Mercodia MPO ELISA

Instrucciones para el uso

10-1176-01Reactivos para 96 determinaciones

Para uso diagnóstico in vitro en la UE/EEE, el Reino Unido y Canadá

Fabricado por Mercodia AB Sylveniusgatan 8A SE-754 50 Uppsala Suecia

Estado regulatoria en el resto del mundo:Solo para investigación.No debe utilizarse en los procedimientos de diagnóstico.

Explicación de los símbolos utilizados en las etiquetas

∑ = 96

Reactivos para 96 determinaciones

Fecha de caducidad

Conservar a entre 2–8°C

Nº lote

© Mercodia 2008-2021

Para uso diagnóstico in vitro

Utilización previstaMercodia MPO ELISA ofrece un método para establecer la cantidad de MPO humana en el plasma EDTA.

Resumen y explicación de la pruebaLa mieloperoxidasa (MPO), una glicoproteina que contiene hierro, es un complejo tetramétrico de vinculación covalente con un peso molecular de 150 kDa.Está compuesta por dos cadenas alfa glucosiladas de MW 59-64 kDa y dos cadenas beta desglucosiladas de MW 14 kDa. La MPO se encuentra abundantemente en los gránulos azurofílicos primarios de neutrófilos y está presente en los monocitos. Como respuesta a una invasión microbiana, los gránulos citoplásmicos de neutrófilos liberan la MPO en el espacio fagosómico y extracelular, catalizando la conversión de peróxido de hidrógeno e iones de cloruro (CI-) a ácido hipocloroso, un potente agente oxidante.  La mieloperoxidasa se emplea tradicionalmente como marcador de inflamaciones de las vías respiratorias causadas por asma o irritantes medioambientales. Asimismo, se cree que la MPO participa en las distintas fases de la aterogénesis y que puede influir en la propagación de la aterosclerosis. La relación entre los niveles elevados de MPO en suero y las enfermedades cardiovasculares (CAD) representa un importante papel de la MPO como marcador de inflamaciones en las CAD, permitiendo la identificación de pacientes con riesgo de padecer accidentes cardíacos a falta de necrosis miocárdica.

Principio del procedimientoMercodia MPO ELISA es un inmunoensayo enzimático combinado en fase sólida. Se basa en la técnica de sándwich en la que dos anticuerpos monoclonales se contraponen a determinantes antigénicos separados en la molécula de la MPO. Durante la incubación, la MPO de la muestra reacciona con anticuerpos anti-MPO vinculados a los pocillos de microtitración. Tras el lavado, se añade la peroxidasa junto con los anticuerpos anti-MPO y, después de una segunda incubación y un simple lavado que retire el anticuerpo etiquetado como enzima sin vincular, la vinculación se detecta por la reacción a la 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina(TMB).La reacción se detiene añadiendo ácido para dar un final colorimétrico que se lea espectrofotométricamente.

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Advertencias y precauciones• Para uso diagnóstico in vitro en la UE/EEE, el Reino Unido y Canadá. No para

uso interno o externo en humanes o animales.• Estado regulatoria en el resto del mundo: Solo para investigación. No debe

usarse en procedimientos de diagnóstico.• Todas las muestras de pacientes deberán manipularse como muestras

susceptibles de transmitir infecciones.• Cada pocillo sólo puede ser usado una vez• La Stop Solution contiene <5% de ácido sulfúrico. La Stop Solution está etiquetada:

Peligro H318 – Provoca lesiones oculares graves. H315 – Provoca irritación cutánea. P280 – Llevar guantes/prendas/gafas/máscara de protección. P264 – Lavarse manos concienzudamente tras la manipulación. P302 + P352 + P362 + P364 – EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar

con agua y jabón abundantes. Quitarse las prendas contaminadas y lavarlas an-tes de volver a usarlas.

P332 + P313 – En caso de irritación cutánea: Consultar a un médico. P305 + P351 + P338 + P310 – EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS:

Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de con-tacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. Llamar inmediatamente a un CENTRO DE INFORMACION TOXICOLOGICA o a un médico.

• El Enzyme Conjugate Buffer, Cal 0, 1, 2, 3, 4, 5, el Wash Buffer, el Assay Buffer y el Sample Buffer contienen <0.06% 5-cloro-2-metil-4-isothiazolin-3-ona y 2-metil-2H-isotiazol-3-ona (3:1).

El Enzyme Conjugate Buffer, los Calibrators, el Wash Buffer, el Assay Buffer y el Sample Buffer están etiquetados:

Advertencia H317 – Puede provocar una reacción alérgica en la piel. P280 – Use guantes de protección. P261 – Evite respirar los vapores. P272 – Las prendas de trabajo contaminadas no podrán sacarse del lugar de

trabajo. P302 + P352 – EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con agua y

jabón abundantes. P333 + P313 – En caso de irritación o erupción cutánea: Consultar a un

médico. P501 – Disponga del contenido y envase de acuerdo a las regulaciones

locales, regionales, nacionales e internacionales.

