manual de procedimientos para inmonologÍa. banco de sangre

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA

DE MEXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES

CUAUTITLAN

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA INMONOLOGÍA.

BANCO DE SANGRE

TRABAJO PROFESIONAL

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:

QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA

P R E S E N T A:

VIANEY HERNÁNDEZ SALINAS

ASESORA: QFB. MARTHA PATRICIA CAMPOS PEÓN

CUAUTITLAN IZCALLI, EDO. DE MEX. 2009

DEDICATORIA

LE DOY LAS GRACIAS A TODA LA GENTE QUE ME APOYO EN LA REALIZACIÓN

DE ESTE TRABAJO POFESIONAL

A MI FAMILIA

EDWIIN MI ESPOSO, POR TODO SU AMOR, SUSTENTO Y COMPRENSIÓN

SEBASTIAN MI ADORADO HIJO, POR DARME LAS FUERZAS PARA CONTINUAR

A MIS PADRES

MARÍA GRISELDA POR SU RECUERDO

OSCAR POR SU EJEMPLO

A MIS HERMANAS

NUBIA Y PAOLA POR SU CARIÑO

A BENIGNO, MINERVA, IRED, IRVING Y DELFINA POR SU PREOCUPACIÓN

PROFESORES

QFB MARTHA PATRICIA CAMPOS PEÓN MI ASESORA, POR TODA LA PACIENCIA Y ENSEÑANZA

DR. ANDRÉS ROMERO, DR. VÍCTOR ZENDEJAS, QFB. GUADALUPE REBOLLAR Y QFB. LADISLAO

PALOMAR POR BRINDARME SU VALIOSO TIEMPO Y EJEMPLO

AL INCMNSZ

POR PERMITIRME SER PARTE DE SU GENTE

“MANUAL DE PROCEDIMIENTOS

PARA INMUNOHEMATOLOGÍA

BANCO DE SANGRE”

ÍNDICE

Página

Generalidades

I. Prólogo 1

I.I. Introducción 2

III. Objetivo, Meta y Alcance 7

IV. Mensaje del Usurio 8

V. Marco Jurídico 9

VI. Seguridad de las Muestras 10

VII. Definiciones 11

VIII. Instalaciones y Procedimientos 12

TEMA 1. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS

1. 1 Responsabilidades 18

1. 2 Aplicación clínica 18

1. 3 Suministros 18

1. 4 Reactivos 18

1. 5 Equipo necesario 19

1. 6 Procedimiento del ensayo 20

1. 7 Marcado y empaque 23

1. 8 Formatos, referencias y bibliografía 24

TEMA 2. GRUPO SANGUINEO ABO AUTOMATIZADO


2. 2 Principio 25

2. 3 Aplicación clínica 27

2. 4 Recolección de la muestra 28

2. 5 Factores de rechazo 29

2. 6 Condiciones de manejo y almacenamiento 30

2. 7 Reactivos 30

2. 8 Control de calidad 31


2. 10 Resultados 34

2. 11 Interferencias y limitaciones del método 34


TEMA 3. GRUPO SANGUINEO Rh

Página


3. 2 Principio 36


3. 4 Reactivos 39




3. 8 Resultados 42


TEMA 4. PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES


4. 2 Principio 44


4. 4 Reactivos 47




TEMA 5. ANTICUERPOS IRREGULARES SU IMPORTANCIA EN

MEDICINA TRANSFUSIONAL

5. 1 Panel de 10 células 57


TEMA 6. RASTREO DE ANTICUERPOS IRREGULARES

MÉTODO LION EN TUBO

Página


6. 2 Principio 59


6. 4 Reactivos 62



6. 7 Resultados 65


6. 9 Formatos, referencias y bibliografia 69


MÉTODO CON ALBÚMINA


7. 2 Principio 70


7. 4 Reactivos 74


7. 6 Resultados 76



TEMA 8. PRUEBA DE COOMBS

Página


8. 2 Principio 79


8. 4 Reactivos 83




8. 8 Resultados 89


TEMA 9. PROCEDIMIENTO PARA CRIOPRESERVACIÓN DE CÉLULAS

PROGENITORAS HEMATOPOYÉTICAS

9. 1 Propósito y alcance

9. 2 Introducción 91

9. 3 Instrucciones y procedimiento 92

9. 4 Material y equipo requerido para criopreservar CPH 100

9. 5 Espécimen a criopreservar 101

9. 6 Procedimientos previos a la criopreservación de CPH 103

9. 7 Procedimiento para criopreservar 105

9. 8 Procedimiento para determinar el No. De CMN de las CPH 113

9. 9 Procedimiento para determinar la viabilidad celular de las CPH 114

9.10 Limpieza y asepsia de la campana de flujo laminar 115

9.11 Verificación de la esterilidad del proceso 116

9.12 Procedimiento para descongelar CPH criopreservadas 116

9.13 Abreviaturas 120

9.14 Formatos, referencias y bibliografia 127

ÍNDICE DE TABLAS

Página

TABLA 1. Avidez 20

TABLA 2. Especificidad 21

TABLA 3. Titulo de reactivos 22

TABLA 4. Sistema de grupo sanguíneo ABO 25

TABLA 5. Tipo y volumen de muestra requerida 29

TABLA 6. Identificación del control 31









TABLA 15. Volumen mínimo y máximo al criopreservar CPH 105

TABLA 16. Valores de DMSO – plasma para la medición exacta

Del DMSO al 20 %

108

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA 1. Tarjeta de gel 27

FIGURA 2. Tarjeta de gel para grupo sanguíneo ABO y Rh 28

FIGURA 3. Tarjeta dianagel 30

FIGURA 4. Ejemplo de procedimiento 42

FIGURAS 5 Y 6. Preparación de suspensión de eritrocitos 47

FIGURA 7. Albúmina al 22% 71

FIGURA 8. Suero de Coombs 80

FIGURA 9. Perfil de la temperatura durante el proceso de Congelamiento 98

FIGURA 10. Esquema de la localización dentro del contenedor de N2 (l) 111

FIGURA 11. Esquema de la localización dentro del marco metálico (RACK) 111

ÍNDICE DE FORMATOS

Página

FORMATO I. Material necesario para la Criopreservación de CPH 121

FORMATO II. Registro del procedimiento de Criopreservación de CPH 123

FORMATO III. Registro de temperatura y nivel de N2 (l) 125

FORMATO IV. Registro del contenedor de N2 (l)

cilindros Infra

126

I. PRÓLOGO

El proceso de la etapa universitaria es un proceso complicado, en la que en muchas

ocasiones hay que dedicar parte de nuestro tiempo libre a las actividades que engloban

una licenciatura del área de ciencias de la salud. Después de concluir el 100 % de

créditos, los estudiantes egresados de licenciatura tienen que realizar un procedimiento

de gran importancia, llamado Titulación, con la cual se da por concluida la etapa de la

carrera. Es gracias a los avances que han realizado en el departamento de exámenes

profesionales al ampliar las opciones de titulación que permitan al alumnado concluir

con dicho proceso. Mi alternativa es la de Trabajo Profesional, es de gran ayuda en mi

situación personal, que desde antes de concluir mis estudios superiores, me incorpore al

área laboral, lo que desde luego obtener el grado, me permitirá seguir avanzando en

estudios posteriores que desee realizar sin dejar de mencionar en mi área de trabajo.

En la actualidad hay que estar bien preparados para enfrentar la problemática que se

nos presenta a los que concluimos la trayectoria, pues las oportunidades son escasas, y

en gran medida de difícil acceso, es por ello que para formar parte, del área del Banco

de Sangre de una Institución de prestigio como es el Instituto Nacional de Ciencias

Medicas y Nutrición Salvador Zubirán, que es mi caso particular, no solo hay que

mostrar lo aprendido durante la formación académica, que considero la mejor carta de

presentación, además es necesario agotar todas las herramientas con las que se cuenta

en la actualidad, como el conocer un segundo idioma, como el ingles, el manejo de

computadora e Internet entre otros.

II. INTRODUCCIÓN

La realización de un examen de laboratorio se lleva a cabo en 3 etapas igualmente

importantes que son, en el siguiente orden: etapas pre-analítica, analítica y post-

analítica.

Este documento se refiere a la segunda de ellas; la etapa analítica.

En el Servicio de Medicina Transfusional se ha enfatizado la necesidad de metodologías

exactas y precisas, para realizar las pruebas pretransfusionales en el menor tiempo

posible para coadyuvar a la salud del paciente.

La altamente sofisticada y bien controlada tecnología actual de laboratorio es menos útil

si las muestras a las que les practicarán los análisis llegan al laboratorio con errores

debidos a mala identificación de las muestras o a técnicas de recolección deficientes.

Hoy en día es más probable que los errores ocurran durante la toma y manejo de las

muestras, que en el propio procedimiento de laboratorio.

Algunos estudios demuestran que el 8% de los errores al rotular la muestra con el

nombre, edad, sexo y número de identificación del paciente no son detectados a pesar de

los extensos procedimientos de revisión en manuales.

Los errores sistemáticos son difíciles de detectar y controlar. El uso de este manual

podría ayudar a minimizar muchos de estos problemas.

Uno de los factores que influye en la atención médica que se otorga, es la disponibilidad

de sangre y sus derivados en las cantidades necesarias y con las características de

calidad y seguridad que garanticen, el cumplimiento de las normas de salud vigentes.

Una certificación, en general, asegura la calidad de un producto, de un organismo o de

una persona. Pone de manifiesto que se poseen los niveles de competencia para ejercer

correctamente y dar adecuadamente las prestaciones que se le suponen. La certificación

es el conjunto de pruebas que permiten la obtención de un certificado que da fe de la

calificación de un profesional en un momento dado de su carrera.

La Certificación asegura a un profesional que posee determinados niveles de

conocimiento y de habilidades que le permiten ejercer su profesión en las mejores

condiciones.

No es un diploma académico ni sustituye a ningún título. No es para aquellos que

empiezan su vida profesional, sino para los que ya están trabajando. Por eso, sólo

pueden ser candidatos aquellas personas que en la actualidad sean profesionales que

tengan una experiencia de al menos dos años. Al margen de consideraciones

académicas, valora, sobre todo, el grado de adecuación a los requerimientos de la

práctica profesional y sus perspectivas de desarrollo. Además, dota a la profesión de una

herramienta de valoración de los niveles de competencia en el conjunto del sector,

clarifica, ayuda en la definición de los perfiles de los candidatos a un puesto de trabajo,

aportando por ello elementos de mayor transparencia y seguridad en el funcionamiento

del mercado laboral.

El Banco de Sangre es la unidad operativa, responsable de la disposición de productos

sanguíneos con oportunidad y en óptimas condiciones, para la realización de los

diferentes procedimientos médicos que se les prescriben a los pacientes en los servicios

asistenciales. En casi todos se lleva a cabo la recolección, conservación,distribución de

la sangre y sus compuestos. La participación de los donadores voluntarios es

fundamental para mantener un número suficiente de unidades sanguíneas, tan necesarias

en la atención a pacientes.

“Tiene el compromiso de cubrir los requerimientos de sangre de pacientes, donadores y

médicos, mediante el mejoramiento continuo de los procesos y tecnología desarrollada,

y aplicados por personal altamente calificado”

La certificación es un requisito fundamental en la práctica médica, el tener acceso a un

Banco de Sangre que asegure la credibilidad de los resultados y que el producto

satisfaga las necesidades y expectativas de servicio de médicos y pacientes,

disminuyendo al mínimo el porcentaje de error, por lo que es indispensable que

dispongan de un sistema de garantía de la calidad, atendiendo a su enorme

responsabilidad sanitaria y social.

“La calidad en estos, no puede ser menospreciada y el objetivo de aplicar un sistema de

gestión de la calidad a través de las Normas Internacionales de Estandarización (ISO),

ayudará a sistematizar el trabajo, cumpliendo estrictamente los estándares”.

Por lo anterior, todo el personal que trabaja en este lugar y en especial los responsables

de gestión y dirección, deben asegurarse que se cumpla con los requisitos de calidad,

normatividad que se ofrezcan productos válidos a los enfermos, así como mejorar la

seguridad de los productos, la productividad y los costos, tras obtener la Certificación

de la Calidad ISO 9001-2000.

La certificación, es un logro importante y trascendental, el cual nos impulsará a

continuar con una mejora constante y ascendente del servicio que prestamos para

beneficio de los pacientes, y claro, sin olvidar a los donadores.

En la actualidad, el implementar un sistema de gestión de la calidad, resulta

indispensable, para contar con servicios de excelencia, aún cuando el proceso que se

lleva a cabo en una época especialmente difícil donde los recursos materiales son

escasos y donde no mucha gente piensa en trabajo en equipo y en superación.

SANGRE

La sangre es un tejido líquido que recorre el organismo transportando células, y todos

los elementos necesarios para realizar las funciones vitales (respiración, síntesis,

defender de agresiones) todo un conjunto de funciones complejas e importantes para la

vida. La cantidad en una persona está relacionada con su edad, peso, sexo y estatura, en

un adulto se considera que hay entre 4.5 y 6 litros. Todos los órganos del cuerpo

humano funcionan gracias a ésta que circula por arterias, venas y capilares.

Está formada por diversos componentes:

GLÓBULOS ROJOS O HEMATÍES

Son las células sanguíneas más numerosas y la hemoglobina que contienen es la

responsable de su color rojo. Se forman en la médula ósea, que se halla dentro de los

huesos del esqueleto, desde donde son liberados al torrente sanguíneo.

Su función es transportar el oxígeno desde los pulmones a los diferentes tejidos del

cuerpo para que las células respiren, y también eliminan los residuos producidos por

la actividad celular (p.ej. anhídrido carbónico).

GLÓBULOS BLANCOS O LEUCOCITOS

Son los encargados de proteger al organismo contra los diferentes tipos de

microbios. Cuando hay una infección aumenta su número para mejorar las defensas.

Unos se forman en la médula ósea y otros en el sistema linfático (bazo, ganglios,

etc).

PLAQUETAS

Son las células sanguíneas más pequeñas. Se producen también en la médula ósea y

viven unos 6-7 días. Intervienen cuando se produce rotura, se adhieren rápidamente

en ese lugar para que cese la hemorragia, dando tiempo a la formación del coágulo

definitivo.

PLASMA

Es un líquido compuesto de agua, proteínas, sales minerales y otras sustancias

necesarias para el funcionamiento normal del organismo y en donde se encuentran

"nadando" las células sanguíneas.

Entre las sustancias de importancia que transporta el plasma están las siguientes.

La Albúmina. Es una proteína que ayuda a mantener el agua del plasma en una

proporción equilibrada.

Las Globulinas. Son los anticuerpos encargados de la defensa de nuestro

organismo frente a las infecciones. Su disminución acarreará una disminución de

las defensas.

Factores de Coagulación. Son imprescindibles para evitar las hemorragias. La

ausencia de algún factor de coagulación puede ocasionar trastornos

hemorrágicos ya que se dificulta la formación del coágulo.

Otras proteínas transportan sustancias necesarias (grasas, azúcares, minerales,

entre otras) para el normal funcionamiento de las células.

III. OBJETIVO

Este manual tiene como objetivo principal, contener las políticas y ensayos

inmunohematológicos, como una estandarizada de procedimientos con el fin de obtener

resultados óptimos en menor tiempo, recopilados a través de la experiencia laboral para

dar respuesta inmediata a las necesidades de los pacientes que requieren una

transfusión segura y de calidad.

METAS

Lograr la efectividad de los Servicios de Medicina Transfusional acorde con las

necesidades de nuestra población en aras de un desarrollo sustentable.

ALCANCE

Aplica a todo el personal que labora en el laboratorio de inmunohematología, así como

las relacionadas con el área afín.

IV. MENSAJE DEL USUARIO

Este documento ha sido elaborado con el objeto de uniformar las actividades y

procedimientos relacionados con el laboratorio de inmunohematología.

Para su preparación se han tomado como base, el manual de procedimientos operativos

(técnicas), el manual de la AABB (American Association of Blood Banks) de los

Estados Unidos de Norte América y los insertos de reactivos del fabricante, además de

referencias bibliográficas.

El documento incluye el protocolo completo de los pasos que deben seguirse en el

servicio de inmunohematología del Banco de Sangre, para llevar a cabo las pruebas

solicitadas.

Describe además las instalaciones en donde se llevan a cabo estas pruebas

(pretransfusionales) tanto en pacientes externos como hospitalizados, así como el

procedimiento para llevar a cabo las pruebas pretransfusionales.

Finalmente se presenta un programa para el entrenamiento del personal que realiza estas

pruebas pretransfusionales.

Con la implementación de estas prácticas se busca la estandarización en la realización

de estas técnicas en el menor tiempo posible para beneficio del paciente.

V. MARCO JURÍDICO

Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos.

D.O.F. 5-II-1997, sus Reformas y adiciones.

Ley Orgánica de la Administración Pública Federal

D.O.F. 29-XII-1976 y sus Reformas.

Ley General de Salud.

D.O.F. 7-II-1984 y sus reformas.

Ley Federal de Entidades Paraestatales

D.O.F 4-II-1998 y sus Reformas.

Ley para el Fomento de la Investigación Científica y Tecnológica.

D.O.F. 21-V-1999

Ley de los Institutos Nacionales de Salud.

D.O.F. 26-V-2000

REGLAMENTOS

Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Prestación de Servicios de

Atención Médica.

D.O.F. 14-V-1986

Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud.

D.O.F. 6-I-1987

Reglamento de la Ley Federal de Entidades Paraestatales.

D.O.F. 7-IV-1995

Decretos por el que se aprueba el Programa de Reforma del Sector Salud 1995-2000.

D.O.F. 11-III-1996

Decreto por el que se reforma la Ley General de Salud.

D.O.F. 26-V-2000

NORMAS OFICIALES MEXICANAS

Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993 para la disposición de sangre humana y

sus componentes D.O.F. 16-I-1995.

NOM – 087 – SSA2.

VI. SEGURIDAD DE LAS MUESTRAS

Al trabajar las muestras de sangre deben observarse “las precauciones universales”.

Todo espécimen pudiera estar infectado con los virus de la inmunodeficiencia humana

(VIH) o de la Hepatitis B, entre otras.

VII. DEFINICIONES

En el contexto de esta publicación, los términos listados abajo se definen como sigue:

(1) Espécimen o muestra de un paciente: Un volumen de sangre colectada

adecuadamente, para realizar una o más pruebas de laboratorio. Regularmente es una

alícuota de sangre anticoagulada, de plasma, o suero.

(2) BBS: Blood Bank Sofá 2000 es un software de administración en Medicina

Transfusional vanguardista para la administración del Servicio, que permite un registro

confiable, de donadores y receptores de sangre humana.

(3) Rastreo de anticuerpos irregulares: Prueba que se realiza de rutina a todos los tubos

primarios que llegan al Servicio.

