métodos espectro fotométricos para la determinación de concentraciones de macromoléculas

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Trabajo Práctico II Métodos espectrofotométricos para la determinación de concentraciones de macromoléculas. Eivers María del Mar Graña Karen Merlo Santiago

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Frecuentemente es necesario estimar la concentracion de una mezcla de proteinas al cabo de una etapa de purificacion o de fermentación.

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  • Trabajo Prctico II

    Mtodos espectrofotomtricos para la determinacin de concentraciones de

    macromolculas.

    Eivers Mara del Mar Graa Karen

    Merlo Santiago

  • Objetivos

    1. Conocer los principales mtodos de cuantificacin de protenas. 2. Construir una recta de calibracin con una solucin de albmina de suero bovino como

    protena patrn para cada uno de los mtodos de Bradford y Lowry. 3. Determinar la linealidad, la sensibilidad, el lmite de deteccin y el rango de cada uno de

    los mtodos ensayados. 4. Determinar la concentracin total de protenas en una muestra incgnita.

    Metodologa

    Para la realizacin de esta prctica se realizaron dos curvas de calibracin, con el fin de determinar la concentracin de distintas muestras incgnita. Para realizar una de las curvas se sigui el mtodo de Bradford, y para la otra, el de Lowry.

    Mtodo de Bradford:

    Para el protocolo de Bradford se utiliz una solucin patrn de seroalbmina bovina (BSA) en

    concentracin 0,5 mg/ml, as como tambin el Reactivo de Bradford (modificado), el cual consta de 40 mg de Coomassie Brilliant Blue G 250, 50 ml de etanol y 100 ml de cido fosfrico 85% completados con agua destilada.

    Siguiendo el mtodo, se confeccionaron dos series de ocho tubos, en los cuales se agregaron 2 ml del reactivo de Bradford a 0,1 ml de solucin proteica. Cinco de los ocho tubos cubrieron el rango de entre 5 y 25 g de protena (para lo cual se realizaron diluciones de la solucin patrn de BSA), uno de los ocho se utiliz como blanco y a cada uno de los otros dos se les agreg una muestra incgnita diferente. A nuestro grupo le fueron asignadas las muestras A y D. El contenido de cada tubo se detalla en la Tabla 1.

    Luego cada tubo se agit en el vrtex y, pasados dos minutos, se midi la absorbancia a 595 nm. Una vez medidas las absorbancias de todos los tubos, se construy una curva de calibracin

    utilizando dichos valores de absorbancia y la masa proteica de cada tubo. Los valores de absorbancia graficados fueron el resultado de realizar el promedio de cada par de absorbancias obtenidas a una misma masa de protena.

    Utilizando el valor de la pendiente de la curva (p), se calcul el valor de la masa de protenas en las muestras incgnita, despejando de la siguiente manera:

    endiente Absorbancia/gdeprotenasP =

    gdeprotenas Absorbancia/Pendiente =

    1

  • Tabla 1. Tabla resumen del protocolo de Bradford, con el contenido de cada tubo correspondientes diluciones de la solucin patrn de BSA.

    Mtodo de Lowry: Se procedi de manera anloga para cuantificar otra solucin incgnita mediante el mtodo de Lowry. Para este se utiliz una solucin patrn de BSA en concentracin 0,5 mg/ml, el Reactivo de Folin-Cicateau, el cual es una mezcla de fosfomolibdato y fototungstano, y una solucin alcalina. Dicha solucin alcalina se compone de solucin de tartrato de sodio y potasio al 2%, solucin de Cu2SO4.5H2O al 1% y solucin de Na2CO3 al 2% en NaOH 0,1 N, en relacin 0,1:0,1:10 respectivamente.

    Siguiendo el protocolo de Lowry, se confeccionaron dos series de siete tubos. Cinco de ellos cubrieron el rango de 25 g a 125 g de protena (para lo cual se realizaron diluciones de la solucin patrn de BSA), uno constituy el blanco y al restante se le agreg una solucin incgnita. El contenido de cada tubo se detalla en la Tabla 2. A cada uno de los cuales se le agregaron 2 ml de la solucin alcalina de cobre. Luego se agitaron los tubos en el vrtex y se los dej reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se agregaron a los tubos 0,2 ml del reactivo de Folin y, luego de agitarlos nuevamente en el vrtex, se los dej reposar 30 minutos a temperatura ambiente. Pasados los 30 minutos, se midi la absorbancia de cada uno de los tubos a 660 nm.

