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Tesis de Posgrado

Mecanismo de acción molecular deMecanismo de acción molecular delos corticoides en la médula espinallos corticoides en la médula espinal

Orti, Eduardo

1985

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

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Orti, Eduardo. (1985). Mecanismo de acción molecular de los corticoides en la médula espinal.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1932_Orti.pdf

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Orti, Eduardo. "Mecanismo de acción molecular de los corticoides en la médula espinal". Tesisde Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1985.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1932_Orti.pdf

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

MECANISMO DE ACCION MOLECULAR

DE LOS CORTICOIDES EN LA MEDULA ESPINAL

Autor: EDUARDO ORTI

Director: Dr. ALEJANDRO F. DE NICOLA

INSTITUTO DE BIOLOGIA Y MEDICINA EXPERIMENTAL

Obligado 2490, Buenos Aires

Tesis presentada para optar al

Titqu de Doctor en CienciasQuimicas

Tesis “32

1935 332,

a mis padres.

A Siïvia,

Agradezco especialmente a:

Dr. Aiejandro De Nicoïa, mi Director de Tesis, por sudedicación, estimuio y guia permanentes;

mis compañeros de 1aboratorio: Lic. Si1via Tornelio,Dres. Héctor Coirini, Ciaudia Helier, Li1iana Neisen­berg y Osvaido Fridman, cha. Ana Maria Magariños y Lic.Danie] Moses, por su cáiido apoyo y colaboración;

Sra. Eisa di Matteo y Srta. Sandra Luchetta, por 1a efi­ciente ayuda técnica;

mis docentes de Quimica Bioiógica: Dres. Eduardo Charreau,Carios Lantos, Juan Carios Ca1vo, Marta Tessone, Omar Pe­dro Pignataro y Lic. Lucrecia Piñeiro, por sus vaïiosasenseñanzas;

Lic. Juan Pabio Radiceila, por su amistad, sus enrique­cedoras discusiones y su contribución en ios programasde computación;

ios Sres. Saú] Corbaïán, Daniel Nieva y Juan José Cieslak,dei bioterio de] IBYME,por su cordia] y esmerada atención;

Lic. Marcelo de las Heras, por sus consejos para 1a de­terminación de 1a ornitina descarboxilasa;

Sr. Aiejandro Esteras, de Pape1sa, por su voiuntariosacolaboración en 1a impresión de 1a tesis;

Dr. Virgilio G. Fogiia, Director de] IBYME,y a todo e]persona] cientifico, técnico, de mantenimiento, de bibiio­teca y administrativo de] mismo, por su invaiorable asis­tencia;

A mi padre, mi madre y a toda mi famiiia porque me apo­yaron y estimuiaron siempre;

A Siivia, mi esposa, por haber sido mucho más que eso.E.0.

I.

iv

INDICE

INTRODUCCION GENERAL Y OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..1

MECANISMOS MOLECULARES DE ACCIONDE LOS CORTICOIDES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..2

- Estructura quimica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..2- Efectos 'fiSiOIógicos: Acción de Tos GCen distintos

tejidos, Efectos fisioIógicos de Tos GCen e] estrés,Efectos de Tos MC. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..4

- Mecanisnuas de acción: Biosintesis, Transporte, Estructu­ra de Ios receptores intraceIuIares, Factores estabiIizan­tes de Tos receptores, Transformación de] complejo hormo­na-receptor, Modeiode] cicIado intraceIuIar de receptores,Regulación de Ia expresión genómica, Mecanismos de acciónno genómicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..

ESTRUCTURA Y FUNCION DE LA MEDULA ESPINAL . . . . . . . . . ..23- CéIIJTas deT SN: Neurona, Neuroina . . . . . . . . . . . . . . . . ..23- Bioquinrica deI SN: MetaboTismoenergético, Transporte

axónico, Neurotransmisión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..2- Anatcnnïa de 'la ME:Anatomia macroscópica, Estructura in­

terna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..30- Funcióri de 'Ia ME: Reflejos meduiares, Funciones de Ia ME

Iuego de extraer eI cerebro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..33

CORTICOIDES Y SISTEMA NERVIOSO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..38- Acción de Ios corticoides sobre eI tejido nervioso:

Efectos especificos sobre 1a quimica y función de] cerebro,Efectos sobre actividades enzimáticas, Efectos sobre 1ae1ectrofisioIogia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..3

- Receptores de corticoides en e] SN: PobIacünmsdereceptores, Incorporación de corticoides "in vivo", Onto­genia de Tos receptores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..42

- Corticoides y ME. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..49

OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..51

PROPIEDADES, DISTRIBUCION Y ONTOGENIA DE LOS SITIOS

DE UNION CITOSOLICOS PARA GLUCOCORTICOIDES DE LA

MEDULA ESPINAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..54

INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..55

III.

v

MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..57- AnimaIes de experimentación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..57- Disección de] SN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..57- Determinación de Tos sitios de unión para GC.....58- Estudios cinéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..60- Efecto de protectores y bioqueantes de grupos

sulfhidriios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..60- Estudios de saturación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..60- Estudios de competencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..61- Sedimentación en gradientes de gTiceroT . . . . . . . . ..62- Distribución zona] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..63- Ontogenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..63

RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..65- Estudios cinéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..65- Efecto de protectores y bToqueantes de grupos

squhidriios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..68- Estudios de saturación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..68- Estudios de competencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..71- Sedimentación en gradientes de giicero] . . . . . . . . ..74- Distribución zona] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..74- Ontogenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..78

DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..82

ESTUDIO DE LA TRANSFORMACION DE LOS SITIOS DE UNION

PARA GLUCOCORTICOIDES DE LA MEDULA ESPINAL . . . . . . . . ..87

INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..88

MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..91

RES

AnimaTes de experimentación y disección de] SN...91Marcación de Tos sitios de unión citosóiicos con(3H)-DEX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..91Cromatografía en coTumna de DEAE-celulosa . . . . . . ..92Determinación de fosfato inorgánico . . . . . . . . . . . . ..93Ensayo de unión a ADN-ceiuiosa . . . . . . . . . . . . . . . . . ..94Obtención de una fracción nuciear purificada.....94Unión de compIejos citosóiicos a Ta fracciónnucIear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..95Método rápido de cromatografias combinadas enminicoTumnas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..96AnáIisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..98

ULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..99Unión de complejos citosóIicos a 1a fracciónnucTear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..99

vi

- Cromatografía en coiumna de DEAE-ceiuiosa . . . . . . ..99- Unión a ADN-ceIuiosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..101- Anáiisis cromatográfico en minicoiumnas

combinadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..106

DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..110

ESTUDIOS "IN VIVO" DE LOS NIVELES DE GLUCOCORTI­

COIDES EN LA MEDULA ESPINAL: CAPTACION NUCLEAR DE

CORTICDSTERONA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..113

INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..114

MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..117- Animaies de experimentación y disección de] SN..117- Obtención de fraccionea subceiuiares . . . . . . . . . . ..117- Captación nucIear de ( H)-CORT en ME e HC. . . . . ..117- Determinación de CORTen tejidos y fracciones

nucIeares por RIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..118- Determinación de CORTsérica por radiocompetición

proteica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..123

RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..124- Distribución de 1a CORTendógena . . . . . . . . . . . . . . ..124- Incorporación nucIear de CORT. . . . . . . . . . . . . . . . . ..127

DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..133

ESTUDIO DE LA UNION DE (3H)-ALDOSTERONA EN LA MEDULA

ESPINAL: PRESENCIA DE SITIOS DE ALTA AFINIDAD Y

SELECTIVIDAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..142

INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..143

MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..148- Animales de experimentación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..148- Determinación de sitios de unión citosó]icos....148- Transformación de Ios sitios de aita afinidad por

(3H)-ALDO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..149- AnáTisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..149

RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..151- Estudios cinéticos y de saturación . . . . . . . . . . . . ..151

vii

- Estudios de competencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..154- Distribución regionaI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..160-Transformación de Ios sitios de tipo I . . . . . . . . . ..160

DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..164

VI. EFECTOS BIOLOGICOS DE LOS GLUCOCORTICOIDES EN LA

MEDULA ESPINAL: REGULACION DE GLICEROL-FOSFATO

DESHIDROGENASA Y ORNITINA DESCARBOXILASA . . . . . . . . . ..169

INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..170

MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..173- AnimaIes de experimentación y tratamiento con

esteroides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..173- Determinación de Ia actividad de GPDH. . . . . . . . . ..173- Determinación de Ia actividad de ODC. . . . . . . . . . ..176- Determinación de 1a unión citosóIica de (3H)-DEX177- AnáIisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..178

RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..179- Efectos crónicos sobre Ia actividad de GPDH.....179- Efectos crónicos sobre Ia actividad de ODC. . . . ..182- Cinética de] efecto de una única dosis de GC

sobre GPDH, ODCy Ia unión citosóIica de(3H)-DEX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..184

- Respuesta a diferentes dosis de GC. . . . . . . . . . . ..187- Especificidad de] efecto sobre ODC. . . . . . . . . . . . ..189- Distribución de Ics niveIes basaIes y estimuIados

de GPDH y ODC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..189

DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..193

VII. CONSIDERACIONES FINALES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..201

RESUMEN Y DISCUSION GENERAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..202

PERSPECTIVAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..212

REFERENCIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..215

ACTH

ADN

ADX

ALDO

AMP

ANOVA

ARN

ATP

CORT

CRF

DEAE

DEX

DOC

DTT

EDTA

GABA

cc

GPDH

HAP

HC

ID50

Kd

Viii

ABREVIATURAS

adrenocorticotrofina

ácido desoxirribonucieico

adrenalectomïa / adrenaiectomizado(s)

aidosterona

adenosina-5'-monofosfato

anáiisis de 1a varianza

ácido ribonucieico

adenosina-5'-trifosfatocervica]

corticosteronafactor iiberador de adrenocorticotrofina

dietiiaminoetano

dexametasona

11-desoxicorticosteronaditiotreito]sa] disódica de] ácido eti]éndiaminotetraacético

ácido y-aminobutirico

g]ucocorticoide(s)giiceroifosfato deshidrogenasahidroxiiapatitahipocampo

concentración inhibitoria a1 50 %

intra peritonea]constante de disociación

MC

ME

NADH

ODC

ORN

RBA

RIA

RU 26752

RU 26988

RU 28362

SN

SNC

TA

Iumbar

minera]ocorticoide(s)

méduïa espina]

nícotinamida-adenina dinucïeótido reducido

ornitína descarboxiïasa

ornitínaafinidad reïativa de unión

radioinmunoaná1isis

3-(3'-oxo-7'a-prop11-17‘p-hídroxi-androstan-4'-en­17'aí1)-propíonolactona119,17p-díhidroxí-l70-(1'-propíoni])-androstan­1,4,6-trien-3-ona

11p,17p-dihidroxí-6-metí1-17a-(1'-propioni1)-an­drostan-l,4,6-trien-3-onasub-cutáneo

sistema nervioso

sistema nervioso centra]

torácico

acetónído de triamcino1ona

ÏQ INTRODUCCIONGENERALY OBJETIVOS

MECANISMOS MOLECULARES DE

ACCION DE LOS CORTICOIDES

ESTRUCTURA QUIMICA

Desde el punto de vista quimico, se consideraba como ti­

pos de moléculas glucocorticoides (GC) a las del grupo del cor­

tisol y la corticosterona (CORT)y de molécula mineralocorticoi­

de (MC)a la 11-desoxicorticosterona (DOC, figura I-l). La com­

paración de las cuatro fórmulas superiores de la figura muestra

una correlación entre estructura plana y acción biológica, que

guarda cierta vigencia. Las caracteristicas comunesde estos es­

teroides son su grupo:cetona en C3 , un doble enlace entre C4 y

C5, una función cetona en C20 y un hidroxilo en C21. El C11 o­

xidado a alcohol o carbonilo parecería marcar la diferencia en­

tre GC y MC. Al observar la fórmula de la aldosterona (ALDO),

un MC casi 100 veces más potente que DOC, se observa que tam­

bién posee un hidroxilo en C11, sin embargo su forma aldehidicao "abierta" se halla en equilibrio con tautómeros ciclicos en

los cuales el aldehido angular en C18 interacciona con los hi­

droxilos estéricamente cercanos. En los fluidos biológicos el

equilibrio se halla desplazado hacia alguno de estos tautómeros,verificándose entonces la ausencia de hidroxilo o carbonilo en

el C11 de la molécula MC El].

CH, OH CH20H

C = o C = O

HO HO ---OH

0 O

Conicosterona Cortisol

C = o C = O

---OH

o O

II-Des0xicorticosterona 17-hidroxi-1l-desoxicorticosterona

CH¡OH CH,OH CHonH l H l H H'Ho\:"-=° °\IC=° O'-./C'°

o-— ‘c o-—cHO

_- d‘_ ‘­0 0 O

Aldosmona

Figura I-l : Estructuras p1anas de corticoides.En 1a parte superior se muestran las estructuras de GC : cor­

ticosterona y cortiso], por debajo 1a de MC: 11-desoxicorticosterona,17-hidroxí-11-desoxí-corticosterona (MCsubóptimo) y aïdosterona consus formas abiertas y cíclicas (hemiacéta1icas)[1].

EFECTOS FISIOLOGICOS

Acción de los GCen distintos tejidos

Los CC son hormonas sistémicas que regulan el metabolis­

mo de la mayoria de las células del organismo. Sus acciones

puedenclasificarse en anabólicas y catabólicas, existiendo

otras Funciones del sistema nervioso (SN) que no se encuadran

en estos conceptos.

La acción anabólica (de sintesis) es ejercida principal­

mente en el higam), riñón y pulmón. En el higado y riñón favore­

cen la gluconeogénesis a partir de aminoácidos circulantes in­

duciendo las transaminasas que los convierten en o-cetoácidos,

precursores de la glucosa. Las enzimas claves de la gluconeo­

génesis (piruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxiquinasa

y glucosa-S-fosfatasa) también son inducidas, favoreciendo el

depósito de glucógeno y el aumento de la glucemia. La hiperglu­

cemia producida es facilitada además por la inhibición de la

captación de glucosa en aquellos tejidos donde actúan como a­

gentes catabóllcos. En el riñón, además de ser gluconeogenéti­

cos, los GCactivan la filtración glomerular. En el pulmón a­

celeran la maduración en el feto y aumentan la sintesis de fos­

folipidos.La acción catabólica (de degradación) se realiza en el

tejido adiposo, linfoide,conectivo. muscular, cutáneo y óseo.

Los GCdegradan las proteinas y lípidos liberando a la sangre

aminoácidos, glicerol y ácidos grasos.En la tabla [-1 se enumeran las acciones estimulantes o

Tabla L¿l: Efectos estimulantes e inhibitorios de los GC.

Efectos estimulantes1. Depósito de glucógeno en el higado2. Gluconeogénesis a partir de aminoácidos en el higado3. Captación hepática de aminoácidos circulantes4. Transaminasas hepáticas5. Biosintesis de proteinas en el higado6. Lipólisis en el tejido adiposo7. Formación de cuerpos cetónicos8. Filtración glomerular renal9. Eritropoyesis y leucopoyesis

10. SeCreción estomacal (ácido clorhídrico y pepsina)11. Elevación de la presión arterial12. Resistencia al estrés13. Propiedades cardiotónicas14. Crecimiento y maduración del pulmón fetal

Efectos inhibitorios1. Captación de glucosa por las células periféricas (resultado:

hiperglucemia)2. Metabolismo proteico en músculo, hueso, tejido linfoideo3. Lipogénesis en el tejido adiposo4. Reabsorción tubular renal de agua5. Númerode eosinófilos, basófilos y linfocitos de la sangre6. Crecimiento del tejido linfático normal (timo, ganglios, bazo)

y patológico (linfomas)7. Sintesis de matriz ósea (resultado: osteoporosis)8. Respuesta inmunitaria (resultado: disminución de anticuerpos)9. Respuestaanti-inflamatoria y anti-alérgica

10. Secreción de CRF y ACTH11. Supresión de mediadores: citoquinas, prostanoides, quininas,

serotonina

[Modificado de A. F. De Nicola, en "Endocrinología Molecular" (R.S. Calandra y A. F. De Nicola editores). El Ateneo, Buenos Aires,pp. 199-219 (1985)].

inhibitorias de los GC. La inhibición de la respuesta inmuni­

taria, anti-inflamatoria y anti-alérgica es la que ha generado

una amplia aplicación de los GCen la farmacología clinica y

terapéutica.

Las acciones nerviosas de los GCincluyen la regulación

del comportamiento y la conducta, cambios enzimáticos, la modu­

lación de los fenómenoseléctricos y la retroalimentación nega­

tiva sobre la secreción hipofisaria de ACTH[2].Estas acciones

serán detalladas más adelante.

Efectos fisiológicos de los GCen el estrés

Los niveles de GCaumentan marcadamente en respuesta al

estrés producido por alteraciones en la homeostasis. A estos

niveles elevados se les ha asignado tradicionalmente la función

de aumentar la resistencia del organismo al estrés. Contraria­

mente a la idea de que la función de los GCes facilitar los

mecanismos de defensa, cada vez resulta más evidente que a ni­

veles moderados o elevados los GCproducen su supresión. Esta

paradoja surgió cuando se descubrió que los GCeran agentes an­

ti-inflamatorios y ha permanecido comoobstáculo en la tarea de

unificar las funciones de los GC.

Muncky col. [3] han propuesto que las altas concentracio­

nes de GC inducidas en el estrés no protegen contra las causas

del mismo sino contra las reacciones normales del organismo al

estrés, impidiendo que ellas mismas se disparen y amenacen la

homeostasis. Esta hipótesis explica la paradoja planteada y pro­

vee a la fisiología de los GCde un concepto unificado de sus

funciones que puede reIacionar efectos fisiológicos y farmaco­

Iógicos tan diversos como el metaboïismo de 10s hidratos de

carbono, los procesos infiamatorios, el "shock" y e] baiance

hídrico. Este modelo también propone que ias enzimas inducidas

por los GCson agentes detoxificantes de mediadores producidos

durante e] estrés como mecanismo de defensa, pudiendo causar da­

ño si no son sometidos a una regulación posterior.

Efectos de ios MC

La acción bioiógica de Ios MC, es 1a reguïación de] me­

taboiismo minera] en e] organismo. Primordiaimente retienen

sodio y cuantitativamente los demás efectos de estas hormonas

como el contro] de la retención de agua y e] de 1a eliminación

de potasio son menos importantes [1].

Los MCtienen también efecto sobre el comportamiento,

siendo e] ejemplo clásico 1a reguiación de la ingesta de sa].

Bajas dosis de MCdisminuyen e] apetito salino de ratas adreno­

privas, mientras que concentraciones mayores producen el efecto

inverso. Otros efectos descriptos incluyen cambios en los elec­

trolitos cerebrales, en edemacerebral, 1a actividad eiéctrica

de ias neuronas y mecanismos de retoalimentación sobre la secre­

ción de ACTH [4].

MECANISMOS DE ACCION

BiosintesisLos corticoides se sintetizan en las giánduias adrenaies.

En el humano 1a zona glomerulosa produce ALDO, mientras que 1a

fasciculada-reticular produce cortisol; en la rata la ALDOtam­

bién se sintetiza en la glomerulosa, mientras que la fascicu­

lada-reticular produce su principal GC: la CORT.

El compuesto madre de los corticoides es el colesterol,

que puede sintetizarse de novo a partir de acetato o provenir

de la captación del colesterol plasmático, posiblemente la fuen­

te más importante. Las moléculas donantes de colesterol a la

adrenal son las lipoproteinas de baja densidad (LDL) y de al­

ta densidad(HDL), según las especies. El colesterol de las lipo­

proteinas se esterifica con ácidos graSos en las células adrena­

les, se deposita en el citoplasma en forma de gotitas lipidicas

y puede hidrolizarse a colesterol libre por acción de la enzi­ma colesterol esterasa.

