MATERIALES Y MÉTODOS

Materia Prima

La materia prima uti l izada fue uva de mesa de exportación de

las variedades Perlette, Flame, Sugar One y Red Globe, cult ivadas

en la región de Pesqueira, en el municipio de Hermosil lo, Sonora.

Las cuales fueron proporcionadas por Viñedo Alta S.A. de C.V. (las

cuatro variedades mencionadas) Campo "La Cuesta" ubicado en el

Km. 23 de la Carretera Hermosil lo-Nogales, Sonora. La uva de uso

industrial proviene del Campo “La Brea”, calle 4 Sur, Km. 3, Costa

de Hermosil lo.

Preparación de las Muestras de Uva

La uva fue lavada con agua desti lada y la cáscara fue

removida manualmente y secada en una estufa de vacío (Nacional

Appliance Company, Modelo 3640) a 50 ºC hasta obtener una

humedad menor o igual al 12 %. La cáscara se pulverizó

mecánicamente a un tamaño de partícula de 30 mesh en una

l icuadora Oster a la máxima velocidad por 10 s. Los polvos de

cáscara y semil la se almacenaron a una temperatura de – 20 ºC

(Yilmaz y Toledo, 2004).

Extracción de los Compuestos Fenólicos

Preparación de la muestra y extracción de fenoles. Los

compuestos fenólicos fueron extraídos de la cáscara (2 g) con 20

mL de metanol acuoso (60:40) con homogenizaciones intermitentes

de 10 seg por un período de 1 min. Posteriormente se sonicó a

temperatura ambiente por 30 min, y se centrifugó a 10,000 rpm por 44

15 min a 4°C. El sobrenadante se f i l tró con papel Whatman (No. 2) y

el material sólido fue sonicado de nuevo con 20 mL de metanol

acuoso (60:40) para después ser centrifugado. Una vez fi ltrado el

sobrenadante se mezcló con el primero para congelarse a -20°C, en

espera de los análisis de oxidación y HPLC (Prior y col., 2001).

Fenoles Totales

Las determinaciones se realizaron espectrofotométricamente

uti l izando el método de Folin-Ciocalteau (Schlesier y col., 2002).

Este método está basado en la oxidación de los grupos fenólicos

por los ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico; formándose un

complejo verde azulado que se mide a 765 nm.

Para la determinación del contenido de fenoles totales de las

muestras, se mezclaron 50 μL de cada extracto con 3 mL de agua

desionizada, adicionando el reactivo de Folin–Ciocalteu 1 N (250

μL, Merck) para reposar por 5 min, después con 750 μL de Na2CO3

al 20%, y 950 μL de agua desionizada, se homogeniza para

reposar por 30 a 40 minutos de reacción se midió la absorbancia a

765 nm (Fig. 9).

Flavonoides Totales

Se uti l izó al ácido gálico monohidratado (Sigma Aldrich, USA)

para la elaboración de una curva de calibración. El contenido de

fenoles totales se expresó como equivalentes de ácido gálico en

mil igramos por gramo de muestra b.s. (Marinova y col., 2005).

Figura 9. Diagrama de cuantificación de fenoles totales.

Para la determinación de flavonoides totales se siguió la

técnica descrita por Siddhuraju y Becker (2003) modificada. Un

50 μL de extracto + 3 mL de agua desionizada +

250 μL del reactivo de Folin–Ciocalteu 1 N

Reposar 5 min

Adicionar 750 μL de Na2CO3 al 20% + 950 μL de agua desionizada

Vortex

Reposar de 30 a 40 minutos

Leer a 765 nm

volumen de 1 mL de extracto se colocó en un tubo de 10 mL, con 4

mL agua desti lada. A ésto se añadieron 0.3 mL de NaNO2 (5

g/100mL) y 0.3 mili l i tros de una solución de AlCl3 (10:100) después

de agitar vigorosamente, se dejó reposar por 1 min. Después de 6

min, se añadieron 2 mL de solución de NaOH 1 M, y se aforó a 10

mL con agua desti lada.

La solución se mezcló, y se midió la absorbancia contra un

blanco a 510 nm en un espectrofotómetro UV-visible (Cary 100 BIO,

Varian) como se observa en la Figura 10. Para la elaboración de la

curva de calibración se uti l izó a la Rutina (E. Merck) como estándar.

El contenido de flavonoides se calculó en base a la siguiente

ecuación l ineal:

Y = 1.442X – 0.024 r = 0.995

Donde: Y es la absorbancia medida y X es el contenido de

flavonoides en mg quercetina/mL.

Se calcularon los rendimientos de extracción de fenoles y

f lavonoides a partir de los pesos totales de los racimos de uvas, así

como de la cáscara fresca y seca.

Identificación de los Compuestos Fenólicos por HPLC

El procedimiento para la identif icación de los compuestos

fenólicos se realizó de acuerdo al método descrito por Cantos y col.