    Una vez medidas las absorbancias de todos los tubos, se construy una curva de calibracin utilizando dichos valores de absorbancia y la masa proteica de cada tubo. Al igual que en el mtodo anterior, los valores de absorbancia graficados fueron el resultado de realizar el promedio de cada par de absorbancias obtenidas a una misma masa de protena.

    Utilizando el valor de la pendiente de la curva (p), se calcul el valor de la masa de protenas en la muestras incgnita, despejando de manera anloga a la de la curva de Bradford.

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  • Tabla 2. Tabla resumen del protocolo de Lowry, con el contenido de cada tubo correspondientes diluciones de la

    solucin patrn de BSA.

    Finalmente, con las ecuaciones de las curvas obtenidas mediante ambos mtodos, se procedi a calcular la masa proteica contenida en cada una de las soluciones incgnita. Resultados Mtodo de Bradford: Con los resultados obtenido a travs de la aplicacin del mtodo de Bradford se realiz el siguiente grfico (los datos utilizados para la realizacin de la curva de calibracin se detallan en la Tabla 5 ubicada en la seccion Anexo):

    Grfico 1. Promedio de absorbancias a 595nm obtenidas en ambas series vs masa de protenas.

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  • A travs de la ecuacin obtenida luego de realizar un ajuste lineal se pudo calcular la concentracin de ambas muestra incgnitas: Muestra Incgnita A: Absorbancia de la muestra A = 0,380 Absorbancia de la muestra A = 0,400 Absorbancia de la muestra A - Absorbancia del blanco = -0,016 Absorbancia de la muestra A - Absorbancia del blanco = 0,003 Promedio de ambas absorbancias = -0,007

    , 07 0, 2X 0 0 = 0

    , 5g , 0035mgX = 0 3 = 0 0

    , 0035mg 0, ml 0 0 1

    , 035mg 1ml 0 0

    0, 0MuestraA[ ] = 0 mlmg

    Muestra Incgnita D: Absorbancia de la muestra D = 0,890 Absorbancia de la muestra D = 0,928 Absorbancia de la muestra D - Absorbancia del blanco = 0,494 Absorbancia de la muestra D - Absorbancia del blanco = 0,531 Promedio de ambas absorbancias = 0,513

    , 13 0, 2X0 5 = 0

    25, 5g 0, 2565mgX = 6 = 0

    , 2565mg 0, ml0 0 1

    , 565mg 1ml0 2

    0, 6MuestraD[ ] = 2 mlmg

    En la prctica, para evitar todos estos clculos y pasajes de unidades se suele calcular un factor el cual al ser multiplicado por la absorbancia de la muestra incgnita nos da directamente la concentracin expresada en mg/ml. A continuacin se calcular dicho factor y multiplicar por la absorbancia de la muestra D para ver si se llega al mismo resultado:

    , 13 0, 2X0 5 = 0

    , 13x1/0, 2 X(g)0 5 0 =

    4

  • , 13x50 X(g)0 5 =

    , 13x50/1000 X(mg)0 5 =

    , 13x0, 5 X(mg)0 5 0 =

    , 13x0, 5/0, ml X(mg/ml)0 5 0 1 =

    , 13x0, X(mg/ml)0 5 5 =

    actor 0,F = 5

    0, 6MuestraD[ ] = 2 mlmg

    Mtodo de Lowry: Con los resultados obtenido a travs de la aplicacin del mtodo de Lowry se realiz el siguiente grfico (los datos utilizados para la realizacin de la curva de calibracin se detallan en la Tabla 8 ubicada en la seccion Anexo):

    Grfico 2. Promedio de absorbancias a 660nm obtenidas en ambas series vs. masa de protenas.

    A travs de la ecuacin obtenida luego de realizar un ajuste lineal se pudo calcular la concentracin de la muestra incgnita: Absorbancia de la muestra = 0,353 Absorbancia de la muestra = 0,344 Absorbancia de la muestra - Absorbancia del blanco = 0,315 Absorbancia de la muestra - Absorbancia del blanco = 0,313 Promedio de ambas absorbancias = 0,314

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  • , 14 0, 04X 0 3 = 0

    78, g 0, 785mg X = 5 = 0

    , 785mg 0, ml 0 0 4

    , 96mg 1ml 0 1

    , 0 MuestraIncgnita[ ] = 0 2 mlmg

    Ahora calculamos el factor pero para el mtodo de Lowry:

