micrornas micrornas silvia juliana serrano gómez bsc, msc coordinadora ficmac-lab
TRANSCRIPT
microRNAsmicroRNAs
Silvia Juliana Serrano Gómez BSc, MScCoordinadora FICMAC-Lab
Dogma central de la biología molecularDogma central de la biología molecular
TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓNARN: Acido Ribonucleico
• Tipos de ARN• mARN: Mensajero• Ribosomal RNA (rARN)• tranferenciaRNA (tARN)
ADN Vs. ARNADN Vs. ARN
ACIDOS NUCLEICOS: Grupo fosfato, azúcar y base nitrogenada.
Transcipcion genicaTranscipcion genica
ADN moldeRegión de transcripción - Promotor
Factores de transcripción
ARN Polimerasa
Generación de mARNGeneración de mARN
Splicing del mRNA
Generación de mARNGeneración de mARN
Traducción del ARNTraducción del ARN
Que es un microRNA?Que es un microRNA?
• Familia de pequeños ARNs (Small RNAs)
Secuencias de cadena sencilla no codificantes de ARN de aproximadamente 22 nucleotidos (nt) que regulan la expresión génica.
Pasos para la generación de un microRNA
1. Gen codificante de microRNA Transcrito de 70nt
2. Pre-miRNA forma estructura de tallo-orquilla (Stem-loop)
3. Pre-miRNA es procedaso por DICER en un miRNA de 21 – 25nt
microRNAsmicroRNAsComo regulan la Como regulan la expresiónexpresión génicagénica??
1. miRNA tiene complementariedad perfecta a secuencia target degradación del mRNA: RNAi
INHIBICION A NIVEL TRANSCRIPCIONALINHIBICION A NIVEL TRANSCRIPCIONAL
2. Unión imperfecta del miRNA al mRNA
INHIBICION A NIVEL POS-TRANSCIPCIONAL INHIBICION A NIVEL POS-TRANSCIPCIONAL (TRADUCCION)(TRADUCCION)
Como regular la expresión génicaComo regular la expresión génicaBiogénesis de los microRNAsBiogénesis de los microRNAs
RNAiRNAi
Precursor largoPrecursor largo
RNAse IIIRNAse III
70 nt
RNAse IIIRNAse III
Regulación génica
Unión parcial por el 3’UTR del mRNA
microRNAsmicroRNAsCaracterísticasCaracterísticas
Annu Rev Pathol. 2009 ; 4: 199–227
DURANTE EL DURANTE EL PROCESAMIENPROCESAMIENTO DEL MIRNATO DEL MIRNA
ALTERACIONES ALTERACIONES A NIVEL DE A NIVEL DE
TRANSCRIPCIÓTRANSCRIPCIÓNN
Supr
esor
es tu
mor
ales
y o
ncog
enes
Supr
esor
es tu
mor
ales
y o
ncog
enes
Bloquear transcripción de supresor tumoral
NO-Bloquea transcripción de
oncogén
Generalidades microRNAs en cáncer
• Secuencias corta de RNA (~22-5pb)
• Actúan a través que un complejo supresor (RISC)
– Degradación del mRNA blanco
– Represión de la traducción
• Un daño en le procesamiento del miRNA se puede traducir en
predisposición a cáncer
microRNAs en gliomas
miRNAs y expresion en gliomasmiRNAs y expresion en gliomasmiR-21miR-21
Determinación de niveles de miR-21
Proliferación microvascular: Reorganización de la matriz extracelular y capacidad de proliferación
qRT-PCR Northern blot
Rutas moleculares afectadas por miR-21Rutas moleculares afectadas por miR-21
Ensayos usando anti-miR-21
Blancos Blancos miR21miR21
ApoptosisApoptosisProliferaciónProliferación
InvasiónInvasiónMigraciónMigración
1
23
4
En ApoptosisEn Apoptosis
RUTA DE P53RUTA DE P53 RUTA DE TGFRUTA DE TGFΒΒ
Citoquina inhibidora del crecimiento
Estabilizar p53
Ruta de metaloproteinasas de matriz (MMP)Ruta de metaloproteinasas de matriz (MMP)
MMP: PEPTIDASAS – DEGRADACIÓN MATRIZ EXTRACELULAR
NIVELES AUMENTADOS EN GLIOMAS
