ʺCaracterización molecular de 297 genotipos de trigo (Tritticum aestivum L.) provenientes del

Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo e inferencia de su estructura genéticaʺ

Márquez Carrillo Miguel Eduardo

Directora: M. Sc. Fernanda LoayzaCodirectora: B. Sc. Karina Ponce

Departamento de Ciencias de la VidaIngeniería en Biotecnología

Introducción

Justificación

Objetivos e Hipótesis

Materiales y Métodos

Resultados y Discusión

Conclusiones

Recomendaciones

Trigo de Primavera (Tritticum aestivum

L.)

Principales productos de

consumo Ecuador

38.6 Kg/persona/año

Producción afectada por enfermedades

98.45% de importación

7605 toneladas en el 2012

Halo poliploide

Roya Amarilla (Puccinia striiformis)Fusariosis de la espiga (Fusarium graminearum)

Introducción

Introducción

Perfil específico del

ADN

Triticum monococcum +

Aegilops speltoides =

Triticum turgidium +

Aegilops tauschii =

Triticum aestivum

Marcadores Moleculares

Amplificación de loci específicos

revela la presencia de

uno o más alelos por locus

Información necesaria

para estudios de mayor

envergadura

Materiales promisorios

Caracterización Molecular

IntroducciónM

arca

dore

s M

olec

ular

esMoléculas (proteínas o ADN) con las

que se puede identificar y caracterizar un genotipo

determinado.

SNP´s, basados en la secuenciación de ADN.

Permiten la asociación de genotipos con fenotipos específicos

Los marcadores microsatélites son repeticiones cortas distribuidas al

azar a lo largo del genoma

La información del polimorfismo generado se la detecta mediante

(PCR) del ADN

métodos de genotipado denominados “múltiplex”,

Introducción

Asignación Genética

Utiliza métodos basados en estadística bayesiana

Structure el cual utilizando datos a priori, asigna porcentajes de pertenencia a cada individuo

Características genéticas comunes entre sí

Justificación

Baja producción interna del cereal,Susceptibilidad que presentan las variedades locales.Problema de interés nacional.

Desarrollo nuevas variedades de trigo, es una estrategia eficiente para mejorar la productividad.Mapeo por asociación, permite al investigador detectar regiones que confieren resistencia .

Estructura de la población es importante para reducir falsos positivos. Incrementar la confiabilidad del estudio. Diversidad genética que existe en la población No estrechamos la base genética.

Objetivos

Caracterizar molecularmente 297 genotipos de trigo (Triticum aestivum

L.) provenientes del Centro Internacional de Mejoramiento de

Maíz y Trigo para inferir su estructura genética

Genotipar las 297 muestras de ADN validado de trigo con marcadores microsatélites mapeados utilizando la tecnología

M13-Tailing en el LI-COR 4300S.

Inferir estructura poblacional de la colección utilizando el programa Structure vs. 2.3.4.

Comparar los resultados obtenidos con la estructura obtenida a partir de marcadores SNP´s en la misma población con los resultados obtenidos del genotipaje con marcadores SSR´s.

General Específicos

Hipótesis

H0:• La colección de 297 genotipos de trigo provenientes del

Centro Internacional de mejoramiento de maíz y trigo no está estructurada genéticamente.

METODOLOGIA DEL PROCESO

Material vegetal

Cuantificación de ADN

Validación con SSRs

Pruebas PCR

Selección de SSRs

PCR con el Método M13-

tailingPruebas

Dúplexaje

GENOTIPAJE en el LI-COR 4300 s

Diseño Estadístico

Extracción de ADN

MATERIAL VEGETAL

297 líneas avanzadas colectadas por todo el mundo por el CIMMYT

M-13 tailing Secuencia de nucleótidos (5´-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3`)

Extremo 5’ del primer Fw SSRs

PCR + M13 Primer (700-800nm)

Productos amplificados SSR marcados

Laser LICOR detectan la IR

Marcadores SSRs

METODOLOGIA M13-Tailing

Imágenes digitalesSAGA-GT

Genotipaje 2pb

Matriz Genotípica de datos

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

ANÁLISIS

SSRs seleccionados

Diversidad genética Estructura genética Correlación fenotípica

PROGRAMAS ESTADISTICOS

• En las extracciones de ADN se obtuvieron rendimientos promedio de 400 ng/µL para extracción con muestra fresca y protocolo casero

• A partir de muestra seca, el rendimiento fue de 100 ng/µL

• Optimización de tiempo y costos en el laboratorio.

