7/24/2019 Mtodos de Ensayos Enzimticos

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Mtodos de ensayos enzimticos

La propiedad caracterstica de las enzimas es catalizar reaccionesespecfcas. Su presencia se detecta por la realizacin de dichasreacciones. La cantidad y concentracin de enzima presente en unasolucin se estima por la velocidad de la reaccin catalizada. Es por elloque la medida de velocidad es esencial en la investigacin de enzimas ypara ello se requiere de mtodos confables y reproducibles.

Si se ha alcanzado el estado estacionario, la actividad de una enzimapuede estudiarse por la velocidad de ormacin de un producto, o por lavelocidad de desaparicin de un sustrato.

!ara muchas enzimas hay ensayos alternativos disponibles, la eleccinpuede hacerse en trminos de la conveniencia, costo, la disponibilidadde equipos y reactivos adecuados, y el nivel de sensibilidad requerida.

"uchas reacciones producen cambios en las propiedades de losreactantes que pueden ser seguidos directa y continuamente. En otroscasos, no hay cambios que puedan observarse directamente y esnecesario usar un ensayo indirecto que involucra un

tratamiento posterior de la mezcla de ensayo. En algunos casos, esposible usar un ensayo indirecto para seguir el progreso de la reaccinen orma continua. !.e. cuando una segunda enzima se usa en el mismoensayo para producir un cambio detectable en orma directa. En otros,es necesario detener la reaccin antes de realizar el tratamiento de lamezcla de reaccin que permita determinar la e#tensin de la reaccin.

Estabilidad enzim$tica.

En una serie de estudios con una preparacin enzim$tica es esencialensayar su actividad en intervalos regulares de tiempo en condicionesest$ndar para chequear que sta permanezca constante. Si una enzimaes inestable y pierde la actividad en el tiempo, es posible corregir losvalores obtenidos en relacin a la inicial si se han realizado una serie deensayos est$ndar a dierentes tiempos% esto permite construir una curvade calibracin de actividad en el tiempo. &e todas maneras, es muchome'or buscar condiciones ba'o las cuales la solucin stoc( de la enzima

pueda ser almacenada sin prdida apreciable de actividad en el tiempo.En resumen, un ensayo enzim$tico es un procedimiento, llevado a caboen un laboratorio, mediante el cual se puede medir la velocidad de unareaccin enzim$tica. )omo las enzimas no se consumen en la reaccinque catalizan, los ensayos enzim$ticos suelen medir.

Pruebas bioqumicas.

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Las pruebas bioqumicas permiten determinar las caractersticasmetablicas de las bacterias ob'eto de identifcacin. *lgunas de estaspruebas son tcnicas r$pidas, ya que eval+an la presencia de unaenzima preormada y su lectura vara entre unos segundos hasta unaspocas horas. tras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del

microorganismo con una incubacin previa de - a /h% a este grupopertenecen la mayora de las pruebas que detectan componentesmetablicos o aquellas que determinan la sensibilidad de unmicroorganismo a una sustancia dada tras cultivo en medios deidentifcacin que contienen el sustrato a metabolizar.

0o obstante, algunas de estas pruebas pueden realizarse de ormar$pida tras incubacin de unas 123 horas% en general, se trata dereacciones enzim$ticas cromo gnicas o pruebas convencionalesmodifcadas 4hay discos o tabletas comercializados con substratoscromo gnicos para uso individualizado5.

Los organismos varan en su capacidad para utilizar dierentescompuestos 4por e'emplo6 carbohidratos, urea, citrato, etc.5 paraalgunos microorganismos que se usan en su identifcacin en ellaboratorio.

!ruebas que se utilizan en la identifcacin preliminar, con lecturainmediata6

)atalasa. La catalasa es un enzima presente en la mayora de losmicroorganismos que poseen citocromos. Las bacterias que

sintetizan catalasa hidrolizan el per#ido de hidrgeno en agua yo#igeno gaseoso que se libera en orma de burbu'as. El principalob'etivo de esta prueba es separar "icrococacceae 4positiva5 deStreptococcus spp. y Enterococcus spp. 4negativa5.

#idasa. Esta prueba sirve para determinar la presencia deenzimas o#idasas. La reaccin de la o#idasa se debe a la presenciade un sistema citocromo o#idasa que activa la o#idacin delcitocromo el cual es reducido por el o#geno molecularproducindose agua o per#ido de hidrgeno seg+n la especiebacteriana. El o#geno act+a por tanto como aceptor fnal deelectrones en la cadena transportadora de electrones. !or logeneral, el sistema citocromo o#idasa slo se encuentra en lasbacterias aerobias, algunas anaerobias acultativas y,e#cepcionalmente, en alguna microaerfla 47ibrio etus5, pero lasbacterias anaerobias estrictas carecen de actividad o#idasa.*simismo, la presencia de o#idasa va ligada a la produccin decatalasa, ya que 8sta degrada el per#ido de hidrgeno que se

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produce como consecuencia de la reduccin del o#geno y cuyaacumulacin es t#ica.