Ruta mediada por PDC4Ruta mediada por PDC4
EFECTOS SOBRE LA EFECTOS SOBRE LA PROLIFERACIÓNPROLIFERACIÓN
mi-R21 y respuesta a quimioterapia (taxanos)mi-R21 y respuesta a quimioterapia (taxanos)
Niveles de expresión de miR-21 por RT-PCR Niveles de expresión de miR-21 por RT-PCR Regulacion de miR-21 por su inhibidorRegulacion de miR-21 por su inhibidor
Inhibidor del miR-21 incrementa la citotoxicidad Inhibidor del miR-21 incrementa la citotoxicidad del taxoldel taxol
Inhibición en un 50% del crecimiento celular Vs. Concentración taxol-inhibidor
Actividad de AKT: Contribuye a supervivenciaActividad de AKT: Contribuye a supervivenciaEnsayos Western-BlotEnsayos Western-Blot
Reducción de la expresión de p-AKT usando combinación del inhibidor y quimioterapia
Taxo
l
Ant
i-miR
-21
Taxo
l + A
nti-m
iR-2
1
Taxo
l
Ant
i-miR
-21
Taxo
l + A
nti-m
iR-2
1
miRNAs y apoptosismiRNAs y apoptosis
6,24% 6,24%
21,75% 18,74%24,68% 21,97%
Aumento de muerte celular por apotosis – Efecto aditivo
miR-21 y resistencia temozolamidamiR-21 y resistencia temozolamida
Ensayos de viabilidad celularEnsayos de viabilidad celular
Tratamiento con miR-21 hace células resistentes a tratamiento con TMZ
Ensayo de apoptosisEnsayo de apoptosis
TMZ: Induce apoptosismiR-21: Disminuye porcentaje de apoptosis
Cascadas de señalización Bax/Bcl2Cascadas de señalización Bax/Bcl2Bax: promotor de apoptosis, Bcl2: inhibidor de apoptosisBax: promotor de apoptosis, Bcl2: inhibidor de apoptosis
Expresión relativa del radio Expresión relativa del radio Bax/Bcl2Bax/Bcl2
Medición niveles Bax y Bcl2 por Medición niveles Bax y Bcl2 por western blotwestern blot
Aumento relación Bax/Bcl2: Promueve apoptosis Disminución de la relación Bax/Bcl2 contribuyen a resistencia a terapias
miR-7 y proliferaciónmiR-7 y proliferación
Primeros en reportar que miR-7 regula el EGFRBaja regulación de miR-7 en glioblastoma
Vía del EGFR-AKT
EGFR y AKT juegan un papel central EGFR y AKT juegan un papel central en los Glioblastomasen los Glioblastomas
Inmunoblot de EGFR
Inmunoblot de AKT: fosforilación en Ser173
Decrecimiento en la expresión de EGFR y de AKT
IRS-1/IRS-2 contienen sitios de unión del miR-7IRS-1/IRS-2 contienen sitios de unión del miR-7
miR-7 suprime la activación de AKT INDEPENDIENTEMENTEINDEPENDIENTEMENTE de la inhibición del EGFR
EGFR regula la actividad de AKT PERO, la inhibición de AKT por miR-7 es dependiente de la inhibición de EGFR?
Conclusiones (1)
• Los microRNAs son molecular de cadena sencilla de aproximadamente 20 nt que
regulan a expresión de diferentes genes
• Dos mecanismos de regulación:
– iRNA
– microRNA
• La gran mayoría de los miRNAs conocidos estas localizados en sitios frágiles
asociados con cáncer
• Daños en el procesamiento del miRNA esta relacionado con el desarrollo de
cáncer.
Conclusiones (2)Conclusiones (2)
• mirR21 es un oncogén sobre-expresado en glioblastomas y se encuentra asociado con resistencia a agentes quimioterapéuticos APOPTOSISAPOPTOSIS
• microRNA-7 (miR-7) es considerado un supresor tumoral que se encuentra sub-regulado en glioblastoma y suprime la expresión de EGFR y AKT PROLIFERACIÓN CELULARPROLIFERACIÓN CELULAR
• Representan un blanco terapéutico Uso de antagonistas