La sintesis comienza en las mitocondrias con la ruptura

de la cadena lateral del colesterol por un sistema multienzi­

mático que lo hidroxila primero en el C20 , luego en C22 y fi­

nalmente una desmolasa lo convierte en pregnenolona y ácido

isocaproico. La formación de los corticoides tiene lugar por

acción concertada de enzimas microsómicas y mitocondriales a

partir de la pregnenolona [2].

Transporte

Los GCnaturales forman complejos con las proteinas del

suero. El complejo entre el GCy las proteinas séricas está en

equilibrio dinámico; su asociación es espontánea y se disocia

fácilmente en un medio fisiológico. Existen tres proteinas que

unen GC: albümina,al—glicoproteina ácida y transcortina (tam­

bién llamada CBG,“corticosteroid binding globulin").La afini­

dad de estas proteinas por los GCdepende de la temperatura,

es mayor a 4 ’C que a 37 °C. Cortisol y CORTson unidos prefe­

rentemente por transcortina; cuando los niveles de cortisol plas­

mático. que normalmente son de 10-20 pg/dl, superan los 30-40

pg/dl, el exceso es transportado por la albúmina. En condicio­

nes normales , el cortisol circula unido a transcortina en un

77,3 %,mientras que la albúmina une 15 Z y el 7,7 % restante

se encuentra libre. De acuerdo a la regla de la polaridad, la

afinidad de transcortina por CORTes mayor que para cortisol.

La importancia de las proteinas séricas transportadoras

de GCradica en que la hormona biológicamente activa es la li­

bre y no la unida a proteinas. Este hecho se manifiesta en la

mayor potencia biológica de los esteroides sintéticos, comola

dexametasona (0EX),que no se unen a transcortina y se encuentran

libres en la circulación [S].

En principio se reconoce a la albúmina como la más impor­

tante de las proteinas plasmáticas capaz de unir y transportar

ALDO[6].Existen también evidencias que la ALDOcircula en for­

ma no unida en una proporción de 30-40 Z, el resto estaria li­

gado a'dos proteinas: albúmina y transcortina [7].

Estructura de los receptores intracelulares

Los primeros pasos del mecanismo de acción de los GC en

sus células efectoras son conocidos razonablemente bien. El

esteroide se une en forma reversible a su receptor, que es una

proteina intracelular oligomérica, formando una unión no cova­

10

lente de alta afinidad, con una constante de disociación (Kd)

en el orden de nM[8].Bajo ciertas condiciones puede sufrir un

proceso de transformación (también llamado activación) median­

te el cual el complejo hormona-receptor adquiere la capacidad

de interaccionar con la cromatina y modificar la expresión ge­

nética [9].

A 37 °C los GCentran a la célula en segundos, probable­

mente por simple difusión, a través de la membranacitoplasma­

tica [10]. La entrada mediada por transportadores puede ocurrir

en algunos sistemas pero parece no tener una función regulado­ra.

Propiedades fisico-qgimicas. El estudio de las propieda4

des fisico-químicas de los complejos hormona-receptor ha reve­

lado que existen multiplicidad de formas. Según el modelo de

Sherman y col. [11], que se muestra en la Figura I-Z, el com­

plejo nativo (hole-receptor o complejo no transformado), esta­

bilizado por iones molibdato, es un tetrámero muyasimétrico

con un peso molecular de 320-350 kD y un coeficiente de sedimen­

tación (s20 w) de 9-10. El dimero seria un intermediario pocoestable y el monómeroel complejo transformado. Estos comple­

jos podrian asociarse a ribonücleoproteina formando agregados

o bien degradarse proteoliticamente originando fragmentos me­

nores. El menor fragmento, que contiene al sitio de unión es

una estructura globular de peso molecular 20-25 kD denominado

mero-receptor.

Holbrook y col. [12] analizaron los complejos formados

11

Tipo de Modelo 5201“ R5 PM_ a/bRecegtor Esguemático S m x10 ProladoI ,­Tetramem _%‘_‘, 9-10 8.0-8.5 320-350 12-l3

Dímero Cch 5-7

Manómero —-g 4-5 5.3-6.0 SO-llO 12-34

S\

Agregados l w >20 >lO >900

Fragment9(5) DO 3-4 2.5-4.0 40-70 3-7Intermedlo(s) l

MEI‘ÜI‘I‘ECEptDI‘ 2-3 l.9-2.4 20-25 1-3

F'gura I-2 : Modelo de formas de receptor de hormonas esteroidesde M. Sherman.

Se representan con circulos rellenos los fragmentos globulares que li­gan la hormona, los circulos punteados indican la posible presencia de sitiosadicionales. Los segmentos rectangulares denotan los fragmentos asimétricosde la molécula y las conecciones entre ellos los sitios sensibles a proteasas.RNPrepresenta ribonucleoproteina o fragmento ribosomal que se une a un núme­ro (n) desconocido de subunidades de receptor. 320,w : coeficiente de sedimen­tación, RS : radio de Stokes, Mr : peso molecular y a/b : la relación axial deun elipsoide prolado hidrodinámicamente equivalente [Tomadode Sherman y col.,J. Biol. Chem. 258 : 10366-10377 (1983)].

'12

en timocitos enteros y estabiiizados por molibdato, observando

dos especies principales que identificaron comoel recptor no

transformado, con las propiedades hidrodinámicas de] tetrámero

propuesto por Sherman y col. [11], y e] receptor transformado,

coincidente con e] monómero de] mismo modelo. Un tercer compo­

nente menor fue identificado comoe] mero-receptor.

E] receptor ha sido purificado utiiizando su propiedad

de unirse a ADNen su forma transformada,o por cromatografía

de afinidad obteniendo 1a forma no transformada [13,14]. Se han

obtenido anticuerpos policlonaies [15] y monocionaies [16] uti­

Iizados para estudiar su estructura. Comose muestra en 1a fi­

gura I-3 se han determinado tres dominios [15]. E1 dominio A

contiene ei sitio de unión para ei esteroide, el B e] sitio de

unión para el ADNy e] dominio C e] sitio de reconocimiento pa­

ra un anticuerpo preparado en conejos contra e] receptor puri­

ficado de higado de rata. Estos tres dominios se separan por

tratamiento de] receptor con enzimas proteoliticas. El dominio

C se puede separar de ios anteriores por tratamiento con a-qui­

motripsina seguido de filtración en ge] de agarosa o cromatogra­

fia en ADN-ceiulosa. La pérdida de] dominio C, ta] como se ha

observado en ciertos clones de iinfoma de ratón, resulta en re­

sistencia a 1a acción hormonaï.

Grupos funcionales. La inhibición de 1a unión de] esteroide

producida por el fosfato de piridoxai y 1a 1,2-ciclohexanodio­

na [17] parecen indicar 1a presencia de residuos de arginina y

lisina que podrian estar involucrados en 1a unión.

ESTEROIDE C

ADN ITripsino ot-QuimotripsnoPopomo TripsinoExtracto Po omolisosómico Ex rocto

lisosormco

Dominio A; Contiene sitio de union poro el ligondo." B: Contiene sitio de union poro ADN: .t' C: Contiene el determinante Inmunologico.

Figura I-3 : Dominios de] receptor de GC.E1 receptor presenta tres dominios, cuyas propiedades se indican

en ia figura. Los tres dominios pueden separarse por acción de enzi­mas proteoiiticas y de extractos iisosómicos. [Tomadode Caristedt­Duke y coi., Proc. Nati. Acad. Sci. USA79 : 4260-4264 (1982)].

14

El receptor de GCes una molécula fosforilada. Las pri­

meras evidencias de la fosforilación del receptor fueron apor­

tadas por Muncky col. [18] que propusieron un reciclado de

receptores dependiente de la carga energética de la célula.

Posteriormente se comprobó el efecto de las fosfatasas y sus

inhibidores [19,20] sobre la capacidad de unión del receptor

y su transformación. La presencia de grupos fosfatos en el

receptor no transformado quedó demostrada por marcación con

32Py análisis por electroforesis en geles de poliacrilamida

[21].

Los receptores de GCde higado y timo son sensibles

a reactivos de grupos sulfhidrilos. El tratamiento de los

receptores libres con estos agentes inhibe la unión del es­

teroide. Tambiénse encontró que.reactivos especificos de.

grupos sulfhidrilos inhiben la unión del complejo transfor­madoa ADN-celulosa. Estudios realizados utilizando cromato­

grafía sobre matrices reactivas con sulfhidrilos evidencia­

ron la presencia de sulfhidrilos diferentes involucrados en

la unión del receptor con el esteroide y del complejo trans­

formado con el ADN [22].

Factores estabilizantes de los receptores

Los reactivos reductores, protectores de sulfhidrilos,

tales comoel ditibtreitol (DTT)y el 2-mercaptoetanol esta­

bilizan las preparaciones de receptor de acuerdo al requeri­

miento de estos grupos. Otros factores agregados rutinaria­

15

mente a los medios de incubación son el gliceroi que dismi­

nuye 1a disociación de 1a hormona de] complejo, y e] EDTAque

al secuestrar cationes divaientes inhibe las proteasas calcio­

dependientes.

Otro factor estabiiizante muyutilizado a partir de las

observaciones de Pratt y su grupo [19] es e] moiibdato y o­

tros oxianiones de ios metales de transición de] grupo VI A

comoe] tungstato y el vanadato. Este efecto protector puede

atribuirse a diversos factores tales como1a inhibición de

fosfatasas y proteasas y también a través de una interacción

directa con e] receptor (23].

E1 1aboratorio de Pratt ha descripto 1a presencia de un

factor endógeno termoestabïe que impide 1a inactivación (pér­

dida de 1a capacidad de unir a] esteroide) y la transformación[24,

25 ]. Este factor ha sido identificado comotiorredoxina, plan­

teándose que 1a inactivación y Ia transformación son procesos

sensibies a una reductasa tiorredoxina-dependiente [25].

Otro factor termoestable impide 1a degradación de los

complejos hormona-receptor en citosoles de timo y céiulas de

leucemia Iinfocitica aguda. Se comprobó que este factor es 1a

calpastatina, inhibidor natura] de una famiiia de proteasas

neutras calcio-dependientes denominadascalpainas [26].

Transformación del complejo hormona-receptor

La proteina receptora puede ser considerada como el ver­

dadero mediador en 1a acción de Ios GC. La hormona seria un

16

ligando alostérico que promueve la transformación del Cumple­

jo hormona receptor a su conformación con mayor afinidal por

el ADN.Este evento fue descripto primero en sistemas lihres

de células, existiendo actualmente evidencias que ocurre en

células intactas [27]. Estos estudios han sido realizados

utilizando la propiedad de los receptores no transformados que

quedan más retenidos en intercambiadores aniónicos que los

transformados. Esta propiedad es consecuencia de la exposición

de cargas positivas sobre la superficie de la molécula que o­

curre en la transformación, favoreciendo la interacción con

polianiones, entre ellos el ADN.La resolución de estas fora

mas de receptores ha sido facilitada por el hallazgo que

el molibdato bloquea en forma reversible la transformación

[28]. La disponibilidad de anticuerpos contra receptores ta

hecho posible, por medio de la microscopía de inmunofluores­

cencia, demostrar que el receptor se encuentra en el citoplas­

ma y se transloca al núcleo en presencia de hormona en la cé­

lula intacta [29,30].

De acuerdo a lo expuesto, el receptor nativo sin unir­

se a la hormona existe como un oligómero en el cual la región

de alta afinidad por el ADNno está expuesta. Este oligómero

(posiblemente unteüfimero ) puede ser un homo-oligómero en el

cual todas las subunidades tienen un sitio de unión para el

esteroide, o un hetero-oligómero en el cual solamente las sub­

unidades homólogas son las que unen la hormona. En la trans­

17

formación se produciría una disociación del receptor oiigomé;

rico en un proceso termo-dependiente, liberándose los monó-°

meros con e] sitio de unión a1 ADNexpuesto en su superficie

[8]. El receptor no transformado está Fosforiiado y posee gru­

pos suifhidrilos reducidos, a1 transformarse se separarïa un

factor (posibiemente tiorredoxina) que estabiiiza al receptor

en su estado nativo e impide 1a transformación, y se desfos­

foriiaria exponiendo grupos cargados positivamente de amino­

ácidos básicos en su superficie [24]. Este modeio basado en

estudios en sistemas iibres de céïulas está de acuerdo con

los estudios reaiizados en céiuias enteras[12].

Modeiode] ciciado intraceiuiar de receptoresSe ha observado que el receptor adquiere 1a capacidad

de unir a] esteroide por un proceso que requiere energia pe­

ro que no es dependiente de 1a sintesis de proteinas [18],

postuiándose un modelo ciciico en 1a acción de] receptor de

GC. En 1a figura 1-4 se ilustra ta] modelo teniendo en cuenta.

gran parte de 1a información que se posee hasta ei momento[8].

E1 receptor inactivado adquiere la capacidad de unión

mediante una fosforiiación catalizada por una proteína quina­

sa, y se inactiva mediante una desfosforilación mediada por

una fosfatasa. La desfosforiiación de] compiejo homona-recep­

tor promuevesu transformación, iiberando un factor identi­

ficado como tiorredoxina. Esta se mantendría reducida por una

tiorredoxina reductasa y preservaria en estado reducido ios

18

SH

Ó F -_s

P WSI

I

u’

G Citoplasma Núcleo\\\

S \H

Figura 1-4 : Modeio de] cicio intraceiular de] receptor de GC.La unión del GC(G) a1 receptor iibre en estado activo (A) requiere

la fosforilación (P : grupo fosfato) del receptor y 1a disponibilidad degrupos sulfhidrilos (SH) que se mantienen reducidos por 1a presencia deun factor (F) que también inhibe 1a transformación. E1 complejo hormona­receptor (B) se transforma defosforilándose y 1iberando F. E1 receptortransformado (C), con cargas positivas en su superficie que faciiitan suinteracción con e] ADN, transioca a1 núcleo donde se asocia a1 ADNde 1acromatina (D). Ei receptor es reciclado a) citoplasma en una forma oxida­da (E) incapaz de unirse a1 esteroide si no es fosforiïado (requerimien­to de ATP) y reasociado a F recuperando sus grupos su1fhidrilos [Tomadode G. G. Rousseau, M01. Cel). Endocrinol. 38 : 1-11 (1984)].

19

sulfhidrilos necesarios para la unión del esteroide y la trans­formación. La tiorredoxina mantendría ocultos restos de ami­

noácidos tales comolisina , arginina e histidina necesarios

para la unión al ADN.

Este modelo cíclico es consistente con los estudios

cinéticos de Munck y Holbrook [31] cuyo modelo también predi­

ce el comportamiento agonista o antagonista de diferentes es­

teroides de acuerdo a su constante de velocidad de disociación.

Las relaciones biológicas de agonistas y antagonistas son ma­

temáticamente indistinguibles de las predicciones del modelo

alostérico de Sherman [32].

Regulación de la expresión genómica

Los GCcontrolan la expresión de genes transcripcional­

mente activos aumentando o disminuyendo la concentración de

ARNmensajero. Estos efectos pueden resultar de mecanismos

transcripcionales.o post-transcripcionales. La inducción de

ARNde virus de tumor mamario de ratón (MMTV:murine mammary

tumor virus) depende de la presencia de determinadas regiones

en el ADNdel pro-virus. Estas regiones se comportan como es­

timuladores de la transcripción. Los genes inducibles por GC

pueden retener la sensibilidad a la hormona luego de ser trans­

feridos a una célula heteróloga por técnicas de transfección.

Los genes no inducibles pueden adquirir esta propiedad si se

los liga a la región promotora de un gen inducible [9,33,34].

Sin embargo la complejidad del mecanismo o de los meca­

20

nismos queda evidenciada por las diferentes regiones del ADN

que contienen secuencias afines al complejo hormona-receptor.

Se han determinado estas secuencias cerca de las zonas promo­

toras de los genes inducibles en la zona anterior a la del

comienzo de la transcripción (pares de bases -50 a -300), en

diversas regiones del ADNtranscribible, en el primer intrón

de un gen inducible y en regiones muy alejadas anteriores al

sitio de iniciación ( a más de 2600 pares de bases) [9,33-39].

Los mecanismos propuestos para la inducción del gen de

hormona de crecimiento en cultivos de células de tumor de hi­

pófisis de ratas incluyen : (a) estimulación directa de la

transcripción no dependiente de sintesis proteica; (b) estimu­

lación de un intermediario estable que aumenta el efecto induc­

tor de la hormona tiroidea; (c) aumento de la estabilidad del

ARNmensajero; (d) alteración de la poliadenilación del RNA

(figura I-S) [40].

Mecanismos de acción no genómicos

Existen en la literatura diversas descripciones de efec­

tos de hormonas esteroides cuyo mecanismo no es fácilmente ex­

plicable con el modelo genómico [41]. Estos efectos , carac­

terizados por la rapidez con que se producen, incluyen la al­

teración de la composición y funciones de las membranas, e­

fectos anestésicos, modificación de la excitabilidad celular,interacción con nucleótidos ciclicos y efectos sobre el trans­

porte de metabolitos. Para los GCse pueden mencionar la re­

21

W>,Ll_ GEN lDirecto/@*1

® I ARNm l Poli AJ\—e u 1Ir

Degradado I‘ ¿Intermediario?)

Figura I-S : Mü1tip1es efectos de Ios GCsobre 1a expresióngenética.

E1 compïejo hormona-receptor puede actuar a1 menos de cuatro ma­neras diferentes sobre 1a expresión genética de] gen de 1a hormona decrecimiento en cuitivos de cé1u1as hipofisarias. Primero, infïuenciasdirectas sobre 1a transcripción. Segundo, existe un efecto potenciadordd efecto sobre 1a transcripción de 1a tri-iodotironina que tarda enaparecer. Tercero, efecto estabiïizador de] ARNm.Cuarto, puede afec­tar 1a longitud de 1a coïa de poIiA.[ Modificado de Lan y co]., J.Steroid. Biochem. 20 : 77-88 (1984)].

22

troaiimentación negativa rápida de 1a seCreción de ACTHque

se produce sobre los tejidos neuroendócrinos [42,43] y ios e­

Fectos sobre ia excitabiiidad nerviosa y la transmisión sináp­

tica [44].

Los mecanismos propuestos involucran interacciones rá­

pidas de ios esteroides con las membranas en Forma directa

debido a sus propiedades lipofilicas o bien por medio de re­

ceptores de membrana [41]. Towle y Sze [45] describieron si­

tios de unión especificos para GCen membranas sinápticas pu­

rificadas de cerebro, diferentes a ios receptores citosóiicos,

y los reiacionaron con e] aumento de ia captación de tripto­

fano producido por ios GC.

23

ESTRUCTURA Y FUNCION

DE LA MEDULA ESPINAL

CELULAS_QQ¿_;E

Neurona

Es la unidad genética, anatómica, trófica y funcio­

nal del SN. Todas las vias nerviosas, los circuitos y arcos

reflejos están compuestos por unidades neuronales dispues­

tas de manera simple o compleja.

Cada neurona posee un cuerpo celular o soma (figura

I-6) que contiene neurofibrillas, cuerpos de Nissl (masas

de reticulo endoplásmico granular), aparato de Golgi, mito­

condrias y diversas inclusiones como pigmentos y lípidos.

Del cuerpo neuronal se expanden una o más prolongaciones

que constituyen las dendritas y el axón.

