 nm. de diámetro y trabaja con voltajes de aceleración variables de 20 a 200 kV. Lleva acoplado un sistema computerizado de análisis de energía de rayos

X dispersados eXL-10 de LINK ANALYTICAL que permite determinar la composición química de la microregión sobre la que se focaliza el haz electrónico. Aumentos entre 5 000X y 1 000 000X

Microscopio Electrónico de Barrido Bombardea la superficie del espécimen con un rayo de electrones. Produce imágenes con una profundidad aparentemente tridimensional. Técnica versátile para la visualización y el análisis de las características microestructurales de muestras sólidas(elevada resolución es 2nm y campo de resolución) . Técnica de interés en campos como :Medicina, Biología, Ciencias de Materiales, Metalurgia, Arqueología, etc. Microfotografía electrónica de Barrido de paredes celulares.

Microscopio de fuerzas atómicas Instrumento mecánico- óptico que detecta fuerzas a nivel atómico (del orden de los nanoNewton) a través de la medición óptica del movimiento sobre la superficie. Obtiene imágenes tridimensionales de la superficie de muestras (Sin preparación especial de las muestras). Lleva acoplado un microscopio óptico( permite la visualización del conjunto punta-muestra y poder situar la punta sobre una zona determinada de la muestra). Distingue detalles en la superficie de la muestra con una amplificación de varios millones( Resolución de menos de 1nm). Aplicaciones Análisis de: Cristales de aminoácidos. ADN y ARN Complejos Proteína - ácidos nucleicos. Cromosomas. Membranas celulares. Proteínas y pépticos Cristales moleculares. Polímeros y biomateriales Componentes de las membranas de la célula.

Microscopio de barrido efecto túnel Forma parte de los instrumentos llamados 'nanoscopios‘( visualiza objetos del tamaño de nanómetros (10 a la menos nueve metros). Inventado en 1981 por G. Binning y H. Röhrer, (IBM, Zurich) (galardonados con el Premio Nobel de Física en 1986 por su invención). Dispone de una aguja tan afilada que en su extremo sólo hay un átomo. La punta se sitúa sobre el material y se acerca hasta la distancia de 1 nanómetro (10 a la menos 9 metros). Una corriente eléctrica débil genera una diferencia de potencial de 1 voltio. Al recorrer la superficie de la muestra, la aguja reproduce la topografía atómica de la muestra. Aplicaciones Imágenes atómicas de moléculas de ADN. Mover átomos individuales. Mapas precisos de superficies de metales o de semiconductores, cada átomo puede distinguirse de su vecino.

Microscopio estereoscópico Visión tridimensional de los objetos, para observaciones que requieren pequeños aumentos

3.0 Partes del micoscropio óptico

Partes del microscopio óptico. SISTEMA MECANICO Píe Brazo Tubo Lugar donde se deposita la preparación. Platina Base sobre la que se apoya el microscopio. Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al pie. Forma cilíndrica En su extremidad superior se colocan los oculares. (Es ennegracido internamnete para evitar los reflejos de luz).

Platina:Presenta un orificio en el eje óptico del tubo que permite el paso de los rayos luminosos a la preparación,puede ser fija, en cuyo caso permanece inmóvil; en otros casos puede ser giratoria, es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares. Escala Pinza

SISTEMA MECANICO Revólver Pieza giratoria en los cuales se enroscan los objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos .

SISTEMA DE Mecánico Tornillo micrométrico Tornillo macrométrico Freno. Aproxima el enfoque,permite un enfoque rápido de la preparación. Se logra el enfoque exacto y nítido de la preparación Tornillos de enfoque

SISTEMA ÓPTICO Oculares: Los oculares están constituidos generalmente por dos lentes, dispuestas sobre un tubo corto . Objetivos: Producen aumento de las imágenes de los objetos y organismos. Partes del microscopio óptico. Sistema de lentes

SISTEMA ÓPTICO Objetivos Partes del microscopio óptico. Están colocados en el revolver. Tienen un sistema de amortiguación. Un anillo coloreado indica los aumentos. Poseen un aumento de 4x, 10x, 40x y 100x aumentos. Sistema de lentes:

SISTEMA ÓPTICO Objetivos Partes del microscopio óptico. Sistema de lentes: Rojo 4x Amarillo 10x Blanco 100x (Inmersión) Azul 40x amortiguación

SISTEMA ÓPTICO Partes del microscopio óptico. Sistema de lentes: Están colocados en la parte superior del tubo. Poseen un aumento de 10x, 15x y 20x. Oculares

SISTEMA ÓPTICO Objetivos Partes del microscopio óptico. ACEITE DE INMERSIÓN Sistema de lentes: Hoy no son de madera de cedro, sino sintéticos. Los hay de baja, media y alta viscosidad. Su empleo es imprescindible con el objetivo de inmersión (100x).

SISTEMA ÓPTICO Sistema de Iluminación: Fuente de luz Condensador Partes del microscopio óptico. Diafragma Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

SISTEMA ÓPTICO Fuente de luz Partes del microscopio óptico. Suele ser una lámpara halógena de intensidad graduable. Se enciende y apaga con un interruptor. En el exterior puede tener un filtro. Sistema de Iluminación: lámpara Interruptor graduación de la luz Filtro

SISTEMA ÓPTICO Condensador Partes del microscopio óptico. Concentra la luz de la lámpara en un punto de la preparación. Sistema de Iluminación: condensador Diafragma o iris Dentro del condensador. Al cerrarse mejora el contraste, pero empeora la resolución. diafragma

4.0 Pasos a seguir para su uso. Conectar el microscopio a la corriente eléctrica. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente.(Si se recogio correctamente ya debe estar en esas condiciones). Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. Encender la fuente de luz con la intensidad mínima y se va aumentando poco a poco. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.

Pasos a seguir para su uso. 6. Para realizar el enfoque: Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico( Mirando directamente y no a través del ocular, se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación y dañar ambos). Mirando, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el

macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. 7. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 5.

Pasos a seguir para su uso. 8. Empleo del objetivo de inmersión: Bajar totalmente la platina. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de 40x. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

Pasos a seguir para su uso. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo. Finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. Se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio. - Apagar el equipo y desconectarlo de la corriente.

Aumento Poder de resolución Límite de resolución Número de campo Profundidad de campo Contraste 5.0 Parámetros Ópticos.

Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular. 40 x 10 x 400x 5.1 Aumento

Es la capacidad del instrumento para dar imágenes distintas de puntos situados muy cerca uno del otro en el objeto. Depende de: la long. de onda (?) y de la apertura numérica (AN). 5.2 Poder de resolución R AN 0.61 ? Es la capacidad de reunión de la luz de objetivo, también se encuentra grabada en la manga del lente.

Es la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para que puedan ser discriminados como tales. El Límite de Resolución es la inversa del Poder de Resolución, de manera que cuanto mayor sea éste, menor será el Límite de Resolución. 5.3 Límite de resolución Límite de Resolución Poder de Resolución 1

Es el diámetro de la imagen observada a través del ocular, expresado en milímetros. 5.4 Número de campo Espesor de la preparación enfocada en cualquier momento. 5.5 Profundidad de campo

Diferencia de absorción de luz entre el objeto y el medio Puede aumentarse con las tinciones. 5.6 Contraste

6.0 Mantenimiento del microscopio El microscopio debe estar protegido del polvo, humedad y otros agentes que pudieran dañarlo .( Guardado en estuche, campana y otros). Las partes mecánicas deben limpiarse con un paño suave.( Humedecer el paño con Xilol si se ha trabajado con aceite de inmersión). La limpieza de las partes ópticas requiere precauciones especiales. Nunca deben tocarse las lentes del ocular, objetivo y condensador con los dedos. Para guardarlo se acostumbra colocar el objetivo de menor aumento sobre la platina y bajado hasta el tope; el condensador debe estar en su posición más baja, para evitar que tropiece con alguno de los objetivos . Guardar en lugares secos, para evitar que la humedad favorezca la formación de hongos. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina,

revólver y condensador). El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular. Mantener seca y limpia la platina del microscopio

