Métodos de detección de HPVEmma Iborra Lacal

Especialista Anatomía PatológicaHospital “Los Arcos”. Santiago de la Ribera.

Murcia

VIII JORNADA DE CONTROVERSIAS EN GINECOLOGIA

Biología molecular y genética

Murcia, viernes 23 de Mayo de 2008 - 16 a 20 horas

Métodos de detección de HPV

• La infección persistente por HPV es condición necesaria para el desarrollo del carcinoma de cérvix.

• Utilidades clínicas de la detección de HPV:1. Información complementaria en

citologías anómalas. 2. Cribado poblacional.

Métodos de detección de HPV

Métodos de detección de HPV

Métodos de detección de HPV.(1) MORFOLOGÍA

LIMITACIONES:1.Sensibilidad para H-SIL 60-80%.2.Errores en el muestreo e interpretación.3.Dificultad de obtener células glandulares atípicas.4.Falsos positivos 5-50%.5.Falsos negativos 30%

Métodos de detección de HPV. (2) BIOMARCADORES PROTEICOS

-Indicadores del estado celular tras infección por HPV.-Predecir progresión o regresión de la infección.

Métodos de detección de HPV. (2) BIOMARCADORES PROTEICOS

Doorbar J. Molecular biology of human papillomavirus infecton and cervical cancer. Clinical Science (2006) 110, 525-541.

Métodos de detección de HPV. (2) BIOMARCADORES PROTEICOS

Doorbar J. Molecular biology of human papillomavirus infecton and cervical cancer. Clinical Science (2006) 110, 525-541.

Métodos de detección de HPV. (2) BIOMARCADORES PROTEICOS

Métodos de detección de HPV. (2) BIOMARCADORES PROTEICOS

p16Identifica células displásicas con S 70-100% y E 34-100%.Mejora la concordancia interobservador.Buen marcador de progresión a carcinoma invasor.No aporta información de serotipo HPV.

Métodos de detección de HPV. (2) BIOMARCADORES PROTEICOS

• Ki-67, PCNA• Expresión variable y condicionada por factores

múltiples.• CDC2, CDC6 y MCM5• Sobreexpresión en células displásicas. • Son necesarios más estudios para demostrar

su potencial como biomarcador en carcinoma de cérvix.

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS

1. Sonda directa:

- Southern Blot

- Hibridación in situ

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS

• 2. Amplificación de señal:

Digene Hybrid Capture®(HC2)

“Captura de híbridos”

(inmunoensayo)

Especimen desnaturalizado

Hibridación con sonda de ARN

Captura y detección de híbridos

Luminiscencia

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS

• 3. Amplificación de molécula diana:

PCR para detectar L1.

Primers múltiples(MY09/11, GP5/6, PGMY09/11, SPF10…).

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS

CLART ® Papillomavirus humano 2 (Genomica):• Genotipado de 35 tipos de HPV.• Microarray de baja densidad en plataforma de

96 pocillos o tiras de 8 pocillos. 1. Producto amplificado marcado con biotina. 2. Hibridación con sonda específica. 3. Incubación con conjugado STRV-Peroxidasa. 4. Precipitado que se detecta por lectura automática.

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS

MÉTODOS POSITIVO NEGATIVO

SONDA DIRECTA Sothern Blot es “gold standard”

Baja sensibilidad, laborioso, requiere grandes cantidades de DNA.No se puede usar en muestras parafinadas

AMPLIFICACIÓN DE SEÑAL Kits comercialesAnálisis cuantitativoAprobado por la FDA (HC2)

Patente

AMPLIFICACIÓN DE MOLÉCULA DIANA

Tecnología flexible (carga viral, genotipo)Muy sensible

Uso exclusivo para investigación.No estandarización.Probabilidad de contaminación.

“Human papillomavirus testing methods”. Roger A. Hubbard. Arch Pathol Lab Med 2003;127:940-945

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS

CAPTURA DE HÍBRIDOS

• Hibridación de una sonda de ARN al ADN complementario de la muestra problema.

• Detección quimioluminiscente de los híbridos expresadas en RLU. Muestra positiva si RLU≥1.

• 13 serotipos de HPV de alto riesgo.

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS

CAPTURA DE HÍBRIDOS

• Sensibilidad clínica 85-100%.

• Detección mínima de 1pg/ml ≈120.000 partículas de virus

• Procedimiento simple y de alto rendimiento con buena reproducibilidad.

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS

CAPTURA DE HÍBRIDOS

• NO especifica tipo de HPV.

• Reactividad cruzada con serotipos de bajo riesgo.

• Detecta presencia de genoma estructural vírico (L1), por lo que mutaciones o delecciones en esas regiones podrían pasar desapercibidas.

Métodos de detección de HPV

• Results

A total of 10,154 women were randomly assigned to testing. Both tests were performedon all women in a randomly assigned sequence at the same session. The sensitivity ofHPV testing for cervical intraepithelial neoplasia of grade 2 or 3 was 94.6% (95% confidenceinterval [CI], 84.2 to 100), whereas the sensitivity of Pap testing was 55.4%(95% CI, 33.6 to 77.2; P = 0.01). The specificity was 94.1% (95% CI, 93.4 to 94.8) for HPVtesting and 96.8% (95% CI, 96.3 to 97.3; P<0.001) for Pap testing. Performance wasunaffected by the sequence of the tests. The sensitivity of both tests used together was100%, and the specificity was 92.5%. Triage procedures for Pap or HPV testing resultedin fewer referrals for colposcopy than did either test alone but were less sensitive. Noadverse events were reported.

• ConclusionsAs compared with Pap testing, HPV testing has greater sensitivity for the detectionof cervical intraepithelial neoplasia. (Current Controlled Trials number IRSCTN 57612064)

Métodos de detección de HPV: Últimos sistemas.

1. Inform ®HPV (Ventana): Sistema automático de hibridación in situ, preservando morfología. Distingue ADN integrado y episomal.

Métodos de detección de HPV: Últimos sistemas.

2. Invader® (Third Wave Molecular Diagnostic): Hibridación DNA con sonda específica y tras

digestión enzimática, detección por señal fluorescente.

• Equipamiento estándar, fácil de usar, no necesita entrenamiento específico.

• Datos iniciales limitados.

Métodos de detección de HPV. PERSPECTIVAS FUTURAS

Detección de mRNA de E6/E7(PreTect HPV-Proofer®. Norchip AS):

• Detecta persistencia de infección• Muestra infección activa• Evita seguimiento clínico innecesario• Identifica genotipo vírico

Métodos de detección de HPV: ¿Cuál es el mejor método?

• HC2 es la elección conservadora de la FDA para el cribado de ASCUS y/o adyuvante a la citología.

• La hibridación in situ y la tecnología Invader® son Reactivos Analíticos Específicos competentes. Necesidad de datos adicionales.

• La PCR se convertirá en el método más destacado si mejora el coste-efectividad, con sensibilidad analítica aumentada y nuevo desarrollo de algoritmos.