El axón es una prolongación larga y delgada que surge

de una región de protoplasma conocida como el cono de implan­

tación. En el extremo distal cada axón se ramifica en arbo­

rizaciones terminales, el teledendrón. El axón contiene mi­

tocondrias, neUrofilamentos, microtübulos y reticulo endo­

plasmico liso, pero carece de reticulo endoplásmico rugoso

y ribosomas. Los axones pueden ser mielinicos o amielinicos.

La vaina de mielina es formada y mantenida por los oligoden­

drocitos y está compuesta por capas concéntricas de lípidos

y proteinas; está interrumpida por constricciones a inter­

24

F ­NUCLEO'., ,/ . '7':\' /i

, f , / Í MITOCONDRIAj ' ‘ RETICULO ENDOPLASMICO( n nucoso

, , / a " SINAPSIS,7 / /

/,

VAINA DE MIELINA—-/

f

y If/¿l I’k> i

Figura 1-6 : Cuerpo ceïular de una neurona.Contiene materia] genético y e] complejo aparato metabóiico co­

müna todas 1as céïuïas. A diferencia de 1a mayoria de las otras cé­1u1as, sin embargo, ias neuronas no se dividen después de1 desarroïioembrionario; 1a dotación original de un individuo debe servir para to­da 1a vida. Hay diversas dendritas y un ünico axón que sa1e de] cuerpoceiular. E1 cuerpo ceiuiar y ias dendritas están cubiertos de sinápsisestructuras en forma de botón donde se recibe 1a información de otrasneuronas. Las proteinas se sintetizan en e] reticuïo endopïásmico. Unsistema de transporte distribuye proteinas y otras sustancias del cuer­po ceiuiar a ios iugares donde se requieren.[50].

¿a

valos regulares conocidos comoextrangulaciones de Ranvrsr.

En el SN periférico los axones se hallan rodeados por 2-;

membrana suoerficial, la vaina de Schwann [46].

NegrogliaEstá constituida por los elementos celulares que for­

man el tejido instersticíal del SN. En los mamíferu las cé­

lulas de la neuroglia exceden en número a las neuronas. A

diferencia de estas la neuroglia conserva toda la vida la

facultad de dividirse, no genera potenciales de acción y no

produce ni recibe sinápsis.

En el SNCse reconocen dos categorias de células de

sostén, la macroglia y la microglia. La macroglia está for­

madapor astrocitos y oligodendrocitos. Los astrocitos son

célllas estrelladas con gran número de prolongaciones que

desempeñan un papel importante en el flujo iónico y en la

regulación del metabolismo de la neurona. Los oligodendroci­

tos son más pequeños y con menos ramificaciones y están in­

volucrados como intermediarios del metabolismo neuronal,

como células de evacuación y como formadoras de la vaina de

mielina.

La microglia está constituida por pequeñas células

con prolongaciones ramificadas, y está considerada comoel

sistema de "limpieza" del SN, estando sus células capaci­

tadas para transformarse en macrófagos, migrar a través del

neurópilo y autolisar o fagocitar [46].

_26

BIOQUIMICA DEL SN

Las neuronas poseen la maquinaria bioquimica común

a todas las :élulas vivas especializándose, a diferencia

de las otras células, en la transmisión de los impulsos ner­

viosos, lo que implica la necesidad de mantener gradientes

iónicos y sintetizar y liberar un elevado número de mensa­

jeros quimicos: los neurotransmisores.

Metabolismo energético

El SNCes el consumidor de energia más activo del or­

ganismo, hecho que queda reflejado por su amplia irrigación

y por su activo consumo de oxigeno. El cerebro, siendo el

2 % del peso corporal, consume el 20 % del oxigeno en repo­

so. Se cree que este gasto energético obedece a la necesidad

de mantener unos gradientes iónicos a través de la.membra—

na de las neuronas.

A diferencia de otras células, las neuronas no pueden

utilizar en condiciones normales diversos combustibles como

ciertos azúcares, lípidos y aminoácidos, dependiendo exclu­

sivamente de la glucosa sanguínea. Tampoco pueden funcionar

en anaerobiosis, dependiendo enteramente del metabolismo

oxidativo.

Transporte axónico

Las neuronas del SNCdel adulto no pueden ser reempla­

zadas y por lo tanto deben existir mecanismos que permitan

la renovación de todos sus elementos, inclusive aquellos

situados a distancias considerables del cuerpo celular de

la neurona.

Se na observado un movimiento constante de proteinas

y otro componentes procedentes del soma celular y dirigido

hacia la sinápsis, recorriendo toda la longitud del axón.

Existen distintos sistemas de transportes, lentos o más ra­

pidos, que fluyen en ambas direcciones, de y hasta los ter­

minales de los axones. Ambos mecanismos parecen involUCrar

un gran número de proteinas fibrosas observadas por micros­

copia. electrónica.

Neurotransmisign

Cuando una neurona recibe un impulso nervioso de una

célula vecina sufre una despolarización local debido a la

apertura de los canales de sodio, que entra disminuyendo.

el potencial negativo de reposo. De esta manera se propaga

el impulso a lo largo del axón y dendritas, cerrándose inme­

diatamente los canales de sodio y abriéndose los de potasio

para restablecer el potencial negativo normal.

Cuando el impulso llega al terminal sináptico, se pro­

ducen una serie de eventos que culminan en la liberación de

los neurotransmisores almacenados.

Los neurotransmisores pueden dividirse en tres grupos:

a) aminas biogénicas: catecolaminas (dopamina, noradrenalina

y adrenalina), serotonina, acetilcolina. histamina.

b) aminoácidos: glutamato y aspartato (excitatorios), y-ami­

28

no butïrico (GABA),glicina, alanina y serina (inhibitorios).

c) neuropéptidos: encefalinas, sustancia P, neurotensina,

p-endorfina, adrenocorticotrofina (ACTH),angiotensina ZZ,oxitocina, vasopresina, polipéptido intestinal vasoactivo(VIP), somatostatina, hormonaliberadora de tirotrofina

(TRH). bombesina, etc.

Las moléculas de transmisor liberadas cruzan el espa­

cio entre el terminal del axón y la membrana de la neurona

receptora, interactuando sobre sus receptores especificos

situados en la membranapost-sináptica. La interacción pue­

de provocar la excitación o inhibición de una neurona, la

contracción de una fibra muscular o la sintesis o secreción

de una hormona en una célula glandular. Estos acontecimien­

tos se producen por alteración de la permeabilidad de la

membrana, por efecto directo del complejo neurotransmisor­

receptor sobre proteinas de membrana o por mecanismos más

lentos mediados por nucleótidos ciclicos.

Posteriormente la molécula de transmisor debe ser rá­

pidamente inactivada. Algunos transmisores son inactivados

por enzimas situadas en el espacio sináptico como la acetil­

colina, otras comola norepinefrina, dopamina . serotonina

y GABAson reabsorbidos por el terminal del axón para ser

degradados o bien recuperados (figura [-7). La comprensión

de las distintas etapas de la transmisión sináptica ha aca­rreado al esclareCMfiento del modo de acción de las drogas

29

TERMINAL“CHOCO

WOS'NAHINOIILASÁ

5l ÁDeu "msm" oz LAMEM-¡nm

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ihi.

rossovnortm.FUSIAIASA'NACTNAOW

Figura I-7 : La Transmisión quimica.Se representa e] proceso de transmisión en una sinápsis de nor­

epinefrina. En primer 1ugar e] neurotranSmisor se sintetiza en 3 eta­pas a partir de] aminoácido tirosina y se aïmacena en vesículas. La11egada de] impuiso provoca 1a entrada de iones calcio, induciendo 1aiiberación de 1a norepinefrina a1 espacio sináptico. Las moiécuiasde transmisor se unen a sus receptores especificos de 1a membranapost­sináptica produciendo efectos a corto p1azo (eiéctricos) y a 1argo pia­zo (mediados por AMPC).E1 efecto termina por una rápida reabsorciónhacia e] pie de] termina] o por degradación enzimática del neurotrans­misor. Los receptores presinápticos median 1a inhibición de 1a sintesisde] neurotransmisor. [47].

30

psicoactivas [47-49]­

EEELLQMJJL_EE_;ETJÏE

Anatomia macroscópica

La MEes una estructura larga y cilindrica, revesti­

da por las meninges, que se encuentra dentro del conducto

raquideo o vertebral. Se extiende desde el agujero occipi­

tal, donde se continúa con el bulbo, hasta el borde inferior

de la primera vértebra lumbar. Tiene dos ensanchamientos,

el cervical y el lumbar, cada uno de ellos relacionado con

las raices que inervan, respectivamente, a las extermidades

superiores e inferiores. En sentido caudal al engrosamien­

to lumbar, la MEespinal presenta una terminación cónica,

el cono medular ("conus medullaris"). Una condensación de

la piamadre, que se extiende caudalmente desde el cono medu­

lar, forma el "filum terminale".

Mientras que la MEes una estructura continua, no seg­

mentada, los 31 pares de nervios espinales asociados con

regiones localizadas producen una segmentación externa.

Sobre la base de esta segmentación externa, se considera

que la MEestá compueta por 31 segmentos, cada uno de ellos

recibe y a la vez suministra pares de filamentos dorsales

y ventrales. Los segmentos medulares se encuentran dividi­

dos del siguiente modo: 8 cervicales (C), 12 torácicos (T),

S lumbares (L), 5 sacros y 1 coccigeo en el humano y 8 C,

31

13 T, 6 L y 4 sacras en la rata [51].

Hasta el tercer mes de vida fetal la MEocupa el con­

ducto ver:e:ral en toda su extensión, pero pasado ese mo­

mento, el creciniento diferencia] de la columna vertebral

excede al de la ME. Al nacer el cono medular está próximo

a la vértepra L3; en el adulto se encuentra entre las vérte­

bras L1 y L2 y ocupa solo los dos tercios superiores del

conducto vertebral. Los sitios por donde emergen los nervios

espinales no varian, pero se produce un alargamiento de los

filamentos radiculares entre los agujeros intervertebrales

y la ME, mas pronunciado para las raices espinales lumbares

y sacras. Estas raices descienden por una distancia consi­

derable dentro del saco dural antes de alcanzar a sus res­

pectivos agujeros intervertebrales. El gran númerode rai­

ces lumbosacras que rodean al "filum terminale" recibe el

nombre de cola de caballo ("cauda equina”). Los nervios

espinales emergen desde el conducto raquideo a través de

los agujeros intervertebrales (figura I-8).Estructura interna

En cortes transversales la MEconsta de una sustancia

gris central en forma de mariposa y un manto de sustancia

blanca que lo rodea.

La sustancia gris contiene células nerviosas y sus

prolongaciones. El predominio de neuronas. neuroglia y capi­

lares le imparte una consistencia densa. Cada mitad de la

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Segmento L4

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Figura 1-8 : Anatomia de 1a ME.A : Posición de 10s segmentos de 1a MEcon referencia a ios cuer­

pos y apófisis espinosa de ias vértebras; B : vista posterior que mues­tra ios filamentos radicuiares dorsaies y ios ganglios espinaies ; C :esquema de algunos segmentos de 1a MEa diferentes niveies, que permiteapreciar variaciones en 1a forma, tamaño y topografía de ias sustanciasgris y bianca. [46].

33

MEtiene una columna gris posterior (sensitiva) o asta que

se extiende casi hasta la superficie y un asta o columna

gris anterior (motora) que se extiende hacia adelante pero

sin llegar hasta la superficie. En los segementos toráci­

cos se observa un asta lateral pequeña y afilada. La comi­

sura gris, que conecta a la sustancia gris de ambos lados,

circunda al conducto central o conducto del epéndimo.

La sustancia blanca, que rodea a la sustancia gris,

contiene escasos cuerpos neuronales o dendritas, pero está

compuesta por fibras nerviosas mielinicas y amielinicas

ascendentes y descendentes y sus células neuróglicas de sos­tén.

Los diferentes niveles de la MEmuestran variaciones

en cuanto forma y tamaño, en la cantidad relativa de sustan­

cias gris y blanca y en la disposición y configuración de

la sustancia gris (figura I-8). Las columnas grises alcan­

zan su punto máximo en los engrosamientos cervical y lumbar,

que están asociados con los nervios más importantes que

inervan a las extremidades [46].

Fu_NsIC>_N9_E_LA_M_E

El SN del humanoha heredado caracteristicas especi­

ficas de cada etapa de su desarrollo evolutivo. De ellas

permanecen tres niveles distintos del SN que poseen una

especial importancia funcional: el nivel de la ME, el ni­

Vel bajo del cerebro y el nivel cortical o cerebral alto.

Muchas de las actividades autonómicas o subconcientes

del Organismo, como ser el control de la presión arterial

y la respiración, son controladas en la región baja del ce­

rebro (bulbo raquideo, protuberancia, mesencéfalo, hipoté­

lamo. cerebeïo y ganglios basales). La corteza cerebral,

en cambio, es fundamentalmente una vasta región de almacena­

miento de información (experiencias pasadas, formas de res­

puestas motoras, etc.). En ella OCUrren también los proce­

sos del pensamiento.

Reflejos medulares

La MEde los mamíferos mantiene aún las funciones de

los animales multisegmentados. Las señales sensoriales se

transmiten a través de los nervios espinales a cada seg­

mento de la ME, causando respuestas motoras localizadas.

Las respuestas motoras de la MEson automáticas y ocurren

instantáneamente en respuesta a la señal sensorial. Además

siguen ciertos mecanismosespecificos denominados reflejos.

La Fiqura [-9 ilustra dos de los reflejos espinales

más simples. A la izquierda se muestra el control neural

del reflejo de estiramiento o miotático. Si un músculo es

distendido se estimula un receptor y un impulso nervioso

es transmitido a través de un nervio sensorial a la ME.

La fibra nerviosa que :ransmite el impulso penetra en laIsustancia gris por el asta posterior gsensitiva) y realiza

35

figura I-9 : Refïejos medulares.Esquema de] camino seguido por e1 impuiso nervioso y 1as sinap­

sis de dos tipos de refiejos meduiares : a 1a izquierda e] refïejo deestiramiento o miotático en e] que se reaiiza un soio contacto sinápti­co y a 1a derecha e] refiejo que invoiucra diversas conexiones neurona­les.

36

SjnápSÍS con una motoneurona ubicada en ei asta anterior

(motera). A su ve: esta io transmite a través de un nerVio' Lo, perUC1endO su contracción.motor a? e5ec.3r, ei núscui

La contracción producida se opone a] estiramiento originaï,

por Io cuaï este refiejo actúa como un mecanismo de retro­

alimentación impidiendo variaciones en la iongitud de]

músculo. Estos reflejos permiten a un individuo mantener

las partes del cuerpo en 1a posición deseada pese a! efecto

de fuerzas externas, como 1a gravedai, que tienden a sacar­

lo de su postura. Estos refiejos reciben e] nombre de anti­

gravitacionales.En 1a figura I-9, a 1a derecha , se iiustra un refie­

jo polisináptico: el refiejo Flexor. Este es ¡a respuesta

a estímulos nocivos (dolorosos) y consiste en 1a contracción

de varios múscuios fiexores e inhibición de extensores, pro­

piciando un rápido retiro de] miembro afectado de] sitio

de donde orovino ei estimulo.

Ademásde estos efectos se producen sinápsis a neuro­

nas que, a través de ias fibras de ias sustancia oïanca,

transmiten 1a información por vias ascendentes a otras re­

giones de] SN, que a su vez envian resouestas motoras en

forma semejante por las vias :escendentes de 1a ME.

Funciones de ia MEluego de exzraer el cerebro

Las Funciones de ia MEquedan ilustradas con ias fun­

ciones refiejas que se mantienen en el“anima1 espinai",

37

iuego de extraer ei cerebro:

a) Ei animai puede pararse. Se debe a reflejos iniciados

en ias sientes, cuyas señales sensoriales aroducen ia ten­sión Je ios múscuïos de ios miembros.

b) Si el animai se mantiene suspendido sus miembros comien­

¿an a hacer movimientos ie marcha. Eszo demueszra que ¡os

reflejos básicos de ia iocomoción se encuentran en ia ME.

c) Mantiene ei refiejo de rascado, locaiizando e} lugar

en ia piei en ia que se produjo e] estimulo.

d) Se producen reflejos iocaies de vasoconstricción y vaso­

jiiatación en Ea piei (control de ia temperatura).

Estos refiejos demuestran que muchas de ias activida­

des diarias son controiacas por la MEy que ei cerebro tie­

ne sobre elias una influencia moduladora [52,53].

CORTICOIDES Y SISTEMA NERVIOSO

gSRTïCOIDES SOBRE EL SNy C) I<) r“ K)Z l) Í’Ïl Il ‘J ui

Los esteroides adrenales ejercen cambios de gran im­

portancia en el funcionamiento del SN. Los GCafectan el

crecimiento y la diferenciación de las células nerviosas

[54] y poseen influencias sobre los procesos del comporta­

miento [55], el sueño [56] y en la adaptación del organis­

mo al medio ambiente [57]. El exceso de GC conduce a estados

psicóticos [55] y acelera al envejecimiento nervioso [58].

Los MCregulan el balance de electrolitos y el apetito sa­

lino [S9],y en ciertas circunstancias pueden intervenir

en los procesos adaptativos [60]. Los GCtambién actúan so­

bre el cerebro y la hipófisis inhibiendo la sintesis y la

liberación de ACTHy CRF [42,43,61].

Los GC son drogas de amplia difusión en la clinica

médica. Entre las patologías del SN tratadas con estas hor­

las lesiones, edemasy tumores intra-cra­

¿62-511. Para ello seutilizan generalmente los cor­

ticoides sintéticos, tales como la dexametasona (DEX)y

la metil-prednisoïona, lada su mayOrpotencia debido a su

resistencia a la degradación. baja afinidad a la :ranscor­

tina y mayor afinidad por el receptor de GC.

sobre la quimica y Función del cerebro

Una estrategia comúnmenteutilizada para detectar los

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NUMERO DE FRACCION

Figura I-10 : Efecto de] bloqueo de ios receptores de GCsobre e] perfi] de sedimentación de (3H)-ALDOen citosolde HC.

La centrifugación en gradiente de giiceroi fue realizada concitosoï incubado con (3H)-ALDO10 nMsolamente (o ) o en presenciade] bioqueante de receptores de GC, RU26988, 100 veces en exceso(o ). [Tomadode H. Coirini, tesis doctora], 1984].

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Figura I-11 :

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Distribución regiona] de receptores citosó­Iicos para GCy MCen cerebro de rata.

Citosoïes de hipófisis anterior (Pit), hipotáïamo (Ht), areapreóptica (Apo), septum (Sep), hipocampo (HC), amígdaïa (Amg), cor­teza cerebra] (Cx) y cerebeïo (Cb) fueron incubadas con 1os esteroi­des tritiados a 0-4 °C durante 4 h (CORTy DEX) o 20 h (ALDO). Lahormona 1ibre se separó de 1a unida por fiïtracíón en minicoïumnasde Sephadex LH-20. [TomadoH. Coirini, tesis doctora], 1984].

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elias para ios 3 esteroides ensayados. Si orden ie compe­

tencia fue : TA > DEX>> RU 26988 >>CORT = progeszerona >

ALDO>>estradiol = testosterona, demostrando buena especi­

Fieidad para GCactivos y para ia progesterona, un bioquean

te ¿ei receptor de 3C ¿36,123'.

'¿ ' hibición producida por el su Juro [82,124] RUI ¡u ._¿ :1

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sugiriendo una inhibición le ÏÍDO mixta.

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0.05).