    , 14 0, 04X 0 3 = 0

    , 14x1/0, 04 X(g) 0 3 0 =

    , 14x250 X(g) 0 3 =

    , 14x250/1000 X(mg) 0 3 =

    , 14x0, 5 X(mg) 0 3 2 =

    , 14x0, 5/0, ml X(mg/ml) 0 3 2 4 =

    , 14x0, 25 X(mg/ml) 0 3 6 =

    actor 0, 25F = 6

    0, 0MuestraD[ ] = 2 mlmg

    Discusin Mtodo de Bradford Este mtodo nos permite cuantificar protenas en una determinada muestra ya que involucra la fijacin de la protena a un colorante (Coomassie Blue) por interacciones electrostticas. El colorante libre, que presenta una coloracin rojiza, se torna azul cuando interacciona con la protena, ms precisamente con sus aminocidos bsicos: lisina y arginina. Cuando ocurre esta unin, el espectro de absorcin se modifica y es la magnitud que se mide en el laboratorio para cuantificar dichas concentraciones. Se trabaj a 595 nm ya que es la longitud de onda en la cul el colorante en su forma aninica presenta su pico de absorbancia. Muestra A: El promedio de las absorbancias medidas dio como resultado un nmero negativo (-0,007). Si bien un espectrofotmetro no puede darnos un valor negativo de absorbancia, un Abs si puede ser menor a cero ya que es un valor relativo a la absorbancia del blanco. En este caso no es un resultado coherenteya que la absorbancia medida de la muestra de la primer serie result menor que la del blanco, que se trataba slo del solvente. Esto se pudo deber a un error de pipeteo o a un error del espectrofotmetro; con respecto al pequeo nmero obtenido como resultado del promedio de las absorbancias de las muestras incgnitas pertenecientes a ambas series se lo puede atribuir a que la muestra incgnita se trataba del blanco o bien que la muestra posea menor cantidad de protena que el lmite de deteccin. Es decir, una cantidad tan pequea de protena la cual no entraba en el rango detectable del espectrofotmetro.

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  • Al calcular la concentracin de protena en la muestra A utilizando este valor negativo de absorbancia, se llega a un valor de 0,00mg/ml. Esto significa que efectivamente la muestra D no contena protena, pero que debido a un error de los mencionados anteriormente, presentaba una absorbancia menor a la del blanco. Muestra D: La masa calculada en la muestra incgnita D mediante Bradford arroj un resultado de 5, 5g2 6

    de protena. Esta masa cae por fuera de la curva de calibracin que se construy, lo que significa que en esa zona de la curva se pierde la linealidad y por lo tanto no se cumple la ley de Lambert-Beer. Haber aproximado la concentracin de la muestra D mediante la ecuacin de la lnea de tendencia implica un aporte muy grande de error en los resultados. Para obtener resultados ms fidedignos se debera repetir la experiencia diluyendo a la mitad la muestra incgnita de forma tal que la absorbancia caiga dentro del rango de la curva de calibracin. Mtodo de Lowry En este mtodo, la coloracin ocurre por la formacin de un complejo entre el Cu2+ y los nitrgenos de los enlaces peptdicos. Para resaltar el color de esta reaccin y aumentar la sensibilidad se utiliz el reactivo de Folin-Ciocalteau, que se reduce en presencia de los residuos de aminocidos tirosina y triptfano dando un color azul. Este reactivo se descompone en solucin, por lo que hay que agitar inmediatamente el tubo de ensayo una vez que se lo agrega para que reaccione con la BSA. La reaccin que ocurre con la protena no es estequiomtrica, por lo que no existe una correlacin entre las molaridades de reactivos y productos, pero si es una reaccin reproducible que nos permite hacer una comparacin con un estndar y de esta forma calcular la concentracin de protena en la muestra. La solucin alcalina que se utiliza en la reaccin (ver su composicin en Metodologa) se prepara en un cierto orden, mezclando en un principio Tartrato de sodio y potasio con Sulfato de cobre pentahidratado, y finalmente agregando carbonato de sodio. Este orden se debe a que el tartrato que se incorpora primero cumple la funcin de mantener al cobre en solucin y evitar que precipite con el agregado posterior de carbonato de sodio. Si el orden fuera otro, precipitara el cobre evitando as que participe de la reaccin. Muestra Incgnita: Se cometi un error al pipetear agua en exceso en el tubo 3 de la segunda serie para el mtodo de Lowry. Si bien no era mucho el volumen de agua en exceso, podra haber afectado nuestros resultados. Al analizar los resultados obtenidos se observ que al realizar el promedio de las absorbancias para el tubo 3 por duplicado y al graficar la lnea de tendencia se redujo este error, ya que teniendo en cuenta o no el punto correspondiente a este tubo, la variacin en la ecuacin

