Método para marcar neuronas de la médula espinal de roedor.

La neurobiotina es un derivado amino de la biotina, sus principales ventajas son: Puede ser usado en vivo. Alta solubilidad. Adecuado para iontoforesis. Alta permanencia en las neuronas. No es tóxico. Puede ser fijado con formalina o glutaraldehído.

Para la detección de la neurobiotina se usa el Sistema Biotina-Avidina. Recientemente la avidina ha sido reemplazada por la estreptavidina (producida por estreptococos), que tiene mayor afinidad y menor tendencia a adherirse inespecíficamente a los tejidos. La molécula de estreptavidina posee cuatro sitios de unión para la biotina.

La constante de disociación del complejo estreptavidina-biotina tiene una Kd de 10-14 M lo que la situa en una de las uniones no covalentes más fuerte que se conoce. Sus ventajas sobre la avidina son:

Un punto isoeléctrico neutro Su naturaleza química (al no tratarse de una glicoproteína no presenta afinidad por las

lecitinas). La unión se mantiene en condiciones extremas de pH, temperatura, disolventes orgánicos,

agentes desnaturalizantes, detergentes y peptidasas.

La estreptavidina se encuentra unida covalentemente a la fluoresceína lo que permite una gran amplificación con muy poco fondo, resultados difíciles de obtener con otros procedimientos inmunohistoquímicos.

Protocolo para el Sistema Neurobiotina-Estreptavidina-Fluoresceína.

Marcado de las neuronas.1. Reconstituir el vial comercial de neurobiotina:

a. Se prepara agregando una pequeña cantidad de solución de llenado de las pipetas (gluconato de K suplementado) al vial comercial, esto es para facilitar la disolución.

b. Luego se ajusta el volumen final hasta obtener una concentración de 0.2%-0.5 %.c. Alicuotar en varios viales que serán almacenados en congelación (-20⁰C).

2. Se llena únicamente la punta de la pipeta de “patch” y para el resto de la pipeta se usa la solución intracelular pero sin neurobiotina (opcionalmente: Este proceso se realizá en cámara húmeda).

3. La alícuota en uso se conserva en refrigeración (4⁰C) o en una cubeta con hielo durante todo el experimento.

4. No es necesario aplicar corriente eléctrica para inyectar la neurobiotina, ya que bastan 5 minutos para que difunda y llene toda la neurona.

Cortes Histológicos.La manera más rápida de endurecer de los tejidos blandos es la congelación inmediata de las muestras, para ser cortadas en criotomo. Este procedimiento permite obtener cortes más finos (10 a 30 μm) que con vibratomo y sin necesidad de inclusión. Pero para preservar correctamente la estructura del tejido se debe congelar la muestra muy rápidamente, normalmente en nitrógeno líquido mezclado con isopentano para conseguir un baño termostático a una temperatura de -160 ⁰C., lo que evita la formación de cristales de hielo que deterioran las estructuras celulares.

Cuando no se realizan los cortes inmediatamente se requiere fijar la muestra, de acuerdo al siguiente protocolo.

1. Preparación de paraformaldehído (PFA) al 4% en buffer de fosfatos (prepara de acuerdo al anexo 1), de acuerdo al protocolo del anexo 2.

a. El PFA se libera en forma de gas formaldehido cuando se disuelve en agua por lo que no se recomienda almacenarlo por mucho tiempo.

2. Se fija la sección de médula espinal que ha sido marcada con neurobiotina en paraformaldehído-PBS al 4% durante 24 hrs. a 4⁰C.

a. El PFA es la forma polimerizada del formol. El agente fijador es el monómero de formaldehido el cual une dos proteínas muy próximas formando un puente.

b. El PFA es un buen fijador para lípidos por lo que fija correctamente estructuras celulares y membranas.

c. El tejido fijado presenta una gran estabilidad y la matriz de entrecruzamientos es permeable a anticuerpos sin necesidad de un pre-tratamiento con proteasas.

d. El PFA es compatible con la mayoría de las técnicas de tinción histológicas, incluidas las de inmunocitoquímica e hibridación de ácidos nucleicos.

3. Crio-protección de las muestras para cortar en criotomo.

a. Con ello se evita que durante la congelación se formen cristales de hielo grandes que puedan dañar las estructuras celulares.

b. Después de varios lavados en PBS (preparado de acuerdo al anexo 1) las muestras se cambian a una solución de sacarosa al 10% en buffer de fosfatos, por 24hr. o hasta que las muestras dejen de flotar.

c. Repetir el paso “b” pero con una solución al 20% de sacarosa.d. Repetir el paso “b” pero con una solución al 30% de sacarosa.

4. Gelatinización de portaobjetos (ver anexo 2). La superficie del portaobjetos donde se colocaran los cortes debe tratarse previamente para que las muestras queden adheridas durante el proceso de revelado. Para ello los portaobjetos se recubren con soluciones de gelatina, albúmina, u otras sustancias y se dejan secar, de manera que hacen de adhesivo entre el cristal y el tejido.