(2000).

Figura 10. Diagrama de cuantif icación de flavonoides totales.

El equipo uti l izado fue un Varian 9050 equipado con un

detector de luz ultravioleta (Varian 3400). Se uti l izó una columna

SupelcosilTM LC18 (30 x 0.4 cm x 5 µm tamaño de partícula,

Supelco, Bellefonte, PA). Los solventes fueron agua más 5% de

ácido fórmico (solvente A) y metanol grado HPLC (solvente B) a un

1 mL de extracto + 4 mL de agua desionizada + 300 μL de NaNO2 al 5% + 300 μL de AlCl3

Reposar 1 min

Adicionar 2 mL de NaOH 1M + 2.4 mL agua desionizada

Vortex

Leer a 415 nm

f lujo de 1.5 mL/min. La elusión se realizó con un gradiente

empezando con 2% de B hasta alcanzar 32% de B a los 30 min,

40% de B a los 40 min. Los cromatogramas fueron registrados a

280, 320, y 360 nm.

Los diferentes compuestos fenólicos se identif icaron por

comparación con los t iempos de retención de los estándares

correspondientes. El ácido gálico, catequina y epicatequina fueron

cuantif icados a 280 nm, el resveratrol y el ácido clorogénico a 320

nm y el quercetin-3-rutinosido conocido como rutina (f lavonol) a 360

nm (García-Alonso y col., 2003). Se elaboraron curvas de

calibración para cada estándar identif icado. Los compuestos

fenólicos de los extractos fueron analizados por tr ipl icado.

Actividad Antioxidante por Ensayo ABTS•+

Este método se basa en la reducción de la coloración

verde/azul producida por la reacción del ABTS•+ (3.8 mg/mL) con 88

μL de persulfato potásico (37.5 mg/mL) incubados a temperatura

ambiente (±25ºC) y en la oscuridad durante 16 h. Una vez formado

el radical ABTS•+ se diluye con etanol hasta obtener un valor de

absorbancia comprendido entre 0.70 + 0.1 a 754 nm. Las muestras

f i l tradas (0.1 mL de extracto) se diluyen con 3.9 mL del radical y se

homogeniza por 1 minuto. La absorbancia se mide de forma

continua transcurridos 7 minutos (Figura 11).

Figura 11. Diagrama de determinación de la actividad antioxidante por el radical ABTS•+.

La reducción en absorbancia es relacionada a la del Trolox, un

análogo sintético e hidrofí l ico de la vitamina E, el cual determina el

valor TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacit ity), calculado

como moles de equivalentes Trolox por gramo de sólido (Pellegrini,

2003).

19.5 mg del radical ABTS + 5 mL de agua bidestilada Soln.

37.8 mg de persulfato de potasio + 1 mL de agua bidestilada Soln.

88 μL de Soln. + Soln. dejar reposar en oscuridad Soln. (12 – 16 h) a Tamb.

88 mL de etanol + 1 mL Soln. Soln.

Leer inmediatamente a

λ754 nm

Colocar en celda 3.9 mL Soln. + 0.1 mL muestra

Actividad Antioxidante por Ensayo DPPH•

Los antioxidantes reducen el radical l ibre 2,2-difenil-1-

picri lhidracilo (DPPH•), el cual t iene una absorbancia máxima a 515

nm. La solución del radical se preparó disolviendo 2.5 mg DPPH• en

100 mL etanol.

Para el ensayo fotométrico se mezclaron 3.9 mL de solución

de DPPH• y 0.1 mL de diferentes concentraciones de los extractos,

para la elaboración de una curva de calibración (Figura 12). La

absorbancia de las muestras se midió en función del t iempo hasta

que las diferencias fueron menores que 0,003 (Materska y Perucka,

2005).

A partir de las cinéticas de disminución de DPPH • . Se

uti l izaron los valores asintóticos de absorbancia y se graficaron en

función de las concentraciones para cada extracto. De éstas últ imas

curvas se calculó la concentración media efectiva (EC50), que es el

contenido de antioxidante requerido para reducir la

concentración inicial de DPPH• a la mitad, para poder comparar la

capacidad antioxidante de los diferentes extractos. Los resultados

finales se expresaron como mg de fruto/mg de DPPH• (Molyneux,

2004).

2.5 mg de radical DPPH y aforar a 100 mL con metanol

Figura 12. Diagrama de determinación de la actividad antioxidante por el radical DPPH• .

Análisis Estadístico

Los datos fueron analizados por un análisis de varianza y

comparación de medias por la prueba de Tukey (p<0.05) uti l izando

Sigmastat 3.5 (Point Richmond, CA, USA). Todos los análisis se

realizaron por tr iplicado.

Homogenizar

Elaborar curva de diluciones(para determinar EC50)

Tomar 0.1 mL de la dilución + 3.9 mL de solución. de radical

Reposar por 30 minutos

Leer inmediatamente a

λ515 nm