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  • de la recta era despreciable. Por lo tanto se decidi tenerlo en cuenta dentro de nuestros valores al graficar. Con este mtodo, se obtuvo una masa de protena en la muestra de , cuyo valor caa8, g 7 5 dentro del rango de la curva de calibracin realizada en el cual se cumpla la ley de Lambert-Beer. En este trabajo se logr complir con los objetivos. Aprendimos a construir una curva de calibracin a partir de una solucin patrn, y utilizando esta herramienta pudimos calcular concentraciones de protena en determinadas muestras incgnitas por mtodos como el de Bradford o Lowry. Si bien ambos mtodos se utilizan en la prctica, tienen aplicaciones distintas dependiendo de la concentracin proteica con la que voy a trabajar y de la estructura primaria de la protena en cuestin: El mtodo de Bradford tiene un rango de trabajo de 0,1 a 10 g de protena/ml, fuera del cul se pierde la linealidad. Presenta menor lmite de deteccin que Lowry, por lo que se lo puede usar para discriminar cantidades pequeas de protena. Presenta la ventaja de ser un mtodo compatible con agentes reductores y til cuando se necesita rapidez en la coloracin. El mtodo de Lowry tiene un rango de 1 a 100 g de protena/ml, por lo tanto cubre un rango mayor que el de Bradford, pero a su vez tiene menos sensibilidad ya que su pendiente en la lnea de tendencia es menor y no podramos distinguir entre dos valores de absorbancia para dos concentraciones muy cercanas pero distintas. Ambos mtodos presentan interferencias de distintas sustancias que interfieren en el dosaje de protenas. Para Lowry las sustancias involucradas son los derivados aminados, los componentes de ciertos buffers, EDTA, SDS, Tritn X-100, cidos grasos, nucletidos, sales, azcares, mientras que para el mtodo de Bradford interfieren en mayor medida los detergentes.

    Es necesario destacar que cualquiera de los dos mtodos puede resultarnos ms o menos til dependiendo de qu tipo de aminocidos contenga la protena a analizar. Por ejemplo, si se poseen dos patrones de protenas que difieren en el contenido de tirosina y triptofano, dos aminocidos con grupos aromticos en su estructura, una curva de calibracin realizada con el mtodo de Lowry resulta ms til para el patrn que posea ms cantidad de estos aminocidos que una realizada con el mtodo de Bradford. Esta diferencia se debe a que los grupos cromognicos que intervienen principalmente en el mtodo de Lowry son el triptofano y la tirosina. Es as que las absorciones mximas se obtendrn con protenas que contengan estos aminocidos, y por lo tanto las curvas de calibracin realizadas con patrones de estas protenas sern ideales para averiguar concentraciones de soluciones incgnita. De la misma manera, si se poseen dos patrones que difieren en la cantidad de aminocidos bsicos, es conveniente realizar una curva de calibracin del patrn con mayor cantidad de ellos mediante el mtodo de Bradford. Esto se debe a que este mtodo aprovecha la unin del colorante Coomassie Blue a las protenas, y estudios sugieren que est unin slo se realiza si la protena contiene grupos funcionales bsicos. Garantizando la unin al colorante, se garantiza una buena absorcin a 595 nm que permitir obtener una curva de calibracin til para la cuantificacin de otras protenas.

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  • Anexo Datos utilizados para la realizacin de las curvas de calibracin. Mtodo de Bradford

    Tabla 3. Datos obtenidos de la primera serie como resultado de la medicin con un espectrofotmetro.

    Tabla 4. Datos obtenidos de la segunda serie como resultado de la medicin con un espectrofotmetro.

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  • Tabla 5. Datos obtenidos como resultado del promedio de ambas series.

    Mtodo de Lowry

    Tabla 6. Datos obtenidos de la primera serie como resultado de la medicin con un espectrofotmetro.

    Tabla 7. Datos obtenidos de la segunda serie como resultado de la medicin con un espectrofotmetro. *Hubo un

    error en la preparacin de este tubo ya que se coloc ms agua que la que informa el protocolo.

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  • Tabla 8. Datos obtenidos como resultado del promedio de ambas series.

    Bibliografa.

    - Gua de trabajos prcticos. Qumica Biolgica, 1er cuatrimestre de 2015. Departamento de

    Qumica Biolgica, FCEyN, UBA. 2015.

    - Anexo Terico. Qumica Biolgica, 1er cuatrimestre de 2015. Mtodos para la cuantificacin de protenas.

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