En otros exnerimenzos la distribución de ios :itios

de unión Fue determinada en cinco zonas de ia ME. En ¡a fi­

Í-ï se .oserva cue existen mayores concentraciones en

ias regiones JUQcontienen ios engrosamiencos cervicai (zo­

na 3) v ïumbar (D); y por ANOVAy el test de Newman-Keuis

existen diferencias significativas entre estas regiones y

1a zona E que contiene; 1a coia de cabaïio y e] "fiium ter­

minaie", con ei menor número de sitios. Las otras regiones

escudiadas, las zonas a y C, presentaron concentraciones me­

nores, pero no significativamente, a aqueiias regiones que

contienen los engrosamientos cervical y lumbar.

ONTOGENIA_

Los resú:adai de la Figura II-IO comniran e] número

de sitios de unión de (3H)—DEXen citosoi ¿e ME de ratas ie

distintas edades. En escos estudios se uciïizaron dos méto­

do" jiferenzes. En ei primero se utiiizaron animaies con

las adrenaïes intactas, por Eo que fue necesario adaptar un

método ie intercamoia usaCc reviamenze en nuestro iabora:o—

'26} para ¿eterminar sitios totales, y no iibres.a 1a WE. Citosoi je ratas ADXse dividió en dos aïïcuotas;

una de las mitades se preincubó con CORT10 nM, qre es una

concentración simiiar a ia que circula en Forma libre en ia

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Fi ura II-9 : Distribución zona] de ios sitios de unión deÍ3HÍ—DEX en ia ME. 3

La unión se estudió iuego de incubar citosoi con ( H)-DEX 10 nMdurante 22 h a 0 °C en TEMGcon moiibdato. La disección de ia méduiase reaiizó en secciones comprendidas entre ias vértebras: sección A:C1-C2; B: C3-C7; C: T1-T8; D: T9-L3 y E: L4-L5. Las secciones B y Dcontenían los engrosamientos cervical y iumbar, mientras que 1a sec­ción E contenía 1a cola de cabaiio y el "fiium terminaie". Los resul­tados se expresan como Z de unión respecto a 1a sección D, que se to­mó como 100. Cada coiumna representa ia media i E.S. de seis experi­mentos, cada uno de ellos realizado con e] tejido obtenido de dos mé­duias.* : p <0,05 vs. unión en la sección E.

80

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Edad (dias)

¿ig_u¿«_a_ig_—;9_: Ontogenia de ia unión de (3H)-DEX en 1a HE.Se utilizaron ratas con adrenaies in:¿ctas (o) de ias edades que

se indican en ia abscisa. La unión total se ¿eterminó en citosoles in­cubados con (3H)-DEX 30 nM durante 3 h a 20 ’C, en TEMGcon molibdato.Este procedimiento permite aproximadamente un 90%de intercambio entreios corticoides endógenosunidos y e] iigando tritiado (ver Resultados).También se utilizaron ratas ADX(o), determinando Ia unión a 0 °C 22 hcon (3H)-DEX 20 nM Se representa 1a media y e] E.S. ,g : p <0,05 vs. la unión a los 2, 4 y 8 dias del respectivo grupo.

81

rata [S] y satura a] receptor de GCdei cerebro [78,31],

durante 60 min a J “C: Ia otra mitad Fue preincubada sin

agregados. Luego amoas aiicuocas fueron incubadas con k H)­

DEX 30 nM durante 3 h a 20 aC en presencia de molibdato

20 nM. La unión en e! citosoi preincubado con CORTfue e]

88 + 6 Z (n=3) del contro], demostrándose asi un intercam­

bio casi compieto.

En e] segundo método se utilizaron ratas ADX24 h

.antes, y la determinación de ios sitios de unión se realizó

siguiendo 'a técnica utilizada para el citoso] de aduitos

ADX(materiaïes y métodos). Con ambos procedimientos se de­

tectaron pocos sitios a los 2 y 4 dias de edad, y un peque­

ño aumento apareCi en e] octavo dia. En ios dias 13-14 105

sitios ie unión alcanzaron ei nivel de ios animaïes preoú­

C ¡.

¿SCUSIQLN

Estos resultados , en concordancia con el trabajo de

tios de.4.Clark y col. {97] demuestran que la MEcontiene s

unión para (3H)-JEX semejantes a los receptores de los GC

descriptos en otras regiones del SN. Al igual que el recep­

tor del cerebro la unión en la médula fue dependiente del

tiempo, mostrando estabilidad a 0 °C y siendo rápidamente

inactivado a 20 °C[80,127,128] . El molibdato aumenta la u­

nión y la estabilida. de la misma especialmente a alta tem­

peratura, lo cual .oincide con las propiedades de los recep­

tores de hormonas esteroides [125,129] . Los receptores de

eSteroiJes son considerados actualmente fosfoproteinas que

el noiibdato activa impidiendo su defosforilación [20,21,

129] , en vista de su capacidad para inhibir fosfatasas

{19}. Ademásel molibdato puede estabilizar a los sitios de

unión por inhibición de la proteólisis como mostraron Shermanpy col. [11] en órganos efectores de os uC.

Los sitios c unión de GCen la MEpueden diferenciar­

se de las proteina: plasmáticas que unen esteroides ya que

la (“H)-JEX no es unida en el plasma de rata [114.115] y

además por el hecho oe requerir grupos sulfhidrilos intactas

que no intervienen en la unión en suero [80] . En concordan­

cia con informes anteriores sobre el receptor de GCdel ce­

rebro [80,128], la unión en la MEFue notoriamente disminui­

83

da por los bloqueantes de sulfhidrilos p-cloromercuribenzoa­

to y N-etilmaleimida.

La unión de (3H)-CORT mostró una afinidad menor que la

de (3H)—DEXy un número de sitios similar. Estos datos coin­

ciden con la afinidad que se obtiene a partir de la RBA

(Kd = Kd x (lOO/RBA )) por lo que se podria dedu­comp dex comp

3H)-DEX comparten un mismoCir que "in vitro“ (3H)-CORT y (

sitio especifico para GC, Además la afinidad menor de la CORT

el GCnatural de la rata, es consistente con la RBAen cito­

sol de higado y timo de la rata, que es aproximadamente la

cuarta parte que la de DEXluego de una incubación prolonga­

da a 0 °C [120,130]

La RBA de la ALDO(7,1%), la testosterona y el'es­

tradiol (<11) fue baja, evidenciando que estos no son los li­

gandos naturales de estos sitios de unión.La relativa poten­

cia de la progesterona para competir con la unión de (3H)-DEX

es consistente con su actividad de bloqueante del receptor de

GCy anti-inductor, lo cual es un hallazgo frecuente en diver­

sos sistemas experimentales, incluyendo cerebro [80,123].

Los efectos del RU 25988, un GC puro {82,124} se estu­

diaron por saturación utilizando una única concentración de

(3H)-DEX. y por despla­

(3

RU26988 variando la concentración de

zamiento de la unión de una concentración fija de H)- DEX

con RU 26988 en un rango de 10-1 OOOnM.Ambos estudios evi­

dencian un comportamiento no competitivo, como queda refle­

84

jado en la variación de Nmaxy de Kd, y por la diferente pen­

diente del RU26988 respecto a los demás competidores. Esta

inhibición mixta puede explicarse según un modelo alostérico

de Sherman del sitio de unión en el cual el competidor puede

unirse a un segundo sitio alterando la ocupación del ligando

trazador [32]. Alternativamente puede postularse la presen­

cia de una población de sitios de unión compleja, con sitios

que reaccionan de una manera diferente a ligandos y compeíi­

dores. La heterogeneidad de receptores ha sido un hallazg

frecuente en otras regiones del SN [83,89,105].

Los perfiles de unión en los gradientes de glicerol,

fueron simétricos evidenciando que en presencia de molibda­

to no se degradaban y la especie identificada corresponde.

al receptor nativo no transformado) u holoreceptor, simi­

lar al encontrado en otros tejidos [11,12.84].

La concentración de los sitios de unión en la MEfue

la mitad de la mostrada por el HC, una región reconocida

por su alto contenido de receptor GC [105]. El bulbo raqui­

deo y la protuberancia tuvieron valores semejantes a los e

la médula, que a juzgar por resultados anteriores podria te­

ner cantidades suoeriores a otras regiones del cerebro sen­

sibles a los GC [84}. Dentro de la ME hubo tendencia a una

mayor unión en los engrosamientos cervical y lumbar enrique­

cidos en sustancia gris y una disminución en la zona termi­

nal, que comprencia DríncindÍmEHCEfibras nerviosas (L4-L6,

85

cola de caballo y "filum terminale"). La detección de si­

tios en esta región prueba que la sustancia blanca es teji­

do blanco de los GC. En forma semejante a lo que sucede en

el nervio óptico [65] , en la MElos sitios podrian origi­

narse en las células gliales. La mayor unión detectada en

los engrosamientos Sugiere que los cuerpos neuronales de la

sustancia gris podrian ser también efectores.El desarrollo de los sitios con la edad en la MEre­

cuerda la ontogenia del receptor GCdel cerebro. En la mé­

dula la concentración de sitios fue baja después del naci¿

miento aumentando lentamente hacia el final de la primera

semana y luego más rápidamente hasta alcanzar los valores

del adulto en la segunda semana. Olpe y McEwen [94] infors

maron que la concentración de sitios de unión de (3H)-DEX

en el hipotálamo y el HC fue minima al primer dia y luego

aumentaba hasta el dia 15 en que alcanzaban los valores del

adulto.

La caracterización de los sitios de unión de los GC

en la MEsugiere que la acción de estas hormonas puede me­

diarse por estos sitios. En la literatura existen informes

que aseveran que los corticoides influyen en el Funciona­

miento de la ME. En una revisión realizada por Hall [44]

se resumen las evidencias existentes de la acción de los

GCsobre la excitabilidad nerviosa y la transmisión sináp­

tica, determinada por métodos electrofisiológicos. En la

86

región Iumbar. a1tas dosis de metiiprednisolona modifica­

ron los potenciales de reposo de las motoneuronas de ia mé­

du1a de gato con hiperpolarización de membrana [44]. Los GC

modifican 1a sintesis, iiberación y recaptación de ios neu­

rotransmisores [44], Hal] y McGinley [98] observaron que una

única dosis de metilprednisoiona tiene marcados efectos so­

bre e] contenido de aminas biogénicas en 1a médula lumbar,

Otros investigadores demostraron que Ios corticoides promue­

ven la recuperación funciona] luego de 1esiones de 1a ME

[44] y que son de valor en e] tratamiento de enfermedades

degenerativas[131]. Este úitimo efecto puede estar relacio­

nado con 1a observación de que administrando altas dosis de

GC se inhibe 1a peroxidación lipidica en 1a ME [99]

Experimentos posteriores deberán demostrar si e] me­

canismo clásico de acción de hormonas esteroideas que inclu­

ye dos pasos, 1a unión de] esteroide a] receptor y 1a tras­

Iocación a] núcleo de] receptor transformado, es e] que ac­

túa en 1a médula. De Io contrario, puede ser necesario pos­

tuiar un mecanismo no genómico para explicar ios efectos

rápidos de ios GCsobre ias funciones electrofisiológicas

de 1a ME [44], mediado por una interacción previa de 1a hor­

mona con su sitio de unión [132,133].

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MATERIALES v METOQQ;

3) m \) n r1 ¡o ¡rnIr­ U') 2NIMA5.3ELE}PEEMELÏBSIONJ DI Ea

Se utiiizaron ratas macho de ia cepa Nistar de 150­

250 g ie peso, mantenidos, tratados y saCrificados como ya

se describió en LL. E1 SN fue extraido separando Ia MEy

El HCde acuerdo ai procedimiento de rutina de] 1aboratorio

[134,11].

WHQL ¿5-5211929,5¿JJLLQLEJLOE99139.3-29[fifilflñïE1 tejido nervioso se homogenizó en alguno de los si­

guientes “buffer” : TEMG(Tris 10 mM, ESTA 1,5 mM, 2-mercap­

toetanoi 2 mMy giiceroi 10% (v/v), pH 7,4), TEMG+M0(TEMG,

moiibdato de sodio 20 mM) o TEMG-Mo(TEMG, cloruro de pota­

sio 30 mMcara igualar ia conductividaj a 1a dei TEMG‘Moïll]

Luego de centrifugar a IDS OOOg durante 60 min se obtuvo un

citosol que contenía 2-5 mg de proteinas por ml, según el me

:ooo de Llwrj v coi. 7117} uziiizando a búmína ce suero oovi

oración. Tooos ios proceuinientos fueron reai'

zados en Frio e inmediatamente después de haber extraido .os

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’'()Fr)‘\.|PJ‘V...__FtnÜ"4._(Ua}Lavc;yr.-|7-,¡.1ry¡1|

94

ïibracíón se reaïízó tomandoalícuotas ie una Jiïución lzloo

De acuario a? método descripto por Kovacs y :3

se SJszanJíí ADN-:eïuïosa (ADNnativo de :ímo ie ternera. J-L

Síochemicaï, en “buffer” TEMG-IO (TEMGcon aïbúmínd de suero

bovino 200 pg/mï y NaCl 10 mM) y se 1lenaron mínícoïumnas has­

ta un volumen de 0,4 mí. Se 1avó repetidas veces con eï

ecno. En una c.mara a 1 ’C se señoraron

200 p] de cizoson gremarcado con i H)-DE< y :ratado con carbón­

dex:rán. se esperaron 10 mín y se ezuyó ¡a fracción no unida

a ADN:on 4 Iavados de - m. de .EMG—lQ, recogiendo las frac­

ciones en vía.es. La radí03c1ívidad deí úïtímo vía! Fue menor

ie 100 cpm (nives baso.,. La fracción unida 3 ADNse eïuyó con

2 ïavados de l mi je .¿16-300 (TEHG-lO con Nau! 300mM). La ra­

díoaczividdd :eï eïuído se cantó ïuego ¿e agregar a ios viaïes

-J u? :3 'J'JEW‘ ce":3 e "te (l g ¿e Jmnííïúor, New Eng ¿nu

HuCÏEJ". "o" te ‘onJeqo,.

:-'¿ "7-: :ï r.- 23';:>:.=¿ *-¡_u¿:¿_¡:_¿1.43793:79:33::

32*o :o —1er ¿na :rJCCIJn nucïear ¿7-¿u1nïe 3L”If':3¿d

se aroceció )ec.n Wcïaen 1 Ziqmond {147] Trozos de ‘ediso de

ZOL1; rqercn 1214::W722-:3 en 3 ni ze Vi 'SICJrosa 3.32 W,

<HQPO¿ l nN, WgC 2 3 nm, 7m 5,5, Trzzon (-130 3,253 V/V; con

1

kL) U'l

homogenizacor te? jn-vidrio. Ei homogenato se centrífugó a

350 g jurante 10 min. Ei precipitado se iavó 2 veces resus­

:enciendaí: en 3 mi de SII (NI sin ei

vienca a centrifugar y descartar el sobrenadante. El preci­

pitado formado se resuspendió en 0,4 mi de NII y 2,1 mi de

N II (sacarosa 2.39 M, KH2504 l mM, MgCïz 3 mM, pH 0.3:. se

mezció agitando con vórtex y se centrifugó a 15 000 g juran­

te 45 min. E1 precipitado, que contenía 1a Fracción nucïear

purificada, se resuspendió en TEMGpara 1a incubación con

(lios complejos citosóïicos marcados con d)-JEK.

UNÍQN2.5 swayos CITOSOLICQS_ALA FRacgin Mycgsas

Se utiïizó citoso' marcado con (3H)—0EXy luego trata­

do con carbón-iexïrán. Una mitad se incubó a 45 °C durante

20 min cara inactivar eï compïejo hormona-receptor [134,II].

se mezciaron 3,5 mi de citosol inac:ivauo o sin en tratamien­

to térmico con aïicuotas de ía fracción nucïear que contenían

10-30 pg de ADN,se agitaron y se incubaron por listinzos :iem­

pos a 20 ’C en incubador neiaoóiico Dubnaff. A} fina izar 2a

incubación se agregaron 3 ni de TEWcFrio, se ag'zí j se Cer­

"“u;a a Ji -, -5 nin ei ïnnanua Jego 3:7V:W;::::: Se

ceaïï;2run 3 ‘avaqos suce;ivos con 3 nl ¿e 'EHu :a;¿ ¡na g se

uto. Los extractos se "ECCqíeron en ¡.13e:I :3 L) (l (b un '_J O La o. ui C; _..

96

se determinó luego de agregar 10 ml de tolueno centelleante.

MI_Q_09_3A919_0__9_E_¿ROMATOGRAHAScomweaes EN Misoymas

Este método de Holbrook y col. ['2] utiliza las propie­

dades de unión de los distintos complejos citosólicos para se­

parar rápidamente los complejos transformados, no transforma­

dos y otros complejos, principalmente mero-receptores. El sis­

tema está compuesto por tres minicolumnas armadas con jeringas

de 1 ml conectadas en serie (figura III-2). A la columna infe­

rior se le agregaron 0,4 ml de suspensión 50%de hidroxiapati­

ta (HAP) en "buffer" Hepes 10 mM, pH 7,6 con molibdato de so­

dio 10 mM, se dejó drenar, se completó con el "buffer" y se co­

nectó la minicolumna del medio evitando la presencia de burbu­

dk)jas je aire. A esta se le agregaron 0,4 ml de suspensión 50

de DEAE-celulosa en el "buffer" Hepes 10 mM, pH 7,6, se dejó

drenar y se completó con "buffer" para conectar la columna su­

perior. Esta se llenó con 0,4 ml de ADN-celulosa 50% en el

"buffer" Hepes con nolibdaïs. se enfrió el sistema en el cuar­

to Frío (l ’C) , donde se realizaron Ïas demás operaciones. An­

tes de utilizar las minicolumnas se lavaron con 2 ml del "buffer"

dejó drenar, se sacó la jeringa y se sembraron 0,1 ml del cito­" i -. ', c, .-'. ,', ;‘ : ,.-¿mamar 5.". lá (20:11de >dDEY‘ÏJY‘. 3d -3.!)C3 .3 \¡:Y‘i.".¿.1 I:

L)| É.) t DlJ ml con igual volumen Je TDMv se eluyó aplicando oresh

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.,<(Hl.\‘.‘

""íios de unión. El cítosoí rue :rEVÍamen:%

tu

U)

ll)

¡I

ï-CEX a Ü °C y tratado con carbón-iextrán.

en dos fracciones idénticas, una de ella

’C para liberar a] esteroíde de 1a unión

, ïa Otra Fue mantenida a O "C

¡ :7raícoíde es:aba ïigdjo a su sitio den aumenïo en ¿a unión nucïear durante L n

’c. En 1a otra Fracción cíïgsóïíca, cue.- J. . _

JnCEflZFacÏJÑ Je a Á)-uE( y demas compone

nero eï ¿C’eraïde n) 53 2ncan:raoa unïíc

Fico, la unión nuclear fue muy baja, >1m11

'zíempo = J) de Ea fracción anïeríür y no

'é EW ÉÜLUMNÁ DE ÉEÁE-CEL

I'd”:=‘;ín ‘2 ‘S :‘C'

)rmd.o:. La C‘3ma‘ografïa se "¿37‘35 con aïx3 ."a 4€ a %I 2rev1amente mar:a‘o -3n “2-JE

u) La

.l.\ 1

N(A)Íl

—L

unio‘nnuclear

(fmol3H-Dex/mgADNxlOs)

CD

o 15 _ 3o 45 60

tiempo de incubación (min)

figura ¿[1:3 : Unión de complejos citosólicos a la fracciónnuclear. 3

Se incubó citosol con ( H)-DEX 20 nM a 0 °C durante 20 h y se lotrató con carbón-¿excrán para eliminar la hormona libre. La mitad seincubó 20 min a 45 ’C (--—o-——)para liberar Jl ligando de los comple­jos. La otra mitad se mantuvo a 0 °C (-——o—-—J.0,5 ml de cada citosolse incubaron con la fracción nuclear purificada (ver materiales y méto­dos) a 20 °C por los tiempos indicados en la abscisa. Al finalizar laincubación se aqre;aro 3 mi ie “buffer” y se descartó el sobrenatanteluego de cenzrifugar a 5 OOOq 15 min. Luego ¿e realizar 3 lavados Con3 mi ¿e “buffer” cada uno, se extrajc Éa radioaczividad 'SCCÍdda a Tosprecipitados con etanoi aosoluto y se la determinó por centelleo iiqui­do.

n. g.