(4)Identificación de anticuerpos irregulares: Prueba que se realiza a los sueros que

resulten con rastreo positivo.

VII. INSTALACIONES Y PROCEDIMIENTOS

Aquí se describen cuales son los sitios potenciales en donde se pueden realizar las

pruebas pre - transfusionales:

MESA DE PRUEBAS CRUZADAS

Aquí se realizan todas las pruebas pretransfusionales a los pacientes, cuenten o no con

registro del Instituto, a quienes sus médicos tratantes les hayan solicitado concentrados

eritrocitarios, plasma fresco congelado, plasma envejecido, crioprecipitados

concentrados plaquetarios y/o plaquetaféresis.

No hay programación de citas, en este mismo sitio se trabajan muestras urgentes y

ordinarias así como las cirugías electivas, inmediatamente después de terminar las

pruebas pretransfusionales del paciente utilizamos el sistema BBS para ingresarlos.

Eventualmente, también acuden al laboratorio de inmunohematología pacientes

ambulatorios que son referidos de otras Instituciones públicas y/o por médicos

particulares.

El acceso es por la puerta número 4 del INCMNSZ que da a la calle Martín de la Cruz

S/N ubicada entre Vasco de Quiroga y Viaducto Tlalpan. Tiene un horario de

funcionamiento de 7:00 hr. a 18:00 hr. por la puerta 2 después de esta hora.

Esta Unidad fue inaugurada en enero de 1995. Cuenta con rampas de acceso e

instalaciones para discapacitados, un mostrador de registro para los pacientes así como

sala de espera y sanitarios.

A continuación se describirán las instalaciones con que cuenta, así como algunos

procedimientos.

Flujo de atención al personal que trae las muestras.

Los pasos que deben seguir al llegar al laboratorio de inmunohematología son:

1) Entregar al químico o técnico responsable de la mesa solicitud y tubo piloto.

2) Esperar a que ambo sean revisados.

3) Si los datos son correctos se le indicará que registre su solicitud en la libreta

de “control de unidades y sus componentes”.

4) Una vez concluidos los pasos anteriores el químico responsable informará al

mensajero en cuanto tiempo estarán listas sus pruebas pretransfusionales.

5) Para la realización de pruebas pretransfusionales ver la Pág. 48.

MESA DE GRUPOS SANGUÍNEOS DE DONADORES

Muestras para grupo sanguíneo AB0 y Rh.

En caso de que sean donadores:

1) El químico o técnico responsable de realizar grupos sanguíneos recoge las muestras

en el área de donadores. Son dos tubos por donador uno para biometría hemática y

grupo sanguíneo y otro para serología.

2) Los estos deben contener los siguientes datos: nombre completo y número de

predonante, fecha, nombre del estudio (ej. B-H., Historia clínica etc.)

3) Para ver la realización de grupos sanguíneos refiérase a la pagina 33.

SITUACIONES ESPECIALES

Paso 1: Revisar la solicitud de laboratorio

Cada una de ellas para exámenes de laboratorio debe ser introducida en el sistema de

software para poder identificar y obtener la hoja de trabajo, etiquetas, y otros

suministros de cada paciente.

Debe contener por lo menos la siguiente información:

Nombre completo del paciente

Número de expediente o de registro

Fecha

Nombre del médico

Ubicación del paciente

Hemoderivados solicitados

Antecedentes transfusionales

Paso 2: En caso de errores

Si hay errores en la solicitud o tubo piloto tales como:

Apellidos mal escritos

Registros diferentes

Tachones o enmendaduras

Entonces la muestra no será procesada, salvo la autorización por escrito del jefe de

Servicio de Medicina Transfusional o por el médico residente a cargo del paciente.

Paso 3: Reacciones Transfusionales

La mayoría de las reacciones transfusionales en este instituto (cerca de 98%) se deben a

leucocitos y a medicamentos, sin embargo cuando estas se presentan, estos son los

pasos a seguir en el laboratorio de inmunohematología:

El médico tratante o enfermera a cargo deberá enviar un tubo piloto y una

biometría hemática al laboratorio.

Aquí se le realizaran de nueva cuenta las pruebas pretransfusionales, qué además

incluyen un Coombs directo con la finalidad de saber si el paciente está

hemolizando.

Una vez que se constató el motivo de la reacción y se tiene la certeza de que la

reacción transfusional no fue por incompatibilidad AB0 se puede transfundir

nuevamente al paciente si así lo requiere.

Para la realización de reacciones transfusionales ver manual de procedimientos

operativos.

INTERFERENCIAS Y LIMITACIONES DEL MÉTODO

FACTORES QUE AFECTAN LOS RESULTADOS DE LABORATORIO

Muestras lipémicas

Muestras hemolizadas

Muestras coaguladas

Muestras insuficientes (menos de 4.5mL de volumen)

Reactivos que presentan turbidez o hemólisis

Las que presenten uno o más de los factores arriba mencionados solo se procesaran

previa autorización del jefe de servicio.

A los resultados de laboratorio inesperados y no buscados se les llama frecuentemente

“errores de laboratorio”. Aún cuando los procedimientos analíticos hayan sido

realizados en forma correcta y precisa, diversas variables pueden afectar los resultados.

El conocimiento de éstas y la estandarización de los procedimientos de las pruebas de

laboratorio son esenciales para la correcta interpretación y el uso óptimo de los datos.

Las principales causas pueden estar relacionadas a factores no analíticos tales como la

toma, manejo y transporte de las muestras.

Los factores no biológicos, como la inadecuada identificación del paciente, y factores

biológicos, como la postura del paciente y la hora de la toma de la muestra, contribuyen

juntos al “error del laboratorio” total.

PROGRAMA DE ENTRENAMIENTO

Se puede pensar, inicialmente, que cualquier individuo inteligente puede llevar a cabo

las pruebas del laboratorio de inmunohematología. Sin embargo, aquellos que están

familiarizados con esté saben que eso no es verdad. La Medicina Transfusional es un

procedimiento complejo que requiere conocimientos y experiencia para realizarlo

correctamente. Por esta razón, una institución debe establecer criterios para la selección

adecuada del personal.

El programa de entrenamiento debe contener instrucciones didácticas y entrenamiento

empírico.

OBJETIVOS DEL PROGRAMA DE ENTRENAMIENTO

Después del entrenamiento, el entrenado debe ser capaz de realizar las siguientes

tareas:

Realizar grupos sanguíneos AB0.

Realizar pruebas pretransfusionales y describir como se llevan a cabo, así como

del rastreo de anticuerpos irregulares fuera del sistema Rho y Coombs directo.

Identificar los diferentes formatos y solicitudes asociados al Servicio de

Medicina Transfusional.

Fraccionar hemoderivados a partir de sangre total, como Concentrados de

Eritrocitos, Plasma Fresco Congelado, Concentrado Plaquetario,

Crioprecipitados, y Plasma sin factor VIII. Etiquetado, almacenamiento y

distribución de todos los componentes sanguíneos obtenidos en esta área.

Llevar a cabo el control de calidad de reactivos de forma manual y

automatizada.

Conocer perfectamente cada una de las áreas del servicio.

Identificar cada uno de los equipos de refrigeración y saber que producto se

almacena en ellos.

Saber a qué temperatura se deben almacenar cada uno de los hemoderivados ya

fraccionados.

Saber a qué temperaturas se conservan cada uno de los insumos y reactivos que

son utilizados rutinariamente en el laboratorio de inmunohematología.

Saber utilizar el software de administración.

CONTROL DE CALIDAD

De manera rutinaria se realizan pruebas de especificidad y avidez a los sueros

hemoclasificadores y potencia al abrir el lote.

Al equipo automatizado también se le realiza de forma rutinaria un rastreo de

anticuerpos irregulares con dos muestras conocidas una negativa y otra con rastreo

positivo.

En el caso de grupos sanguíneos se lleva a cabo evaluando tres muestras de individuos

con grupos sanguíneos previamente conocido.

FASE PRE – ANALÍTICA

TEMA 1. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS

1.1 RESPONSABILIDADES

Es responsabilidad del Jefe de Medicina Transfusional y del Coordinador (a) el

proporcionar éste documento al personal de nuevo ingreso y a todo aquel que lo

requiera.

Es responsabilidad de todo el personal de inmunohematología conocer y seguir este

procedimiento.

1.2 APLICACIÓN CLÍNICA

En Medicina Transfusional es primordial ya que esté es la base de todo inmunoensayo y

se lleva a cabo de manera habitual. Cada día se hacen pruebas de especificidad, avidez

y potencia al abrir el lote de los sueros hemoclasificadores.

1.3 SUMINISTROS

La siguiente lista describe los suministros que deben estar disponibles en el laboratorio

de para llevarlo a cabo manera habitual.

1.4 REACTIVOS

Antisueros hemoclasificadores tienen las siguientes características: Caducidad

mínima de un año, con certificación ISO 9001, FDA o mayor

Eritrocitos con fenotipo conocido al 3-5% caducidad de 3 a 4 semanas

Tarjetas con gel sephadex para pruebas cruzadas, grupos sanguíneos y fenotipos

Solución salina fisiológica al 0.9%

Solución I (diana sol I)

Solución II (diana sol II)

Solución de lavado A (diana fluid A)

Solución de lavado B (diana fluid B)

1.5 EQUIPO NECESARIO

MATERIAL DE VIDRIO

Pipetas Pasteur

Tubos de 12x75 mm

Frascos goteros estériles

EQUIPOS

Centrifugas de mesa

Incubador de calor seco

OTROS

Guantes: Son de látex, no estériles. Si algún trabajador es susceptible de

desarrollar dermatitis al usarlos por largos períodos de tiempo, debe intentar usar

de vinil u otro tipo de plástico.

Contenedores desechables para punzo-cortantes:

En este sitio debe haber disponibles contenedores desechables para material punzo-

cortante en el cual se coloca el material de vidrio usado que se haya roto. Están

fabricados de plástico rígido y tienen una pestaña para desatornillar la aguja.

Además están claramente marcados como residió bio – peligrosos, de acuerdo con la

NOM – 087 – SSA.

Bulbos de hule o látex

Gogles

1.6 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO

AVIDEZ

La avidez de los reactivos hemoclasificadores para determinar grupos sanguíneos del

sistema ABO, en la prueba en placa y a temperatura ambiente, debe ser tal, que la

aglutinación de los eritrocitos del tipo correspondiente se inicie en el tiempo máximo

que se específica para cada subgrupo, contados a partir del momento en que se ponen en

contacto suero y eritrocitos y el tamaño de los cúmulos aglutinados no debe ser menor a

1mm de diámetro.

TABLA 1. AVIDEZ

ESPECIFICIDAD

El producto debe estar libre de aglutininas diferentes a las especificadas en la etiqueta y

libre de efectos o substancias indeseables tales como la presencia de hemolisinas o la

tendencia a producir el fenómeno de rouleaux.

SUERO

GRUPO

SANGUÍNEO O

SUBGRUPO DE LOS

ERITROCITOS

ENSAYADOS

NÚMERO DE

ESPECIMENES

AL AZAR EN

PRUEBAS

TIEMPO MÁXIMO

EN SEGUNDOS

PARA QUE INICIE

LA AGLUTINACIÓN

Anti - A

A1 2 15 R1r Rrª

A2 2 20

A1B 1 15

A2B 2 30

Anti - B

B 3 15

A1B 1 15

A2B 1 15

Anti - AB

A1 2 15

A2 2 20

B 3 15

Anti - D

30

0

Este control se lleva a cabo de manera habitual y se hace como una determinación de

grupo sanguíneo ABO en tubo con eritrocitos con fenotipos conocido al 3-5%.

Lavar con solución salina fisiológica al 0.9% eritrocitos del grupo O, A, B y A2

y variantes débiles del grupo A.

Preparar una suspensión salina del 3-5% de cada uno de los eritrocitos.

Colocar igual volumen de la suspensión de eritrocitos y del reactivo, en un tubo

de tamaño adecuado (los eritrocitos deben lavarse tres veces y resuspender en

solución salina fisiológica al 0.9 % para obtener la suspensión del 3-5%).

Centrifugar 30 segundos de 3000 a 3500 rpm.

Leer. Los reactivos deberán contener únicamente las aglutininas especificadas

en la etiqueta.

TABLA 2. ESPECIFICIDAD

CÉLULAS CONOCIDAS

SUERO

A1

A2

B

0

R1r

Rr

Anti - A

4+

4+

0

0

Anti - B

0

0

4+

0

Anti - AB

4+

4+

4+

0

Anti - D

4+

0

POTENCIA

El titulo mínimo de los reactivos hemoclasificadores aceptable para cada grupo o

subgrupo de eritrocitos por prueba, se indica en la siguiente tabla:

TABLA 3. TITULO DE REACTIVOS

SUERO

GRUPO

SANGUÍNEO O

SUBGRUPO DE LOS

ERITROCITOS DE

PRUEBA

NÚMERO DE

ESPECIMENES

PROBADOS

TIEMPO MÁXIMO EN

SEGUNDOS PARA QUE

INICIE LA

AGLUTINACIÓN

Anti - A

A1 2 256

A2 2 128

A1B 2 128

A2B 3 8

Anti - B

B 2 256

A2 B 2 128

A1 2 256

Anti - AB

A2 2 64

B 2 256

Anti - D

R1r 2 64

Rrr 2 0

TITULO

Hacer diluciones dobles seriadas de los reactivos hemoclasificadores en

solución salina fisiológica al 9%.

Colocar tubos de ensaye de 12x75 mm en una gradilla y agregar igual volumen

de la dilución del suero y de la suspensión de eritrocitos a cada tubo y mezclar.

Centrifugar 30 segundos de 3000 a 3500 rpm.

Resuspender suavemente las células y bajo iluminación apropiada leer

microscópicamente sin demora.

Los títulos de aglutinación se realizan siempre por duplicado y deberán ser

reproducibles. Si existen diferencias en las lecturas de dos tubos con la misma

dilución del suero, deberá repetirse la prueba.

Lecturas. Los sueros sin diluir más los eritrocitos no se consideran diluciones.

La aglutinación se lee en los tubos con suero que se ha diluido antes de la

adición de la suspensión de eritrocitos.

1.7 MARCADO Y EMPAQUE

Las etiquetas en el envase primario y secundario deben contener la siguiente

información:

Nombre del producto

Nombre y domicilio del fabricante y distribuidor

Número de lote

Número de registro de la SSA

Fecha de expiración

Temperatura de almacenaje

Volumen

Debe cumplir con las especificaciones señaladas en la NOM- 008-SCFI-1993.

1.8 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍA

Asociación Argentina de Hemoterapia e Inmunología. 2004. Manual Técnico.

Ed. Biomote. Argentina. p. 22, 23, 25,25.

Documento M29-T de la NCCLS.1997. Protección de los Trabajadores de

Laboratorio de Enfermedades Infecciosas Transmitidas por sangre, líquidos

corporales y tejidos. p.15,16.

Documento H18-A de la NCCLS. NOM-003 –SSA2-1993. Procedimientos Para

el Manejo y Proceso de Muestras de Sangre. p. 12, 14, 15,16.

Documento M29-T de la NCCLS 2000, Protección de los trabajadores de

laboratorio de enfermedades infecciosas transmitidas por sangre, líquidos

corporales y tejidos. p. 210 – 216.

Manual de Procedimientos Operativos

Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993. Para la disposición de sangre

humana y sus componentes D.O.F. 16-I-1. p. 102,103, 105 – 114.

NOM-008-SCFI-1993.

FASE ANALÍTICA

TEMA 2. GRUPO SANGUÍNEO ABO AUTOMATIZADO


El Coordinador de Inmunohematología debe asegurarse que este procedimiento se

cumpla.

Es responsabilidad de los químicos y técnicos laboratoristas cumplir con lo descrito

en este procedimiento.

2.2 PRINCIPIO

La determinación de los grupos sanguíneos se realiza mediante una reacción antígeno-

anticuerpo.

El sistema de grupos sanguíneos ABO es único en cuanto a que una persona que

carezca de los antígenos A y/o B en los eritrocitos, regularmente tiene anticuerpos en el

suero dirigidos al antígeno o antígenos faltantes.

TABLA 4. SISTEMA DE GRUPO SANGUÍNEO ABO

GRUPO SANGUÍNEO

ANTIGENOS

PRESENTES EN LOS

GLOBULOS ROJOS

ANTICUERPOS PRESENTES

EN SUERO

O

Ninguno

Anti - A y Anti - B

A

A

Anti - B

B

B

Anti - A

AB

A y B

Ninguno

Para realizar el grupo sanguíneo de una persona se prueban directamente los eritrocitos

con reactivo Anti-A, y Anti-B ( prueba con eritrocitos o prueba directa). La

confirmación de los resultados se hace utilizando eritrocitos de grupo A y B ( prueba

sérica o prueba inversa ). Algunas pruebas adicionales facilitan la identificación de

subgrupos por ejemplo: La distinción serológica de las células A1 y A2 utilizan lectina

de las semillas de Dolichos biflorus.

En la dilución apropiada, esta lectina reacciona como Anti-A1 y aglutina los eritrocitos

A1, pero no los A2. El 80% de los individuos del grupo A o AB posee globulos rojos

que se aglutinan en presencia de anti-A1 y, por lo tanto, se clasifica como A1 o A1 B.

El 20% restante, con eritrocitos que se aglutinan en presencia de Anti-A, pero no de

anti-A1, se clasifican como A2 o A2 B.

PRINCIPIO DEL MÉTODO

La tecnología de microtipificación en gel se basa en la separación por tamaño de los

eritrocitos aglutinados, durante un proceso de centrifugación en un gel poroso.

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequeños se distribuyen

a lo largo de la columna. Las tarjetas tienen 8 columnas compuestas por un gel de

sephadex que sirve como soporte para evitar que los eritrocitos aglutinados crucen

hasta el fondo del pocillo, de tal forma que solo los eritrocitos libres podrán migrar

formando un pequeño botón al final del pocillo.

FIGURA 1. TARJETA DE GEL

Tarjetas de Gel

Gel de Sephadex o Poliacrilamida

Sobrenadante

Cámara de Reacción

2.3 APLICACIÓN CLÍNICA

El sistema de grupo ABO sigue siendo el más significativo en Medicina Transfusional.

Es el único en el cual el suero de la mayoría de las personas no expuestas a eritrocitos

humanos poseen anticuerpos recíprocos constantes y previsibles.

A causa de estos anticuerpos, la transfusión de sangre ABO incompatible podría

provocar hemólisis intravascular grave, así como también las otras manifestaciones de

las reacciones hemolíticas transfusionales agudas. Las pruebas de detección de la

incompatibilidad ABO entre los receptores y donantes constituyen la base de los

estudios pretransfusionales.