Material requerido pero no suministrado• Pipetas de volumen adecuado (para añadir la solución de la Assay Buffer,

enzyme conjugate 1X, Substrate TMB y Stop Solution se prefieren las pipetas de repetición)

• Tubos, Cubetas y probetas para preparar los reactivos• Tubos para dilución de muestras• Agua bidestilada• Agitador magnético • Mezclador de vórtice• Lector de microplacas con filtro de 450 nm• Agitador de placas (700-900 vueltas por minuto, movimimento orbital)• Aparato para lavador de microplaca con función de sobre-flujo de lavado

(recomendado pero no obligatorio)

ReactivosCada paquete de MPO ELISA contiene reactivos para 96 pocillos, suficientes para 42 muestras y una curva de calibrado por duplicado. Para series de ensayos más amplias, emplee reactivos combinados de paquetes con números de lote idénticos. La fecha de caducidad del paquete completo se encuentra indicada en la etiqueta exterior. La temperatura de conservación recomendada es de 2-8ºC.

Coated Plate 1 placa 96 pocillos Lista para usarRatón monoclonal anti-MPO 8 bandas de pocilloPara las bandas de microtitración sin utilizar, cierre la bolsa con una cinta adhesiva y utilícelas en los 2 meses siguientes.

Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 frascos 1000 μL LiofilizadoCódigo de color amarillo Añada 1000 μLConcentración indicada en la etiqueta del frasco de agua redestiladaAlmacenamiento tras restitución: 2-8°C durante 2 meses. por frascoPara conservar los Calibrators restituidos durantemás de 2 meses, almacénelos a -20°C.

Calibrator 0 1 frasco 1000 μL Listo para usarCódigo de color amarillo

Sample Buffer 1 frasco 12 mL Listo para usarCódigo de color amarillo

Assay Buffer 1 frasco 12 mL Listo para usarCódigo de color rojo

Enzyme Conjugate 11X 1 frasco 1.3 mL Preparación, Peroxidasa mezclada con ratón monoclonal anti-MPO véase a continuación

Enzyme Conjugate Buffer 1 frasco 13 mL Listo para usarCódigo de color azul

Wash Buffer 21X 1 botella 50 mL Diluya el contenidoAlmacenamiento tras la dilución: con 1000 mL de2-8°C durante 2 meses agua redestila da para crear la solución de wash buffer 1X

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Substrate TMB 1 botella 22 mL Listo para usarSolución incoloraNota: Fotosensible.

Stop Solution 1 frasco 7 mL Listo para usar0.5 M H2SO4

Preparación de la solución 1X de enzyme conjugatePrepare la cantidad necesaria de solución 1X de enzyme conjugate diluyendo Enzyme Conjugate 11X (1+10) en el Enzyme Conjugate Buffer o según la tabla siguiente. Mézclela lentamente. Cuando prepare la solución 1X de enzyme conjugate para toda la placa, vierta todo el contenido del Enzyme Conjugate Buffer en el frasco de Enzyme Conjugate 11X.

Número de bandasEnzymeConjugate 11X

EnzymeConjugate Buffer

12 bandas (una placa)8 bandas4 bandas

1 frasco700 μL350 μL

1 frasco7.0 mL3.5 mL

Almacenamiento tras la dilución: 2-8°C durante 2 semanas.

Obtención y manipulación de muestrasUn aspecto importante que debe tenerse en cuenta en las condiciones de manipulación previas al análisis es la prevención de la liberación artificial de MPO de neutrófilos en las muestras, lo que podría provocar la obtención de resultados falsamente altos. Se trata de un asunto particularmente importante, puesto que la MPO ha demostrado su potencial como marcador de enfermedades cardiovasculares en las que los informes han vinculado el aumento de las concentraciones de MPO circulatoria a un aumento del riesgo de padecer enfermedades coronarias, un aumento del riesgo en pacientes con síndromes coronarios agudo y la utilidad clínica en la identificación y el pronóstico de los pacientes con insuficiencias cardíacas. Las concentraciones mayores de MPO en plasma con heparina, citrato-plasma y suero se deben a la liberación in vitro de MPO de los neutrófilos, dependiendo dicho aumento de las concentraciones del tiempo a temperatura ambiente tras la extracción. El plasma EDTA está recomendado para medir la MPO porque los valores no se confunden con la liberación ex vivo difícilmente controlable de la MPO de neutrófilos y por lo tanto puede reflejar de una manera más precisa la concentración de MPO en circulación.

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Plasma EDTAEl plasma EDTA es el tipo de muestra recomendado para los análisis de MPO. Extraiga la sangre mediante venipunción en tubos con EDTA como anticoagulante y separe la parte de plasma por centrifugación.