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:sze :íco aumento niger*

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L. CJ (D ... 0| .J Ü k< :L I U cl (U c

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1

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fico superior)

ios comoie;

nicia , j luego

jos transformad

yen con cïoruro

fectó ia estabi

tuvo constante

de moiibdato, e

nas aumentaron

45 min de incub

nidos disminuye

de los mismos.

piejos eran travaiores se mant

1lidad que ¡os n

1a dinámica de

se muestra í

45 min a 20 ’C

n ausencia oe

cativamente (de

ios complejos t

fmoi/ mg protei

La diferencia e

de molibdato sódico. En su presen

'os Fueron eïuidos de ia calumna con e'

1 h prácticamente no se dete:

os retenidos en 1a ADN-ceiuiosa y

de sodio 300 mM. La incubación a

ïidad de ios complejos ya que ia

en ei transcurso de ia incubación.

n cambio, ios complejos retenidos

alcanzando e] vaior máximo despué

cia todos

Í Eavaio i­

taron comple­

que se eïu­

20 °C no a­

unión se man­

En ausencia

en ias coium­

s de ios 30­

ación. La unión tota] y ios :ompiejos no rete­

ron marcadamente, evidenciandose

A ia hora de incubación, ia mitad

nsformados, y se evidenció que es

ia degradación

de ios com­

tos, cuyos

uvieron invariabies, poseían una mayor estabi­

o transformados.

[II-1 detaiia el efecto de} moiibdato sobre

Ios compiejos citosóiicos de la M

inión a ADN-caïuiosa de ios comoïej

s oreoaraoos con o sin moiíbdato incuoados‘ . .- 3.¡uego de ias 3 h de incubaCion con ( d)-DEÁ.

moïiodaïo ía unión tota? disminuyó signifi­

93 a 51 fmoï/ mg proteina), mien

ransformados aumentaron 10 veces

0/

:ras que

(1,5 a 15

na), siendo casi el 30mde Ia unión :otai.

n ia unión totai fue :eb ia 1 ia inactiva­

10

l i l ¡

6160+1<3

C1120

CD\C)

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x 0 ' I l ¡UJ . . . .C) =, 160 w “‘“‘\\\‘\\\\9 °M°OL_

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OJ-CL———C'}—————CJ-—Ü———C}l l i

O 15 30 45 60

Tiempo a 20 oC (mm)

Figurangjíïí Determinación con ADN-ceïuiosa de Ta ciné­tica oe transformación de los complejos citosóiicos.

os citosoies se obtuvieron en presencia de moiibdato (gráficoinferior) o en su ausencia (gráfico sunerior) y se incuoaron 20 h a3-1 °C con Ï3Hï-3ÉK 20 1M. Se incubarc: durante ios CÏEHUU3indica­ios a ZC ïC j se 'haïarun con c3r36n—:ex:ri1. Se sembraron ¿Eicuozasen nin.:: "' ¿CH-¿e‘Jiaea y se eïuyercn "os comuïejos no crane­-orm¿::s. se Jnec a ADN-ceïuiosa, con TiHG-LJ (NaCi 10 mH,-——»h--—) los co oïejos transformados, unidos a ia ADN-:eiuiosa,.. , mcon TEMG-3OO (NaCi 3Ïes. La unión toïaï:racciOnes.

V

00 iH ———4:F——-),recogiendo los eiuidos en via­Ï-—-}———‘se determinó sumando la ie es ios

4..

\

|!'¡<’1P.IU(­

(/1I(Wu’)r‘>\y­

CICÍ"F"3g(I.u«1'oi7.acnqy.m,r,s."r"|-1L;I"'I‘'¡i

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'Ja;TSLrv(3Cft!.»t'*vr_1‘a.u_«n,__,v'I"3ln74urx(‘7\‘m"f‘l'I.4¡UTg\‘n)‘'.*L.r")"j(7‘k.'|nxzuFJvIr1'17'In[/1JK.In|y"'‘L":C‘Nm:1(-cñ"1m

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CIJn le ';< : .g 2;); no re‘enidcs .0" ía ¿31—;—J J:

1::1 " ¡el 1 .- El a 35 FJJÉ/nq ;r0:ein3.

ii a III-2 53 ¿JdeFi Ía gnijñ a A31-;;

¿e )S :axuïejcs :itasáïícos Je la ME¿an 705 iei “C.

feCZGr 5C :Éásico. Las inCJbaciones Fueron realizadas

(

condiciones que favarecen ¿a ¿ransforma;ijn .sïn noífhvair

CL15 min a 20 ’C). La unión tota] en Ea ME Fue Ea mina

deï HC, cifra que está de acuerdo con datos ¿nzeriore

II]. La unión a ADN-celuiosa expresada en Fmoï/mg pro!1 1

¡D (la x'U

1 ¡Dfue simiïar nn amcus :ejiios. mientras que si 3

cauívameñïe ma/Or aDECZOa ¡a unión :uíaï fue signif í

ANALISIS ¿RJMATJGRAFZQJ ¿N WIHEFOLUnNAS COMBINADAS

‘on :3 mezsjo rígida Je ninicoïumnds combinadas

nue;"a :u- =1 .‘n-::')nes de ïFJflS’,rW2”13n, en ¿msn. . _ ‘\ _ . Á A". -- ,__ n, _¿1:33 e” 23-“,3 a: Jn.a a ADN-V:!UIOSJ, 35-033 a ¡:4;

:aïenïaníeñta g ¡ii iganda TEMG‘HQ33:35 proocrciones

"un irásticamenïe. En escas condiciones 2a mayoria de

compiejos eran no :ransïormados (80%), siendo la unió

ADN-ceíuiosa muy ded (l,2-3,51).La ?*¿¿;f3n unida a

¡u

l‘u

' ;'.:, 4- En ¿e J) canal-¿73 c1‘asóïïccs

Cam:efg; cítasjíícus¿ïmoÏ/mg proz.)

——rw—+-w-mv-w——»wwnv——-m Z de trans­Totaïes Transformados Formación

,._. m ,_.f­ >(­ m o

.. U'I I+ ,_. . o} 17,0 i 0,77%­

izaron en

a O °C v ¡ungo 45 mín a 20 ’C en presencia de

trató con carbón-dextrán l se sembraron aïïï

Eos cizosaïes en las mínicoïumnas de ADN-:eïu­

uve*on ïos compïejcs no transformados can TENC

suma de =mbos. Los resultado: se 5x3re;¿n co­

Zi. 1 es el nqm—*ose anima‘es :3:Jd.¿2.3

1x‘o. ¡JG iC; **: 9< 3,3Ü3 na'ov ¡ue 4C \:e

Igpjg_iiï¡3: Análisis de ios compiejos citosóïicos de HEe

HC :or un :rocgjimianto rápido je minicoiumnas camaínctzs.

(“H)-OEX unida (Fmol/mg prot.)

ME H

Minicoiumnd —_M-fio "ZM3““ ___:M3”' _'">’%Ho&v

ÏüÑlïifihfiw"‘3;ífïíí“”b,7EÏÍÏ'—ÜÍÍEWÉZÏ”“33”¿”22”DEAE-Ceiulosa 11,0 i 3,4 46,1 i 4,6 35,6 i 18,3 84,9 i 21,5

HAP 3,2+_1,2 11,1:3,s 6,9: 4,9 15,7: 8,9

Cítoso] de ME y de HC se incubó en TEMGsin moïibdato (-Mo)

duran:e 3 h a 3-4 “C y luego 30 mín a 20 °C en presencia

H)-DEK 20 nM condiciones de transformación) o de ma­

nera aná‘oga pero en presencia ie moiibdaca 20 mme incuoan­

¿o soïamen:e en frio I+Ho, condiciones no transformanzes).

cuego jei trdcanienzo con carbón- dextrán, Fe senbraron Iasxalícuota; en Í caïumna superior, que contenía ALN-csïuïo­í.)

tontenia ÉEÁï-Zsíuïssa y ia inferior HAP. Se ¿tuerto a 4o?­

orïok y :oï, .LZÏ en Ta; mismas se retienen ios rece ï:r3:

:ransformajos, ios no ¿ransformados y los mero-recentores,\,_..._....... -- .. \.-.."--v; —_‘ ‘ - ..-. .,,.. ,‘--_ _"1_--_-. 4i:.;:"...: -3.) ”:;u..c.-C.) >C :‘<..Y':aqr‘. cdi-ul)182;!¿3

“ - Ñ 1.‘ Ñ ¿f‘_: _- c”, :1 1L. _/ q 1x; - 1’ ..

31171'Ï

109

¿aii/os. En las incubacíones en TEMG­

asociada a las tres coïumnas fue mu­

:53 nuevamenze Ia inactivacíón de

agente protector.

110

sen casaca; de transformarse variando sus oropiedades para

accuirir una mayor afinidaj por 103 núcïeos v Ia A?H-c31u—

iosa. La unión de] corticoide a ios núc eos se verificó ai

incubar a 20 °C y soiamente si este estaba ligado a una ma­

cromoiecuia termoïábii. E1 esteroide iibre, luego de inac­

tivar ia unión por cazenzamiento, no fue caoa: de asociar­

se a ¡a Fracción nuciear. Esto implica que ia unión de

feroide a ios sitios aceptores nucleares requiere ia presen­

cia ¿e los compiejos citosóiicos intaczos.

oiibdato en el medio de incubación,I­ Cu U "S {D U1 {D 3 {1 -. DJ L­ (L 5

coro ocurre en Aires te ¡dos {28}, inhibió marcadamen:

umnas de DEAE-ceiu­

"esa {Figura 772-3} sa evidencio ei erecto por ía ausencia

nas 2133/03 ¿an n'n‘;a u.w¿s Ta unión a ‘3N-‘e.uïosa :Je 1;

aa a J no Je'=c:33 e \;iQU”3 III-l, 'aoïas III-l y 3). En

ïJZJZ —::;s .‘bïS e no .Jui'J 52:5; 1:15 ¡a union tiranía

as ‘ncuax: )n¿- 4 23 ’Z 35:3 É)13u’ÉJIIJP‘ZJ CJinciae 2:1

como vaso indispensable, ie

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Li 3re3¿2c1a je sitios que ligan GC en CÏCOSJÏ ._

ha quedao; bien establecida {134,II,IIÏ]. Los sitio ¡iia­

dos tienen ¿iia afiniiaj cor 7a DEX, que es un GC jÍHLéLiLu.

es menor, como ya fue jescrioto para ios receptores en ios

tejidos efectores ciásicos comoel higado, ei timo y el ce­

rebro [82,120,130], 1a Kd se encuentra en ei rango fisioió­

gico para su ocuoación por ia hormona endógena circulanze

en forma cr 1 m (1

'os receatores de 1a MEson capaces de transformarse

adquiriendo afinidad por ADN-ceiuïosa [III] lo

que sugirre un mecanismo de acción genómico común al efec­

to de ios a; en 0*ros tipos de tejido [9]. La interacción

ie Éos corticoides "in vivo” ha sido estudiada por autorra­

>.4

jiografia de regiones seleccionadas de ia ME[96,1 3,104

3era eSïas investigaciones no fueron enfocadas desce e? gun­

:o de visïa :ioiu;míc3.

La CCJoac.ón ¡e eS')s siifos en ;)n¿'c.ones F.sioío—

fu —' ‘3 ze a 1 .o‘. g Ja: ie “J'ïü a :—;'­

:o -3 :3‘ 4- 5‘ "SJ ¿F :2 ncrncnas es‘ev: isa ns"á 3:—-­

‘2 ‘ "(ir J iorc'o- - "‘ o“ _. ' u r1 o ‘n v 7\o 2“-1 7;; 41/“ au: 3L-ur_) _n.('_ ¡05 «a- ‘r' nCIU/ '1 .. J­

1.ów a aro‘einas anasna"‘cas, 1a esoe-1=i;‘jao y saiaraC'on

za as 31Ï1J> "ecearores EsïJdíOS res ¡23-03 an :onas se

cerebro demQSZraronque existen cierzas diferencias regio­.- Ivy-1 ,.4 s---- "¿113—-:L , per) ,2 ,:J_aCI0nnaies en =i ‘entenijo JE SORT

nu: ¿ar ‘27 =síer3íie es ¿iferenciai res:ec:3 ie Ea casca­

ción :isuiar, mostrando que ninguna región tiene un meca­

nismo de rezención de ia hormona y que posibiemente ia re­

tención nuclear v ia tisuiar son independientes entre si

[150]. Ei HC que es ia zona donde existe mayor unión cito­

sóiica presenta también ios niveies más elevados de capta­

ción nuclear [91], por io que se io utiiiza con fines com­

parativos en este estudio.

Con e. obje:o de determinar si ios niveles de CORT

en Ea MEy ei SNC fiuctúan de acuerdo a 1a actividad adre­

noc0rticai v si existen diferencias regionaies entre zonas

de ia MEo entre esta y otras zonas dei SN, se midió por

RIA ía CDR;:isuiar de animaïes intactas, intactas someti­

jos a estrés y Aux. Para determinar ia castación de CORTse

ratas ADXv se determinó su capta­43 K ("D (1 rr ID (u U1 'r FD 'S O _4

Í(D Q:

lbión nucíear, :izosózica z :isuíar, ¿amaaranzo .us va cr

obtenidos ¿en 33 nive;e: sericas. :e Jetermino ¿a inccrac.- . ,,).,‘_ _. s... _‘_ i . . ,_‘3C7ún nu::e:r :e \ n;--3k: inyeccaca "in Vivo” en T3 M: j

HC. _3 Wi ¡Jií”j itveíe: :e fis? siniïares a Éos ie Dt”

:JPJS e .Nc. 3- ;.J.=s 3 as lar.2; ones SiS-En "as y re

U1

,_k. .l) ¿TECÏJ

‘.J‘. (1.:

QI

Ip4 ..

l(/ gl ¡n ln A

Se utiïízaron ra:as macho de 1d cepa Nístar ¡e 150­

250 g de 3:30 coraoraï

EE :ra:amíen:o can JC se reaïízó por inyección ínïra­

peritoneal de] esteroíde (Sigma) dísue?:o en 0,4 m1 de eta­

nol-NaC1 0,9%

colocadas en un ambiente a 4

C2, C3-C7, ¡L­I r‘ '--\ ‘ 1'_-s l

J

vanenze. y L,­

(40%). Las

IA ll)J

-IJ, obteniendo eï HC,

.1 fl) Z f‘i

ratas sometidas a estrés fueron

°C durante 8 n.

de! SN se realizó según se ieSCribíó an­

corteza cerebral,sta ultima se seccionó en 3

g-ej y Ll-Ls. Las secciones C3-C7 y 79­ngrosamíentos cervicaï y lumbar res;ectí—

‘a cola de cabalïo y "filum terminaie

.n ¿chwen 1 Zignane [147,ïï} La rr3:-:ón

¡o cen-rifuqando el primer sobrenaianze 1

u.

3: " “7' Ïï_--_3Ï)_BÏ__.EN__M_E 5.371€.

n :or ¡ía endovenosa \femoraí)

ng and Nuciear) jísue ta en J,J mï gr

118

etanol—saiina (301) a ratas ADXanestesiadas con éter. Lue­

go de 50 min los animales fueron decapitados y se purifica­

ron los núcleos de la MEy el HC. Debido a la baja incorpo­

ración de la radioactividad a los núcleos de la médula (ver

resultados) se ensayaron modificaciones a la téCnica origi­

nal. Se intentó matar al animal a tiempos menores (30 min) o

mayores (180 min), utilizar un “buffer” de homogenización

sin Tritón X-lOO (ya que el detergente disgrega la membrana

nuclear externa), o utilizar un colchón de sacarosa mas di­

luido (1,3 en lugar de.2,2M). Tambiénse intentó utilizar

una preparación nuclear cruda [152].

La radioactividad se extrajo dos veces de la fracción

nuclear con 1 ml de etanol absoluto. Los extractos se eva­

poraron en viales y se contaron con 10 ml de tolueno cente­

lleante. Los resultados se expresaron como Fmol de esteroi­

de tritiado por mg de ADN.

2.E_Ï_E_&‘.4.l_a‘!6_9__ïjl‘l:2 E._13.9,R T.ELLE, 2.9.0.5.4} .fi’r ¡{EL NES _i ¿L É-i‘_:5_ _P_0_

¿ALa determinación de CORTen homogenatos. fracciones

nuc aires 1 :íïosoïe: ¿e Eos tejidos EStudiados se realizó

por RIA segjn la :éCnica de Unoerwood j Nilliams L153]. Los

homogenatos se prepararon con 50 mg de tejido en 1 ml de a­

gua. Una alícuota de l ml de citosol y los homogenatos sevextrajeron con L nl de éter de petróleo para eliminar lipí­

3,35 H

Fl"!

Éor.

nzaron y

nce 3€

e 3a fracción nuclear se ex:

evaporaron

resuspenoió

ïatína 0,5% y se disolvió ¡a

3 ve

‘35 1

no} absoiuto 0 se resusoendíó ei

n] ¿e agua,

Íos homoge

Zízó enwn:ls...

se sonicó y se

natos y lo S

Ia suspensión i

I antisuero de Gordon

inato-C

de 0,1 mï ¿e

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En ratas intactas (IS) y sometidas a es’C durante 8 h se determinó CORTpor RIA en l

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135

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tios de unión como ha sido demostrado por nuestro laboratorio

Si bien los sitios de unión citosólicos de la MEposeen

las propiedades de los receptores de GCy se encuentran en

una concentración de aproximadamente la mitad de los de? 4C,

la incorporación nuclear de una dosis trazadora de (3H)-CORT

suministrada "in vivo" fue mucho menor. A esta observación

se le puede atribuir diversas explicaciones. En primer lugar

las bajas dosis de GCinyectadas a la circulación pueden no

alcanzar la ME.Esta posibilidad podria descartarse teniendo

en cuenta que el homogenato de la MEposee 50% de la radio­

actividad del correspondiente al HC. En segundo lugar la rer

tención nuclear de radioactividad puede ser muy lábil en la

MEdisociándose de su unión durante la purificación de los

núcleos liberándose a la fracción citosólica. Este mecanis­

mo ha sido probado para las hormonas sexuales [158]. Si bien

esta posibilidad merece tenerse en cuenta, la protección de

ios núcleos utilizando preparaciones más crudas [152] no au­

mentó la radioactividad nuclear. En tercer lugar, puede ser

posiaïe que una parte de los sitios citosólicos sea traslo­

cada a] núcleo, mientras que otra permanece en el citoplas­

ma debido a la actividad de un inhibidor de la traslocación

que actuó "in vivo" [159] o para realizar sus funciones en

este compartimento ceïaiar. ¿sia Joolación de receptores JO­

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ÉSPENAL:BRESENLJADE SLUOSV EALTA

¿FLÏéiÍL'ïÍE 7.’SELECTIMIDAD

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HC y o

en los

.amblé

d GC

no

tras estructuras

órganos

.ízado u

d para

(1 s) ,3v

u

'17.

que

1'A

Q)

círcunventrícularesPara :ara

.Ïü

UEÍ‘J SE."