FIGURA 2. TARJETA DE GEL PARA GRUPO SANGUÍNEO ABO Y Rh

2.4 RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA

PREPARACIÓN DEL PACIENTE

No es necesario el ayuno del paciente y/o donante para la realización de este

estudio

TIPO DE MUESTRA:

Suero

Eritrocitos

VOLUMEN REQUERIDO:

Sangre total: Óptimo, 7 mL

Mínimo 4 mL

TABLA 5. TIPO Y VOLUMEN DE MUESTRA REQUERIDO

TIPO DE

MUESTRA

VOLUMEN

Óptimo

Mínimo

Suero

Eritrocitos (3-5%)

4.0 mL

3.0 mL

1.0 mL

0.5 mL

RECIPIENTE DE RECOLECCIÓN

La muestra debe ser recolectada en un tubo con tapón morado que contiene

anticoagulante (EDTA), o en un tubo sin anticoagulante con datos especiales para el

Servicio de Medicina Transfusional.

IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA

La muestra debe estar perfectamente identificada, conteniendo en la etiqueta nombre

completo, número de registro, fecha de la toma, y ubicación del paciente en caso de no

pertenecer a la consulta externa.

2.5 FACTORES DE RECHAZO

Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes

puntos:

Presencia de macro partículas

Muestras mal etiquetadas

Volumen insuficiente

Muestras coaguladas

Cuando una muestra es rechazada, el coordinador y/o responsable de área (o el

responsable del turno) deberá dar aviso al médico encargado del servicio (o al MIP),

solicitando una nueva muestra o cancelando el análisis y llenar un reporte de productos

no conformes (FR-AC-05) como se establece en el procedimiento general de control de

producto no conforme (PG-AC-04).

2.6 CONDICIONES DE MANEJO Y ALMACENAMIENTO

La muestra debe estar contenida en tubos siempre cerrados y en posición vertical. Se

recomienda separar físicamente el suero de las células dentro de las 2 horas siguientes a

la recolección de la muestra. El análisis se realiza dentro de la primera hora de llegada

de la muestra. Después del análisis se almacenan durante las primeras 72 hrs. entre 2ºC

y 8ºC. Si la muestra requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores

rígidos de plástico perfectamente bien cerrados, los cuales deben de proporcionarle

seguridad y facilidad de transporte a la muestra. Las tarjetas diana donors/ donantes

deben almacenarse cerrados entre 2°C y 8°C.

Las condiciones de almacenamiento distintas a las recomendadas pueden producir

resultados erróneos.

Estabilidad de las tarjetas diana en gel.

El reactivo es estable hasta la fecha de caducidad que aparece en la etiqueta si se

almacena entre 2°C y 8°C. No congelar.

2.7 REACTIVOS

MATERIALES

FIGURA 3. TARJETAS DIANAGEL DONORS/ DONANTES

FORMA AUTOMATIZADA

INGREDIENTES ACTIVOS

Tarjetas diana en gel Anti-A (marca Grifols)

Tarjetas diana en gel Anti-B (marca Grifols)

Tarjetas diana en gel Anti-AB (marca Grifols)

Todos los reactivos deben utilizarse de acuerdo con las instrucciones del

fabricante.

PREPARACIÓN

Previa centrifugación de las tarjetas de reactivos dianagel donors/donantes

FORMA AUTOMATIZADA:

No requiere de preparación

ACEPTABILIDAD

La aceptabilidad de un reactivo está determinada por los resultados obtenidos en

el control de calidad

2.8 CONTROL DE CALIDAD

TABLA 6. IDENTIFICACIÓN DEL CONTROL

NOMBRE DEL

CONTROL NIVEL TIPO DE MUESTRA

PRUEBA DIRECTA reactivo:

Anti - A

Anti - B

Anti-AB

Anti - D

I Antisueros, tarjetas

PRUEBA INDIRECTA Células al 3-5 % :

Células A1

Células A2

Células B

Células O

II

Eritrocitos

PREPARACIÓN DEL CONTROL

No requiere preparación

FRECUENCIA DE USO DE CONTROLES

Deben analizarse los 2 niveles de controles todos los días que se procese el analito

ACEPTABILIDAD Y ACCIONES CORRECTIVAS

En caso de que una corrida sea rechazada, debe repetirse el ensayo, si después de ello no

se corrigen los valores, deben indagarse las posibles causas de error, como pueden ser

entre otros factores: almacenamiento inadecuado del reactivo, muestras de sangres

viejas, suspensiones muy diluidas o muy concentradas, tiempo y temperatura de

incubación inapropiada.

Si al observar estos detalles persiste, debe buscarse alguna falla sencilla en el equipo, si

el continua lo conveniente es dar aviso al servicio técnico especializado del proveedor

del instrumento.

REGISTRO Y ALMACENAMIENTO DE LOS DATOS DE CONTROL DE

CALIDAD

El Sistema Operativo del equipo Wadiana tiene la capacidad de almacenar los

resultados de Control de Calidad obtenidos cada vez que este se procese. De esta

manera, se puede observar en pantalla el valor obtenido.

ALTERNATIVAS EN AUSENCIA DE CONTROLES COMERCIALES

En caso de no contar con controles comerciales debe usarse una muestra de eritrocitos y

de sueros de los grupos A, B, AB, Rh, O.

EQUIPO NECESARIO

Centrífuga

Guantes desechables

Gradillas

Sistema Wadiana


Bulbo de hule

Pipetas Pasteur


Una vez recibida la muestra debe ser centrifugada durante 5 minutos a 3500 rpm.

Las muestras de suero deben ser procesadas sin ningún tratamiento previo y conforme

lo especificado según el Manual del Sistema Wadiana.

PROCEDIMIENTO

1. Muestra tomada en tubo con tapón morado con anticoagulante (EDTA).

2. Centrifugar la muestra durante 5 minutos a 3000-3500 rpm.

3. Colocar el reactivo diana sol. 1 en la posición num. 9 del Sistema Wadiana.

4. Posteriormente colocar las tarjetas diana gel donors/ donantes.

5. Verificar las soluciones de lavado 1, 2.

6. Especificar en el equipo que prueba se va a realizar (grupo sanguíneo).

7. Identificar la muestra (nombre completo).

8. Realizar el inicio de la prueba.

Nota: el tiempo de análisis es de 10 minutos.

2.10 RESULTADOS

REPORTE DE RESULTADOS:

Los resultados obtenidos del equipo pueden ser capturados manualmente o transmitidos

al Sistema del Paciente Ambulatorio (SIPAM) y/o en el programa Blood Bank y son

validados y liberados por el responsable de turno.

En la validación de los resultados se revisa que los resultados obtenidos sean

congruentes y que no queden espacios libres en la pantalla sin capturar.

CRITERIOS DE REPETICIÓN

Deben repetirse ensayos discrepantes.

VALORES CRÍTICOS

No están establecidos los valores críticos para estos análisis.

2.11 INTERFERENCIAS Y LIMITACIONES DEL MÉTODO

La empresa LICON analizó las siguientes sustancias para determinar su interferencia

con esta metodología.

Entre las sustancias que causan interferencia se encuentran: muestras viejas, muestras

hemolizádas, que la dilución de eritrocitos que hacemos para nuestro análisis estén muy

concentradas o muy diluidas, reactivo mal almacenado, caducado, etc.


Brecher ME. 2002. Technical Manual. Fourteenth edition. Maryland, USA:

American Association of Blood Banks; p. 230,235.

Malvasi Graciela N.2003. Técnicas de Diagnóstico y Seguimiento en el

Laboratorio de Inmunoserología - Guía De Trabajos Prácticos. p. 35, 45,47-49.

Malvasi Graciela N. 2006. Técnicas de Diagnóstico y Seguimiento n l

Laboratorio de Inmunoserología – Guía De Trabajos Prácticos. p. 82, 84, 98,

102,103,105.

Ivan Roitt. Jonathan Brostoff. David Male. 1997. Inmunologíc. 4ª Edición.

Harcourt. p. 215,233- 235

Mandell-Douglas Bennet. 1991. Enfermedades Infecciosas. Ed. Médica

Panamericana. p. 33, 37, 48, 59,60.

Manual ABB. p. 350.

Manual del Sistema Wadiana de LICON.

Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M.1997. Blood Tranfusion in Clinical

Medicine. Tenth edition. London, UK: Blackwell Science; p.507, 508,509-512.

Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993. Para la Disposición de Sangre

Humana y sus Componentes D.O.F. p.16-I-1995.

Reporte de control de producto no conforme (FR-AC-05)

TEMA 3. GRUPO SANGUÍNEO Rh


El Coordinador de Inmunohematología debe asegurarse que este procedimiento se

cumpla.

Es responsabilidad de los químicos y técnicos laboratoristas cumplir con lo descrito en

este procedimiento.

3.2 PRINCIPIO

El antigeno D es altamente inmunogénico y se ha reportado que estimula la producción

de anti-D en un 50-85% en individuos D negativos que han sido expuestos a sangre D

postiva . Los anticuerpos Anti-D tienen importancia considerable ya que pueden

originar la severa enfermedad Hemolítica del Recién Nacido (HDN) y reacciones

hemolíticas trasfuncionales. El antígeno D y la forma débil del antigeno D

(denominado Du) son comúnmente considerados en la selección rutinaria de sangre para

transfusión.

La detección óptima de células D débiles por anti-D requiere la aplicación de una

prueba indirecta de antiglobulina. El término comúnmente utilizado. Rh (+) y Rh (-) se

requiere específicamente a la presencia y ausencia del antígeno D.

DESCRIPCION DEL MÉTODO :

El reactivo hemoagrupador en esta prueba se basa en el principio de la

hemoaglutinación.

La incubación de células rojas a probar con el reactivo hemoagrupador Anti-D origina

una reacción específica antigeno – anticuerpo si el antígeno D correspondiente está

presente en las células prueba, la detección visible de la reacción se observa por

aglutinación de las mismas.

La no-aglutinación indica un resultado negativo, y dentro de las limitaciones de esta

prueba, indica la ausencia del antigeno D correspondiente.



No es necesario el ayuno del paciente y/o donante para la realización de este

estudio

TIPO DE MUESTRA

Suero

Eritrocitos

TABLA 7. TIPO Y VOLUMEN REQUERIDO

TIPO DE MUESTRA

VOLUMEN

Óptimo Mínimo

Suero

4.0 mL

1.0 mL

Eritrocitos (3-5%)

3.0 mL

0.5 mL


La muestra debe ser recolectada en un tubo sin anticoagulante con datos especiales para

el Servicio de Medicina Transfusional.



completo, número de registro, fecha de la toma, y ubicación del paciente en caso de no

pertenecer a la consulta externa.

FACTORES DE RECHAZO


puntos:




Cuando una muestra es rechazada, el Coordinador y/o responsable de área (o el

responsable del turno) en turno da aviso al médico encargado del servicio (o al MIP),

solicitando nueva muestra o cancelando el análisis y llenar un reporte de productos no

conformes (FR-AC-05) como se establece en el procedimiento general de control de




la recolección de la muestra. El análisis se realiza dentro de las dos primeras horas de

llegada la muestra.

Después del análisis se almacenan durante las primeras 72 hrs. entre 2ºC y 8ºC.

Si la muestra requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rígidos de

plástico perfectamente bien cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y

facilidad de transporte a la muestra.

3.4 REACTIVOS

FORMA AUTOMATIZADA


Tarjetas dianagel donnors/ donantes (marca Grifols)

Tarjetas Coombs (marca Grifols)

Tarjetas phenotype Rh

PREPARACIÓN

Previa centrifugación de las tarjetas de reactivos dianagel donors/donantes

FORMA AUTOMATIZADA: No requiere preparación



NOMBRE DEL


Control R 1R 1 positivo I Suero

Control rr negativa

II

Suero




Deben analizarse los 2 niveles de controles todos los días que se procese el

analito.

ALMACENAMIENTO

Almacenar los frascos goteros sin abrir entre 2oC y 4

oC. Una vez abiertos, los controles

que se utilizarán en un plazo de 30 días pueden almacenarse entre 2oC y 8

oC de uso de

los controles.

LÍMITES DE ACEPTABILIDAD Y ACCIONES CORRECTIVAS

En caso de que una corrida sea rechazada, debe repetirse el ensayo, si después de ello no

se corrigen los valores, deben indagarse las posibles causas de error, como pueden ser

entre otros factores: reactivo, sol.1, sol.2, mal almacenamiento del reactivo.

Si al observar estos detalles persiste, debe buscarse alguna falla sencilla en el equipo, si

continua lo conveniente es dar aviso al servicio técnico especializado del proveedor del

instrumento.


CALIDAD

El Sistema Wadiana tiene la capacidad de almacenar los resultados de Control de

Calidad obtenidos cada vez que se procesa un control. De esta manera, se pueden

observar en pantalla el valor obtenido.

EVALUACIÓN EXTERNA DE LA CALIDAD

Panel del Centro Nacional Siglo XXI.


En caso de no contar con controles comerciales debe usarse una muestra de suero de un

paciente normal y otra de un paciente patológico alto.


Centrífuga

Guantes desechables

Gradillas

Sistema Wadiana


Bulbo de hule

Pipetas Pasteur


Una vez recibida la muestra deben ser centrifugadas durante 5 minutos a 3000 rpm.

Las muestras de suero deben ser procesadas sin ningún tratamiento previo y conforme

lo especificado según el Manual del Sistema Wadiana.

PROCEDIMIENTO:

1. Muestra tomada en tubo con tapón morado con anticoagulante (EDTA).

2. Centrifugar la muestra durante 5 minutos a 3000-3500 rpm.

3. Colocar el reactivo diana sol.1 en la posición núm. 9 del sistema Wadiana.

4. Posteriormente colocar las tarjetas dianagel donors/ donantes.

5. Verificar las soluciones de lavado 1, 2.

6. Especificar en el equipo qué prueba se va a realizar (grupo sanguíneo).

7. Identificar la muestra (nombre completo).

8. Realizar el inicio de la prueba.

FIGURA 4. EJEMPLO DE PROCEDIMIENTO

Nota: El tiempo de análisis es de 10 minutos.

3.8 RESULTADOS

REPORTE DE RESULTADOS


al Sistema del Paciente Ambulatorio (SIPAM) y/o en el Programa Blood Bank y son

validados y liberados por el responsable de turno.


Deben repetirse ensayos discrepantes.

VALORES CRÍTICOS

No están establecidos los valores críticos para estos análisis.


De Jesús Linares G. 2001. Inmunohematología y Transfusión. Ed.Viamonte;

p. 72- 75,235-239.

Graciela N. Malvasi. 2003. Pruebas de Laboratorio en el Estudio de Anemias

Hemolíticas. p. 25,25.

John G.Kelton. 20000. Transfusión Sanguínea. Ed. DOYMA. Barcelona España;

p. 56, 58, 59, 310, 311, 316, 317, 318.

Manual del Sistema Wadiana de LICON, insertos de los antisueros.

Radillo-González A. 1999. Medicina Transfusional. México. Prado; p. 88,89,

302,303, 3309-313.

Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigación para la

Salud D.O.F. 6-I-1987

Reporte de control de producto no conforme (FR-AC-05).

Rodríguez-Moyado H, Quintanar-García E, Mejía- Arreguí MH. 20004. El

Banco de Sangre y la Medicina Transfusional. Primera edición. México,

Editorial Panamericana; p. 433-436,502-507.

Vives L, Aguilar J, Aguilar L. 1997. Manual de Técnicas de Laboratorio en

Inmunohematología. Segunda edición. Barcelona, España: Masson; p. 105-112.

TEMA 4. PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES


El Coordinador de medicina transfusional debe asegurarse que este procedimiento se

cumpla.


este procedimiento.

4.2 PRINCIPIO

La selección de la compatibilidad del donante y receptor en la transfusión, se basa en la

compatibilidad de los grupos sanguíneos ABO y Rh, es decir, en la comprobación de la

ausencia de anticuerpos preformados contra los antígenos de las células del donante en

el suero del receptor (lo que se denomina prueba cruzada).

Esta incluye técnicas que permiten demostrar la ausencia de anticuerpos específicos

regulares e irregulares de importancia clínica en el suero del receptor.

PRUEBA MAYOR (anticuerpos en el suero del receptor, contra los eritrocitos del

donador).

(PRUEBA MENOR) particularmente cuando se pretenda transfundir sangre total

proveniente de donador con antecedentes de aloinmunización (embarazos o

transfusiones previas).

La prueba menor ha sido eliminada en algunos bancos de sangre, ya que rutinariamente

a los donadores de sangre se les realiza determinaciones serológicas de los anticuerpos

más comunes.

La presencia de anticuerpos de baja incidencia en el plasma de los mismos,

probablemente no cause una reacción transfusional al ser diluidos en el plasma del

receptor.

Desde la introducción de la prueba por Ottenberg en 1908, se han realizado muchas

modificaciones, con la finalidad de proveer al paciente el máximo de seguridad y

beneficio realizándose modificaciones en los medios de reacción, en la temperatura y en

el periodo de incubación, seleccionando procedimientos con el menor costo y un

mínimo de detecciones de incompatibilidad in vitro que no tendrán un mayor

significado in vivo, por esta razón la incubación de la prueba a temperatura ambiente

está siendo eliminada.

APLICACIÓN CLÍNICA

Valoración de la prescripción (indicación) de la transfusión. Es obligación del médico

responsable del banco de sangre valorar cada una de las solicitudes recibidas, ya que en

muchos casos se encuentra que la indicación de la transfusión no está justificada.


Suero del receptor y Eritrocitos de donador.


TIPO DE MUESTRA

VOLUMEN

Suero

2 Gotas

Eritrocitos

1 Gota


En un tubo con tapón morado con anticoagulante EDTA que proporciona el banco de

sangre.



completo, número de registro, cama del paciente, fecha de la toma.

FACTORES DE RECHAZO


puntos:

Muestra coagulada

Muestra hemolizada

Muestra mal etiquetada


CONDICIONES DE MANEJO Y ALMACENAMIENTO



la recolección de la muestra. Si no se analizan las muestras de suero dentro de las

primeras 8 horas, deben almacenarse entre 2ºC y 8ºC.

La muestra debe ser manipulada sólo por personal autorizado. Debe ser transportada

bien cerrada y en posición vertical, en gradillas de tamaño adecuado al tubo, o en su

defecto a través de un sistema de transporte neumático.

Si la muestra requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rígidos de

plástico perfectamente bien cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y

facilidad de transporte a la muestra.

4.4 REACTIVOS

1. Solución salina fisiológica al 0.9%

2. Glóbulos rojos del donante, en suspensión al 3- 5% en solución fisiológica 0.9%

FIGURAS 5 Y 6. PREPARACION DE SUSPENSION DE ERITROCITOS

3. Suero del paciente (obtenido en los tres días previos a la transfusión, sí el paciente se

encuentra dentro de la ventana de inestabilidad serológica).


