medios de cultivo, métodos de siembra
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Clase de Marcela sanchezTRANSCRIPT
MEDIOS DE CULTIVO
Conocer los medios de cultivo
Aplicar fisiología al cultivo de
microorganismos en el laboratorio
Identificar medio de cultivo –
método de siembra
Recordar técnicas de tinción en
microbiología
OBJETIVOS
Principios de cultivo microbiológico
Facilitar el crecimiento y el aislamiento de las bacterias presentes en una muestra clínica.
Determinar qué bacterias entre las que se desarrollan tienen más probabilidades de ser las
causantes de la infección y cuales son sus posibles contaminantes o colonizadores.
Obtener un desarrollo suficiente de las bacterias de importancia clínica para permitir su
identificación y su caracterización.
CULTIVO PURO CULTIVO MIXTO CULTIVO CONTAMINADO
DEFINICIÓN Sustrato sólido, líquido o semisólido que contiene todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y desarrollo de los gérmenes.
Fuentes de energía, carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y varios minerales.
pH
Luz
Temperatura
Esterilidad absoluta (salvo excepciones)
Recipientes adecuados
Es importante destacar que la transición exitosa de un microorganismo in vivo a un ambiente in vitro va a depender de:
Disponibilidad de nutrientes esenciales
Condiciones ambientales adecuadas
pH
Temperatura
Oxígeno y CO2
Presión
Luz
Clasificación de los medios de cultivo según
consistencia
SEMISÓLIDOS
LÍQUIDOS
SÓLIDOS
MEDIOS SÓLIDOS
semisólido
Caldo nutritivo
Caldos de enriquecimiento
Caldos revitalizadores
Clasificación de los medios de cultivo según
utilización
Selectivo y diferencial
Nutritivo
Enriquecimiento
Contienen nutrientes que favorecen el desarrollo de la mayoría de los microorganismos sin requerimientos especiales de cultivo.
No promueven el crecimiento de ningún agente en particular
MEDIOS NUTRITIVOS
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO
Contienen nutrientes específicos requeridos para el crecimiento de
patógenos que pueden estar presentes solo o con otras especies
de bacterias en la muestra de un paciente
Se utilizan para favorecer el desarrollo de un patógeno
determinado a partir de una mezcla de microorganismos mediante el uso
de especificidad de nutrientes
En general, son medios líquidos
MEDIOS SELECTIVOS
Contienen uno o más agentes que inhiben el crecimiento de los microorganismos que no se quieren estudiar
Agentes inhibidores: colorantes, sales biliares, alcoholes, ácidos y antibióticos
MEDIOS DIFERENCIALES
Contienen un factor o factores que permite que las colonias de una especie o un tipo bacteriano exhiban ciertas características
metabólicas o de cultivo que puedan utilizarse para diferenciarlas de otras bacterias que crecen en el mismo agar
MEDIOS ESPECIALES
MEDIOS CROMÓGENOS
MEDIOS DE TRANSPORTE
MEDIOS DE CONSERVACIÓN
Sustancias cromogénicas:
- Son productos químicos de síntesis que son incoloros cuando se unen a sustratos naturales por enlaces que son hidrolizados por enzimas microbianas específicas.
- Cuando la enzima microbiana hidroliza el enlace, se libera el compuesto cromogénico, que adquiere un color intenso.
- Ejemplo: Cromo agar (agentes uropatógenos), se pone en evidencia la actividad enzimática de la B- glucoronidasa o B- galactosidasa de las bacterias formándose colonias de diferentes colonias según la especie.
- Identificación presuntiva, haciendo innecesaria la realización de pruebas bioquímicas.
Medios para bacterias no exigentes
- agar
- extracto de carne
- peptona
- NACL
- leche descremada (congelar cepas)
NORMATIVA ISP, entregar
CONTROL DE CALIDAD
El Control de Calidad en la preparación y evaluación de los medios de cultivo es considerado como una esencial y buena práctica de laboratorio, necesaria para mantener el nivel y la ejecución de cualquier técnica microbiológica.
Proceso continuo que se extiende desde las materias primas ; a través del productor hasta el producto final utilizado en los diferentes departamentos de análisis y diagnóstico microbiológico.
▪ Recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés (Productividad) ▪ Inhibición o suspensión de los microorganismos no deseados. (Selectividad) ▪ Propiedades bioquímicas (diferenciales y diagnósticas) ▪ Propiedades físicas (por ejemplo, pH, Volumen) ▪ Sea estéril .... etc.
El Jefe inmediato responsable del área * Deberá analizar mensualmente los resultados de las pruebas realizadas por el responsable del departamento de control de calidad * Evaluará el cumplimiento de objetivos a través de los resultados
CRITERIOS DE EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS PREPARADOS.