Resultados

Extracción de ADN

Resultados

• Se observaron bandas de amplificación con el marcador SSR BARC10 en un peso entre 300 y 350 pb

Validación de ADN

Muestras vegetales

Resultados

• Se logró establecer la temperatura de 82 primers, de los cuales 33 eran explotables para la investigación

Validación de polimorfismo de primers

Resultados

Estandarización del Genotipaje

Resultados

PRIMER MARACAJE TIPO

BARC83800 DUPLEX

WMC216

GWM325700 DUPLEX

CFD49

WMC773800 DUPLEX

WMC111

WMC658700 DUPLEX

WMC728

PRIMER MARACAJE TIPO

BARC71800 DUPLEX

BARC204

GWM437700 DUPLEX

WMC492

CFA2129800 DUPLEX

GWM493

WMC331700-BSA DUPLEX

CFD84

GWM261800 DUPLEX

BARC130

GWM297700 DUPLEX

GDM153

PRIMER MARACAJE TIPO

WMC89_4B800 DUPLEX

WMC89_4D

GWM161 700 MONOPLEX

GWM456 700 MONOPLEX

GWM147 800 MONOPLEX

WMC720 800 MONOPLEX

GDM132 800 MONOPLEX

BARC133 700-CL MONOPLEX

BARC19 700-BSA MONOPLEX

GWM121 800 MONOPLEX

GWM314 800 MONOPLEX

GWM636 700 MONOPLEX

GWM469 700 MONOPLEX

Genotipaje de marcadores seleccionados SSR en LI-COR 4300S (corridas)

• Los resultados del genotipaje se expresan en imágenes que el programa SAGA-GT reporta con los datos de peso molecular de los fragmentos.

Resultados

Resultados

• Datos compilados en una base de datos• Estimación de LD con el paquete Genetics v. 1.3.8.1, descartó 5

marcadores.

Registro de datos del LI-COR 4300S y análisis estadísticos

MARCADORTAMAÑO DE

MUESTRANº DE

OBSERVACIONESALELOS PIC

BARC83_1A 297 292 3 0.48GWM147_1D 297 292 3 0.24

WMC216_1D 297 288 2 0.32

GWM636_2A 297 275 6 0.68WMC658_2A 297 258 5 0.74

MARCADORTAMAÑO DE

MUESTRANº DE

OBSERVACIONESALELOS PIC

WMC111_2D 297 271 4 0.68GWM261_2D 297 292 5 0.58BARC19_3A 297 278 3 0.48BARC133_3B 297 288 4 0.57GWM493_3B 297 285 3 0.44GWM161_3D 297 290 4 0.55GWM314_3D 297 286 6 0.71WMC492_3D 297 292 3 0.4

MARCADORTAMAÑO DE

MUESTRANº DE

OBSERVACIONESALELOS PIC

GWM456_3D 297 282 3 0.55BARC71_3D 297 261 4 0.37WMC89_4B 297 281 4 0.34

WMC720_4D 297 283 6 0.73WMC331_4D 297 287 3 0.58

CFD84_4D 297 287 2 0.34CFA2149_5A 297 290 4 0.48BARC130_5D 297 287 3 0.46GDM153_5D 297 277 4 0.63

MARCADORTAMAÑO DE

MUESTRA

Nº DE

OBSERVACIONESALELOS PIC

CFD49_6D 297 278 6 0.52GDM132_6D 297 279 3 0.52GWM469_6D 297 285 6 0.76GWM297_7B 297 281 5 0.61GWM437_7D 297 282 6 0.73GWM121_7D 297 280 4 0.48

MEAN 297 282.71 4.46 0.54

Resultados

Asignación genética

• Utilizando el programa Structure, se hicieron los análisis de agrupación, simulando entre 1 a 10 subpoblaciones (k).

• Utilizando el método de Evanno (2005), Delta K, se determinó (k=2)

Resultados• Mayoría de marcadores SSRs se encuentran en el

genoma D• Necesario incluir marcadores presentes en todos los

cromosomas para tener representatividad en cada grupo de ligamiento

• Se utilizaron 45 marcadores SNPs corridos en la misma población.

Resultados

Asignación genética

• Utilizando el programa Structure, se hicieron los análisis de agrupación, simulando entre 1 a 20 subpoblaciones (k).