UI

uniforme, 10

un

ienen

H." “j

1 :

.Ï í:

‘ L‘Ui'l

'33

}. Li

je

de

áístríbución d

unión para MC.

e Eos si

lL

unión específico

a ALJO

para

caxlzándose principa.mente¡ïmbícas

[1501

ïas poblaciones de

d

í¿

serie de

venraja sobre

¿orzina, son m

s‘erolaes fe g

4níon ie 705

GC se na desa

ex;íusívamente

ïa cuant

ïos na

ás

Y‘f‘C

CG

iFí

yor

¡D

[81,84,85,104}

S

corcicoides 3

A

I

D

ítíos

tura

. . ,u

¿JO e:

(D

._. OI 3 LI]

int

se

los

-1.

'JHE

MC

unida por otro sitio con especí­

y también

dor­

,4I; 1­

v" A—":uH "I-J­l _..,u . h

Y-Ü CH)ñ yn; "' ' ‘.- 1. "" ‘ v _n

¡ _

CH, Í Ív l ‘

fi ciñí I/¡JH \\Hk /- c . « . I í C14 'u CH? ___.

Í\J

’enïa 4nd veïscicaí de iísocíación muy ráoída. Adicional

un 3r430 Í€ÏÏ.3 en ’e aosícíón 5 se ODÏJVO RU 2836 \'=

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e 55:35 desventajas y parece

1 A

'U"es camp.e LU U1

l-4

IC; LA n.1

l;L; -J LA 3 U r

¡.11 Hs 9 U U) C u

el C-77 tenían actividad anti-MC dependiendo esoecíaï

ñ O

lb

de Fa :¿21raíe;a de! sustituyente aiquïlíco. Si lOS comp"'‘ ¡ J I I

¡L)

g,J

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4. . ....--- 1' - -' ,h‘ ' - 4‘ " w ,nn;;3, eran ,aJ:H:: ¿e ¿n.r;c Jl recep or e: We3. ea.os:_ .‘A- - .—‘ , r. c . '- _ r. C , . —.,‘ ,‘.'.'J/:: .9) n33 (1331 ¿r1 .a 1 ¡”2.: laCyOÑG. JE ¿”LOÑHFJ que

> , ,. : - r‘ "r" c ‘ -4- _j una nena. 3¡:n.c11 par 31 de uC ¿10). -n a _;, 1_ .‘.,——.‘ ‘ — - ‘- '\, J -- ,- _ g,- .Jx ;. ,; x: ¡rex -: 28a ue 33‘3) —g:n,. g

s33 "ec¿:':re_ .e ‘3-"‘res eS'e“01aes ;S’)S ¿3n3uest_. . \ , - .. _' , “F _. ‘ .. 4 ur"3 "h. :"'Jx‘v J: sn..10> ¿e uk. C‘: EO: .443 "x.

p ‘ rd31'15; ._-ngz..\_‘- .._ . ‘ -._.,‘.. \ ' ur: e ­LOS ‘”.‘Il ,. :-'.._' ‘ ‘fll‘_:..u) :' .1 A y)” ­

1.‘ J¡\ 1I'\\ __ _‘.: ' ¿;__cenzrac1,nes ¡suzrajaa .: %,-1LJU-ar:; ¿n ÏnLIucr

esta hornona se unla excïusívamente a Tos sitios de GQ

bído a su baja afinidad / por e] símiïar número de si’.4

:Jrradíográííccs {164; / aïqunos estud'I. O V1 .l) Up fl C ¡"1 -­ o m bh C

í"; nn; ¿75, 'u‘ n . C 117un hidroxílo y un grupo prop"

0] (f:

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)1l )J ¡.I. «¡la_n¡-nc\ -ur--u\

r... (h

bioquimicos

pecificos para

queanïes

de MC en

dio para

sitios Jsencia

para

iectividad para

gión caudai.

cubaba e

este era

de tener

cionados

.3h

de por Io

la ALDO, ei

[85] parecian indicar

MC en ia ME. Por

especificos necesarios o

presencia de receptores

-_4completar

unión ie corticoides en

menos dos

los MC y el

s ¿e aita afinidad se distribuyen

toda ia ME

En otros experimento'- .— 1C1I.G:OI a mayor

¿FJ

de

ula

S,

eilo,

a caracterización

W

pobïaciones

componente de alta afinidad

de menor afinidad

con concentraciones

ha

temperatura

,_,_

de si:'

casi

iiamos que

en

Se :emos::

para

U]

los

147

GC.

uniforme­

menores en

S vI

ia

5€

capaz ie unirse a ADN-ceiulosa sugiriendo oue

una afinidad

con una acción genómica

intrínseca porde

,_J

la

itios nucïeare;

normona.

re­

in­

Jresencia de sa},

pue-'reid­

l:jI(1'r­")I.lo .:rll"u»“1"jL

.—-lr1,n;1)¡7.:¡U(l;nf.»''_'I-l‘1'!-t’vn.\,v1uc:":3l'Jy­

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LLr‘'nhmn)>-u"‘v1'!'21«v11a)"3‘1’"‘Uf')v-I‘')r.ww1..w-"1

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‘v-U)i.l(Ww-1:1P)l;Hvv)v1'ï“JC)"'v(l'"v:'17rwr7.Ik1nLgv1mh

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ID v Tos RBAde ïas curvas ¿e campetnncia se­

transfurmasas Togít-ïog como seCu U 0.a W (r _.. .1 s... ¡L A.) C. LI)

x‘J

gsïuoïo_s__;_¿:_.\igïzcos './ oe sgiuRAcron

La rigura 7-2 nuestra la curva de tiempo de incuba­

ción ie citosoï ie MEcon (3H)-ALDOa O °C. E] equilibrio

se mantiene hasta ias 22 h, aunqueun (L La 0 Dll _) l‘I pl (a tu U"‘_. J \

e? medio de incubación no posea molibdato como agente pro­

tector adicional. Para asegurar un compïeto equiiibrío y

en vista de la escasa inactivación dei receptor a O °C se

toman 20 h como tiempo óptimo de incubación, a] iguai que

Ias condiciones utiiizadas en e! HCpara 1a determinación

je] receptor de MC.4}.

En la figura 7-3 se muestra Ia

:urva de saturación y e! correspondiente gráfico de Scat­

:nard de 1a unión en citosoí utiïizando concentraciones de

í H)-AL30 de 5-25 nM. En estas condiciones se observa una

unión que no se sazura compietamente, obteniénaose oor ex­

:rapoïación Jn iumero 19 sitios de 95 fmoi/mg proteina y

una (d de 37 nm. La concentración de sitios es comparabie

a Eos flü-LSO fnaïes/mg proieina obtenidos Jara ¡a unión de

GC (ver Qesuïtados de Z.) y ia afinidad es Simíïar a Ea cai­

cuiada a partir de 1a Kd de (3H)—DEX (3;? nM) y el RBA je

ALDOrespecto de DEK (7,11) que es de 45 nH.

Sin embargo, en estudios recientes se observó que si

152

-\J I

OKgpr'ol.)

-f\J LJI

C.)l

(Jll

(3H)—d!(1oslcmna

unida(fmol/m OC) L\

Lu KS di Í‘) (J

CÍQïra 772 : Cinétíca de la unión de ( H)-ALDOen cítoso]

vbó el Cítosoï de néiuïa entera preoarrgc en TEWGa Ü °"'ewcgs indicados en presencia de (3H)-ALÏO 4.1 1M, xue‘a¿rhcña Íibre jor Fíïtración en mínícolumnas de Sïahadex

‘ ' ' EI ineszecífíc: se_' La basicas:ividaï en e? eau1do.'* ‘ resangía te ÁLJO 5 pH.

oLa

a1c C“o Z3 \:JW oo FU 5tu V' ru

A ÉI C

m D

1

o 5 I 15 20 253

_ (4 L F w l .( H) ¿mostaona hare (mw,

r- " " '- 3“,_-«1__cu".3>/3 hamsm de sacar-¿mon de Ia un1-3n de Í .‘,­ALÉO ar: a :¿3 :3'1c\=r‘.';r‘a«;ianes en cítoso'a 1951€.

í" : tos” 4.:- ncurw‘r) I 1 ”C durante 20 h e4l7;.1\ ll‘r‘ " fr: I : - ‘:;- .p- ' ,- - ' -‘“¡j-thU '2-;, z... _ ¿TJ .LJ nhï‘)'.ra ¿a LUrVd Qe )' C.aaartaco ¿ut-¿"mr ia re:r:3¿en:ación de Scatchard. ' ráue unión estimajm fueron mi“ 35 fmoï/mg proteína y Kd 37 1M.

se utiiiza un rango de

nes (0,3-45ETIETEOY‘ES

de unión de mayor afinidad por e]

Tomando un conjunto de

tuvieron valores de Kd

tio L o de aiza

o de baja afinidad

siempre mayor

citosol de HC

mayores no desplaza en

ALDOpresente en concentración 5 nM. mientras

una inhibición casi

de RU 28632 en esta concentración para

(’H)-AL00 ai sitio de

concentraciones

afinidad de RU 28362

crecie:

Scatcnerj que sugiere

afinidad

máxima de 1a unión de

G

de competición de

por estos sitios ie GC

¡.4 U1 JL.

(3Hi-ALDOque incluya concentracio­

aparece una curvatura en e!

1a presencia de otro sitio

Iigando (Figura V-4).

tres experimentos simiiares se ob­

de 0,8 nM en promedio para ei si­

y de 30,8-195 nM para el sitio II

7-2). Ei número de sitios fue

Coirini y coi.

H . . . . ._ J.rorma Significativa 1a union de ( d

que producia

SC. En presencia

impedir ia unión de

ó de vi5ua1izarse e! comoonen­

obteniéndose un gráfico ie Scatcnard

sitio I inalterado.

28352 como anti-JC yizados, RUC ¡'I _¡

inercn ensayadcs sara comoezir :on

ra V-S mues:ra

¡a unión de ( H)-ÜEX 10 nM

osx y RU 26752. La

\I

COTI

AFue mayor que eÍ

155

RU 23362Z'

Unida(imol/rngADNHO'Z)

0 IO _ 20 30 40LI bre (nM)

U/L(fmol/mgADN-IO'2/nM)

Unida (fmol/mg ADN - 10‘2)

igura“y¿}7: Análisis de saturación de ia unión de (3H)—DOen un amplio rango de concentraciones dei iigando.

Ei citosoi fue incubado a O °C durante 20 h en presencia de(3H)-ALDO0,3-46 nM, con incubaciones paralelas en presencia de unexceso de ALDO(- OOOx) para determinar unión inesnecifica. Acurvas de saturación obtenidas en presencia (o——o)o ausencia (o-—o)de RU28362 (biooueante ie receptores de GC) en concentraciones 10veces superiores a las de (3H)—ALDO.B : gráfico de Scatchard de losdatos de 'unión en presencia (o-—o) o ausencia (o——o)de RU 28362.Las iineas punteadas representan ias 2 componentes obtenidas de iacurva ¿e? gráfico de Scaïcnard en ia que no se agregó QU28362, se­gún ei néïoco ¡e ïocbard ¿154i . Ver ReSUEtados y tapia 7-2.

156

I391q_y:22 Parámetros de unión de (3H)—AL30en citosoi de

ME.

3. . 3. ,( H)-HLDO ( H)-AL00 + ¿0x

Exp. N° Tipo I Tipo II RU 28362

I Kd 0,97 42,3 1,06Nmax 178 534 232

II Kd 0,76 195 0,52Nmax 315 S360 263

III Kd 0,69 30,8 0,66

Las condiciones experimentales son las de Ta figura V-4.

“d se expresa en nM y el número de sitios (Nmax) en fmoi/

mg de ADN. Los sitios de tipo I y [I se refieren a acueiios

representajos 30r 715 lineas punteadas en ei gráfica ¿e

Scatchard de 3a figura V-l (exp. N°III).

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1(‘H)-ALDO Unida (fmol/mg ADN)

Condiciones notransformantes

Condiciones deMinicolumna transformación

ADN-celulosa 89 i 20* 15 i 3

DEAE-ceïuïosa 55 i 24 153 i 34

HAP 17 i 6 7 _ 4

E1 cítosol fue íncubado con (3H)-ALDO 5 nM v RU 29362 50

nM en TEMG con KCI 150 mM durante 3 h a O ’C y 30 min a

20 ’C \condícíones de transformación) o en EMCcon NaZHOO4

20 mM3,5 h a O °C (condiciones no transformantes). Luego

del tratamiento con carbón dextrán se sembraron en el sis­

tema de mínicoïumnas y se eïuyeron con Trís lO mM, OTT 0,5

nM j Ha7MOJ¿ LO mM {EEE}. Jesoués de 1a elución se con:o

ía nadíoaczívídad asociada a cada ‘ase cromazográFíca y se

-'Íta:35 como mesías j ES en fmoE/mg ADN

e 1 dezermínacíones independientes.Fc“*: p < 9,92 vs. ADN-celulosa de condiciones no trana.orman­

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La ¡cï‘v dai ie “a” se JQÏE”1 na n c‘enco a 73“­Vw ‘,- ' a -'A ‘ a - I ‘Ñ '1"\ "\« ' < ,.na- an .- H—¿”t 3 ,1”- r ie L-Kl- .,-,«l ¡Acv _ng an­

Nuclear, 32,5 Cí/moí} :e acuerdo a Russeïï y Snyder :202¡.

¿cy¿07 evaoorandoLa("C}0RN se purific\ para e]1'm1'nar(l

a soïución ácida (HCI 0,01 N) con corriente se nitrógeno

bajo campana, redísoïvíendo en HC] 0,01 N y evaporanao nue­

vamenze. -E residuo se íísoïvíó en HC} 0,01 N (100 OOOc:m/

3‘ te'ído se homogenizó en 2 volumenes de "buffer"

que contenía fosfazo de potasio 50 mM, EDTA 2 mM, JTT 1 mM,

y azida sódíca 2 g/ï, pH 7,2 y se centrífugó en microcentrï­

fuga (Fisher 235 B) a 12 000 rpm aproximadamente obteniéndo­

se el sobrenadante. Se incubaron 0,1 ml en frascos con tapa

de goma a 37 °C con 0,1 m1 de "buffer" que contenía fosfato\SO mM, EDTA 2 mM, ORN (Sigma; 0,2 mM y Fosfato de sírídoxal

/,.. . .. — . ¡\ - . ."I/l- \ —,'\Dïqmd> 3,1 ¡n34 3r ¿,2 y + ,ul (4DG 300 :pa’) ae w L)--¿R a:

Los Fraacos se '33:”Ofl ínmeaia.ammn:e se.‘anco ïa junta :cï

'atan :e a5q< con '93car‘ÍmJ íï taaón ¿3 goma estaba a­

travesaca por Jn aïamore en cuyo extremo :enïa adosado una

.. \ ,_ . . . y . 'I,‘ \ .n ..¿idas JC: gAmersnam/Searze) para capturar e!\‘kd-u07 1109­rado [203}. Luego de 1 h de incubación se inyectaron, a tra­

vés del tapón, 0,3 m1 de ácido trícïoroacétíco 40% para de­1- .- . . a- . . , ._ N

tener ¡a reacczon y 11berar al("L%uO) ie ¡a soluc1on .204].

Luego de 3C min adicionaies para atrapar cuantitativamente

ei (‘é'É-CCZ iiberado (si se incubaba 1 h en iugar de s0min nc habia una mayor captación) se sacó ei tapon y se co­

ioci ia ceica piástica en un via" oe vidrio ai que se ie a­

gragaron ECm7 de toiueno centeiisanta para 5:;erminar ic

radizactividac. Ei bïanco de reacción sc determinó a¿r&gan­

do e' "buffer" de homogenización en iugar de sobrenadanta.

En OÍ“E aiicuota de sobrenacante se determinaron iasr 1

Iorcteina: por e; método de Lowry ¿-17]., 4tr estas condiciones ia prodUCCion de a j-CO fue

Éineaí con e? tiemoc y con 1a concentración de proteinas

(hasta ¿ é mg). La actividad enzimática se expresa en pmoi

'-C02/h/mg proteina.

1‘’l u ¡ \ y \.- h,’CELIll¿3.1QR, DE AU- U_!"_ïtQI\í__,CÏ_T_Ü_5_0É-.1.EL; D, _

umenes se "bufferSe homogenizó e] tejido en 2-3 vo“

._I.EMC(ver capituio II) que contenía mc. bdato 2C mNy car­

bón-dextrán (22-0,2%); para eïiminar asteroide iiore. Lus­

go de centriíugar a 105 OGGg 30 min, para obtsner .a frac­

ción citosóiica, ia misma se incubó 3 u a C t {yd.. . . . . \ (3 \ -; a,oir ei intercambio de Sitios ocupados¡ con \ h)-D;) .u nN

afin ¿a determinar 1a unión de acuerdo a nuestros esudics

II]. Los resuitados se exrrasaron en fmoles

Ce asteroide ïigadc/mg proteina.

izar

es

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L1

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:ï, jor37 zar:

73 cond

3¿STEC)

‘:‘ 'WÉYAA ¿y :a'es Jorenico>, y s

3n.¿r12 Jne: :ntre jos únicos grupos

e Stuten y para comparaciones múïtïp

<eu s Los dato provenientes de Ea d

ho ?Jeron homocedásticos, según e z

¡o cual previo a] análisis estaíïslí

e una transformación Iogarítmíca paraición de homocedasticídad.

).'" 2

es 3

-¿rw

3: j

o ie

sa*1

(l)

179

tragos 2273:9335 5,33€ '_.AACTIVIDPQ935395

La GPDHde ME se determinó a diversas concentra­

ciones de sustratos, como se observa en la Figura VI-Z,

observándose que a las concentraciones de trabajo (dihi­

droxiacetona-fosfato 0,7 mM, NADH0,085 mM) se obtiene la

velocidad máxima.

En estas condiciones se determinó la GPDHde anima­

les que recibieron diversos tratamientos crónicos (tabla

VI-l). La ADXde 4-7 dias no produjo efectos significati

vos sobre la actividad de esta enzima, mientras que el

tratamiento con GCnaturales o sintéticos produjo un au­

mento significativo de la misma. La GPDHde los animales

tratados con DE; fue 353 superior a la de los controles,

mientras que la CORTaumentó 27% los niveles basales. En

otros estudios realizados se observó que estos efectos

persistian si el tratamiaento hormonal era suspendido un

dia antes (0,157 * 0,003 vs. 0,241 i 0,03 pmol/min/mq ,

n=3, p< 0,01).

Jtros esteroides suministrados en Forma crónica no

aumentaron la aczividad Je GPDH. La ALDOen dosis que in­

hibe el apetito saiino, el estradiol y la testOSterona en

dosis fisiológicamente activas {125] no tuvieron efectos

significativos. La progesterona, que también es un anti­

(nmol/min)

o

GPDH

O

180

O L L I |

O,2 0,4 O,6 0,8conc DAP(mM)

O/ 0'-*‘s‘.“‘O\

0 0,05 0,10conc NADH(mM)

¡2 . Curvas de sus:r1:os je a JPDH de “Eetermínó ïa activida: ¿9 :PDF en 01 csoïes ¿e ME, regís­estrOECZOmétrícamente Ea 199538” C Sn Je ‘ÁCH 3 31“ nm,ió Ta cancennracíón de díhidrox‘a:5ïona-:osfa;a (333“ :7‘‘ ación inicial de NABHde J 385 n?

r, . .

Ta concentración de NADHu ïïízanCo GAP 0,7 mH.