Centrífuga

Guantes desechables

Gradillas

Solución salina

Albúmina, LISS, PEG ( polietilenglicol )

Antiglobulina humana (poli inespecífico IgG – C3).


Una vez recibida la muestra de sangre debe ser centrifugada durante 5 minutos a 3500

rpm.

La prueba cruzada puede ser dividida en tres fases:

FASE I. SALINA RÁPIDA:

1. Coloque 2 gotas de suero del paciente en un tubo de 12 x 75 mm previamente

etiquetado.

2. Añada 1 gota de la suspensión de células de glóbulos rojos de la unidad a ser

transfundida.

3. Mezclar y centrifugar durante 30 segundos a 3500 rpm.

4. Observar en busca de hemólisis, resuspender con suavidad las células y

examinar la presencia de aglutinación. En general no se requieren lecturas

microscópicas.

5. Leer, interpretar y registrar los resultados de la prueba.

FASE II. 37°C:

La prueba continua incubándose a 37°C utilizando algunos de los medios de

reacción entre los cuales podemos mencionar:

ALBUMINA solución al 22% : Añadir 3 gotas e incubar por lo menos 30

minutos, centrifugar 30 segundos y leer, después se realizan tres lavados con

solución salina fisiológica al 0.9% y llevar el procedimiento hasta la fase de

Coombs.

La albúmina podría influir en el segundo estadio de la aglutinación, por

reducción de la carga negativa neta de los eritrocitos o alteración de la tensión

superficial intercelular, favoreciendo así la aglutinación de las células

recubiertas de anticuerpos.

PEG (polietilenglicol). Añadir 2 gotas e incubar por lo menos 15 minutos con

este reactivo no se centrifuga se procede a realizar los lavados tres veces con

solución salina fisiológica al 0.9%.

FASE III. ANTIGLOBULINA HUMANA:

Proceder a añadir 2 gotas de anti gamma – globulina humana

(Anti IgG - C3d) a cada botón lavado de células, mezcle bien y centrifugue por

15 segundos a 3500 rpm.

Resuspender las células mediante una agitación suave. Lea macroscópicamente

(Si es necesario) para la aglutinación y anote los resultados.

Si el botón se disuelve la prueba es negativa o prueba compatible.

Si hay aglutinación la prueba es positiva o prueba incompatible.


Banco Central de Sangre, Centro Médico Nacional Siglo XXI

2002. Instituto Mexicano del Seguro Social. Editorial Prado. p. 103- 115.


American Association of Blood Banks; p. 253-263.


p. 62, 63, 65, 66, 219, 220.

Malvasi Graciela N. 2003. Pruebas de Laboratorio en el Estudio de Anemias

Hemolíticas. p. 210 - 215.

Mejía-Arreguí MH. 2004. Resolución de Problemas Transfusionales

Relacionados con Concentrados Eritrocitarios. Gac. Med. Mex. 2004; 140

(Supl 3); p. 25-p34.

Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M.1997. Blood Tranfusion Cinical

Medicine. Tenth edition. London, UK: Blackwell Science; p. 97-102, 244 -251.

Radillo-González A. 1999. Medicina Transfusional. México. Prado; p. 137-147,

266.



Editorial Panamericana; p. 159-160.

TEMA 5. ANTICUERPOS IRREGULARES, SU IMPORTANCIA EN

MEDICINA TRANSFUSIONAL

La Medicina Transfusional es una herramienta muy importante en las áreas de la

salud.

Los concentrados sanguíneos funcionan como un mecanismo auxiliar en el proceso

respiratorio de pacientes a quienes una condición patológica les impide elaborar

eficientemente sus propias células sanguíneas, o bien, en pacientes con pérdida

sanguínea grave en quienes el vital líquido es requerido para recuperar o mantener el

equilibrio del cuerpo. No obstante en su utilidad, se reconocen efectos nocivos

ocasionados por reacciones transfusionales, cuya aparición puede ser inmediata o tardía.

El efecto inmediato va de leve a grave y se puede manifestar en forma de urticaria,

fiebre o choque anafiláctico. Se atribuye a factores tales como la contaminación

bacteriana del componente transfundido o la respuesta inmune debida a la introducción

de un antígeno desconocido por el paciente, se debe a anticuerpos contra las diferentes

células sanguíneas, de tal forma que se identifican anticuerpos contra antígeno,

componentes leucocitarios, plaquetarios, eritrocitarios o del sistema HLA.

Entre los anticuerpos antieritrocitos el más nocivo es el que provoca la incompatibilidad

por sistema ABO: ha ocasionado aproximadamente 40 % de las muertes por

incompatibilidad. Los generadores de este problema son la confusión al asignar la bolsa

de sangre al receptor y el etiquetado equivocado de las muestras para las pruebas

pretransfusionales.

Para conocer la naturaleza de los anticuerpos presentes en una reacción transfusional es

muy importante disponer de todos los antecedentes que afectan o provocan la

producción de los mismos, como los que se ocasionan después de la transfusión y,

cuando se habla de mujeres, los gineco obstétricos, para indagar respecto a una probable

enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN).

Las que son tardías los efectos son adversos producidos por la transmisión de

microorganismos contenidos en la sangre del donador. Desde el punto de vista de la

inmunohematología, los anticuerpos contra antígenos sanguíneos se clasifican como

sigue:

Anticuerpos contra los propios antígenos del individuo: autoanticuerpos

contra antígenos, eritrocitos y plaquetas, y los producidos en enfermedades

autoinmunes, como las de la colágena. En este contexto podemos considerar

a los anticuerpos autoinmunes como anticuerpos irregulares o adquiridos, y

dividir a los aloanticuerpos de la siguiente forma:

Regulares naturales: los producidos contra el sistema ABO (anti-A y anti-B).

Irregulares naturales: anti A1, anti-M, anti-N, anti-P1. anti-E, entre otros.

Irregulares adquiridos o inmunes: antisistema Rh Hr (anti-D, anti-c, anti-C, y

otros), anti-Kell, anti-Duffy. En este contexto, los anticuerpos del sistema

ABO aparecen una vez que el individuo entra en contacto con el medio

ambiente donde se encuentran microorganismos como algunas bacterias

coliformes que contienen sustancias químicas con estructuras parecidas a las

de este sistema.

Por anticuerpos regulares debemos identificar a los que existen en todos los individuos

y que éstos tendrán durante toda su vida. Los anticuerpos irregulares son los que no

están de esa manera, aunque en el caso de los naturales no se conoce a ciencia cierta qué

o cómo se induce su producción.

Los adquiridos se conocen también como inmunes y son el resultado de la exposición a

antígenos desconocidos por el individuo al momento de la transfusión o en las mujeres

por el embarazo; estos anticuerpos son dirigidos contra antígenos de sistemas diferentes

al ABO. Los anticuerpos naturales regulares son preferentemente inmunoglobulinas de

la clase IgM, las cuales fijan de manera tan eficiente el complemento que pueden

provocar lisis intravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso la muerte del

paciente.

Los anticuerpos adquiridos o inmunes son generalmente inmunoglobulinas IgG, las

cuales producen hemólisis extravascular en el bazo o en el hígado mediante fagocitosis

del complejo eritrocito anticuerpo.

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) más comunes en nuestra población son los

que involucran a los sistemas MNSs, P1, Kidd (Jka, Jk

b), Duffy (Fy

a, Fy

b), Kell, Lewis y

Diego.

De acuerdo con la temperatura óptima de reacción, estos anticuerpos se dividen en

anticuerpos fríos y anticuerpos calientes.

Los anticuerpos fríos van dirigidos contra los sistemas MN, Lewis y P1, con óptima

reacción a temperaturas entre 4°C y 22°C; estos son generalmente inmunoglobulinas

tipo IgM y ocasionalmente tipo IgG, y debido a esa temperatura de reacción carecen de

importancia clínica salvo que su reacción ocurra también a 37°C, es decir, que actúen

como anticuerpos calientes.

Entre estos sólo los dirigidos contra los antígenos M y N han sido asociados con EHRN,

cuya severidad va desde leve a moderada. Los llamados anticuerpos calientes tienen una

temperatura óptima de reacción a 37°C, a veces visible pero en otras ocasiones sólo

evidente hasta agregar anti gamma globulina humana (suero de Coombs). Estos tienen

una relevante importancia clínica ya que se les asocia con reacciones transfusionales de

intensidad moderada a severa, que pueden ocasionar la muerte; además, son causantes

de hemólisis en los recién nacidos, quienes en ocasiones requieren

exsanguinotransfusión.

El laboratorio clínico funciona como un servicio de apoyo muy importante en la

medicina transfusional para la terapéutica, por lo que se ha desarrollado el área de

inmunohematología cuyo valor radica en la identificación de los anticuerpos irregulares

derivados de los procesos de inmunización, sean transfusiones, por embarazos o de

naturaleza autoinmune.

Para un óptimo funcionamiento de esta área del laboratorio es importante conocer las

características ya descritas del comportamiento de los anticuerpos, así como otras más:

La afectación que sufren por el efecto de medios de baja fuerza iónica (LISS,

polietilenglicol y otros), por el de productos químicos o enzimas (ficina, tripsina,

quimiotripsina, ditiotreitol, papaína, stalidasa, bromelasa, y otras) o de otras

sustancias. De esta manera conocemos que algunos anticuerpos de este tipo se

ven afectados o son destruidos.

Las reacciones antígeno-anticuerpo pueden observarse in vitro mediante:

Hemólisis: La unión se traduce en lisis de los eritrocitos en presencia del

complemento (siempre que el anticoagulante empleado no capture los iones Ca y

Mg necesarios para la activación del complemento).

Aglutinación: Los anticuerpos que reaccionan en medio salino se conocen como

completos o aglutinantes (comúnmente tipo IgM). Como ya se comentó, existen

diferentes elementos que influyen en la reacción antígeno anticuerpo y que

deben conocerse para utilizarlos adecuadamente en la búsqueda de anticuerpos

irregulares:

a) Aglutinación en medio macromolecular: Hay anticuerpos que aglutinan mejor cuando

se suspenden en una solución de macromoléculas (albúmina, dextrán, gelatina,

polivinilpirrolidona); aquí la albúmina en concentración de 22% a 30% incrementa la

constante dieléctrica del agua, lo que disminuye el potencial zeta. Hay evidencia de que

el dextrán y el PVP potencializan la reacción con puentes de polímeros.

b) Prueba de Coombs: Este procedimiento es útil para poner de manifiesto anticuerpos

incompletos o sensibilizantes.

c) Soluciones de baja fuerza iónica: Reducen la barrera electrostática facilitando la

reacción antígeno anticuerpo.

d) Enzimas: Potencializan la reacción antígeno anticuerpo reduciendo la superficie de

carga y removiendo estructuras que interfieren en el acceso de las moléculas del

anticuerpo.

e) Centrifugación: Acelera la reacción antígeno anticuerpo, por la fuerza que produce la

misma.

f) Temperatura: Afecta la reacción antígeno-anticuerpo de acuerdo con la temperatura

óptima de reacción: 4ºC a 22ºC para los fríos, o 37ºC para los calientes.

g) Proporción de antígeno y anticuerpo: Es importante en la búsqueda de la zona de

equivalencia de la reacción antígeno-anticuerpo. Es fundamental tener un panel de

células (eritrocitos) donde estos importantes fenotipos ya hayan sido tipificados para

usarlos en la identificación del anticuerpo correspondiente.

En el Servicio de Inmunohematología, se emplean las técnicas siguientes para la

identificación de anticuerpos irregulares de forma manual:

Técnica salina: previamente lavados, los eritrocitos del panel de fenotipo

conocido o de la sangre de donación se ponen en contacto con el suero problema

a razón de una gota de células resuspendidas de 2 a 3 % por dos del suero

problema. Para iniciar el proceso se centrifugan y se leen; posteriormente se

incuban a una temperatura de 22°C durante media hora a una hora cuando se

sospecha una enfermedad por anticuerpos fríos de tipo autoinmune; centrifugar y

leer para descartar o confirmar este diagnóstico.

El siguiente paso es incubar a 37°C por 30 minutos, empleando el mayor

tiempo cuando se sospecha sensibilización por transfusión o embarazos previos.

Centrifugar, leer y finalmente lavar los eritrocitos tres veces con solución salina

fisiológica 0.9% para retirar totalmente las proteínas séricas y al final agregar suero de

Coombs; centrifugar y leer.

Técnica en solución salina de baja fuerza iónica o LISS (low ionic strengh-

saline): Los eritrocitos previamente lavados y suspendidos en una dilución entre

2 y 3 %, se lavan una vez con dos a tres gotas de solución de LISS, se decantan a

sequedad y se agregan dos gotas de LISS más dos gotas del suero problema;

homogenizar y agregar dos gotas más de LISS, incubar por 15 minutos a 37°C,

lavar nuevamente tres veces con solución salina y agregar suero de Coombs;

centrifugar y leer.

Técnica enzimática con bromelina (bromelasa): Por el fuerte efecto que tiene

esta enzima sobre los eritrocitos, los tiempos de incubación se reducen. El

procedimiento es de la siguiente forma: a los eritrocitos lavados se les agrega el

suero problema en la proporción ya descrita más una gota de la enzima

(bromelina); se incuban, centrifugan y se leen.

Después se incuban a 37°C por 15 minutos; se centrifugan y se leen. Para

finalizar, se lavan en la forma ya mencionada y se les agrega suero de Coombs;

se centrifugan y se leen.

Técnica en albúmina: En esta técnica se procede de forma parecida a la salina,

sólo que se omite el paso de la incubación a 22°C, respetándose también los

tiempos de incubación. Como reactivo adicional se agrega en cada tubo dos

gotas de solución albuminosa al 22%. Todas las pruebas se fundamentan en las

características mencionadas previamente para las reacciones antígeno-

anticuerpo. En cualquier técnica los resultados se deben anotar inmediatamente e

interpretar en conjunto al final.

5.1 PANEL DE 10 CÉLULAS

Se elaboran células de donantes con fenotipo conocido en el que se han incluido los

más comunes de nuestra población. Éste consta generalmente de grupos sanguíneo O,

factor RhOD positivo y de factor RhOD negativo; de cuatro donadores para

determinación de grupo en el sistema ABO (A1, A2,B, O); de dos donadores grupo O

para diferenciación de factor RhO D (una factor positivo y otra factor negativo); células

de un donador grupo O, las cuales serán sensibilizadas, es decir, se les pegará un

anticuerpo de naturaleza IgG, generalmente un anti-D, y otras del mismo grupo O sin

sensibilizar que funcionan como control negativo; éstas dos últimas servirán para

controlar el suero de Coombs.

Debe trabajarse con sumo cuidado teniendo siempre en cuenta que de nuestro trabajo

depende la vida de muchos pacientes, y que nosotros podríamos ser la causa de una

pronta recuperación o de una complicación mayor. Nos corresponde poner nuestro

mayor empeño para obtener resultados óptimos; Por eso, cada técnica debe ser trabajada

de acuerdo con los parámetros establecidos, por ejemplo: el sistema Duffy es sensible a

los medios de baja fuerza iónica y susceptible de ser destruido por algunas enzimas, lo

que pudiera conducir a resultados erróneos. La importancia de la albúmina, radica en

que puede magnificar reacciones del sistema Rh-Hr, sin embargo, la técnica más

empleada es la salina, ya que nos permite observar adecuadamente las reacciones y nos

apoya en las otras técnicas, sobre todo cuando se observa más de una población de

anticuerpos antieritrocitos, además de ser altamente confiable.

Para reacciones in vitro y dado que el sistema de complemento en algunas reacciones

antígeno-anticuerpo es imprescindible, se recomienda que se trabaje con muestras

frescas para no permitir que éste se consuma hasta desaparecer.

Cabe aclarar que los factores del complemento son proteínas que actúan en cascada e

interactúan con los anticuerpos antieritrocitarios, ya sea para la lisis del complejo

mencionado (C9) o para facilitar la función de las células fagocíticas (C3).





p. 62, 63,65, 66, 219, 220.

Kelton G. John. 20000. Transfusión Sanguínea. Ed. DOYMA. Barcelona

España; p. 56, 58, 59, 310, 311, 316, 317, 318.

Malvasi N. Graciela. 2003. Pruebas De Laboratorio en el Estudio de Anemias

Hemolíticas.

Mejía-Arreguí MH. 20004. Resolución de Problemas Transfusionales

N Malvasi Graciela. 2006. Técnicas de Diagnóstico y Seguimiento en el

Laboratorio de Inmunoserología – Guía De Trabajos Prácticos. p. 12, 14, 18,19.

Radillo-González A. 1999. Medicina Transfusional. México. Prado; p.137-147,

266.

Relacionados con Concentrados Eritrocitarios. Gac Med Mex 2004; 140

25 - 34.



Editorial Panamericana; p. 159-160.

Roitt Ivan. Jonathan Brostoff. David Male. 1997. Inmunología. 4ª Edición.

Harcourt. p. 156, 157, 159.


(MÉTODO LO-ION EN TUBO)


El Coordinador de Medicina Transfusional debe asegurar que este procedimiento se

cumpla.


este procedimiento.

6.2 PRINCIPIO

El uso de gamma LO-ION, en lugar de las soluciones de albúmina bovina para los

procedimientos de anticuerpos, crea un ambiente de baja fuerza iónica que incrementa

la proporción del anticuerpo captado durante la incubación y así es mayor la reactividad,

ya sea como hemoaglutinación directa o en pruebas de antiglobulina indirecta. Al

mismo tiempo, la incorporación de compuestos de alto peso molecular incrementa la

habilidad de muchos anticuerpos para dar reacciones de aglutinación directas con las

células que posean el antígeno apropiado.

Aplicación clínica

Este estudio consiste en el rastreo que permite identificar a los pacientes que presentan

en su suero anticuerpos antieritrocitarios dirigidos contra antígenos que no son del

sistema ABO.

Esta prueba está indicada como parte de las pruebas de compatibilidad sanguínea

pretransfusional, en mujeres Rh negativo, como parte del estudio de la EHRN, en

estudios de la anemia hemolítica autoinmune, entre otras más.


Preparación del paciente:

Ayuno necesario de 8 horas

Tipo de muestra:

Sangre total


TIPO DE MUESTRA

VOLUMEN

Óptimo

Mínimo

Sangre total

7.0 mL 5.0 mL


La sangre debe ser recolectada en un tubo de BH. Proporcionado por el Servicio de

Medicina Transfusional con la etiqueta correspondiente.



completo del paciente, número de registro, fecha de la toma y ubicación exacta,

indicando servicio y número de cama.