• Utilizando el método de Evanno (2005), Delta K, se determinó (k=3)

Resultados

• Después de haber realizado los análisis en el programa Structure, se presenta el grafico de barras de los coeficientes de pertenencia de los genotipos a las tres subpoblaciones determinadas

Asignación genética

Resultados

Coordenada Porcentaje individual

(%)

Porcentaje Acumulado

(%)

1 21.516 21.51623

13.85410.618

35.3745.99

• Análisis de componentes principales a partir de un set de 3,700 SNP.

• Gran parte de la varianza existente en la población es capturada en los tres primeros componentes principales

Análisis multivariado

Resultados

• Se efectuó el PCA en dos dimensiones (2D), en el Programa Eigensoft versión 4.2, ya que se podía apreciar de mejor manera la separación genética de los 3 grupos conformados

Análisis de componentes principales (ACP)

Resultados

Característica subpoblación 1 subpoblación 2 subpoblación 3 Total Inmune 16.67% 5.32% 5.61% 9.09%Muy Resistente 11.46% 25.53% 29.91% 22.56%Muy Susceptible 14.58% 9.57% 11.21% 11.78%Resistente 39.58% 55.32% 40.19% 44.78%Susceptible 17.71% 4.26% 13.08% 11.78%

Total general 100.00% 100.00% 100.00% 100.00%

Correlación de datos fenotípicos

Resultados

Característica subpoblación 1 subpoblación 2 subpoblación 3 Total

Resistentes 67.71% 86.17% 75.70% 76.43%

Susceptibles 32.29% 13.83% 24.30% 23.57%

Total

general100.00% 100.00% 100.00% 100.00%

Correlación de datos fenotípicos

Conclusiones

• Con el protocolo utilizado para muestras frescas, se obtuvo altas concentraciones de ADN (hasta

3000 ng/ μl); mientras que con la metodología empleada para muestras secas se obtuvo menores

concentraciones de ADN genómico (hasta 200 ng/ul), sin embargo este último resultado no afectó a

nuestro estudio, ya que los marcadores SSRs requieren entre 5 a 20 ng/ul de ADN.

• En función de optimizar tiempo y recursos, cuando se trabaja con especies alopoliploides como el

trigo, se puede seleccionar primers que amplifiquen en diferentes cromosomas, asemejándose a

tener una combinación multiplex, como fue con el primer WMC89 que amplifico en el cromosoma

4B y 4D.

• Para obtener resultados objetivos en análisis de agrupamiento en trigo, es necesario tener datos

genotípicos en todos los cromosomas de sus genomas.

Conclusiones

• Para saturar regiones del genoma que no tengan cobertura, se puede utilizar marcadores

basados en distintos principios como fue el caso de SSRs y SNPs, basta que estén en equilibrio

de ligamiento.

• Los estudios de diversidad genética reflejaron que para los 28 marcadores utilizados se hallaron

125 alelos con un promedio de 4.46 alelos por marcador.

• El promedio PIC de los marcadores fue de 0.54

• Los análisis efectuados de agrupamiento y multivariados permitieron distinguir tres grupos

genéticos, de características muy similares, ya que las subpoblación 1 agrupo a 96 individuos, la

subpoblación 2 a 94 y la subpoblación 3 a 107.

• La subpoblación 2 presenta 87% de plantas resistentes a roya amarilla

Recomendaciones

• Al presentar la subpoblación 2 los mayores índices de plantas resistentes a roya amarilla, se

puede recomendar utilizar esta subpoblación en futuros programas de mejoramiento.

• Para mejorar la amplificación de marcadores SSRs, se puede optimizar el mix agregando BSA

o modificar la concentración de MgCl2.

• Se determinó que las condiciones óptimas de amplificación para los primers BARC19 y CFD84,

deben ser con 0,1% de BSA en el mix

• Para los primers BARC124 Y BARC133, se debe disminuir la concentración de MgCl2 a 1,5 mM

para obtener mejor amplificación

• Para realizar el análisis de estructura de la colección de líneas elites, es necesario contar con

un ordenador de alto rendimiento, y que pueda garantizar estar encendido y con energía por

más de 48 horas.

GRACIAS

AgradecimientosDr. Eduardo MorilloIng. Esteban FalconíIng. Johana BuitronLcda. Katerine OrbeJosé MorenoPersonal del DNB

M. Sc. Fernanda LoayzaB. Sc. Karina PonceDpto. Ciencias de la vida