U")In

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mxmo+xn<moo.o+mHH.owxm<HF

ax2.270..aún.H23.35H

.aal,coucmwsmumem.poknwe‘rwñ‘wusa‘r

182

GC [123}, disminuyó en forma significativa la actividad

suministrados en la salina de bebida a animales ADX.Ambos.

esteroides aumentan la actividad, existiendo una gran va­riabilidad entre los animales sometidos al tratamiento

prolongado. En otro experimento se encontró que la ODCen

los animales intactos se encuentra significativamente dis­

minuida (p< 0,35) respecto de los ADX(12,3 i 0,9, n=4 vs.

25,3 i 1,7 pmol/mg/h, n=3). Si a animales ADXtratados con

DEXse les susnendia el tratamiento un dia antes, se encon­

traba una disminución similar (50%) de la ODC(17,5 i 3,5

vs. 9,4 i 0,2 pmol/mg/h, n=4, p< 0,05). Esto demuestra que

los GC pueden modificar la actividad de ODCen forma drás­

tica pero bifásica. Esta variabilidad puede ser debida a

que las hormonas tienen un efecto di erante relacionado con

el tiempo y sus concentraciones plasmáticas, las que depen­

den del horario de ingesta del fluido que contenía GC. Mien­

tras que Jara la GPDHel tratamiento crónico es un modelo

eficaz para estudiar su regulación por GC. para la ODCes

conveniente utilizar tratamientos más reproducibles, como

por ejemplo la inyección de cantidades definidas y a tiem­

pos establecidos de las hormonas.

Actividad de ODCC0ntrol n

3) D >< U1 P4 Ch g 0! .‘La) u H

Se dezermínó ¡a ac:ívídad

de ratas macho ADX de 1-7

y CORTse reaïízaron dor

¡.1 (D b)

[L¿¿: Efeczos Crónícos de GC sobre Ia actividad de

Actividad de ODC(pmoT/mgprot./h) Tratamiento n (pmo1/mgprot./h)

ADX+DEX 3 40,5 i 14,2

ADX+CORT5 28,2 + 3,l*

de ODCen sobrenadantes de ME

Jïas. Los tratamientos con DEX

1a saïína de bebida en concen­

traciones de 10 y 100 Hg/m} respectivamente (n=número de

casos estudiados).4.‘u. p < 0,05 vs. ADX:ontroï.

,.1 (1') 4­

GENETICA TEL EFE:.0 3€ JW; JNQZAVQQ_15“¿É_GQ SÏSÉE ZP)“.3:3; l _1 w 3" “A .mn'w 3-: afijfiïaí

Paca ¿Díufiïlif ::¿;r Eos cambios que pracucen ios

GCen a) iï"7ïÍiJcS ew:ímáticas es necesario conocer e.

tiempo que e: esiïan para manifestar su efecto. La deter­

minación de Eos sitios Je unión citosóiicos Jara GC, en

Condiciones en Ias :ue no está favorecido e! intercamoio

Sieroide unido con e] libre radioactivo (tiemoos re

cortos y bajas temperaturas), serviría para in­I__.

< 01 Li ¡Ti _) (I lL

ferir ia ocupación y/o depieción de estos sitios por ¡a

hormona inyectada posibilitando reiacianar ia unión ai re­

ceptor con el efecto en:imá:ico.

En este es‘adio se inyecto Jna 40515 eievada ie ‘os­

fata Je 3€(, que es un GCpotente j de císija 15177Ï23Í5n,

muy a: ¡izaso en 135 “aï¿“ï:fl135 :aviacgiógicas ca F gJ­

ra Vï-3 mueïrvi Jue na=za Ïas 5 H 10 3: oroouc: ef:c:a -0­

bre .a ZPCw.¿5-anc0 ‘a ac:1/idad en:1'5:‘ca =ume":a a “:­

cién a las 20 H. A los i Jiasíiñh) todavia persisze un au­

mento significativo. z: erec:a sobre 1a ODces Jiferente.

Cu (/1l­ J ¡J 0 Q! 3 lya que no hay cambios a ias 2 h, pero si a

zándose un máximo que cuadrfgïica ai estado basa] a ias o

h. Sin embargo, a ias 30 ñ se evcuentra una marcada dismi­

nución de Ía ac:ívidai, sienco esta menos de 1a mitad de

ia iniciai. La figura 72-1 muestra e] gráfico de ias inver­

sas de acuerdo a2 me ‘Ed ¡e Líneweaver-Burk obtenido con

135

_ , | la T .FS l T

Ü nor 3 l"U | 4

S “0;” T.Ï .' 1' 1

z iCüt- Í] “r .1 l“3 i 101 ' 'n . l.\ ggL - - .

O 2 20 46

,‘ aooÏ- "3V LIe l vo 300+­U sCE; 200 r"3

Ev 100 '3 4 ¡,1s o [Ïi

2 I‘i .6 .10

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É l? TC)i. 5C)- ',' 3

m: i a:E 60" 3 ‘ ‘ IU ‘ T 4

C ¿.0 - 7.9 n

S 2()­:3 o — —

0 i 2 4 6 24

tiempo de inyección(h)

Ejpdïd y;—3 Qesauesga :emcora] de las actividades enzimá­'1cas v Ed unión le (JH)-3EX a una única dosis de Fosfataae

A razas ADXse ies suministró 5 rng/kg peso s.c. ie fosfato deDEK.En los :iemnos indicados se determinaron ias actividades enzimá­ticas de DDCy ‘EPC'H¿z Ea unión citosó'lica de (3H)-DEX iuego de 3 h deincubación a 0 ’C. Los remitados se expresan en porcentaje dei contrc‘l(tiempo= i) h) , animaïes que no Fueron inyectados, como medias i :3.En ias barras se indica e] número de casos estudiados.i : p<0,05 vs. contro]«s: p<0,01vs. control.

186

-1

'ELCL

o:

11,120 9‘ Eo /— La. o T

0'90- // ÉQOG­E o E}

f 60 ' I Ï O ADXooEX-P9 — O

É30.r/./_\-\ (100../ onox> / p 1 1 l .

0,2 ot. 0,6 0,6 /

S(mM) 02

v...- 1 L L i

-a -4 _ 0 4 8 ¡2l/s (mis/14)

Eiggfg_ïl¿í : Gráfico de las inversas de 1a actividad de ODCen ME.

Se determinó 1a actividad de ODCen sobrenadantes de MEde ratasADX(o) y ADXinyectadas con DEX-P (5 mg/kg peso s.c.) 6 h antes de!sacrificio (o) atrapando y contando Ia radioactividad de] (14c)_con Ii­berado de un medio de incubación que contenía 400 000 cpm de (14C)ÏORNy concentraciones variaoïes de ORN.Las concentraciones indicadas co­rresponden a la suma de sustrato marcado y no radioactivo. En ei aparta­do se grafican ias concentraciones vs. ia veiocidac inicia], en elgráfico central ias inversas.ADX : Vmax= 37,7 pmoi h-1 mg prot'1 Km: 0,14 mM.on+ DEX-P ; ‘lmax=1'12,3 pmoi h-l rng prot-l Km= 0,12 mM.

ME de ratas ADXy ADX inyectadas con fosfato de DEX 6 h an­

tes, donde se observa el efecto anterior. La velocidad máxi­

ma es casi l veces superior en las preparaciones de animales

tratados, mientras que no hay cambios en la constante de Mi­

chaelis (Km).

La unión citosólica de (3H)-DEXse encuentra disminui­

da a solo 1 h de la inyección, y los valores más bajos de u­

nión se obtienen a las 4 h. A las 6 h ya son ligeramente más

elevados y 1 dia después se encuentran normalizados. Es decir

que el primer cambio observado luego de una única dosis de GC

es una disminución de sitios de unión citosólicos, seguido deun gran aumento de la ODC. A las 20-24 h se evidencia el au­

mento de la GPDH,cuando ya se restablecieron los sitios de

unión y la ODCcayó a valores inferiores a los basales.

RESPUESTA A DIFERENTES DOSIS DE GC

La figura VI-S muestra el efecto producido por una úni­

ca inyección de fosfato de DEXadministrada con la suficiente

antelación para lograr el efecto máximo. Asi, para GPDHse to­

maron 20 h mientras que 6 h fueron óptimas para la ODCy 4 h

para la unión citosólica (ver figu a VI-3). Ambasenzimas res­

ponden a las mismas dosis de fosfato de DEX, siendo 0,2 mg/kg

peso la minima dosis efectiva para ellas. La unión citosólica3de ( H)-DEX disminuye al aumentar las dosis de GC inyectado.

y esta variación es paralela al efecto producido sobre las

188g

g * i ­130- ‘e i w

l 4120- e3 } a

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3 20­S O¡_

O QOA 0,2 1 5

Doss de fosfato de Dex(nig/kg)

figgr3_ïl¡j : Respuesta de ias actividades enzimáticas y dela unión de (3H)-DEXa diferentes dosis únicas de fosfato deDEX.

A ratas ADXse ies suministraron las dosis indicadas de fosfato deDEXs.c.. Luego de 6 h se saCrificaron para determinar 1a actividad deODC. a ias 20 h 1a actividad de GPDHy a ias 4 h para 1a unión citosó­iica de (3H)-DEX.Se representan ias medias i ES de ios porcentajes res­pecto de los controles (dosis= o mg/kg) que recibieron solamente ei ve­hículo. En las barras se indica e] número de casos estudiados.' : p-<0,05 vs. control.li : p<0,01vs. control.

189

actividades enzimáticas. Mientras que una dosis de 0,04

mg/kg peso no produce efecto significativo, una dosis de

0,2 mg/kg o mayor disminuye significativamente 1a unión

citosóiica indicando que 1a hormona inyectada se unió a

los receptores.

ESPECIFICIDAD DEL EFECTO SOBRE ODC

En 1a tabla VI-l se muestran ios datos sobre e]

efecto de diferentes esteroides sobre 1a actividad de GPDH.

Una vez estabiecidas las condiciones en ias cuaies se ob­

serva un aumento reproducibie de 1a actividad de ODC, fue

posibie determinar e] efecto de los distintos esteroides.

Se inyectaron a ratas ADXcon esteroides 5 mg/kg s.c. 6 h

antes dei sacrificio (tabia VI-3). De esta manera se ob­

servó que todos ios corticoides (DEX, CORTy ALDO) produ­

cian e] marcado aumento de 1a ODC, mientras que 105 este­

roides sexuales y 1a progesterona no modificaron signifi­

cativamente los valores basaies. Si 1a dosis inyectada

era diez menor (0,5 mg/kg) 1a DEXy 1a CORTtodavia eran

efectivas y aumentaban 1a OOC, mientras que 1a ALDOya no

tenía efecto sobre su actividad.

DISTRIBUCION DE LOS NIVELES BASALES Y ESTIMULADOS DE GPDH

Se determinaron ias actividades enzimáticas en tres

190

Tabla VI-3 Efecto de esteroides sobre 1a actividad de

ODC de 1a ME.

Actividad de ODC Z de]

Inyección n (pmoI/mg prot./h) control

VEHICULO 7 24 i 2,5 ­

DEX (5mg/kg) 4 104 i 8,2 ** 423

" (0,5mg/kg) 3 60 i 8,7 ** 250

CORT (5mg/kg) 4 92 i 8,6 ** 383

" (0,5mg/kg) 3 45 i 2,5 * 192

ALDO(Smg/kg) 4 87 ¿17,2 M 352

" (0,5mg/kg) 3 28 i 5,2 117

PROG (5mg/kg) 4 19 i 2,3 79

TESTO (5mg/kg) 4 22 i 6,9 92

E2 (5mg/kg) 4 28 i 7,4 117

Se determinó 1a actividad de ODCen sobrenadantes de ME

de ratas ADXinyectadas 6 h antes con vehiculo (etanol­

salina 40 %), DEX, CORT, ALDO, progesterona (PROG), tes­

tosterona (TESTO)y estradio] (E2) S.C.

dicadas (n=nümero de casos estudiados).

**: p < 0,01 vs. contro] (vehicuio).

*: p< 0,05 vs. contro] ( " ).

en 1as dosis in­

191

zonas bien diferenciadas de] SN de ratas ADXy ADXtrata­

das con GC. Se tomó e] HC, que es 1a zona con mayor densi­

dad de receptores de GCde] cerebro [105], el engrosamien­

to cervica] de 1a ME, que es una zona rica en receptores

de GCy que muestra altos niveles de GCendógenos [134,

157,II,IV] y 1a co1a de cabaïlo que contiene menos recep­

tores [134,II] pero está constituida por prolongaciones

nerviosas. Esta última zona se asemeja a1 nervio óptico,

donde se encontraronnecmtores de GCcon propiedades "in

vivo" diferentes a Ios de] HC[157,II,65]. Para aumentar

1a actividad de GPDHse utiÏizó e] tratamiento crónico con

DEXmientras que para ODC se utiïizó una dosis única de]

éster fosfóríco. En 1a figura VI-6 se observa que ios valo­

res basales más e1evados de GPDHse encontraron en e] en­

grosamiento cervica], siendo Ïos de 1a cola de cabaiio me­

nores y ios del HC aún más bajos. La DEXaumentó signifi­

cativamente 1a actividad en e] HCy e] engrosamiento cer­

vical pero no en ia coia de cabaiio . Los niveles basales

de ODCfueron simiïares en las tres zonas estudiadas, y en

todas eiïas eTtratamiento con GCe1evó marcadamente su ac­

tividad, siendo 1a estimulación menor en e] HC que en las

otras dos zonas.

192

4

GPDHLamolminmgprot)

_o.0 c-n‘N

II4

L.

T: 8 O '­9CL

E

T-C 4 O c.6 i Ú’E2- 20 LU í:o 311.:O o L

EC C

Figura VI-6. : Distribución en zonas del SN de ias actividadesenzimáticas.Se determinó 1a actividad de ODCen HC, engrosamiento cervical (EC)

y cola de cabaHo (CC) de ratas ADX(I) y ADXinyectadas con S mg/kg pe­so de fosfato de DEXs.c. 6 h antes de] sacrificio (Cl, n=4). La GPDHfuedeterminada en ias mismas zonas de ratas ADX(I) y ADXtratadas con 10 pg/rn] de DEXen salina de bebida durante 5 dias (E, n=5);i : p< 0,05 vs. ADXde 1a misma zona.s: : p<0,01vs. ADXde la misma zona.

MM

En este estudio se demuestra que ios GCaumentan

1a GPDHde MEen tratamientos proiongados. E1 efecto es

especifico de GC, ya que 1a ALDOsuministrada en dosis

en ias cuaies reguia e] apetito saiino no produce varia­

ción. Tampocoson efectivos 1a testosterona y e] estra­

dio]. La progesterona produce e] efecto contrario y redu­

ce 1a actividad de GPDH.Teniendo en cuenta ias propieda­

des anti-GC de 1a progesterona [123] se podria inferir

que 1a inhibición sea producida por bioqueo de] receptor

de GC. Sin embargo e] efecto de 1a progesterona se obser­

va en animaies ADX, en 105 cuaïes e] receptor de GC no

es ocupado por sus agonistas y por 10 tanto no podria es­

perarse que se manifieste 1a actividad anti-GC de 1a pro­

gesterona. Es probabie que 1a acción de 1a progesterona

se produzca por interacción con un sitio diferente o mo­

dificando ias pobiaciones ce1u1ares, especiaimente aque­

1105 tipos donde se expresa 1a actividad de GPDH.

Los cambios producidos por ios GC en 1a GPDHson de]

20-50% de 10s va1ores basaies, de acuerdo con ei efecto en­

contrado en otras regiones de] SN [65,189]. La ADXno tuvo

efecto sobre 1a actividad de los animaïes intactos en repo­

so, io cuaï sugiere que 1a regulación de 1a GPDHse rea1i­

za en presencia de amp1ias variaciones de 1os GCcircuïan­

194

tes. comoen tratamientos farmacológicos y el estrés.

La ODCfluctuó marcadamente luego de diferentes tra­

tamientos hormonales. Este hecho está de acuerdo con la

propiedad de esta enzima. que es la de mayor indice de re­

cambio y menor tiempo de vida media conocida entre las en­

zimas de mamíferos [205], Los GC producen un aumento de 4

veces a tiempos relativamente cortos (6 h) mientras que

luego de 20 h de suministrados su actividad se halla redu­

cida. Este efecto bifásico es explicado por la rápida de­

gradación a la que es sometida luego que el efecto sobre

su sintesis ha cesado, y es posible que la baja actividad

encontrada en el tejido de animales intactos pueda ser de­

bida a las fluctuaciones diarias de los GCcirculantes [152],

encontrándose disminuida varias horas después del pico de

máximaconcentración sérica. La persistencia del efecto so­

bre la GPDHluego de 2 dias de la inyección de GC o al in­

terrumpir por 1 dia el tratamiento crónico revela un mayor

tiempo de vida media de esta enzima.

El aumento de ODCfue especifico para corticoides, ya

que mientras altas dosis de DEX, CORTy ALDOeran efectivas,

la progesterona, el estradiol y la testosterona no tenian e­

fecto. Al suministrar dosis menores se evidenció la especi­

ficidad para los GC, ya que DEXy CORTmantuvieron su efecto

y el de ALDOya no era observable. La ALDOen altas concen­

traciones es capaz de unirse a los receptores de tipo II,

que tienen baja afinidad por este iigando y mayor afinidad

por ios GC [V], y de esta manera tener efecto de GC. A ba­

jas concentraciones ALDOsolo puede unirse a] sitio de MC

(de tipo I) y por lo tanto no posee actividad de GC.

Los estudios efectuados con una única dosis de GCe­

videncian 1a correiación existente entre ia ocupación de

ios sitios receptores de GCy 1a respuesta. E1 primer cam­

bio detectado en ios tres parámetros determinados (unión

citosóiica, actividad de GPDHy ODC)fue 1a disminución de

Ios receptores. Esta caida de 1a unión debe interpretarse

como ocupación de receptores por 1a hormona inyectada, ya

que 1a determinación se reaiizó en condiciones que no fa­

vorecen e] intercambio, o por depieción de 1a unión citom

sóiica por transiocación a1 nücieo. La ocupación/depleción

de Ios receptores precede en por 10 menos 2 h a1 aumento

de 1a ODC y en S h o más a] de 1a GPDH, io que implicaría

que e] primer paso de ios efectos observados es 1a unión

de] esteroide a] receptor. Las curvas dosis-respuesta ava­

1an esta observación ya que 1a minima dosis efectiva para

aumentar las actividades enzimáticas es también efectiva

para detectar 1a ocupación/depleción de los receptores. Es­

tos resultados indican que los GCserian capaces de inducir

1a GPDHy 1a ODC en 1a ME, como ocurre en otras regiones de]

SN [65,66,186,187]. En efecto; McGinnis y de Veiiis compro­

baron que e] aumento de GPDHen células nerviosas era debi­

196

do a 1a acumulación de ARNmensajero y aumento de la sinte­

sis de la enzima [192,206]. Kumary col. determinaron un au­

mento de ARNpoliA + especifico para GPDHen cuïtivos de Cé­

lulas gliaies [207]. E1 aumento de ODCpor GC en e] SN y

otros tejidos ha sido atribuida a una mayor concentración

de enzima y no a cambios post-traduccionaies [66,198,199,

205,208,209]. Debe mencionarse que 1a compieta demostración

de 1a inducción de estas enzimas en 1a MErequiere 1a deter­

minación de Ia proteina especifica, para 1a GPDHse ha de­

mostrado por métodos inmunoquimicos que 1a actividad enzi­

mática es representativa de 1a concentración de enzima ya

que 1a GPDHen sus estados basa] e inducida no era diferen­

ciable [210]..