Suero, plasma con heparina y citrato-plasmaEl suero, el plasma con heparina y el citrato-plasma pueden utilizarse en el ensayo. El suero o la presencia de anticoagulante de heparina o citrato no afectarán a la medición del propio analito. Sin embargo, al valorar los resultados deberán tenerse en cuenta los posibles efectos derivados de la manipulación previa al análisis.

AlmacenamientoLas muestras de sangre de plasma EDTA pueden conservarse durante 1 hora a temperatura ambiente antes de centrifugarlas a 1500g durante 10 min. A continuación, el plasma separado pasa directamente a ser analizado o se congela a temperaturas inferiores a los -20°C hasta que llegue el momento de su análisis.

Dilución de muestrasNormalmente las muestras deberían diluirse 1:5 (50 μL de muestra + 200 μL de Sample Buffer) antes de someterlas a análisis.

Procedimiento de evaluaciónTodos los reactivos y muestras deben estar a temperatura ambiente antes de su uso. Preparar una curva de calibración para cada ensayo. El producto ha sido validado y optimado sin sellador de placa.

1. Recomponga el Calibrator 1-5 con 1000 µL de agua redestilada para cada frasco.

2. Prepare la solución 1X de enzyme conjugate, la solución 1X de wash buffer y las muestras.

3. Prepare pocillos de microplacas suficientes para incorporar los Calibrators, controles y las muestras por duplicado.

4. Utilice la pipeta de 25 µL y pase dicha cantidad de cada Calibrator, controles y de las muestras a los pocillos correspondientes.

5. Añada 100 µL del Buffer Assay a cada pocillo.

6. Incube en un agitador de placas (700-900 rpm) durante 1 hora a temperatura ambiente (18-25°C).

7. Lave 6 veces con 700 μL de solución 1x de wash buffer por pocillo usando un lavador de placas automático en la función de lavado con agua abundante. Tras realizar el último lavado, vuelque la placa y golpéela con firmeza sobre el papel absorbente. No incluya el paso de impregnación en el proceso de lavado.

O de forma manual: Descarte el volumen de la reacción volcando la microplaca en una pileta.

Añada a cada pocillo 350 μL de solución 1X de wash buffer. Deseche la solución de lavado, golpee confirmeza varias veces. Sobre el papel absorbente para eliminar el exceso de líquido. Repita esta acción 5 veces. Evite la impregnación prolongada durante el lavado.

8. Añada a cada pocillo 100 µL de solución 1X de enzyme conjugate.

9. Incube en un agitador de placas (700-900 rpm) durante 1 hora a temperatura ambiente (18-25°C).

10. Lave siguiendo las indicaciones anteriores.

11. Añada a cada pocillo 200 µL de Substrate TMB.

12. Incube en el banco durante 15 minutos a temperatura ambiente (18-25°C).

13. Añada a cada pocillo 50 µL de Stop Solution. Coloque la placa sobre un agitador durante unos 5 segundos para

asegurarse de que se mezcla bien.

14. Lea la densidad óptica a 450 nm y calcule los resultados. Haga una lectura cuando hayan transcurrido 30 minutos.

Aviso: Actuar con especial cuidado de no contaminar el sustrato TMB con la solución del conjugado enzimático.

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Control de calidad internoLos grupos de suero internos con concentraciones de MPO baja, media y alta deberán probarse de forma rutinaria como muestras y sus resultados se registrarán día tras día. Es conveniente que el laboratorio emplee se acostumbre a registrar los datos siguientes de cada prueba: Número de lote del paquete, fechas de dilución y/o restitución de los componentes del paquete, valores DO para los Calibrators y controles.  Los laboratorios deben seguir las normativas gubernamentales o requisitos de Acreditación para el control de calidad periódico.

Cálculo de los resultadosNota: El Calibrator 0 (control negativo) no debe emplearse para calcular la curva de calibrado. La concentración de MPO en muestras desconocidas deberá calcularse, en la medida de las posibilidades, empleando una reducción de los datos informatizados. Utilice las absorbencias obtenidas frente a las concentraciones conocidas de los Calibrators 1-5 y el análisis de regresión spline cúbica para construir la curva de calibrado. Multiplique las concentraciones de MPO que se han calculado por el factor de dilución (p. ej., x5).

Ejemplo de ficha

Pocillos Identidad A450 nm Conc. μg/L**

1A-B

1C-D

1E-F

1G-H

2A-B

2C-D

2E-F

2G-H

3A-B

Calibrator 0

Calibrator 1*

Calibrator 2*

Calibrator 3*

Calibrator 4*

Calibrator 5*

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

0.066/0.062

0.101/0.108

0.195/0.193

0.453/0.468

1.479/1.422

2.471/2.476

0.265/0.260

0.817/0.821

1.582/1.591

76

272

548

*Concentración indicada en la etiqueta del frasco**Resultado multiplicado por el factor de dilución (x5)

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Ejemplo de curva de calibracionAquí se muestra una curva de calibrado típica. No utilice esta curva para calcular los resultados de la prueba real.

