MATERIALES Y MÉTODOS

1) EXUDADO VAGINAL1.1) Observación directa o en fresco

- Suero o muestra obtenida del exudado vaginal- Tubo de ensayo- Hisopo de observación - Porta-objetos- Cubre- objetos- Microscopio óptico

Metodología: 1. Dejar caer muestra con ayuda del hisopo de observación, se hace un extendido pequeño en el cubre-objetos. 2. Observar al microscopio a 10x y 40x.

Hallazgos: Buscar agente Trichonoma Vaginalis, sus características morfológicas y movilidad.

1.2) TINCIÓN EN SECO/ TINCIÓN DE GRAMSobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas, de acuerdo a la composición de su pared bacteriana.

Material:- Portaobjetos- Cubreobjetos- Microscopio óptico- Solución de cristal violeta al 1 %- Solución de lugol.- Solución decolorante (alcohol etílico y

acetona 1:1)- Solución de safranina al 1 %- Ansa de punta y ansa de aro.- Mecheros- Alcohol

Metodología:1. Se toma muestra del exudado con el hisopo de observación y se extiende en el

cubre-objetos.La secuencia de la tinción, después de haber fijado el frotis es la siguiente:

2. Aplicar una gota de Violeta Cristal durante un minuto y lavar con agua,3. Aplicar gota de lugol durante un minuto y lavar de nuevo con agua,4. Decolorar con una gota de alcohol acetona durante 30 segundos y escurrir 5. Cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 min. Lavar y secar.6. Observar a 40x y 100x con aceite de inmersión.

Considerar:1) EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para evitar que pierdan la tinción las células grampositivas.

Imagen 1. Observación en fresco.

Imagen 2. Secuencia de Tinción.

2) Cultivos de más de 24 horas de teñidos pueden perder su habilidad de retener el cristal violetaHallazgos:Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una soluciónde cristal violeta (todas las células, tanto las grampositivas como las gramnegativas, están teñidas de azul.En alcohol-acetona, las células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras. Con la safranina se evidencían las células gramnegativas, tiñéndose de color rojo.

CULTIVO

Agar SabouraudEste medo es utilizado para el cultivo de mohos y levaduras patógenas y no patógenas.

Material:- Agar Sabouraud en caja de Petri.- Asa de punta.

Metodología:1. Tomar muestra con el asa de punta 2. Inocular con estrías transversales sobre la

superficie del medio de cultivo, Agar Sabouraud.3. Incubar en aerobiosis a 20-25°C, durante 5 días.4. Observar características de las colonias

después de la tinción de gram a 100x, con aceite de inmersión.

Hallazgos: Agar Sangre.Este medio es utilizado para el cultivo de hongos y bacterias (no selectivo).

Material:- Agar Sangre en caja de Petri- Asa de punta.

Metodología:1. Tomar muestra con el asa de punta 2. Inocular con estrías transversales sobre la

superficie del medio de cultivo, Agar Sangre.3. Incubar a 37°C, durante 24-48 hrs.4. Observar características de las colonias

después de la tinción de gram a 100x, con aceite de inmersión.

Hallazgos:Hemólisis alfa: lisis parcial de glóbulos rojos. Se observa un halo de color verdoso alrededor de la colonia en estudio (por oxidación de hemoglobina a metahemoglobina).Hemólisis beta: lisis total de glóbulos rojos. Se observa un halo claro, brillante alrededor de la colonia en estudio.

Imagen 4. Agar Sabouraud

Imagen 3.. Agar Sabouraud

Hemólisis gamma: ausencia de la lisis de glóbulos rojos. El medio no presenta modificaciones de color y aspecto.

TUBO GERMINATIVO

El tubo germinal es una extensión filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en su origen, cuyo ancho suele ser la mitad de la célula progenitora y su longitud tres o cuatro veces mayor que la célula madre. Esta prueba es selectiva para el agente Candida Albicans.Material

- Plasma de conejo o plasma de humano.- Portaobjetos - Cubreobjetos- Microscopio- Aceite de inmersión (opcional)

Metodología1. Emulsionar una porción de la colonia aislada en 0,5 ml de suero humano o de conejo.2. Incubar a 37 °C durante 3 a 5 h.3. Depositar una gota de la emulsión sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, colocar uncubre-objetos y visualizar a x100, x400 ó x1.000.

Hallazgos: Es positiva si se visualizan los tubos germinales por Candida Albicans.

HARINA DE MAÍZ

Este medio confirma la determinación de tubo germinal y clamidosporas en agar. A este medio comercializado (Oxoid) debe agregarse Tween 80 (polisorbato) a una concentración final de 0,02% para reducir la tensión superficial y aumentar la formación de hifas y blastoconidias.

Material:- Agar harina de maíz en caja de Petri- Porta-objeto- Cubre-objeto- Microscopio- Aceite de inmersión (opcional)

Metodología:1. La inoculación se debe realizar, según la técnica de Dalmau, haciendo tres cortes paralelos en el agar (separados 1 cm) manteniendo el asa en un ángulo aproximado de 45°.

Imagen 5. Candida albicans. Tubo germinativo positivo.

Imagen 6. Observación macroscópica en Agar harina de maíz.

2. Colocar un cubre-objeto sobre la superficie de agar cubriendo una parte de las estrías de siembra.3. Incubar las placas sembradas a 30 °C durante 24- 48 h y luego examinar al microscopio a través del cubre-objetos a x100, x400 ó x1.000

Hallazgos: visualizar el desarrollo de clamidosporas, hifas y blastoconidias.