Las pruebas bioqumicas se utilizan con recuencia para identifcar

bacterias y levaduras porque las dierentes especies producen distintasenzimas. Estas pruebas tienen por fnalidad detectar la presencia deenzimas. 9n tipo de prueba bioqumica se basa en la deteccin deenzimas catabolizadoras de amino$cidos relacionadas con los procesosde descarbo#ilacin y deshidrogenacin

Pruebas Bioqumicas

Las actividades enzim$ticas son ampliamente utilizadas para dierenciara las bacterias. :ncluso las bacterias estrechamen te relacionadaspueden ser separadas en especies dierentes mediante el empleo de

pruebas bioqumicas, por e'emplo, para determinar su capacidad deermentar un con'unto de hidratos de carbono seleccionados. En elrecuadro anterior se describi un e'emplo del empleo de pruebasbioqumicas para identifcar bacterias 4en este caso, en mamerosmarinos5. *dem$s, las pruebas bioqumicas pueden proporcionar datosacerca del nicho de la especie en el ecosistema. !or e'emplo, unabacteria que pueda f'ar el gas nitrgeno o el azure elemental o#idadobrindar$ nutrientes importantes para los vegetales y los animales.

Las enterobacterias gramnegativas constituyen un grupo grande yheterogneo de microbios cuyo h$bitat natural es el tracto intestinal de

los seres humanos y de otros animales. Esta amilia contiene diversospatgenos que causan diarrea. Se han desarrollado varias pruebas paraque los tcnicos de laboratorio puedan identifcar con rapidez elpatgeno, el mdico pueda entonces proporcionar el tratamientoadecuado y los epidemilogos puedan determinar la uente de unaenermedad. ;odos los miembros de la amilia Enterobacteriaceae sono#idasa negativos. Las bacterias de esta amilia

pertenecen a los gneros Escherichia, Enterobacter, Shigella, )itrohactery Salmonella. Escherichia, Enterobacter y )tro2 bacter, que ermentan lalactosa para producir $cido y gas, pueden distinguirse de Salmonella yShigella, que no lo hacen. !ruebas bioqumicas adicionales, como lasrepresentadas en la fgura, permiten dierenciar entre los gneros.

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El tiempo necesario para identifcar las bacterias puede reducirse demodo considerable si se emplean medios de cultivo selectivos ydierenciales o mtodos de identifcacin r$pida. Se e#plic que losmedios selectivos contienen componentes que estimulan el desarrollo delos microorganismos deseados y suprimen el crecimiento de los que

compiten en ellos y que los medios dierenciales permiten que elmicrorganismo deseado orme una colonia con alguna caractersticadistintiva.

El "anual de

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transcurso de / a 1/ horas. En ocasiones este sistema se denominasistema de identifcacin numrica porque a los resultados de cadaprueba se les asigna un n+mero. En la orma m$s simple, a una pruebapositiva se le asignara un valor de - y a una negativa se le asignara unvalor de >.

En la mayora de los equipos comerciales a los resultados de las pruebasse les asignan n+meros que varan de - a / y que se basan en laconfabilidad relativa y en la importancia de cada prueba y el totalresultante se compara con una base de datos de microorganismosconocidos.

En el e'emplo que se muestra en la imagen

Se inocula una enterobacteria desconocida en un tubo de pruebapara llevar a cabo -? pruebas bioqumicas.

&espus de la incubacin se observan los resultados en cadacompartimiento.

Los resultados positivos se marcan er@ la planilla de puntuacin.0tese que a cada prueba se le asigna un valor% el n+meroderivado de la puntuacin de todas las pruebas se denomina valor:&. La ermentacin de la glucosa es importante y una reaccinpositiva recibe un valor de 1, en comparacin con la produccin deacetona 4prueba 72! o prueba de 7oges2!rosAauer5, que no tienevalor alguno.

La interpretacin computarizada simult$nea de los resultados de laprueba es esencial y es provista por el abrican2 te. En este

e'emplo los resultados de la prueba indican que la bacteria esEnterobacter cloacae, con los resultados tpicos de la prueba. 9nalimitacin de las pruebas bioqumicas es que las mutaciones y laadquisicin de pl$smidos pueden producir cepas de caractersticasdierentes. * menos que se emplee una gran cantidad de pruebasun microorganismo puede identifcarse de modo incorrecto.

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