Se evalúa utilizando criterios objetivos del medio respecto a: La recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés La inhibición o supresión de los microorganismos no deseados tiene que ser cuantitativa Los atributos ( por ejemplo: Propiedades físicas y bioquímicas) Rajadura del plato o envase Variaciones en el volumen del medio Hemólisis Cristales en el medio Presencia de burbujas Presencia de coágulos Cambio de color normal Contaminación Falla en la inhibición de microorganismos saprofitos Esterilidad
PRUEBAS FUNCIONAMIENTO Para evaluar cada lote de medio de cultivo que sea recibido en el laboratorio, se emplean cepas patrones (ATCC) de varios géneros y especies de acuerdo al medio de cultivo a analizar. El control del funcionamiento consistirá en comprobar:
capacidad del medio de recuperar un bajo número de los microorganismos más sensibles para los que ha sido preparado.
capacidad de inhibir un alto número de los microorganismos que deben ser inhibidos en caso de los medios selectivos y
diferenciar los microorganismos para los que ha sido diseñado en caso de los medios diferenciales.
RECONSTRUCCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
DESHIDRATADO
• Cumplir con las instrucciones de preparación del medio de cultivo indicado en la etiqueta del envase
• Cumplir con los procedimientos técnicos de fórmulas enviadas por el cliente
• Utilizar agua destilada de calidad
• Determinar el pH del M de C
• Esterilización del medio de cultivo
• Procedimiento escrito
• Control de esterilidad del Medio de Cultivo
AGAR INFUSION DE CARNE
MEDIO DE LOWENSTEIN JENSEN
AGAR SANGRE
DEFECTO
Apelmazamiento del Producto deshidratado
El valor de pH no coincide Con el indicado
ERRORES EN LA PREPARACIÓN
Apelmazamiento del producto deshidratado
El envase no fue cerrado correctamente después de su uso.
El envase permaneció abierto por largo rato. El producto sobrepasó la fecha de vencimiento.
El valor de pH no coincide con el indicado
• No fue empleada agua destilada• El medio fue sobrecalentado durante su preparación• El Ph no fue determinado correctamente• El medio estaba vencido.
Aparición de turbiedad o precipitados:
El medio preparado perdió agua por evaporación
El medio se calentó en exceso El medio no se calentó lo suficiente.
No fue empleada la cantidad del medio o suplemento recomendada.
El color del medio no coincide con el indicado:
El medio fue sobrecalentado durante su preparación.
El pH no fue ajustado correctamente.
El recipiente empleado estaba sucio.
Los azúcares contenidos en el medio se caramelizaron
El gel se obtiene más blando que lo característico para el medio:
No fue garantizada la disolución total del agar durante la preparación del medio. No fue empleada la cantidad del medio recomendada o se añadió agua en exceso.
El crecimiento de los microorganismos es pobre:
El medio fue sobrecalentado El valor del pH no fue ajustado correctamente. La adición de suplementos al medio se efectuó a excesiva temperatura. El medio no fue mezclado correctamente.
El crecimiento de los microorganismos es atípico:
Quedaron residuos de sustancias inhibidoras del crecimiento no deseables, en los recipientes donde se preparó o distribuyó el medio.
El medio de cultivo fue preparado de manera incorrecta.
El producto sobrepasa la fecha de vencimiento.
ES, POR LO TANTO, MUY IMPORTANTE QUE EL TECNÓLOGO MÉDICO SEA QUIEN SUPERVISE Y
CONTROLE TODOS LOS FACTORES NECESARIOS EN LA PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO, PARA ASÍ LOGRAR AISLAR
E IDENTIFICAR CON EXCELENCIA LOS DISTINTOS AGENTES
MICROBIANOS.
MÉTODOS DE SIEMBRA Y
AISLAMIENTO
VAMOS A CONTESTARNOS
ALGUNAS INTERROGANTES
¿Para qué sembramos?
¿dónde sembramos?
¿qué necesitamos para realizar una correcta siembra?
Microbiología, Prescott´s
Microbiología, Prescott´s
Los métodos de siembra se utilizan para inocular por distintos métodos sobre un medio de cultivo apropiado una muestra que contenga bacterias con el fin de reproducirlas para aumentar el número de individuos de la población y formar colonias en el caso de medios sólidos.
Siembra por aislamiento
I. Siembra con rastrillo
II. Siembra con asa de cultivo - Diseminación en superficie- Agotamiento en superficie- Tubos en superficie- Tubos en profundidad o picada
III. Siembra con tórula
Figura 12: Siembra con rastrilloManual de microbiología 2011, U. Mayor
Figura 13: Siembra de diseminación en superficieManual de microbiología 2011, U Mayor
Figura 14: Siembra semi-cuantitativa de agotamiento en superficie.
Manual de microbiología 2011, U Mayor
Figura 15: Siembra de tubo en superficie.
Manual de microbiología 2011, U Mayor
Figura 16: Siembra de tubo profundidad.
Manual de microbiología 2011, U Mayor
TINCIÓN DE GRAM
Pared celular bacteria gram positiva y gram negativa
Gram positiva Gram negativa
Gram negativa
de Braun
Gram positiva
1 minuto
1 minuto
30 segundos
15segundos
Decolorar con alcohol-acetona
Primera aproximación al posible diagnóstico
Técnicas rápidas y baratas
Diagnósticos rápidos y certeros
DIRECTOS
EXAMEN AL FRESCO MATERIA GENITAL
Secreción vaginal y/o uretral
Semen, secreción prostática
Orina de primer chorro
LEVADURAS
BACTERIAS
CLUE CELLS
LEUCOCITOS
TRICHOMONAS