FACTORES DE RECHAZO


puntos:

Muestras lipémicas o hemolizadas


Muestras sobre etiquetadas

Muestras con etiquetas tachadas o corregidas


Recipiente distinto al proporcionado


responsable del turno) debe comunicar al médico encargado del servicio (o al MIP),

solicitando nueva muestra o cancelando el análisis y llenar un reporte de producto no

conforme (FR-AC-05) como se establece en el procedimiento general de control de



La sangre se extrae por una técnica aséptica, mediante una punción limpia y sin

problemas de toma. Se coloca en el tubo proporcionado por el Servicio de Medicina

Transfusional, correctamente etiquetado. Debe de centrifugarse inmediatamente y ser

procesada en ese mismo día. Después de terminar los estudios la muestra se debe de

conservar y almacenar en su tubo original debidamente tapado y en refrigeración entre

2ºC y 8ºC por un tiempo no mayor de 72 horas.

La muestra debe ser manipulada sólo por personal autorizado. Debe ser transportada

bien cerrada y en posición vertical, en gradillas de tamaño adecuado al tubo, o en su

defecto a través de un sistema de transporte neumático.

Si ésta requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rígidos de

plástico perfectamente cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y

facilidad de transporte.

6.4 REACTIVOS

MATERIALES

Pipetas Pasteur

Tubos de ensaye de 12 x 75 ó 10 x 75 mm

Bulbos

Gradillas

Marcador con tinta indeleble

Pluma (tinta azul o negra)

Papel parafilm

Cronómetro

Contenedor de plástico con hipoclorito de sodio al 5 % en cantidad suficiente

Contenedor desechable de punzo cortantes

Libreta de pruebas de Banco de Sangre

Reactivo de células rojas para la detección de anticuerpos

Solución salina fisiológica al 0.9 %

Reactivo de anti-IgG, C3d (suero de Coombs)

Reactivo de células rojas sensibilizadas

Reactivo de células rojas no sensibilizadas

Reactivo de Gamma LO-ION

PREPARACIÓN

Los eritrocitos del panel se preparan cada vez que se utilicen realizando tres lavados con

solución salina fisiológica al 0.9 % y resuspender es ésta a una concentración

aproximada de 3% a 5%. De igual manera se preparan los eritrocitos sensibilizados y no

sensibilizados, proporcionados en el mismo.

ACEPTABILIDAD

La aceptabilidad de un reactivo está determinada por los resultados obtenidos en el

control de calidad.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD



El reactivo es estable hasta la fecha de caducidad que aparece en la etiqueta si se

almacena entre 2°C y 8°C. No congelar.

CONTROL DE CALIDAD


NOMBRE DEL


Suero No. 1 5 mL Suero

Suero No. 2 5 mL Suero

Células sensibilizadas 10 mL Células

Auto testigo No aplica Suero-células




Los sueros control se analizan al inicio de cada lote de eritrocitos del panel 10 Siglo

XXI.

Para los reactivos de Inmunohematología es diario al inicio del día.

ALMACENAMIENTO

Almacenar los frascos sin abrir entre 2oC y 8

oC.

PROCEDIMIENTO DE USO DE LOS CONTROLES

Los controles de sueros conocidos proporcionados se procesan de la misma manera que

cualquier muestra de pacientes, realizando el procedimiento descrito.


La aceptabilidad de la prueba se basa en que los resultados del control de calidad se

cumplan de acuerdo a los procedimientos descritos.

Las acciones correctivas necesarias serán tomadas por el coordinador del área.


CALIDAD

Todos los datos obtenidos del control de calidad se registran en los formatos

correspondientes.


En caso de no contar con controles comerciales se puede utilizar muestras de sueros ya

conocidos y caracterizados plenamente en el laboratorio, tanto de un paciente con

anticuerpos irregulares positivos como uno con anticuerpos irregulares negativos.

Los sueros son congelados en alícuotas de 200µL cada una de ellas será procesada con

la frecuencia y aceptabilidad de un control.


Centrifuga clínica

Centrifuga serológica Clay Adams

Baño María

Guantes desechables

Gradillas

Lentes de seguridad


PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN DE ERITROCITOS DE LA MUESTRA Y

DEL PANEL (3-5 %).

Tomar 4 gotas del concentrado eritrocitario de la muestra y de cada célula del

panel 10 y colocarlos en un tubo de vidrio, previamente identificados

Adicionar solución salina fisiológica al 0.9 % hasta que esté lleno el tubo y

homogenizar completamente

Centrifugar durante 1 minuto

Decantar el sobrenadante

Repetir el lavado dos veces más

En el último lavado, quitar el exceso de solución salina

Con pipeta Pasteur, tomar una gota del concentrado eritrocitario, trasvasarlo en

otro tubo de vidrio debidamente identificado y agregar 24 gotas de solución

salina fisiologíca al 0.9 % y homogenizar.

MÉTODO

a) Preparar una serie de 10 tubos identificados con el número de cada célula del

Panel 10 . Incluir un autotestigo

b) Con pipeta Pasteur agregar 2 gotas de suero de la muestra en cada tubo

c) Agregar una gota de la suspensión de eritrocitos de cada célula del panel a cada

tubo correspondiente

d) Agregar una gota de la suspensión de eritrocitos del paciente en el tubo

autotestigo

e) Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3500 rpm

f) Resuspender suavemente el botón de células, tubo por tubo. Leer y anotar si

existe o no aglutinación

g) Agregar a cada tubo dos gotas de LO-ION mezclar y centrifugar 30 segundos a

3500 rpm

h) Observar tubo por tubo si existe hemólisis. Leer y registrar la presencia de

hemólisis

i) Resuspender completamente el botón de células mediante agitación suave e

incubar a 37°C durante 10 minutos (máximo 30 minutos)

j) Luego de la incubación, lavar en tres ocasiones con solución salina fisiológica al

0.9 %, centrifugando durante 1 minutos en cada lavado

k) Eliminar el exceso de solución salina fisiológica al 0.9 % en el último lavado y

agregar dos gotas de suero de Coombs a cada tubo, se mezcla suavemente y se

centrifuga durante 30 segundos a 3500 rpm

l) Se resuspende suavemente el botón de células a contraluz tubo por tubo y leer la

aglutinación. Registrar los resultados

m) En los tubos en donde no se observó aglutinación con el suero de Coombs,

agregar una gota de células rojas sensibilizadas, mezclar suavemente y

centrifugar durante 30 segundos a 3500 rpm

n) Después de la centrifugación resuspender el botón de células por agitación suave

y leer a contraluz la aglutinación, tubo por tubo. Registrar los resultados

o) El registro de todos los datos y observaciones realizados durante la prueba se

harán en la libreta de registro de estudios del Banco de Sangre con el formato y

organización establecidos.

6.7 RESULTADOS

CÁLCULOS Y CONVERSIONES

Con los datos obtenidos al final de la prueba se realiza la lectura mediante comparación

con la carta de identificación de anticuerpos correspondiente proporcionada en el Panel

10 para la identificación de él o los anticuerpos encontrados.

REPORTE DE RESULTADOS

Los resultados obtenidos pueden ser capturados manualmente en el formato

correspondiente ya establecido o transmitidos al Sistema del Paciente Ambulatorio

(SIPAM) vía electrónica (interfase) y son validados y liberados por el Coordinador de

Medicina Transfusional o el responsable de turno.

En la validación de los resultados se revisa que los resultados obtenidos sean

congruentes y que no queden espacios libres en la pantalla sin capturar.

Una vez que los resultados son liberados en el SIPAM, son impresos durante la noche

en el departamento de archivo clínico y son archivados en el expediente del paciente.

INTERVALOS DE REFERENCIA

Los intervalos de referencia para la identificación de anticuerpos irregulares son:

NEGATIVO

POSITIVO. Nombre del anticuerpo identificado.


Cuando se tenga el antecedente de que esta misma prueba ha resultado positiva

anteriormente en el paciente.

Cuando la discrepancia obtenida en el estudio, pudiera ser debida a la aplicación

de la gamma-globulina anti-D en mujeres Rh negativo en un periodo anterior no

mayor de tres meses.

Cuando después de un resultado negativo en la fase de Coombs, no se observe

aglutinación con las células de control de Coombs (células sensibilizadas)

después de la centrifugación.


Factores como materiales contaminados, tiempo o temperatura inadecuada o

examinación de la aglutinación impropia pueden dar resultados falsos.

La utilización de plasmas o sueros viejos para las pruebas, puede ocasionar

fallas en la detección de anticuerpos dependientes de complemento.

El suero o plasma de prueba puede contener un anticuerpo dirigido a un antígeno

no representado en el reactivo de células, o bien, puede contener un anticuerpo

que es muy débil para ser detectado mediante los medios y/o métodos de prueba

empleados.

En casos raros la presencia en el suero o plasma de anticuerpos dirigidos a un

antibiótico puede causar reacciones falsas. Se ha reportado anticuerpos para la

Neomicina y el Cloranfenicol.

Las fases de lavado de las pruebas deben de ser llevadas a cabo sin interrupción,

y el resultado final debe ser interpretado inmediatamente que se termine con la

prueba.

La prueba de Control de Coombs no nos da una absoluta seguridad de que no se

presenten resultados falsos al realizar las pruebas. Pueden ocurrir sin ser

detectados errores debido a la inadecuada agitación, incubación, etc.




Burtis Carl A., 1996. Fundamentals of clinical chemistry, 4ª ed. Ed. W.B.

Saunders Company, U.S.A: p. 351-359.


p. 62, 63,65, 66, 219, 220.

G.Kelton John. 2000. Transfusión Sanguinea. Ed. DOYMA. Barcelona España;

p. 46, 48, 69, 210, 451, 456, 457, 518.

Mandell-Douglas Bennet. 1991. Enfermedades Infecciosas. Ed. Médica

Panamericana. p. 73, 77, 78, 79,80.

Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M.1997. Blood Tranfusion in Cinical

Medicine. Tenth edition. London, UK: Blackwell Science; p. 205, 206,208,

319,322.

Malvasi Graciela. 2003. Técnicas de Diagnóstico y Seguimiento en el

Laboratorio de Inmunoserología - Guía De Trabajos Prácticos. p. 45,47, 72, 73,

77, 78,79.


48, 66.

Reporte de control de producto no conforme (FR-AC-05).


(MÉTODO CON ALBUMINA)


El Coordinador debe asegurar que este procedimiento se cumpla.


este procedimiento.

7.2 PRINCIPIO

La habilidad de los anticuerpos de los grupos sanguíneos de producir una aglutinación

directa de las células rojas sanguíneas antígeno-positivas, depende de la distancia de

separación del puente de las células en suspensión, los anticuerpos IgG, son incapaces

de ligar el espacio entre las células rojas suspendidas en una solución electrolítica;

existen varias teorías que pueden explicar la habilidad de potencialidad de la albúmina

en la aglutinación directa por IgG. La descrita por Pollack y colaboradores en la que

explican que la albúmina reduce el potencial zeta por disposición de algunos sistemas

de pruebas, realmente liga algunos anticuerpos Rh incompletos para que produzcan una

reacción en las pruebas de aglutinación directa. La presencia de albúmina bovina

también ha sido reportada para mejorar la sensibilidad de la prueba de aglutinación

indirecta para un gran número de anticuerpos específicos de los grupos sanguíneos.

DESCRIPCION DEL REACTIVO

La albúmina es preparada de suero o plasma bovino, y está disponible en solución al

22 % o al 30 %, se adiciona azida de sodio a una concentración de 0.1% como

conservador. El pH es de 3.3 +/ - 0.1. Estos productos generalmente no contienen

caprilato de sodio, una solución de ácido graso, que es usada como estabilizador durante

el tratamiento caliente como una parte en el proceso de fabricación.

En algunas ocasiones los aditivos del sistema de prueba que contienen caprilatos pueden

causar resultados falsos - positivos.

FIGURA 7. ALBÚMINA BOVINA POLIMERIZADA 22%

Cuando el suero de pacientes contiene anticuerpos para caprilato o algunos otros con

una cadena corta de ácidos grasos, la formación de los complejos albúmina -

inmunoglobulina causa aglutinación de algunas células rojas sanguíneas.

Esta aglutinación es algunas veces vistas solo en la fase de antiglobulina pero es

observada ocasionalmente en la prueba después de la incubación a 37oC.

Esta causa puede ser sospechosa si un suero da positivo con todas las células

(incluyendo el control).

Mantenga a 1oC

- 8

oC cuando no se use. No se congele, mantenga su esterilidad, no se

use si esta marcadamente turbio.

APLICACIÓN CLÍNICA

Para la potencialización de anticuerpos incompletos en los procedimientos en

la detección de anticuerpos.


No se necesita preparación especial del paciente

CONDICIONES DE LA MUESTRA

Muestras no contaminadas, muestras sanguíneas viejas

TIPO DE MUESTRA

Suero, Plasma o células rojas


TIPO DE

MUESTRA

VOLUMEN

Óptimo

Mínimo

Suero

1.0 mL

0.5 mL


La sangre se extrae por una técnica aséptica y el suero es separado para ser probado tan

pronto como sea posible.



completo, número de registro, fecha de la toma, iniciales del flebotomista y ubicación

del paciente en caso de no pertenecer a la consulta externa.

FACTORES DE RECHAZO


puntos:

Muestras lipémicas










El suero es separado para ser usado tan pronto como sea posible, si la prueba se dilata,

las muestras para la identificación de anticuerpos, deben conservarse de 2oC

a 8

oC por

un tiempo no mayor de 48 horas. El suero puede mantenerse por un tiempo mayor de 48

horas. El plasma de muestras anticuaguladas puede usarse si se desea, pero el operador

debe estar enterado que esto puede dar resultados falsos o detectar anticuerpos

dependientes de complementos. Si son requeridas células rojas para la prueba se pueden

obtener las muestras utilizando EDTA, heparina u oxalato y éstas deben ser probadas

antes de 48 horas. Las células rojas sanguíneas de muestras coaguladas pueden ser

probadas dentro de 21 días después de su recolección. Las células rojas de donadores

unitarios deben ser probadas hasta antes de la fecha de caducidad.

7.4 REACTIVOS

Reactivo de células sanguíneas para la detección e identificación de

anticuerpos antiglobulina humana

Células control Coombs

Albúmina bovina al 22%

MATERIALES

Tubos para prueba de 10 x 75 mm

Pipetas

Solución salina fisiológica 0.9 %

Baño María a 37°C

Centrifuga

Cronómetro

PREPARACIÓN

La albúmina es preparada de suero o plasma bovino, y está disponible en solución al

22 % o al 30 %, adicionada con azida de sodio una concentración de 0.1% como

conservador. El pH es de 3.3 +/ - 0.1.

ACEPTABILIDAD

La aceptabilidad de un reactivo está determinada por los resultados obtenidos en el

control de calidad.


Los cartuchos de reactivo deben almacenarse cerrados entre 1°C y 8°C, no se congelan,

mantenga su esterilidad, no se use si esta marcadamente turbio.



El reactivo es estable hasta la fecha de caducidad.


Centrífuga

Guantes desechables

Gradillas

PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO

Colocar dos gotas del suero del receptor en tres tubos marcados I, II y AC

(autocontrol)

Agregar una gota de las células I, II y AC a sus respectivos tubos

Añadir tres gotas de albúmina al 22% a cada uno de los tubos

Incubar 30 minutos a 37°C

Centrifugar 30 segundos a 3500 rpm

Examinar la hemólisis y reconocer si se presenta

Resuspender las células agitando suavemente con la mano

Lavar los tubos tres veces con solución salina fisiológica 0.9% llenando completamente

el tubo y decantando con cuidado la solución salina entre lavado y lavado; y

resuspender las células perfectamente cuando se adicione la solución salina fisiológica

para el siguiente lavado.

Decantar la salina fisiológica 0.9 % completamente en el último lavado

Añadir una o dos gotas de anti – globulina humana en el botón seco de células

Mezclar bien centrifugar

Un minuto 1000 rpm

15 segundos a 3500 rpm

El tiempo apropiado dependiendo de la calibración de la centrifuga

Resuspender las células con un movimiento suave

Leer la aglutinación y anotar los resultados de la prueba.

7.6 REPORTE DE RESULTADOS

Si no hay aglutinación o hemólisis en la prueba del paciente y el donador pueden ser

considerados compatibles. Esto está sujeto a la apariencia de la aglutinación

comparativa de las células control de Coombs.


Si las células control de Coombs no aglutinan, la prueba compatible debe repetirse.


No todas las soluciones de albúmina bovina son igualmente efectivas en su habilidad

para una aglutinación potencial por anticuerpos Rh incompletos. Un procedimiento de

control cualitativo apropiado puede ser seleccionando un anticuerpo incompleto

débilmente reaccionante para usarse sobre una base para confirmar la habilidad

potencial de albúmina bovina. El suero seleccionado debe ser probado contra células

positivas y negativas para el antígeno relevante. La prueba contra células negativas

provee seguridad de que la misma albúmina no acumula células rojas sanguíneas

humanas normales.

Otros factores que pueden dar resultados falsos incluyen los siguientes:

Contaminación de las muestras sanguíneas reactivas y/o materiales adicionales

Muestras sanguíneas viejas, las pruebas pueden dar reacciones más débiles que

las que se obtienen con muestras frescas

Una concentración mayor de la suspensión de células

Inadecuada incubación de tiempo o temperatura

Centrifugación inadecuada. Una excesiva centrifugación puede tener dificultad

en resuspender el botón celular en la prueba en tubo; un botón no muy claro y

fácilmente dispersarse la aglutinación

Una lectura inadecuada de la aglutinación.


Inserto de la prueba de Albúmina Bobina 22% o 30 %.

Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M.1997. Blood Tranfusion in Cinical

Medicine. Tenth edition. London, UK: Blackwell Science; p. 403, 404, 423, 425.

436, 441.


Laboratorio De Inmunoserología – Guía De Trabajos Prácticos. p. 42, 43, 44,

45, 67, 68,71.

Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993. Para la disposición de sangre

humana y sus componentes D.O.F. 16-I-1995.


Inmunohematología. Segunda edición. Barcelona, España: Masson; p. 204, 308,

309,310.

TEMA 8. PRUEBA DE COOMBS


El Coordinador de inmunohematología debe asegurar que este procedimiento se

cumpla.

Es responsabilidad de los químicos y técnicos laboratoristas cumplir con lo descrito

en este procedimiento.

8.2 PRINCIPIO

La reacción de Antiglobulina, fue descrita por Moreshi. En 1908, y fue aplicado por

Coombs y sus colaboradores en 1945 en la serología de grupos sanguíneos. Cuando se

utiliza el suero de animales inmunizados con proteína humana en la detección de los

llamados anticuerpos incompletos, la capacidad del suero antiglobulina para reaccionar

con componentes del complemento humana unidos a los glóbulos rojos fue reportado

en 1957 por Dacie y sus colaboradores.