5. Llevar las muestras a la platina del criotomó para congelar y cortar.a. Recuperando los cortes con un pincel fino.

b. Cortes montados directamente en el portaobjetos gelatinizado.

Revelado de las neuronas marcadas.

1. Llevar las muestras en una caja de multiposo de 96.

2. Permeabilizado de las muestras con tritón. La fijación con solventes como acetona o metanol no solo fija las células sino que produce una extracción de los lípidos por lo que no es necesaria ninguna permeabilización. Por el contrario cuando las células son fijadas con “cross Linkers” como formaldehido o glutaraldehído los lípidos no son extraídos. Si el antígeno es intracelular es necesario permeabilizar. Lo más normal es permeabilizar con Tritón X-100 al 0.1%-0.4% durante máximo 10 minutos. Es un detergente no-iónico que sirve para solubilizar proteínas en su estado nativo. Otros metodos de permeabilización alternativos emplean diferentes detergentes como saponina, digitoxina, SDS o Tween20.

3. Enjuagar con PBS tres veces durante 5 min cada lavado. Remover la solución en cada lavado mediante succión, evitando que la muestra se seque.

4. Revelado de la neurobiotina con streptavidina. Incubar con estreptavidina de fluoresceína durante 15 minutos en la cámara oscura. La concentración óptima del conjugado de estreptavidina debe ser determinada por titulación; intervalo recomendado 10–20 µg/ml en PBS. Lavar exhaustivamente con PBS.

5. Montado de la preparación con Cytoseal 60. Conservar las laminillas en un lugar oscuro a temperatura ambiente

6. Observación de la marca fluorescente en un microscopio de epifluoresencia. La streptavidina tiene una excitación máxima de 495 nm y una emisión máxima a 515 nm.

ANEXO 1

PB (BUFFER FOSFATOS 0,1 M, pH 7.5)SOLUCIÓN A [ M ] PM g/500ml de H2Od

NaH2PO4 0.2 137.99 13.799

SOLUCIÓN B [ M ] PM g/1000ml de H2Od

Na2HPO4 0.2 141.96 28.392

Para preparar un litro de buffer de fosfato 0.1 M entonces se deberá mezclar:

1. 500 ml de H2Od

2. 95 ml de SOLUCIÓN A3. Agregar 405 ml de SOLUCIÓN B poco a poco hasta ajustar pH a 7.4

ANEXO 2

PREPARACIÓN DE PARAFORMALDEHÍDO (PFA) 4%

1.- 500ml de PB 0.1M.

2.- Pesar 24gr de PFA (Se debe usar guantes, cubreboca, bata y trabajar en campana de extracción)

3.- Disolver los 24gr de PFA en 500ml de PB 0.1 M a 60°C.

4.- Agregar hidróxido de sodio NaOH 1M en gotas hasta disolver.

Notas:

Es importante que nunca exceda los 60⁰C; así que en caso necesario se retira de la plancha y se deja enfriar un poco.

Tampoco es aconsejable que se enfríe la solución a ≤ 50°C, o no se disolverá el PFA. El hidróxido de sodio ayudará a disolver el PFA, volviendo el pH alcalino. Es importante no

excederse con el NaOH, en tal caso con algunas gotas de HCl se reajusta el pH. 5.- Ajustar el pH a 7.4 añadiendo ácido clorhídrico.

Notas:

Se utilizan tiras medidoras de pH. Si se va a utilizar un pHmetro se debe usar un electrodo exclusivo para el PFA, ya que el

PFA se adhiere fuertemente a las paredes de vidrio del electrodo.6.- Aforar a 600ml con PB 0.1 M. Listo! Ahora tenemos 600ml de PFA al 4% en PB, con un pH 7.4.

7.- Filtrar con papel filtro.

ANEXO 3

GELATINACIÓN DE PORTAOBJETOS

Agua destilada 800ml

Gelatina Knox 4gr.

Sulfato de cromo y potasio (Cr K (SO4)2) 0.4gr.

PREPARACIÓN:

1) Se muele el sulfato de cromo y potasio en un mortero, hasta que quede como polvo fino.

2) Se calienta el agua destilada, cuando empieza a hervir se le agrega la grenetina lentamente para que no se formen grumos.

3) Una vez que esté bien disuelta y este hirviendo, se le agrega el sulfato de cromo.

4) Se afora a 1000ml

5) Se filtra y se guarda en un recipiente a 4⁰C.

PROCEDIMIENTO:

a) Las laminillas nuevas se limpian con etanol.

b) Se sumergen en la solución de grenetina.

c) Se escurren un poco en papel secante, se pueden dejar secar a temperatura ambiente o en el horno a temperatura baja.

d) Una vez secas, se vuelven a sumergir en la grenetina (3 veces más), hasta completar 4 capas, dejándolas secar cada vez.

e) Al terminar se puede guardar la grenetina sobrante para volverse a usar.