Límites del procedimientoComo sucede con las pruebas de diagnóstico, un diagnóstico definitivo no debería basarse en los resultados de una única prueba, sino que correspondería al médico realizarlo tras haber valorado todos los resultados clínicos. Las muestras lipémicas, ictéricas o hemolizadas no interfieren en el ensayo.

Valores esperadosLa práctica correcta dicta que cada laboratorio establezca su propio rango de valores.

MPO (μg/L)

OD

450

nm

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Características del rendimientoLímite de detecciónEl límite de detección se define como la Capacidad de Detección según la norma ISO11843-Parte 1. La Capacidad de Detección deberá considerarse parte de la validación de un método en lugar de tomar la concentración más baja que pueda medirse. El límite de detección es más bajo que la concentración del Calibrator 1 establecida con la metodología descrita en la norma ISO1183- Parte 4. La concentración para las muestras con una absorbencia por debajo del Calibrator 1 no debería calcularse. En su lugar, se expresarán como menos que o igual a (≤) la concentración indicada en el frasco para el Calibrator 1.

Efecto ganchoLas muestras con concentraciones de hasta 30 000 µg/L han sido analizadas sin reflejar resultados altamente bajos. RecuperaciónLa recuperación tras la incorporación es del 85%-96% (89% de media).La recuperación tras la dilución es del 97%-108% (101% de media).

PrecisiónCada muestra fue analizada en 4 réplicas en 33 ocasiones diferentes.

Coeficiente de variación

Muestra Valor siguientesµg/L

Repetibilidad%* Intra laboratorio %**

123

11.5834.93119.21

4.43.03.1

9.98.65.5

*Intra ensayo variación**Total ensayo variación

Especificidad

Se han hallado las siguientes reacciones cruzadas:

Reacción cruzada

TPO ≤ 0.01%

CRP ≤ 0.01%

EPO 3.53%

Lisozima 0.03%

Elastasa 0.12%

Alfa-1-antitripsina ≤ 0.01%

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CalibraciónEl paquete MPO ELISA ha sido calibrado en contraposición con un preparado comercial de MPO, altamente purificado y plenamente validado.

GarantíaLos datos sobre el rendimiento presentados fueron obtenidos con el procedimiento indicado. Todo cambio o modificación en el procedimiento no recomendado por Mercodia AB podría influir en los resultados, en cuyo caso Mercodia AB declina todas las garantías expresas, implícitas o legales, incluida la garantía implícita sobre comerciabilidad e idoneidad de uso.  En tal caso, Mercodia AB y sus distribuidores autorizados no se responsabilizarán de los daños y perjuicios indirectos o resultantes.

ReferenciasBaldus S. et al. (2003) Myeloperoxidase Serum Levels Predict Risk in Patients With Acute Coronary Syndromes. Circulation 108:1440-1445

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Hazen S L. et al. (1999) Formation of Nitric Oxide-Derived Oxidants by Myeloperoxidase in Monocytes. Circ. Res. 85:950-958

Nambi V. (2005) The Use of Myeloperoxidase As a Risk marker for Atherosclerosis. Current Atherosclerosis Reports 7:127-131

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Klebanoff SJ. (2005) Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol 2005;77:598-625

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Shih J. et al. (2008) Effect of Collection Tube Type and Preanalytical Handling on Myleoperoxidase Concentrations. Clin Chem 54:6 1076-1079

Schindhelm RK. et al. (2009) Myeloperoxidase: a useful biomarker for cardiovascular disease risk stratification? Clin Chem 55:1462-1470

En nuestra web podrá encontrar más referencias: www.mercodia.com

*No suministrado Ver página 8 para detalles

Para soporte técnico, póngase en contacto con: support@mercodia.com

Hoja de resumen del protocoloMercodia MPO ELISA

Añadir Calibrators, controls* y muestras

25 μL

Añadir Assay Buffer 100 μL

Incubar1 hora a 18-25ºC en un agitador de

placas, 700-900 rpm

Lavar con solución de wash buffer 1X 700 µL, 6 veces

Añadir solución de la enzyme conju-gate 1X

100 μL

Incubar1 hora a 18-25ºC en un agitador de

placas, 700-900 rpm

Lavar con solución de wash buffer 1X 700 µL, 6 veces

Añadir Substrate TMB 200 μL

Incubar 15 minutos a 18-25ºC

Añadir Stop Solution50 μL

Agite durante 5 segundos para que se mezcle.

Medida A450 nm Valore los resultados.

31-3154Version 12.02021-02-10