La prueba de antiglobulina Coombs es un procedimiento importante para la detección

de inmunoglobulina y/o complemento unido a los glóbulos rojos. La prueba de

antiglobulina directa se utiliza para demostrar los anticuerpos y/o complemento unido a

los glóbulos rojos in vivo, y la prueba de antiglobulina indirecta después de la

incubación del suero y los glóbulos rojos, demuestran los anticuerpos y/o complemento

unido in vitro.

Cuando los anticuerpos incompletos (usualmente IgG) entran en contacto con los

glóbulos rojos que poseen los antígenos apropiados, éstos se unirán a la superficie de las

células y permanecerán unidos durante la serie de lavados con solución salina

fisiológica 0.9% para eliminar la proteína humana unida. Se puede detectar entonces la

presencia de la proteína resultante a través de una prueba de lavado de células con un

reactivo hecho de suero de conejo inmunizado con la proteína humana adecuada, o de

anticuerpos monoclonales secretados por hibridomas derivadas de ratón inmunizado y

de un cultivo medio fluido.

La aglutinación de glóbulos rojos por Anti-IgG en la prueba de antiglobulina directa e

indirecta, indica que las células están cubiertas con anticuerpos.

Algunos reportes sugieren que el IgG puede fallar ocasionalmente en la detección de

anticuerpos que se demuestren por el uso de un reactivo de antiglobulina humana poli

específica y los anticuerpos no detectados por Anti-IgG pueden ser clínicamente

significativos en algunos casos. El usuario debe ser consiente que la información

científica actual no es completamente un soporte para el uso excesivo de Anti-IgG para

pruebas de rastreo de anticuerpos y para pruebas de compatibilidad.

Un paso crucial en el procedimiento de la prueba de antiglobulina son los lavados de

células antes de añadir la antiglobulina humana. Los lavados eliminan la proteína

humana unida, que de otra manera pudieran neutralizarla.

DESCRIPCIÓN DEL REACTIVO

Anti-globulina humana, Anti-IgG, Gamma Clone (verde o incoloro) contiene un

anticuerpo murino monoclonal IgM secretado por hibridomas de la línea celular 16H8

cultivada en un medio fluido, este anticuerpo está destinado para reaccionar con un

epítope en el dominio CH3 de la región Fc de IgG humano.

FIGURA 8. SUERO DE COOMBS MONOCLONAL-POLIESPECÍFICO

(ANTI-IgG,-C3D)

El sobrenadante del cultivo del tejido que contiene el anticuerpo monoclonal se diluye

en una solución amortiguadora apropiada para facilitar la resuspensión del botón de

células después de la centrifugación.

El producto final se ajusta a un pH 7.0 + 0.1 y contiene azida de sodio a una

concentración final de 0.1% como conservador. Advertencia: La azida de sodio puede

reaccionar con las tuberías de plomo y cobre formando azidas metálicas explosivas.

Enjuague con un gran volumen de agua para prevenir la formación de azidas explosivas.

El Gamma-Clone Anti-IgG Verde contiene una mezcla de Acid Blue #1 y Acid Yellow

#23. Estos reactivos de diagnóstico están destinados para utilizarse como se indica en

cualquiera de los métodos descritos en este instructivo. No se diluye. No se use después

de la fecha de caducidad. Manténgase de 1°C a 8°C cuando no se use. No se congele.

Tenga cuidado de mantener la esterilidad. No se use si está turbio. Precaución: No

pipetee este producto con la boca.



No se requiere una preparación previa del paciente para obtener la muestra. La sangre

debe obtenerse por medio de una técnica aséptica, y preferentemente debe probarse

mientras esté fresca. Si ocurre un retraso en la prueba, la muestra debe conservarse de

1°C a 8°C.

Para la prueba de antiglobulina directa se debe extraer la sangre con o sin anticoagulante

cuando se va a realizar la prueba con Anti-IgG.

TIPO DE MUESTRA

Suero, eritrocitos


TIPO DE MUESTRA

VOLUMEN

Óptimo

Mínimo

Suero

4.0 mL 2.0 mL


La muestra debe ser tomada en un tubo vacutainer con EDTA.



completo, número de registro, fecha de la toma, iniciales del flebotomista y ubicación

del paciente en caso de no pertenecer a la consulta externa.

FACTORES DE RECHAZO


puntos:

Muestras lipémicas











recomienda separar físicamente el plasma de las células dentro de las 2 horas siguientes

a la recolección de la muestra.

Si no se analizan las muestras de suero dentro de las primeras 8 horas, deben

almacenarse entre 2oC

y 8ºC. Si no se analizan las muestras dentro de las primeras 72

horas, deben congelarse entre –15oC y –20

oC.

8.4 REACTIVOS


Suero de Coombs Poliespecifico

PREPARACIÓN

No requiere de preparación

ACEPTABILIDAD

La aceptabilidad de un reactivo está determinada por los resultados obtenidos en

el control de calidad.


Los frascos goteros de reactivo deben almacenarse cerrados entre 2oC y 8°C.



NOMBRE DEL


Eritrocito sensibilizados 1 Eritrocitos

Eritrocitos no sensibilizados 2 Eritrocitos




En cada corrida de una muestra se realiza el control de calidad

ALMACENAMIENTO

Se almacena de 2oC - 8°C

PROCEDIMIENTO DE USO DE LOS CONTROLES

Se maneja de la misma manera que una muestra problema


Se acepta cuando pasa el control de calidad

En caso de que una corrida sea rechazada, debe repetirse el ensayo


CALIDAD

Se registra en la bitácora de control de calidad

EVALUACIÓN EXTERNA DE LA CALIDAD

Células del panel del siglo XXI en muestras de suero.


En caso de no contar con controles comerciales debe usarse una muestra de

suero de un paciente normal y otra de un paciente patológico alto.

Los sueros son congelados en alícuotas de 200 µL; cada una de ellas será

procesada con la frecuencia y aceptabilidad de un control.


Centrífuga

Guantes desechables

Gradillas

Tubos de ensaye de 12X 75 mm


Una vez recibida la muestra de suero debe ser centrifugada durante 5 minutos a 3500

rpm.

Para la detección de glóbulos rojos sensibilizados in vitro

Este procedimiento puede ser utilizado para la detección e identificación de anticuerpos

inesperados y para pruebas de compatibilidad.

Cuando se prueban los glóbulos rojos con reactivos específicos para el uso de pruebas

de antiglobulina indirecta (incluyendo Anti-D en la prueba para D débil), realice la

prueba de acuerdo con el procedimiento explicado en el inserto para el uso del reactivo

en particular.

En el caso de las pruebas para la detección de anticuerpos inesperados, siga las

instrucciones dadas para los reactivos de glóbulos rojos o para cualquier aditivo que se

utilice.

En cualquiera de los casos revise estas instrucciones dadas para la fase de

antiglobulina.

Note que las células conocidas que tengan una prueba de antiglobulina directa positiva,

no pueden usarse en la prueba de antiglobulina indirecta.

1.- Por cada muestra a probar, etiqueta un pequeño tubo de prueba 12 x 75 mm ó 10 x

75 mm, si va a realizar una prueba a temperatura ambiente, se deberá preparar el juego

de tubos por duplicado.

2.- Colocar 2 o 3 gotas del suero en cada tubo.

3.- Añada una gota de la suspensión de células a cada tubo. Las células deben ser

lavadas por lo menos una vez y resuspenderse en salina fisiológica a una concentración

de 3-5%. El reactivo de glóbulos rojos se puede utilizar directamente del frasco.

Alternativamente pueden prepararse en la forma recomendada por el fabricante, o por

medio de un procedimiento que sea efectivo para el usuario. Si utiliza un procedimiento

de baja fuerza iónica en el que las células están resuspendidas en una solución de baja

fuerza iónica revise las instrucciones del fabricante, las cuales toman preferencia sobre

este paso.

4.- Si se utiliza un aditivo como Albúmina Bovina al 22% ó 30% un aditivo de baja

fuerza iónica, como Gamma LO-ION, Gamma PeG, añádalo de acuerdo con las

instrucciones del fabricante. Note que este paso no es aplicable si las células fueron

resuspendidas en la solución de Baja Fuerza Iónica (LISS) en el paso 3.

5.- Mezcle y centrifugue el tiempo apropiado a la calibración de la centrífuga

Nota: La fuerza centrífuga aplicada a las mezclas de suero y células es la mínima

requerida para producir un botón compacto de células y un sobrenadante claro. Una

centrifugación excesiva dificulta la resuspensión del botón de células, asimismo una

centrifugación inadecuada puede producir una aglutinación que se dispersa fácilmente.

Cada laboratorio debe calibrar sus propias centrífugas para determinar el tiempo óptimo

y velocidades de centrifugación para los diferentes sistemas de prueba.

Como una guía, un minuto a 1000 rpm, es usualmente adecuado tanto para pruebas con

salina rapida como con albúmina. A 3500 rpm las pruebas de solución salina fisiologica

0.9% usualmente requieren 15 segundos, mientras las pruebas de albúmina requieren 30

segundos por la mayor viscosidad de la mezcla de prueba.

6.- Examine para hemólisis y registre si hubiere. Nota: Asumiendo la ausencia de

contaminación bacteriana o química, la hemólisis puede indicar una reacción

antígeno/anticuerpo. Algunos anticuerpos capaces de producir hemólisis tienen

especificidad en el grupo AB, Lewis, Kidd o sistema Vel.

7.- Resuspenda las células por medio de una agitación suave y registre el resultado.

8.- Incube las muestras con solución salina fisiólogica al 0.9% (si se realizaron) por 15

minutos a temperatura ambiente (23°C ± 3°C) y los otros tubos por 15 minutos (o de

acuerdo a las instrucciones del fabricante) a 37°C ± 1°C.

9.- Mezcle y centrifugue el tiempo apropiado a la calibración de la centrifuga.

10.- Repita los pasos 6 y 7, registrando los resultados apropiadamente (ej “37°C salina”,

“37°C albúmina”, “37°C LO-ION”.

11.- Descarte los tubos etiquetados para las pruebas con solución salina fisiológica 0.9

% a temperatura ambiente si se realizaron.

12.- Lave las células de todos los tubos incubados a 37°C por lo menos 3 veces con los

tubos llenos de salina, teniendo cuidado de decantar la solucion salina fisiologica entre

los lavados y resuspender las células por completo cuando se le añada la solucion salina

fisiológica para la siguiente lavada.

13.- Decante la solución salina fisiológica 0.9% completamente en seguida de la última

lavada.

14.- Añada 1 ó 2 gotas de Gamma Clone Anti-IgG, verde o incoloro, al botón de

células y mezcle.

15.- Centrifugue inmediatamente por:

a) 1 minuto a 1000 rpm ó

b) 15 segundos a 3500 rpm o

c) El tiempo apropiado de acuerdo a la calibración de la centrífuga.

16. Resuspenda las células mediante agitación suave, observar la aglutinación y registre

los resultados de la prueba.

17.- Confirme las pruebas negativas como se explica en el paso 8, en el procedimiento

de la prueba de antiglobulina directa. Si la centrifugación del tubo, como en el paso 15

se retrasa más de un minuto desde la adición del Gamma Clone Anti-IgG para lavar el

botón, la prueba debe repetirse, aún cuando la prueba de control de Coombs de un

resultado positivo.

8.8 RESULTADOS

Se entregan aproximadamente en las dos primeras horas

Reporte de resultados


al Sistema del paciente Ambulatorio (SIPAM) vía electrónica (interface) y son

validados y liberados por el Coordinador de Químico o el responsable de turno.


Anderson - Cockayne. 1993. Química Clínica. Editorial interamericana Mc

Graw. p. 54, 57.66, 68,69.


American Association of Blood Banks; p. 504,505,506,545,546, 563,564.

De Jesús Linares G. 2001. Inmunohematología y Transfusión. Ed.Viamonte; p.

50,51, 62,63,64,77,78.

Inserto para la prueba de Coombs, laboratorios Gamma.


Laboratorio de Inmunoserología – Guía De Trabajos Prácticos. p. 21, 25, 32,45.


266.



Editorial Panamericana; p. 177, 178-181.


Inmunohematología. Segunda edición. Barcelona, España: Masson; p. 445-471.

TEMA 9. PROCEDIMIENTO PARA CRIOPRESERVACIÓN DE

CÉLULAS PROGENITORAS HEMATOPOYÉTICAS

9.1 PROPÓSITO Y ALCANCE

PROPÓSITO

Criopreservar las Células Progenitoras Hematopoyéticas (CPH) provenientes de sangre

periférica movilizada y de Médula Ósea, obtenidas mediante procedimientos de

Aféresis y en el quirófano, respectivamente; conservando su viabilidad, esterilidad y

funcionalidad, para ser transplantadas posteriormente en pacientes con anomalías

hematológicas.

ALCANCE

Todos los usuarios podrán seguir este procedimiento para la criopreservación y el

transplante de CPH.

9.2 INTRODUCCIÓN

ANTECEDENTES

Los transplantes de Células Progenitoras Hematopoyéticas (CPH) se consideran, hoy

día, el tratamiento de elección para una gran variedad de enfermedades tanto malignas

como no malignas. El uso de estas en su forma autóloga tiene como objetivo restablecer

las funciones hematopoyéticas en pacientes sometidos a altas dosis de quimioterapia,

radioterapia, o ambas, y por tal motivo, la conservación de los precursores

hematopoyéticos a temperaturas bajas y en condiciones óptimas garantizan su

almacenamiento durante el tiempo que sea necesario, con la mínima pérdida de sus

capacidades de autorregulación y diferenciación.

Por lo anterior, los bancos de sangre o el Servicio de Medicina Transfusional son los

responsables de recolectarlas y procesarlas, y deberán de contar con manuales de

procedimientos actualizados para mantener un sistema de calidad, y asegurar que los

procedimientos, el almacenamiento y la distribución de los productos se ajusten a los

requerimientos y lineamientos internacionales para satisfacer las necesidades de

atención a los pacientes.

CONDICIONES GENERALES PARA LA PRESERVACIÓN DE LA ULTRA

ESTRUCTURA Y FUNCIÓN CELULAR

La resistencia al frío –y al congelamiento– depende de un gran número de diferentes

factores. En primer lugar el descenso repentino de la temperatura puede tener un efecto

adverso en ciertas células: una forma de choque térmico, que puede ocurrir tanto por

arriba y por debajo del punto de congelamiento. También, la formación de cristales de

hielo, dentro y fuera de las células pueden acarrear un gran daño físico.

Otra consecuencia de la formación del hielo es un cambio del medio ambiente

extracelular, en donde el congelamiento del agua tiene como resultado un incremento en

la concentración de sales de la solución, elevándose a un nivel específico que

corresponde al punto eutéctico (eutéctico, a adj. Dícese de una mezcla de cuerpos

sólidos, cuya fusión se realiza a una temperatura constante, como la de los cuerpos

puros. © El Pequeño Larousse Interactivo, 2000).

Un incremento tal en la concentración de los electrolitos permite la deshidratación

celular. Es de notar que las células que son más resistentes, son las mismas que son más

resistentes en bajar su temperatura.

CHOQUE TÉRMICO

El choque térmico puede ocurrir cuando ciertas células son enfriadas repentinamente,

incluso en la ausencia de cristalización. El rango crítico oscila entre +15ºC y 0ºC,

aunque también puede ocurrir entre 0ºC y -80ºC. El choque térmico comienza en la

membrana como un resultado de:

Contracción diferencial de varios componentes de la membrana

Rompimiento mecánico

Cambios conformacionales en la topografía de la membrana

El daño infligido no depende significativamente del perfil catiónico en el fluido

extracelular, sin embargo, el perfil aniónico es mucho más importante. Los aniones más

importantes, del menos dañino al más dañino, son el acetato, cloruro, nitrato, yoduro y

sulfato.

El choque térmico pude ser minimizado por:

Agentes crioprotectores

La presencia de ciertos fosfolípidos (fosfatidil serina)

Enfriamiento lento

Acondicionamiento previo en medios con alta concentración de sales.

UMBRAL DE DESHIDRATACIÓN

La mayoría de las células de los vertebrados son susceptibles incluso a una

deshidratación parcial (tanto a una temperatura normal o baja). Dependiendo del tipo

celular específico y de la especie, las células no pueden tolerar la pérdida de más del 20

al 80% de su línea basal de contenido de agua, estableciéndose así un límite del umbral

de deshidratación, en el cual las estructuras celulares sufren un daño irreversible.

La correlación entre la resistencia de las células a la deshidratación y su resistencia a las

bajas temperaturas es un reflejo de los efectos en el balance iónico. Esto es, el

incremento en la concentración de sales que acompaña a la cristalización es el

responsable de los efectos más dañinos.

El incremento en la concentración de sales induce la precipitación de proteínas dañando

la estructura lipoproteíca de la membrana. Al mismo tiempo, la cristalización de los

amortiguadores electrolíticos puede inducir grandes cambios del pH. El incremento en

la concentración de ciertos iones y compuestos tiene efectos tóxicos en el interior

celular.

El congelamiento también puede afectar la naturaleza coloidal del medio intracelular, un

efecto que puede ser reversible o irreversible. El sistema coloidal puede separse en dos

fases distintas con moléculas de agua asociadas, siendo eliminadas de las

macromoléculas orgánicas de tal manera que posteriormente se agregan y se vuelven

vitrificadas.

VELOCIDAD DE CONGELAMIENTO Y CALENTAMIENTO

El método ideal del congelamiento y la velocidad óptima de enfriamiento dependen de

varios factores conflictivos, muchos de los cuales son pobremente entendidos. Las

condiciones ideales son a menudo determinadas por pruebas de ensayo y error, dando

como resultado protocolos, en donde se establece la velocidad del enfriamiento; sí la

temperatura debería de ser disminuida en intervalos de tiempo; qué agente crioprotector

es empleado; etc. El objetivo es prevenir el choque térmico, los efectos adversos de la

excesiva concentración de sales, y el daño al medio coloidal de la célula. En las

velocidades de enfriamiento para uso rutinario, la cristalización y el inicio (seeding)

siempre comienzan en el compartimiento extracelular.

La extensión del tiempo de las células durante el punto eutéctico, por ejemplo, el

tiempo transcurrido en que son expuestas a una alta concentración de sales

La velocidad de congelamiento intracelular

El tamaño y la forma de cualquier cristal de hielo formado

Si el enfriamiento es lento, el crecimiento de los cristales de hielo en el compartimiento

extracelular es tal que las células se contraen y son expuestas a altas concentraciones de

sales.