7.0 Conclusiones El Microscopio es: un instrumento que se utilizan para obtener una imagen aumentada de objetos minúsculos o detalles muy pequeños de los mismos. El microscopio simple o lente de aumento es el más sencillo de todos y consiste en realidad en una lupa que agranda la imagen del objeto observado. Dos lentes convexas bastan para construir un microscopio. Cada lente hace converger los rayos luminosos que la atraviesan. Una de ellas, llamada objetivo, se sitúa cerca del objeto que se quiere estudiar. La imagen es observada por la segunda lente, llamada ocular, que actúa sencillamente como una lupa. Zacharias y Hans Janssen construyeron en los años 1590's el primer microscopio registrado. En 1932, Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio electrónico a base de lentes electrostáticas. Los virus, y los objetos más pequeños, como las macromoléculas solamente pueden verse a través del microscopio eléctronico. 

Leer más: http://www.monografias.com/trabajos91/microscopia/microscopia.shtml#ixzz2yKpRJh5a

Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar ampliaciones hasta 5000 veces más potentes que los mejoresmicroscopios ópticos, debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones "visibles".

Tipos de microscopios electrónicos

(1) carcasa, (2) emisor de electrones, (3) electrones, (4) cátodo, (5) ánodo, (6) Lente condensador, (7)

muestra analizada, (8) Lente objetivo, (9) Lente proyector, (10) Detector (sensor o película fotográfica).

Existen dos tipos principales de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de

transmisión y el microscopio electrónico de barrido.

Microscopio electrónico de transmisión[editar]

Artículo principal: Microscopio electrónico de transmisión

El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto cuya

imagen se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y

otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio

electrónico de transmisión debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles

de ángstroms. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar la imagen de un

objeto hasta un millón de veces.

Microscopio electrónico de barrido (MEB)[editar]

Imagen de una hormiga tomada con un MEB (microscopio electrónico de barrido).

Artículo principal: Microscopio electrónico de barrido

En el microscopio electrónico de barrido (MEB) la muestra es recubierta con una capa de metal

delgado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la cantidad de

electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar

figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolución está entre 3 y 20

nm, dependiendo del microscopio. Permite obtener imágenes de gran resolución en materiales

pétreos, metálicos y orgánicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por

electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie.

La microscopía electrónica es una técnica que requiere instrumentos de alta complejidad y personal altamente especializado. Se utilizan la microscopía electrónica de transmisión o convencional y la de barrido.

Las muestras para microscopía electrónica deben fijarse en glutaraldehído, que se solicita al laboratorio de Anatomía Patológica con las instrucciones para la toma y fijación de la muestra. Los fragmentos deben ser pequeños y tienen que fijarse en forma de varios trocitos cuboideos de tejido de no más de 1 mm, obtenidos con hoja de afeitar o bisturí limpios. Las muestras se incluyen en resinas sintéticas (Epon) y se practican cortes 10 veces más delgados que los de microscopía de luz llamados cortes ultrafinos. La tinción se realiza con sales de metales pesados como citrato de plomo, tetróxido de Osmio o acetato de uranilo, que permiten un contraste adecuado del tejido bajo el haz de electrones. Los cortes ultrafinos se montan sobre grillas de cobre, se tiñen y se observan al microscopio electrónico. Para documentar los hallazgos es necesario obtener fotografías en blanco y negro de las preparaciones. Las grillas, muestras, inclusiones y fotografías se guardan en un archivo especial durante años.

