1

Medida del número de microorganismos (II)

• Métodos directos:

– Recuento de  UFC = viables por siembra de muestras de diluciones en placas de Petri

– Recuento de UFC a partir de grandes volúmenes de suspensiones diluidas:

• se hacen pasar por filtros de nitrocelulosa o equivalentes (ej.: sistema Millipore®), y se incuban sobre medio sólido

Dispersión sobre superficieMedio líquido (40°C aprox.)

2

Filtración por membrana de Millipore® de una muestra (en muestras muy diluidas)

Medida del crecimiento por masa celular (I)

• Métodos directos:

– Determinación del peso húmedo

– Determinación del peso seco

– Determinación del N total

– Determinación de algún componente característico:• ADN, ARN

• Proteínas

• ATP

• Clorofilas (en fotosintéticos)

3

Medida del crecimiento por biomasa (II)

• Métodos indirectos:– Consumo de nutrientes 

• QO2 (consumo de oxígeno)

• QCO2 (consumo de dióxido de carbono)

– Productos del metabolismo• Producción de ácidos orgánicos

• Producción de CO2

4

Cuando se inoculan células a un medio de cultivo?

5

Crecimiento balanceado (=equilibrado) 

• El número de células, cantidad de biomasa,concentración de proteínas, ácidos nucléicos, etc.evolucionan en paralelo (cambian en la misma forma)

• El incremento por unidad de tiempo de losconstituyentes de la población es un valor constante:

• y el nº de células, la masa u otros componentes seduplican en un mismo lapso de tiempo

Considerando que el cultivo tiene un crecimiento equilibrado en la ecuación 1. “N” puede representar cualquiera de estos factores.

Ecuación 1 N= No x 2n

Como n= número de generación y td es el tiempo que transcurre, en cualquier tiempo de cultivo (T) se puede calcular

Ecuación 2 n= T_ td

Cinética de crecimiento en cultivo discontínuo (batch)

Importancia?

No = número inicial de célulasN= número de células después de n generacionesn= número de generaciones

6

combinando las ec. 1 y 2:

Ec. 3 N = N0 2T/td

Ec. 1. N= No x 2n

NNo

2n

No = # de células al inicioN = # de células después de “n” generacionesn = # de generaciones o duplicaciones

Ec. 2 n= T Tiempo de crec. td tiempo de duplicación

Cinética de crecimiento en cultivo discontínuo (batch)

Las ecuaciones exponenciales son difíciles de manejar gráficamente, setransforman en una recta, aplicando logaritmos en los dos términos yresulta:

Ecuación 4 ln N = ln N0 + (T/td) ln 2

N = N0 2T/td

7

Ejercicios:

1. Si se inoculan 1.2 x103 bacterias en un medio de cultivo y después de 4 horas de incubación creciendo exponencialmente se obtienen 1.8 X105 bacterias.n=?g =?td=?

2. Cuántas bacterias habrá en un cultivo después de 51 horas si este se inocula con 1 bacteria que tiene un td= 3 horas

3. Con cuántas bacterias deberá inocularse un medio de cultivo si queremos tener 8. 1x104 bacterias después de 12 horas?

4. Cuánto tiempo tardará una población inicial de 2X102 para llegar a 1.2 x106

bacterias?

Si se inoculan N bacterias que se duplican cada 3 horas en un medio de cultivo fresco... después de 3 h tendremos 2N bacterias, en otras 3 horas 4N..

Se considera que haycrecimiento sincrónico quese ajusta a un modelogeométrico de crecimiento esdecir que el aumento de lapoblación se dá en puntosdiscretos (3, 6, 9, 12, etc.horas) . Pero en la prácticaaún en las condicionesóptimas de crecimiento estono se obtiene, porque?

Modelo de crecimiento en escalera

8

•Porque las bacterias generalmentepueden encontrarse en diferentesetapas del proceso de divisióncelular por lo que el cultivo no estásincronizado.

•Incluso si se iniciara con 1 solacélula, la sincronicidad semantendrá solamente por algunasgeneraciones.

•Así, se observa que la gráfica decrecimiento es de tipo exponencial,que permite utilizar modelos confunciones exponenciales paracalcular parámetros de crecimientoy predecirlo a diferentes tiempos.

Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento en el número de células (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuación que describe la cinética es la siguiente:

Ecuación 5

Es una recta con m= ?

9

Cinética del crecimiento (fase exponencial

dN / dt = µ N

dN / N = µ dt

∫ dN / N = µ ∫ dt

Ln N – Ln N0 = µ t

Ln N = Ln N0 + µt

N = N0eµt

La velocidad (tasa) decrecimiento es proporcional al número de células

El logaritmo del número decélulas varía de forma lineal con el tiempo.La pendiente de la recta deproporcionalidad es la tasa decrecimiento µ

El aumento del número de células es exponencial

A la constante de proporcionalidad k se le denominará (μ), y se le conoce como tasa de crecimiento.

Se transforma en la siguiente función exponencial:

Ecuación 6 N = N0 eμt = X = X0 eμt

Es la ecuación general del crecimiento microbiano.

Describe el comportamiento del cultivo en la fase exponencial de crecimiento (Fase Log)

10

12

3

4

5

6

7

Cultivo continuo(sistema abierto)

• Cultivo balanceado que se mantiene por tiempo indefinido, por un flujo de nutrientes contínuo; que incluye:– Una cámara de cultivo de volumen constante

– A la que llega un suministro de nutrientes desde una cámara reservorio

– Desde la cámara de cultivo se elimina parte del cultivo y de sustancias tóxicas por un dispositivo de rebosadero

11

Medio fresco desde reservorio

Válvula para controlar el flujo

f (en ml/h)

f (en ml/h)

vx

Pérdida neta células: -dx/dt = x·D

Crecimiento bruto: dx/dt = x· μ

Crecimiento neto: dx/dt = x· μ - x·D = = x (μ-D)

En equilibrio μ = D; luego dx/dt = 0 y x se hace constante

D = f/v (en h-1)