Los diferentes tiempos de inducción de ias enzimas

de 1a MEsugieren mecanismos de acción diferentes. A1 igua]

que en la estimulación por GCde la fosfodiesterasa alcali­

na I de céiuias de hepatoma, 1a GPDHde 1a ME tiene un pe­

riodo 1atente de cierta consideración [211], lo cua] puede

hacer pensar que existe un intermediario [9]. La inducción

de ODCen 1a MEse asemeja a 1a de tirosina-amino-transfe­

rasa de céiuias de hepatoma, que es un efecto transcripcio­

nai directo, ya que ambas aumentan en un periodo corto de

2-4 h [9].

La heterogeneidad en ias respuestas de ias activida­des enzimáticas a] tratamiento con GCen distintas zonas

,_.. k0 \l

dei SN, como asi también ias diferencias entre ios nive­

ïes basales ie GPDH sugiere 1a existencia de pobiaciones

se uiares :irersntes que responden a Eos G; son caracte­

se iocaiiza seieCtivamente en.5 —‘\ m xl r) m U) t í L u. LI) í­ na D 'U L) I

ios oïígciendrqciïos [195], ceiuias gíiaies que forman 7»

vaina “e nielína en Ji SNC, mientras que ia ODCpuede ser

eStimuÉaoa tanto en ¿éïulas gïianes como neuronaies [212}.

De estos resultados se desprende que en ia MEse encuen­

tran receptores para GCampiiamente distribuidos en céiu­

ias giiales. Los oiigodendrocitos serian responsables de

las yariaciones de GPDHy ios astrocitos, que son ias ce­

lulas giiaies más abundantes en todo ei SNC, podrian ser

A te, de ia respuesta de ia DDC. EL¡D m u (D 3 C) DJ 1

se produce en forma generaiizada en

todas ias zonas dei SN, To cuai está más Je acuerdo con

‘lrelativa uniformidad de ios astrocitos que con .a extrema

diversidai de Ïas neuronas en diferentes regiones del SN

Íl IA -4.3 ISin embargo Zampoco pueden descartarse como efectOr

voiucrados en eStos cambios, ciertas pooiaciones neurona­

Ies que, según eszunios autorradiográficos [103,104}, re­

tienen GC. Las céíuias gíiaies, y en especia] ios astroci­

tos, son actualmente consideradas como importantes efecto­

res de Eos GC en ei tejido nervioso [213-216]. Debido a 1a

importancia metaoóiica de ias enzimas estudiadas, ios GC

tendrian tanto en ia MEcomo en e] resto dei SN una Función

reguiadora dei metaboiismo. Estos efeczos se hacen eviden­

ce; an la 3rsïe::i5n que producen estas hormonas en ïos ca­

-q- «a _,- ‘._....j‘-...,.,— ¡Ji 'C'J‘"1Ï: ‘ rn: v ,w'c a nn"su) .: ..3J.':q.ign:-,> de .w -*o.; -n ¡OS ¿'J- De 4-5drvulaa

una intensa accividad :rófica y proliferación de las céiu­

DI U1J

... Q: (Lo L.)

1Estas enzimas, y en especia] ¡a ODCpor ia magnizud

de su respuesta, pueden ser utilizadas como marcadoras se­

lectivas de ia actividad de ios GC en ia ME y ei SN en ge­

nera}, acomcañada: con 1a determinación de otros paráme­1tros bioquímicos de importancia bioïógica Como¡a unión ci­

iica, 1a unión de compiejos hormona-receptor a ADN-ce­

¡uiosa, etc. , que permitan evaluar de una manera mas in­

tegra] ias compiejas accciones de los GC en ei SN.

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202

RESUMEN Y DISCUSION GENERA_L_

Los corticoides ejercen diversos y complejos efec­

tos sobre el SN, modificando funciones variadas y diferen­

tes, detectables por medio de la bioquímica, la electrofi­

siologia, la histoiogia y en estudios de comportamiento

[44,54-76]. Estos podrian estar mediados por receptores,

para los cuales se han encontrado poblaciones heterogéneas

en el cerebro [77-85], y tener mecanismos de acción que in­

volucren o no a la regulación de la expresión genética [9,

33-39,41,44,4S,l32,133].

La ME, que representa una gran parte del SNC, pero

al no poseer la extrema diferenciación funcional , estruc­

tural y bioquimica del cerebro, no ha sido considerada co­

mo un modelo para el estudio de la acción de los corticoi­

des en el SN. pese a la facilidad y simplificación que pue­

de brindar tomarla como modelo efector.

En el presente trabajo se han determinado y caracte­

rizado los principales procesos moleculares involucrados en

el mecanismo de acción de los corticoides en la ME, habién­

dose obtenido los siguientes resultados:

1) Se determinaron sitios de unión citosólicos de GC,

habiéndose encontrado una aita afinidad para los corticoi­

des naturales y sintéticos. siendo de estos la DEXy la TA

203

los que mostraron la mayor afinidad, otros eStEFOÍdES C0m0

la ALDO y la progesterona tuvieron afinidades mucho meno­

res, mientras que la afinidad para andrógenos y estrógenosno fue detectable. Estos sitios de unión tuvieron otras

propiedades comunes al receptor de GCnativo de los teji­

dos efectores clásicos comola termolabilidad, la protección

y estabilidad brindada por la presencia de molibdato en el

medio de incubación [125,129],el efecto protector del 2-mer­

captoetanol que mantiene reducidos los grupos sulfhidrilos,

la inhibición de bloqueantes de los mismos [80,128] y el

coeficiente de sedimentación en gradientes de glicerol que

es de 9-10 S [11,12,84].

Los sitios estaban ampliamente distribuidos en toda

la ME, predominando ligeramente en los engrosamientos Cen­

vical y lumbar, en los que predomina la sustancia gris.

La concentración de estos sitios fue más de la mitad de la

hallada en el HC, que tiene la máxima concentración en el

SN [105]. La ontogenia reveló un incremento de la unión en

las dos primeras semanas de vida, similar al desarrollo

en otras regiones del SNC [94] y al de marcadores de célu­

las gliales [189].

2) Se comprobó la transformación del complejo hormo­

na-receptor, posterior a la unión, a un estado con mayOr

densidad de cargas positivas en su superficie que permite

nor COHC

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206

La presencia de ambos tipos de sitios también quedo eviden­

ciada en estudios de competencia de la unión de \ H,-ALDL

utiii:an;a concenzraciones variables de anti-3C y anti-HC

frente a :os concentraciones del iigando marcado, que per­

mitian su unión a ios sitios de tipo I soiamente o a ambos

en proporción simiiar. Las condiciones escogidas para deter­

minar seieCtivamente ios receptores de tipo I fueron: in­

cubación a o °c durante 20 h con (3H)—AL00 5 nM y RU 28362

50 nM. La distribución de estos sitios fue similar a ia

previamente haiiada para los dei tipo II. predominando en

ios engrosamientos cervicai y lumbar, siendo menor en ia co­

ia de cabaiio y "fiium terminaie". En ei sistema de mini­

columnas combinadas se determinó ia transformación de es­

tos receptores y ia aparición de especies simiiares a mero­

receptores. Las pr0piedades de estos sitios son simiiares

a ias del receptor de MCde otros tejidos [79,82-85,167—

170,177,178]. Estos sitios serian de importancia biológi­

ca y podrian ser responsabies de efec:os soore ei baiance

de eïectroiitos, e? edema, y ia actividad eiéctrica de neu­

ronas descriptos en ei cerebro [105,169,180.182], pero aún

poco estudiados en ia ME.

S) Se comprobó Ia inducibiiidad de ia GPDHy ¡a ODC

en ia ME, de acuerdo a 10 haliado en otras zonas dei SN

[65,66]. La GPDHaumenta un 20-40 Z iuego ie tratamientos

207

crónicos o 20 h después de una única dosis. La ODCpresen­

ta un efecto bifásico, aumentando 4 veces luego de 5 h de

una única dosis y disminuyendo a ia mitad Iuego de 20 h.

Los cambios mas rápidos de ia ODCpueden interpretarse por

un efecto transcripcionai directo y por e] rápido recam­

bio de esta enzima 205], mientras que e? de ia GPDHpuede

atribuirse a un efecto indirecto más lento [9]. Ei efecto

sobre estas enzimas estaria mediado por ei receptor de ti­

po II, de GC, ya que 1a CORT y la DEX son mucho mas poten­

tes que 1a ALDOpara producir e] efecto. Otros esteroides

no producen aumento. La reiación con 1a ocupación de ios

receptores queda evidenciada también por la disminución

de 1a unión citosóiica de (3H)-DEXpor ocupación o depieïción de ios sitios receptores. Esta disminución ocurre an­

tes de observarse e] efecto sobre las enzimas y es obser­

vabie con las mismas dosis de GC que aumentan las enzimas.

Se determinó 1a actividad de ias enzimas en distintas zo­

nas dei SN de ratas ADXy tratadas con GC observando que,

con cierta variabiiidad, ei efecto es generaïizado en ei

SN, y de acuerdo a ia ïocalización ceiuiar de ias enzimas

[195,212} se deduce que ias céiulas giiaies de Ta MEposeen

receptores de GC responsabies de ios cambios en ia GDCy

1a GPDH.

Todos estos resultados llevan a ia concïusión que en

208

la MEde la rata existen receptores de corticoides. distri­

buidos en por lo menos dos poblaciones, una con mayor afi­

nidad para GC y otra para los MC. Ambos tipos de sitios

son transformables a una conformación con mayor afinidad

por la ADN-celulosa. Los niveles endógenos de GC son compa­

tibles con la ocupación de los sitios y existe captación

nuclear de la hormona, siendo diferente a la del HC. Los

receptores de GCestarian involucrados en los aumentos

producidos en las actividades de GPDHy ODCy se encuentran,

al menosen parte, en células gliales.

Se han descripto en la MEmuchas de las caracteris­

ticas del mecanismode acción clásico de los corticoides,

por lo que podria extrapolarse lo conocido en los tejidosclásicos a la ME. Elreceptor seria una molécula oligoméri­

ca fosforilada con grupos sulfhidrilos funcionales, luego

de unir al esteroide en el citoplasma sufriria un proceso

de transformación a un estado monomérico con afinidad por

el ADN, probablemente con la pérdida de algún grupo Fos­

fato y un factor estabilizante. Luego el complejo hormona­

receptor migrarïa al núcleo para interactuar con la croma­

tina, prouuciendo diversas cambios en la expresión genéti­

ca, que se traducen en un aumento de ARNmensajero para

la sintesis de determinadas proteinas [8,3,40], comola

GPDH y la ODC.

Los receptores de corticoides estarian localizados

en gran proporción en céiuias giiaies por diversos motivos.

En primer iugar se ios encuentraen todas ias regiones estu­

diadas, inciuida ia zona de 1a coia de cabaiio que no posee

cuerpos neuronaies. La distribución reiativamente homogénea

es una caracteristica poco consistente con 1a extrema diver­

sidad de tipos de neuronas y más acorde con 1a probabie uni­

formidad de ias céïuias gïiaies comoios asrocitos [189]. En

segundo iugar, ios GC inducen enzimas fundamentaimente giia­

ies. En tercer lugar, e] desarroiio ontogenético de ios si­

tios de unión de GC, que aumenta en ias dos primeras sema­

nas de vida, es simiiar a1 desarroiio de céiuias giiaies

[189]. En cuarto iugar, 1a baja incorporación nuciear "in vi­

vo " en reiación a1 número de sitios citosóiicos parece ser

una caracteristica de 1a interacción de 10s corticoides con

ias céiuias giiaies [65]. La iocaiización neurona] también

ha sido ha11ada en 1a MEpor autorradiografia [96,103,104]

y es sugerida por ia unión citosóiica en regiones enrique­

cidas en sustancia gris (engrosamientos cervica] y 1umbar)

que fue 1igeramente superior a 1a de ias demás zonas [11,

V]. Los sitios neuronaies parecen ser de mayor importancia

en e] HC [89] que en 1a ME.

Las observaciones de ios mecanismos moiecuiaresde ios

corticoides reaiizadas permiten extrapoiar muchosde ios re­

suitados obtenidos en otras regiones dei SN o en tejidos

efectores ciásicos de estas hormonas a 1a ME. Sin embargo,

210

es importante poder confirmar cada una de las posibles con­

clusiones que se puedan sacar "a priori" de observaciones

parciales. Un ejemplo del peligro de generalizar resultadoslo brinda la evolución del modelo de acción de las hormo­

nas esteroides. El modelo clásico postula que los recepto­

res se encuentran en el citoplasma y luego de unirse a la

hormona son translocados al núcleo, lo cual parece ser cier­

to para los corticoides, cuyos receptores determinados por

inmunofluorescencia, se localizan en el citoplasma en au­

sencia de hormona y en el núcleo en su presencia [29,30].

En el caso de los estrógenos se enc0ntró que este modelo no

se cumple, ya que recientemente se localizó al recptor li­

bre en el núcleo [216-219]. En la MEse encontró, que a

diferencia del HC, los receptores de GCparecen prevalecer

en las células gliales, y presentan propiedades diferentes

en la incorporación nuclear "in vivo". Esta diferencia re­

salta también la importancia de trabajar con sistemas vivos.

en los cuales se pueden determinar los mecanismos molecu­

lares que ocurren fisiológicamente. Si bien los estudios

en sistemas más simplificados, comolos cultivos celulares,

pueden brindar infOrmación dificil de obtener con el animal

entero, estos estudios deben tener comomarco de referencia

obligatorio las observaciones realizadas "in vivo". La ME,

por su menor complejidad anatómica y funcional que el cere­

bro, por la abundancia de tejido que proporciona y por su

excelente respuesta a

a elegir para escudiarcorticoides en CéiUiÓS

ios corticoides,ios mecanismos

puede ser ei modelo

fisiológicos de los

212

EEBÉEEETIVAS

Los trabajos presentados en esta tesis no han agot­

do e] tema de 1a acción de ios corticoides en 1a ME. No so­

iamente han quedado aspectos que merecian ser considerados,

sino que también se han abierto nuevos interrogantes que

aumentan aún más ias posibiiidades de estudio de] mecanis­

mo de acción de las hormonas adrenales en el tejido nervio­

so. Los resuitados presentados serán e} punto de partida,

ysemuamente servirán de referencia a importantes investi­

gaciones que se reaiicen en este tema.

Entre ios aspectos en los que aún puede profundizar­

se se encuentran Ia determinación de marcadores de Ia ac­

tividad bioiógica en este tejido. Para ios GCpodrian es­

tudiarse enzimas taies comoia tirosina hidroxilasa, glu­

tamina sintetasa, adeniiatocidasa y feniietanoiamina-N­

meti] transferasa; neurotransmisores y neuromoduiadores co:

mo catecoiaminas, sero onina, sustancia P y Opiáceos; y

nucieótidos ciclicos, que en otros sistemas parecen ser re­

gulabies por estas hormonas [69,74,89,220-222]. Para los

MC,de ios que se posee menor información, podria estudiar­

se ia enzima conversora de angiotensina I en II [223].Es­

tos marcadores podrian utilizarse en Ia determinación de

la actividad de los corticoides en el SNen distintos esta­

dos fisiológicos o patoiógicos en los que se encuentra a]­

213

terada 1a respuesta a estas hormonas, tales comoe] estrés,

1a vejez y 1a diabetes [77,152,224]. La regulación de los

receptores por otros factores como 1esiones de 1a ME [100­

102,225], o tratamientos con drogas como vasopresina y se­

rotonina que podrian estar involucradas en 1a regulación de]

receptor de GCde] cerebro [226,227], es otro aspecto que

puede ayudar a comprender las funciones de los corticoides

en e] SN.

Otro interrogante que aún no ha sido completamente

di1ucidado se refiere a 1a locaïización exacta de Ios recep­

tores, tarea de compleja resoïución, que puede encararse

mediante determinaciones bioquímicas en pequeñas zonas de]

tejido extraídas por micropunción de cortes congeïados, o

bien pOrautorradiografia de cortes incubados con 1as hor­

monas marcadas. Estos estudios se están iniciando en nuestro

laboratorio.E1 hecho de haber encontrado diferencias en 1a incor­

potación nuc1ear "in vivo" ha planteado 1a posibilidad que

en 1a MEexistan mecanismos alternativos en ia acción de los

GCque deben ser investigados. Los estudios pueden centrar­

se en determinar 1a ocupación de 10s receptores citosóiicos

"in vivo" para ver si existen mecanismos de captación di­

ferentes o bien determinar 1a presencia de inhibidores de

Ia transformación o 1a translocación de] receptor. Otra a­

proximación a1 tema es la separación de neuronas de 1a giia

214

0 el uso de cultivos de diferentes tipos celulares para

determinar diferentes poblaciones de receptores.

’ Si bien mucho es lo que resta por conocerse de los

mecanismos moleculares en el SN y muchas son las dificulta­

des que existen para hallar respuestas a los interrogantes,

hay varias posibilidades abiertas para intentar conocer me­

jor estos procesos. Las respuestas podrán surgir en la me­

dida en que estas posibilidades se renueven y se enriquez­

can. El objetivo de esta tesis se habrá cumplido si además

de haber significado un avance en el conocimiento de los

mecanismos bioquímicos de la acción hormonal, también con­

tribuyó al planteo de estos enfoques renovados.

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Comunicaciones de ios resuitados presentados en esta tesis;

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Bubiicacipnes:

ORTI E., COIRINI H., DENICOLAA.F.: Properties and distribution ofgiucocorticoid binding sites in cytoso] of the spina] cord.Neuroendocrinoiogy 40: 225-231 (1985).

ORTI E., TORNELLOS., DE NICOLAA.F.: Dynamic aspects of giucocor­ticoid receptors in the spinai cord of the rat. J. Neurochem.45(1985, en prensa).

ORTI E., MAGARIÑOSA.M., DE NICOLAA.F.: Evidence of high affinity,stereoseiective binding sites for (3H)-a1dosterone in the spina] cord.Neuroendocrino1ogy (1986, en prensa).

ORTI E., MOSESD., DE NICOLAA.F.: Giucocorticoid reguiation of giyce­roiphosphate dehydrogenaseand ornithine decarboxyiase activities inthe spinai cord of the rat. (1985, en redacción).

Reunionescientificas:

ORTI E., COIRINI H., DENICOLAA.F.: Caracterización de ios sitios deunión para dexametasona en 1a médula espina]. Sociedad Argentina deInvestigación C1inica, Mar de] Piata 21-24 de noviembre de 1983.

ORTI E., TORNELLOS., DE NICOLAA.F.: Dinámica de] receptor de giuco­corticoides en 1a médula espina]. Sociedad Argentina de InvestigaciónCiinica, Mar de] Piata 14-18 de noviembre de 1984.

DE NICOLA A.F., COIRINI H., MAGARIÑOSA.M., ORTI E., TORNELLO5.:Distribución regiona] y propiedades de ios receptores de corticoidesen e] sistema nervioso. Asociación Latinoamericana de Ciencias Fisio­1ógicas, Sociedad de Bioiogia de Chiie, 11-15 de noviembre de 1984,Punta de Traica, Chi1e.

ORTI E., COIRINI H., TORNELLOS., DE NICOLAA.F.: Caracterización de]receptor para giucocorticoides en 1a méduia espinai. Asociaciones Ar­gentino-Hispánica e Hispano-Argentina de Medicina y Ciencias Afines,1-4 de febrero de 1985, Madrid, España.

ORTI E., MAGARIÑOSA.M., DE NICOLAA.F.: Evidencias de sitios de a1taafinidad y estereoseiectividad para a1dosterona en 1a méduia espina].Sociedad Argentina de Investigación Ciinica, Mar de] Piata 24-28 denoviembre de 1985.

ORTI E., MOSESD., DE NICOLAA.F. : Reguiación de giiceroifosfato des­hidrogenasa y ornitina descarboxiiasa por giucocorticoides en 1a médu­1a espina]. Sociedad Argentina de Investigación Ciinica, Mar de] Piata24-28 de noviembre de 1985.