 

Microscopía electrónica de transmisión

En esta técnica la preparación teñida es traspasada por un haz de electrones, lo cual proporciona la imagen ultrafina sobre una pantalla ad hoc. El microscopio electrónico de transmisión es capaz de generar un haz de electrones a alta tensión (80kV) y concentrarlo sobre la preparación mediante un complejo sistema de campos electromagnéticos equivalentes a las "lentes" del microscopio de luz.

La mayor utilidad de la microscopía electrónica de transmisión es en Oncología. Es particularmente útil en el diagnóstico de neoplasias malignas, ya que permite identificar la estirpe o diferenciación de una neoplasia. Por ejemplo, al demostrar elementos de diferenciación no apreciables a microscopía de luz como desmosomas, propios de células epiteliales, que orientan hacia carcinoma; microvellosidades bien desarrolladas, que sugieren adenocarcinoma; melanosomas en melanoma y gránulos densos rodeados por membrana en carcinoma neuroendocrino.

En conjunto con la inmunohistoquímica permite identificar un alto procentaje de las neoplasias malignas (95%). Igualmente, en el diagnóstico diferencial de metástasis tumor

maligno indiferenciado en ganglio linfático ( melanoma maligno, carcinoma, linfoma). En el frecuente dilema adenocarcinoma versus mesotelioma maligno pleural; también en el diagnóstico de la granulomatosis de células de Langerhans.

Esta técnica juega un papel muy importante en el estudio de las enfermedades del riñón, en particular en glomerulopatías primarias y secundarias. Junto con la inmunofluorescencia directa representan el estudio básico para llegar a un diagnóstico preciso en cada caso.

Otras aplicaciones son la identificación de partículas virales intranucleares y citoplasmáticas. También en enfermedades metabólicas para estudiar el tipo de inclusiones o cuerpos de inclusión en las células afectadas (Niemann-Pick, Tay-Sachs, amiloide, etcétera). En enfermedades ampollares de la piel es el único método para diferenciar variedades de epidermólisis bulosa congénita.

En ciertas enfermedades respiratorias se ha detectado un trastorno importante del transporte mucociliar. Ultraestructuralmente, se observan cilios con alteraciones en número y disposición del esqueleto ciliar microtubular y ausencia de los brazos internos de dineína y de las espículas radiales del esqueleto microtubular constituyendo el llamado síndrome de cilios inmóviles o disquinesia ciliar. Estas anomalías representan un trastorno de carácter congénito y la microscopía electrónica es el único método que permite hacer un diagnóstico preciso en estos pacientes.

En muchos casos la información negativa, o sea la ausencia de algún carácter morfológico específico, puede ser también muy útil . El examen cuidadoso y la evaluación de las características ultraestructurales a la luz del cuadro clínico y la imagen histopatológica al microscopio de luz y los estudios inmunohistoquímicos, permiten un diagnóstico de certeza en la mayoría de los casos.

 

Microscopía electrónica de barrido

La microscopía electrónica de barrido permite el estudio de superficies celulares. La imagen se obtiene rastreando la superficie de la muestra con un haz electrónico ultrafino. Las señales generadas se recolectan, amplifican y captan en un tubo de rayos catódicos. Se utiliza en forma rutinaria en el estudio de enfermedades del tallo piloso. En estas condiciones hay anomalías estructurales y de superficie de los pelos, que pueden identificarse fácilmente con esta técnica. De esta forma, es posible incluso establecer un pronóstico de reversibilidad de las alteraciones utilizando esta técnica.

Microscopio óptico

Microscopio óptico.Descripción:A) ocular, B) objetivo, C) portador del objeto,D) lentes de la iluminación, E) sujeción del objeto, F) espejo de la iluminación.Un microscopio óptico es un microscopio basado en lentes ópticos. También se le conoce

comomicroscopio de luz, (que utiliza luz o "fotones") o microscopio de campo claro. El

desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Los

microscopios de Leeuwenhoek constaban de una única lente pequeña y convexa, montada

sobre una plancha, con un mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (la

muestra o espécimen). Este uso de una única lente convexa se conoce como microscopio

simple, en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos ópticos.