Subsecuentemente, la fase líquida se congela a la temperatura eutéctica. Si el

enfriamiento es muy rápido, el agua en el interior de las células forma pequeños

cristales de forma irregular que son relativamente inestables. Si las células son

descongeladas subsecuentemente muy lentamente, estos cristales se agregarán a una

forma más grande, formando cristales más estables, los cuales pueden causar daño. El

incremento en la concentración de sales que acompaña al proceso de congelamiento

causa contracción celular, y si continúa por encima de cierto umbral, permite la

permeabilización de iones en la membrana. Por ello, la viabilidad celular depende de la

velocidad de enfriamiento. La mayor sobrevida a una cierta velocidad disminuirá

conforme esta velocidad se incrementa. La velocidad ideal es disminuyendo lentamente

la temperatura, que permita a las células perder suficiente agua para prevenir el

congelamiento intracelular prematuro. Sin embargo, si la velocidad es demasiado lenta,

las células serán expuestas a altas concentraciones de sales por un largo periodo de

tiempo. Además, el rango ideal de enfriamiento depende del volumen crítico de las

células que es definido por:

La permeabilidad de la membrana celular al agua

El área de la superficie de la membrana

El factor principal que causa la perdida de la viabilidad es la formación de cristales de

hielo intracelular, y especialmente la agregación de estos cristales durante el

descongelamiento. A una velocidad lenta de enfriamiento la alta concentración de sales

resultante ejerce efectos adversos cuando el agua intracelular - que tiene un alto

potencial químico - difunde hacia el exterior celular y se congela en el compartimiento

extracelular.

Los porcentajes más altos de sobrevida son obtenidos en una variedad de velocidades de

enfriamiento referida como la zona de transición, en el cual el efecto de ambos

mecanismos es mínimo.

FENÓMENO A TEMPERATURAS BAJAS

Hay un gran consenso de información acerca de los cambios biofísicos y bioquímicos

que ocurren en las células vivientes en temperaturas inferiores a los 0ºC. Se puede

concluir que, a no ser que la temperatura de almacenamiento sea demasiada baja,

algunas células continuarán viviendo y su tiempo de sobrevida dependerá de su radio

metabólico residual que será lentamente desacelerado a una mayor o menor extensión.

A temperaturas entre 0ºC y -40ºC, que no es lo suficientemente baja para la

preservación eficientemente de ciertos tipos celulares, la difusión procede y esto puede

modificar el balance iónico en el medio. A temperaturas más bajas, estas soluciones de

electrolitos son solidificados en eutécticos.

La estructura cristalina del hielo puede cambiar también (con el crecimiento de cristales

o recristalización) provocando un serio daño físico a estructuras biológicas importantes.

PRESERVACIÓN A TEMPERATURAS BAJAS

En el mundo de los seres vivos, la temperatura de -70ºC es considerada el umbral de

temperatura más bajo en el cuál ningún proceso vital está permitido. Cuando se

contempla el almacenamiento a largo o muy largo plazo, temperaturas por debajo de

este umbral deben ser empleadas.

Muchos investigadores, conservan células almacenadas en presencia de algún agente

crioprotector (por ejemplo, Dimetilsulfóxido [DMSO] o glicerol), para prevenir

cualquier daño, al momento en que son almacenadas a temperaturas inferiores de -

130ºC. En la práctica, es difícil creer que cualquier proceso dañino puede ocurrir

todavía a esta temperatura en la cual el agua es vitrificada. Algunas células

particularmente lábiles, deben almacenarse a temperaturas extremadamente bajas de -

196ºC, como es el caso del nitrógeno liquido N2 (l).

MEDICIÓN DE LA TEMPERATURA

Debido a que la velocidad de congelamiento y descongelamiento pueden tener un mayor

impacto en la viabilidad de las células y tejidos, deben de ser medidas en una forma

cuantitativa. La mejor manera de realizarlo es generar una curva completa que describa

el proceso de congelamiento y descongelamiento. Para esto, debe realizarse lo siguiente:

1. El enfriamiento antes de que el congelamiento inicie

2. El tiempo de súper-enfriamiento y sus parámetros

3. El inicio de la cristalización y la duración de la meseta de la fase de transición

4. El rango en el cual la temperatura desciende después de la fase de transición

Esta curva es referida como el perfil de la temperatura del sistema en consideración y

puede ser normalizada a una referencia medible para su fácil manipulación. El

parámetro más fácil de estimar en el rango de enfriamiento, es el tiempo en que la

temperatura cae desde 5ºC, (al punto en el cual la mayor parte del cambio de fase o

eutéctico procede, con su correspondiente liberación del calor latente de fusión) hasta -

50ºC. Sobre este rango, la temperatura tiende a volverse lineal en función del tiempo.

Ver figura 1.

(*) Súper-enfriamiento: Durante el proceso de congelamiento, el súper-enfriamiento

constituye una fase importante y crítica del perfil de temperatura. En términos prácticos,

la manera en que una solución es enfriada por debajo de su punto de congelación puede

determinar cómo ocurrirá el inicio de la formación de cristales de hielo y por ende la

forma de cristalización.

FIGURA 9. PERFIL DE LA TEMPERATURA DURANTE EL PROCESO DE

CONGELAMIENTO CONTROLADO.

AGENTES CRIOPROTECTORES

Las causas principales de la destrucción celular son la formación de hielo intracelular, y

la exposición a altas concentraciones de sales. El éxito durante el congelamiento

depende en mantener un volumen de agua suficiente en la fase líquida, tanto en los

compartimientos intracelular y extracelular, para mantener los electrolitos en solución.

El inicio y la subsecuente cristalización pueden ser inhibidas por la inactivación del

punto del potencial de condensación por medio de un envenenamiento químico. Los

agentes usados para este fin son capaces de unirse a las moléculas del agua a través de

puentes de hidrógeno y son llamados como crioprotectores, son muy diversos en su

estructura química pero todos actúan de la misma forma.

Cualquiera que sea su estructura, todos son muy solubles en agua y por su capacidad de

formar puentes de hidrógeno con las moléculas de agua, disminuyen el punto de

congelamiento de cualquier solución en la cual son incluidos.

La segunda propiedad importante de estos agentes es de que no son tóxicos a las

células. La toxicidad en este caso es muy difícil de definir a consecuencia de las

condiciones externas, tan opuestas a la naturaleza del producto en sí mismo. En la

práctica, la toxicidad depende de la concentración del agente crioprotector, la tonicidad

del medio, y de cómo las células están en contacto con el agente.

Congelamiento ideal

Incremento en la

velocidad de enfriamiento

Las demás variables que determinan la extensión a la cual un aditivo en particular será

capaz de proteger a las células de un sistema biológico dado, dependen de factores tales

como el peso molecular del compuesto y su habilidad de atravesar la membrana celular.

En términos generales los agentes crioprotectores modulan las propiedades eutécticas de

una solución de tal manera que la cantidad de hielo formado y en consecuencia, la

concentración de sales es reducida. Por disminuir el punto de congelamiento del fluido

extracelular, inhiben el flujo de agua intracelular, previniendo así la disminución del

volumen celular a su mínimo volumen crítico. Por reducir la retracción celular, estos

agentes atenúan la hiperconcentración del fluido intracelular y por ello inhiben la

precipitación de las proteínas.

En la práctica, una solución salina isotónica (9 gramos de NaCl por litro) en presencia

de 1% de DMSO alcanzará una concentración de 50 g/L a una temperatura de -5ºC. En

presencia de 5% de DMSO, esta concentración no será alcanzada hasta que la

temperatura haya descendido a -20ºC y a una concentración de 10% del crioprotectante

no se alcanzará hasta los -50ºC.

La cantidad del daño inducido en las células durante el congelamiento depende de dos

factores conflictivos, y ambos dependen de la velocidad de enfriamiento: a velocidades

que son demasiado lentas, altas concentraciones de sales serán generadas, a velocidades

que son demasiado rápidas, el hielo se formará en el interior de las células. La máxima

viabilidad es obtenida por el enfriamiento a una velocidad, en la zona de transición, en

el cual el efecto combinado de ambos mecanismos es minimizado.

Como regla general, el agente crioprotector parece proteger a las células a velocidades

de enfriamiento lento en el cual el daño asociado con los efectos de la solución

predominan. Basadas en observaciones empíricas, se ha demostrado que el resultado de

incrementar la concentración de un agente crioprotector (por ejemplo, glicerol o

DMSO) en la suspensión celular siendo enfriada a diferentes velocidades, es trasladar el

radio óptimo más inferior acoplado con un incremento del rango general de sobrevida, y

se ha documentado que los problemas asociados con el congelamiento intracelular no

son afectados por la presencia del agente crioprotector.

Con referencia a la noción de la zona de transición descrita anteriormente, se pude decir

que el agente crioprotector presente durante el congelamiento, traslada la zona entera en

la dirección de rangos más bajos por disminuir el umbral asociado con el daño causado

por la combinación de las altas concentraciones de sales y del hielo intracelular.

9.3 INSTRUCCIONES Y PROCEDIMIENTO

Los principales factores que se deben tener en cuenta con el procedimiento de

criopreservación son: la concentración celular, el medio crioprotector, el programa de

congelamiento y el sistema de almacenamiento.

La suspensión celular inicial de una muestra de CPH obtenida de sangre periférica

movilizada no debe de exceder de 2-3 x 10 7 células por mililitro.

El medio crioprotector puede variar, pero es recomendable que contenga una fuente

nutritiva, que puede ser albúmina humana, suero o plasma autólogo u homólogo, en una

concentración final de al menos 10%. El agente crioprotector de elección es el DMSO a

una concentración final del 10%, la adición debe de realizarse lentamente y a una

temperatura de 4ºC. Para tal efecto, se procede a preparar la solución crioprotectora con

DMSO al 20%, adicionando un volumen igual de la cosecha de CPH y de la solución

crioprotectora, resultando una concentración final al 10% y siempre manteniendo a una

temperatura de 4ºC.

Una vez terminada la mezcla, se transfiere a una bolsa de congelamiento que debe estar

constituida por un material plástico no lipofílico (poliolefina o teflón-kapton) para evitar

el daño a las membranas celulares, y además debe de ser lo suficientemente resistente a

bajas temperaturas (-196ºC). La bolsa se introduce en un soporte de aluminio que

mantenga comprimidas ambas superficies, proporcionando así un espesor y forma

homogénea de la muestra que facilite un correcto intercambio de calor.

El programa de congelación puede variar, pero en términos generales debe incluir

primero una fase de estabilización a una temperatura de 4ºC, seguida de un descenso

constante de la misma a un ritmo de 1-2ºC/min. En el momento previo al punto

eutéctico, se debe inducir un descenso prolongado de la temperatura de la cámara para

compensar la liberación del calor latente de fusión.

Una vez superada la fase de transición, el ritmo de enfriamiento debe permanecer

constante entre 1-2 ºC/min.

Las células congeladas pueden almacenarse en un contenedor de N2 (l), en su fase

líquida, donde la temperatura se mantiene constante a –196ºC. Si la muestra se mantiene

en la fase gaseosa, la temperatura puede oscilar entre –100ºC y –140ºC.

OBSERVACIONES

El Dimetilsulfóxido es potencialmente tóxico para las células en temperaturas por arriba

de 0ºC, por ello su adición y los pasos subsecuentes deben de realizarse lo más rápido

posible en todo el procedimiento, tanto en la preparación de los reactivos, como en la

preparación de las muestras biológicas se deben de mantener a una temperatura de 4ºC y

con asepsia en la campana de flujo laminar.

En el laboratorio se han realizado experimentos de criopreservación usando la prensa

para la bolsa criogénica, incluida en el equipo CryoMed Freezeer, el casete de aluminio

(Canister), y los sensores de temperatura, superficial, o dentro de la muestra, con lo cual

hemos observado que el proceso se ve afectado por estas configuraciones y por tal

motivo es necesario elegir el programa adecuado al momento de criopreservar las CPH

según la manera que se elija al congelar las muestra.

9.4 MATERIAL Y EQUIPO REQUERIDO PARA CRIOPRESERVAR CPH

1. Bata quirúrgica

2. Cubre bocas

3. Gorro quirúrgico

4. Guantes estériles

5. Campos estériles

6. Tijeras inoxidables estériles

7. Pinzas inoxidables estériles (Rocher)

8. Gasas estériles

9. Torundas de algodón (jabón, alcohol, isodine)

10. Alcohol isopropílico al 70%

11. Desinfectante (glutaraldehído, fenol al 5%, o formaldehído)

12. Isodine

13. Frascos estériles (100 mL) o matraz Elermeyer de 250 mL

14. Probeta graduada estéril (100 mL)

15. Acopladores para toma de muestras (Sampling Site Couplers, Fenwal 4C-2405)

16. DMSO estéril (Sigma, Cat D-2650) o USP (Sigma, Cat. D-1435)

17. Jeringas desechables estériles de 5, 10, y 20 mL

18. Agujas estériles del No. 18G

19. Bolsa criogénica de 250 mL (OriGen, Cryostore, Cat. CS 250n)

20. Casete de aluminio (Canister) para bolsa criogénica a 4ºC

21. Equipo para congelamiento controlado CrioMed Freezer

22. N2 (l) a baja presión

23. Guantes criogénicos

24. Frascos para hemocultivo y de hongos/micoplasma (pediátricos, 1-3 mL)

25. Tubos para Biometría Hemática (BH)

26. Hielo fräppe

27 Refrigerantes envueltos en papel

28. Azul Tripano al 0.4%

29. Cubre y porta objetos

30. Microscopio óptico

32. Sellador dieléctrico

33. Bolsas para desechos

34. Etiquetas de identificación

35. Crioviales estériles

36. Campana de Flujo Laminar

37. Depósito para almacenamiento con N2 (l)

38. Formato del material necesario para criopreservar CPH (Formato I)

39. Formato de registro del procedimiento para criopreservar CPH (Formato II)

40. Marcos metálicos (Racks) numerados N2 (l)

41. Diagrama del sitio de almacenamiento en el depósito de N2 (l)

42. Pipetas automáticas de 200 y 1000 μL

43. Puntas para pipetas automáticas de 200 y 1000 μL

44 Solución Salina Fisiológica 0.9%

9.5 ESPÉCIMEN A CRIOPRESERVAR

Células progenitoras hematopoyéticas (alogénicas o autólogas) movilizadas de

sangre periférica y obtenidas mediante aféresis.

Médula ósea autóloga obtenida en quirófano.

Si es necesario, la suspensión celular es primero concentrada en forma manual o por una

técnica automatizada (seguir el procedimiento apropiado).

9.6 PROCEDIMIENTOS PREVIOS A LA CRIOPRESERVACIÓN DE CPH

Realizar la limpieza y desinfección de la campana de flujo laminar, la

esterilización con luz ultravioleta (U.V.) del material que no se puede esterilizar

con vapor (por ejemplo, bolsas criogénicas, DMSO, tubos de BH, etc.), dejar 15

minutos y encender la lámpara de luz U.V. Colocar un letrero que indique que

está encendida.

Solicitar el plasma del paciente (aprox. 100 ml) obtenido durante la aféresis al

equipo de enfermería y mantenerlo a 4ºC.

Rotular las bolsas criogénicas y el casete de aluminio (canister).

Colocar una etiqueta de identificación en la porta-etiqueta de la bolsa criogénica.

Sellar con el sellador dieléctrico en varios puntos la porta- etiqueta.

.

La información de la etiqueta debe contener la siguiente información:

Nombre del donador

No. de unidad o identificación (por ejemplo, expediente)

Fecha

Producto celular (por ejemplo, CPHSP alogénica, MO o CPHSP autóloga

reducida), si es autóloga: SOLO PARA USO AUTOLOGO

No. de secuencia de la bolsa criogénica, (por ejemplo, 1 de 3).

Apartar las bolsas criogénicas hasta que se necesiten.

Rotular una bolsa criogénica como bolsa control y apartarla hasta su uso.

Rotular los frascos de cultivo, BH y crioviales con la información del paciente.

Rotular el casete de aluminio (canister) con una etiqueta con la información

de paciente.

Verificar el nivel de N2 (l). Abrir la válvula del N2 (l), y encender el equipo de

congelamiento y elegir el programa que va ser utilizado.

Colocar canister en el congelador hasta su uso.

Anotar el número de lote, la fecha de caducidad y la casa comercial del DMSO

y de las bolsas criogénicas en el Formato del registro del procedimiento de

criopreservación de CPH (Formato II).

9.7 PROCEDIMIENTO PARA CRIOPRESERVAR

Pesar la bolsa que contienen las CPHSP al terminar su recolección. Restar el peso de la

bolsa vacía (bolsa transfer de 600 mL de equipo CobeSpectra = 32g; bolsa de

recolección de equipo CS-3000 = 25g) y dividir el resultado entre la densidad específica

de las CPH (d= 1.066) para obtener el volumen aproximado. Con este valor se puede

calcular la cantidad de bolsas criogénicas que serán necesarias para la criopreservación

de las células.

Ejemplo, Peso de la bolsa con CPHSP = 133 g

Peso de la bolsa transfer de 600 mL = - 32 g

__________

101 g CPHSP

÷

Densidad específica de las CPHSP = 1.066 g/mL

__________

94.74 mL de CPHSP

En la siguiente tabla se muestran el volumen mínimo y máximo permitido al

criopreservar CPH en las bolsas criogénicas de diferentes capacidades (Nota. Los datos

fueron tomados de las bolsas Cryostore de Origen Biomedical, pero se puede aplicar a

cualquier bolsa con las mismas dimensiones y capacidades).

TABLA 15. VOLUMEN MÍNIMO Y MÁXIMO PERMITIDO AL

CRIOPRESERVAR CPH

Código del

Producto

Volumen, a

congelar

Min – Max

Volumen

Nominal

Largo,

cm Ancho, cm

CS 50 10 a 20 50 11.4 7.6

CS 250 30 a 70 250 15.2 12.7

CS 500 55 a 100 500 19.0 12.7

Tomando en cuenta la capacidad de las bolsas criogénicas, el volumen de CPH se

dividiría en 3 bolsas criogénicas con un volumen de 31.58 mL (más un volumen igual

de solución crioprotectora con DMSO al 20%).

Si el volumen de la cosecha es mayor a 140 mL, el volumen deberá ser reducido,

según el protocolo establecido en el Servicio de Medicina Transfusional.

Si el volumen de la cosecha es igual o menor a 140 mL, colocar la bolsa dentro de la

campana de flujo laminar. Realizar la asepsia de uno de los puertos de entrada y colocar

un acoplador de toma de muestra en el puerto y realizar su asepsia correspondiente.

Si no se cuenta con dicho acoplador, realizar la asepsia del tubo de recolección de la

bolsa de CPH para puncionarlo con una jeringa con aguja del calibre 18G. En este

momento se puede realizar la asepsia de los puertos de entrada de las bolsas criogénicas

y de los frascos de hemocultivo. De igual forma, realizar la asepsia de un extremo de

tubo de la bolsa del plasma para poder tomar el volumen indicado para preparar la

solución crioprotectora.

Usando una jeringa de 5 mL con aguja del calibre 18G retirar 2 mL de la

suspensión celular y depositar 1 mL en un tubo de BH (Tubo morado con

EDTA), rotulado previamente. Realizar el recuento celular en el equipo CellDyn

3500 y determinar el número de células Mononucleares en la muestra.

Inocular 1 mL de la suspensión celular en un frasco de hemocultivo, rotulado

previamente como pre-congelamiento o pre-DMSO. Tomar las jeringas de

20 mL con aguja del calibre 18G y llenar completamente a un volumen de 20 ml

cada una. Usar las jeringas necesarias para recolectar el volumen total de

CPHSP. La última jeringa contendrá menos de 20 ml.

Tapar la aguja con su capuchón cuidadosamente y retirar la aguja de la jeringa

(desechar la aguja en un contenedor de punzo cortantes). Unir cada jeringa a una

bolsa criogénica. Dispensar la suspensión celular hacia la bolsa, dejando la

jeringa unida. Comenzar con la bolsa criogénica # 1.

Repetir el procedimiento con las otras bolsas criogénicas.

Anotar el volumen de cada bolsa criogénica en el formato del registro de

procedimiento.

Dispensar a la bolsa control un volumen igual al de la bolsa de CPH con mayor

cantidad de la solución control (se puede utilizar plasma).

Colocar las bolsas criogénicas entre los refrigerantes e incubar durante 30

minutos.

Calcular la cantidad de la mezcla crioprotectora (plasma autólogo con DMSO al

20%) para que al ser mezclada 1:1 con las células.

Volumen de cosecha de CPH + volumen bolsa control = volumen de

solución crioprotectora + 10 mL de excedente.

Ejemplo:

70 mL para CPH + 20 mL para la bolsa control = 100 mL de solución crioprotectora

(90 mL para bolsas + 10 mL excedente).

Por lo tanto se prepara el volumen de solución = 80 mL de plasma + 20 mL

DMSO.

En la siguiente tabla se muestran los cálculos de diferentes volúmenes de solución

crioprotectora:

TABLA 16. VALORES DE DMSO-PLASMA PARA LA MEDICIÓN EXACTA

DEL DMSO AL 20%.

Volumen Total (mL)

=

DMSO

+

Plasma

5 1 4

10 2 8

15 3 12

20 4 16

25 5 20

30 6 24

35 7 28

40 8 32

45 9 36

50 10 40

55 11 44

60 12 48

65 13 52

70 14 56

75 15 60

80 16 64

85 17 68

90 18 72

95 19 76

100 20 80

105 21 84

110 22 88

115 23 92

120 24 96

125 25 100

130 26 104

135 27 108

140 28 112

145 29 116

150 30 120

160 32 128

170 34 136

180 36 144

190 38 152

200 40 160

250 50 200

300 60 240

Anotar el volumen de la solución crioprotectora de cada bolsa criogénica en el

Formato del registro del procedimiento de criopreservación.

Anotar el volumen total de cada bolsa en el Formato del registro.

Colocar un reloj con alarma a los 30 minutos y otro a los 20 minutos.

A la alarma de los 20 minutos preparar la solución. Con la probeta estéril medir

la cantidad del plasma autólogo frío (a 4ºC) y depositarlo en un frasco estéril en

hielo. Con una jeringa de 20 mL tomar la cantidad necesaria de DMSO y

adicionar al plasma mezclando perfectamente para evitar desnaturalizar las

proteínas del plasma debido a la reacción exotérmica.

Iniciar el programa correspondiente del congelador programable y permitir que

se enfríe a 4ºC.

A la alarma de los 30 minutos tomar con una jeringa de 20 mL la cantidad

necesaria de la solución crioprotectora. Retirar la jeringa vacía de la suspensión

de CPH, con prontitud adicionarla en cada bolsa criogénica, empezando con la

bolsa control y posteriormente a las bolsas con las células, mezclar

perfectamente. Usar el émbolo de la jeringa para retirar la mayor cantidad

posible de aire y tomar aproximadamente 2.5 mL de la mezcla.

Colocar 0.5 mL en un criovial rotulado, 1 mL en el tubo de BH, rotulado

previamente como post-DMSO, para corroborar su viabilidad. Mantener el tubo

a 4ºC. Inocular 1 mL de la mezcla en el frasco de hemocultivo, rotular como

post-DMSO.

Sellar la línea de la bolsa criogénica que contiene la jeringa tres veces con un

sellador dieléctrico. Cortar con tijeras en medio de la línea sellada y desechar la

línea unida y la jeringa.

Secar rápidamente cada bolsa criogénica y colocarla dentro del canister

previamente enfriado a -20ºC; por ejemplo, colocar la bolsa #1 canister #1.

Cuando corte la línea sea cuidadoso en no dejar cualquier gota de CPH en el

área de sellado. La presencia de células en un extremo abierto de la línea

después del sellado debe de ser evitada ya que puede contaminar el N2 (l) en el

tanque de depósito. Ver observaciones para otras opciones para congelar las

bolsas criogénicas usando una prensa para congelamiento del equipo CryoMed

Freezer.

Colocar los canister y el criovial en la cámara de enfriamiento. Distribuir

individualmente los canister en una gradilla metálica para que se lleve a cabo el

proceso en las mismas condiciones del congelamiento.

Coloque la bolsa control dentro de un canister e inserte el sensor de la

temperatura en uno de los puertos de muestreo. Tener cuidado de no dejar aire

para evitar un registro inadecuado del proceso de congelamiento. Cerrar con

cuidado el canister para evitar maltratar el sensor de la temperatura, y colocarlo

en la gradilla metálica. Ver observaciones para otras opciones para congelar las

bolsas criogénicas usando una prensa para congelamiento del equipo CryoMed

Freezer.

Cerrar la puerta de la cámara de enfriamiento y oprimir el botón de RUN del

equipo. Registrar el programa utilizado para el congelamiento controlado y el

tiempo de inicio en el Formato del registro de procedimiento (formato II).

Al final del proceso de congelamiento presionar el botón stop para silenciar la

alarma del equipo. Registrar el tiempo final. (formato I).

Abrir la puerta de la cámara de enfriamiento, remover los canister y el criovial

de las CPH y colocarlos en el depósito de almacenamiento con N2 (l) en la fase

de líquida o de vapor. Anotar el No. del marco metálico (rack), la fase de

almacenamiento de N2 (l) y el sitio dentro del depósito de N2 (l) en el Formato

del registro del procedimiento de criopreservación , según el siguiente diagrama:

FIGURA 10. ESQUEMA DE LA LOCALIZACIÓN DENTRO DEL

CONTENEDOR DE N2 (l).

FIGURA 11.ESQUEMA DE LA LOCALIZACIÓN DENTRO DEL MARCO

METÁLICO (RACK)

Imprimir la gráfica del registro de temperatura y rotular con la identificación del

paciente.

La carta de congelamiento será parte del registro permanente del proceso.

La gráfica del congelamiento no deberá mostrar un cambio inusual o inesperado en la

temperatura.

La curva apropiada del calor latente de fusión deberá de estar por debajo de 0ºC.

Cerrar la puerta de la cámara de enfriamiento y accionar el botón de calentamiento

(warm) para descongelar la cámara. Al terminar, retirar la bolsa control y almacenarla a

-20ºC y apagar el equipo de congelamiento.

Limpiar la campana de flujo laminar y tirar todo el material desechable en las bolsas

correspondientes.

9.8 PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR EL NO. DE CMN DE LAS CPH

Encender el equipo para Biometría Hemática, Cell-Dyn 3500.

Evaluar los controles alto, normal y bajo, y establecer si el equipo no muestra

valores fuera del rango para dichos controles. Si algún valor está por afuera de

estos rangos será necesario calibrar el equipo según el manual del usuario.

Procesar por duplicado la muestra rotulada como pre-DMSO que se obtuvo de la

cosecha de CPH. Si los valores están por encima del rango de detección del

equipo diluir la muestra de CPH 1:10 con solución salina fisiológica. Obtener el

promedio de los valores y reportarlos en el formato del registro del

procedimiento de criopreservación.

Calcular el No. De CMN presentes en la muestra y la dosis / Kg de peso, como

sigue:

Leucocitos Totales = valor de leucocitos obtenido del Cell-Dyn (K/μL) x 1000000 x

Dilución (si se realiza) x Volumen de la cosecha.

CMN Totales = % de Linfocitos Cell-Dyn + % de Monocitos Cell-Dyn ÷ 100 x

Leucocitos Totales.

Dosis de CMN/Kg = CMN totales ÷ peso del donador.

Anotar los resultados en el formato del registro del procedimiento de criopreservación.

9.9 PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR LA VIABILIDAD CELULAR DE

LAS CPH

MATERIAL REQUERIDO:

Portaobjetos

Microscopio óptico

Pipeta automática de 50 μL

Puntas para pipeta automática

Tubos de ensayo de 12 x 75 mm

Cámara de Neubauer

Cubreobjetos para cámara de Neubauer

REACTIVOS:

Azul de Tripano al 0.4 %

PROCEDIMIENTO:

Verificar que el material este completamente limpio.

Rotular un tubo de ensaye de 12 x 75 mm con el nombre donador y

CPHR y otro con el nombre del donador y CPH post-DMSO.

Adicionar a cada tubo 50 μL de la CPH de la cosecha y de la muestra

post-DMSO, respectivamente.

Adicionar en cada tubo 50 μL de la solución de Azul Tripano al 0.4% y

mezclar perfectamente.

Adicionar la muestra en la cámara de Neubauer y contar el número de

células vivas y muertas con el microscopio óptico (40X).

Reportar el porcentaje de viabilidad de las muestras en el formato del

registro del procedimiento de criopreservación.

9.10 LIMPIEZA Y ASEPSIA DE LA CAMPANA DE FLUJO LAMINAR

Debido a que las CPH son recolectadas en un ambiente “abierto” y porque muchos de

los pasos de su procesamiento no pueden ser realizados en un sistema completamente

cerrado, hay numerosas oportunidades para la contaminación con microorganismos. Por

esto, se debe asumir un método estricto de asepsia que deberá de ser realizado en el área

de trabajo dentro de la campana de flujo laminar. Cultivos bacterianos y de hongos

deberán ser realizados en las diferentes etapas del procesamiento para determinar si

cualquiera de las técnicas y/o materiales en uso están comprometiendo la pureza de

estas.

MATERIAL Y EQUIPO REQUERIDO:

Solución desinfectante PRESEPT (Code Nr. SPW50, Johnson & Johnson)

Alcohol al 70%

Fenol al 5 %

Guantes desechables

Cubre bocas

Lentes de Protección

Gasas estériles

PROCEDIMINETO:

Realizar la limpieza de la superficie del piso, techo y paredes con la solución de

Dextrán-Hipoclorito de Sodio.

Encender la luz de la campana de flujo laminar, realizar la desinfección de las

cuatro paredes de ésta con la solución PRESEPT humedecer las gasas estériles

con etanol al 70 % y pasar por toda el área, desinfectar con la solución de Fenol

al 5 %. Dejar actuar por 15 minutos.

Encender el motor y dejar durante 30 minutos como mínimo. Posteriormente

encender la luz U.V. y dejar actuar durante 15 minutos. Colocar un letrero

indicando que la luz está encendida.

9. 11 VERIFICACION DE LA ESTERILIDAD DEL PROCESO

Mantener la esterilidad es una consideración importante en el procesamiento y

criopreservación de las CPH. Se ha reportado contaminación en pacientes que han

recibido transplantes alogénicos y autológos. Los microorganismos identificados fueron

flora normal encontrada en la piel.

La contaminación puede ocurrir durante la colección de las mismas y en varias etapas

durante el procedimiento. La disponibilidad de sistemas semicerrados de recolección

reduce oportunamente la contaminación, sin embargo la esterilidad debe ser

monitoreada con cultivos bacterianos y de hongos. La identificación del organismo y su

sensibilidad debería de ser realizada en los cultivos que resultaran positivos. Aunque el

mayor propósito de esta prueba es la protección del paciente, también suministra

información epidemiología útil acerca de las actividades de laboratorio y del transplante

en general.

9.12 PROCEDIMIENTO PARA DESCONGELAR CPH CRIOPRESERVADAS

Las células criopreservadas son descongeladas en un baño maría entre 37ºC y – 40ºC

inmediatamente antes de infundirlas y administrarlas a través de un catéter central.

Aunque la infusión de DMSO ha sido asociada con cierta toxicidad incluyendo nauseas,

vómitos, rubor, incremento en la frecuencia cardiaca y presión sanguínea, y elevación

de las transaminasas en suero, muchos investigadores creen que la manipulación de las

células descongeladas pueden provocar pérdida celular inaceptable.

MATERIAL NECESARIO:

Baño María

Cronómetro

Agua estéril

Solución desinfectante PRESEPT (Code Nr. SPW50, Johnson & Johnson)

Disolver una tableta de 5 g en 3 litros de agua

Alcohol al 70%

Fenol al 5 %

Refrigerantes

Tubos de vidrio de 12 x 75 mm

Frascos para Hemocultivo y Hongos

Microscopio Óptico

Porta y cubre objetos

Azul de tripano al 0.4%

Campos quirúrgicos

Contenedor de N2 (l) portátil

Ropa quirúrgica

Gasas estériles

Tijeras estériles

Acoplador para toma de muestra

Jeringas desechables estériles de 10 mL y 20 mL

Agujas estériles del calibre 18G

Torundas de alcohol e isodine

Guantes estériles

Cubre bocas

PROCEDIMIENTOS PREVIOS PARA DESCONGELAR LAS CPH

Localizar en el depósito de almacenamiento de N2 (l) las bolsas criogénicas con las

CPH correspondientes al paciente que va a ser reinfundido. Verificar perfectamente que

los datos de las bolsas concuerden con los datos del paciente que se va a transfundir,

Determinar la cantidad de CMN y/o células CD34 de cada bolsa criogénica.

Transferir los canister de la fase líquida a la fase gaseosa del depósito de N2 (l), por lo

menos 12 horas antes de la reinfusión.

PROCEDIMIENTO:

Realizar la desinfección del baño maría con la solución desinfectante PRESEPT

con la ayuda de gasas estériles y la asepsia con una solución de Fenol al 3 %.

Dejar actuar por espacio de 30 minutos cubrir con un campo quirúrgico y

trasladar el baño al pie de la cama del paciente al que se van a reinfundir las

CPH.

Localizar las células criopreservadas y acomodar las bolsas de mayor a menor

concentración en el depósito de N2 (l) portátil, trasladar el contenedor al área

donde se llevará a cabo la reinfusión y conectar el baño maría a una toma de

corriente eléctrica. Adicionar agua estéril y dejar que alcance la temperatura de

40ºC. Adicionar el antiséptico.

A la indicación del médico responsable, seleccionar la primera bolsa con mayor

concentración de CPH del contenedor portátil de N2 (l) y verificar una vez más

los datos de identificación de la bolsa y del paciente. Introducir la bolsa al Baño

María y con una leve agitación dejar que se descongele, aproximadamente 1

minuto y 50 segundos. Este tiempo puede variar según el volumen de las células

y de las características de la bolsa criogénica.

NOTA: No descongelarlas completamente, sino hasta el punto en que se

note la apariencia de una moneda de 10 pesos en el centro de la bolsa.

Retirar la bolsa criogénica del Baño María y colocarla entre dos refrigerantes.

Realizar la asepsia de uno de los puertos de entrada con las TORUNDAS de

alcohol e isodine e insertar el equipo de transfusión para su reinfusión en el

paciente. Otra opción sería, colocar un acoplador de toma en el puerto de entrada

y con la ayuda de una jeringa de 20 mL con aguja del calibre 18G, tomar las

CPH e iniciar la reinfusión en alguna de las líneas de soluciones que tenga el

paciente.

Vigilar los signos vitales y reacciones que pudiera presentar el paciente.

En cada una de las bolsas realizar la asepsia de una esquina y cortar con las

tijeras estériles un extremo de las bolsas. Tomar el sobrenadante remanente para

realizar los cultivos bacterianos (hemocultivo y hongos) y la viabilidad de éstas

después de descongelarlas. El DMSO es toxico para las células a temperaturas

mayores de 4ºC, por tal motivo, conservar todas las muestras en los

refrigerantes.

9.13 ABREVIATURAS

EDTA Anticoagulante, Etilendiaminotetraacético disódico

BH Biometría Hemática

CMN Células Mononucleares

CPH Células Progenitoras Hematopoyéticas

CPHSP Células Progenitoras Hematopoyéticas de Sangre Periférica

NaCl Cloruro de Sodio

Dx Diagnostico clínico

DMSO Dimetilsulfóxido

ºC Grados Centígrados Celsius

Hto Hematocrito

HB Hemoglobina

Kg Kilogramo

MO Médula Ósea

µL Microlitro

N2 (l) Nitrógeno Líquido

SP Sangre periférica

SSF Solución Salina Fisiológica al 0.9%

Tx Tratamiento

U. V. Ultra violeta

MATERIAL NECESARIO PARA LA CRIOPRESERVAR CPH

FORMATO I

PREPARADO

1. Bata quirúrgica

2. Cubre bocas

3. Gorro quirúrgico

4. Guantes estériles

5. Campos estériles

6. Tijeras inoxidables estériles

7. Pinzas inoxidables estériles (Rocher)

8. Gasas chicas estériles

9. Torundas de algodón (jabón, alcohol, isodine)

10. Alcohol isopropílico al 70%

11. Desinfectante (glutaraldehído, fenol al 5%, o formaldehído)

12. Isodine

13. Frascos estériles (100 mL) o matraz Elermeyer de 250 mL

14. Probeta graduada estéril (100 mL)

15. Acopladores para toma de muestras (Sampling Site Couplers, Fenwal 4C-2405)

16. DMSO (Dimetilsulfóxido) USP (Sigma, Cat. D-1435) o estéril (Sigma, Cat

17. Jeringas desechables estériles de 5, 10, y 20 mL

18. Agujas estériles del No, 18G

19. Criobolsa de poliolefina o teflón de 250 mL o 500 mL

20. Canister para criobolsas de poliolefina a 4ºC

21. Equipo para congelamiento controlado Criomet

22. Nitrógeno líquido N2 (l) a baja presión (22 PSI dewars) criogénicos

24. Frascos para hemocultivo (pediátricos, 1-3 mL)

25. Tubos para Biometría Hemática

26. Hielo fräppe

27 Refrigerantes envueltos en papel

28. Azul Tripano al 0.4%

29. Cubre y porta objetos

30. Microscopio óptico

32. Grapas metálicas y rodillo

33. Sellador dieléctrico

34. Bolsas para desechos

35. Etiquetas de identificación

36. Crioviales estériles

37. Campana de Bioseguridad

38. Depósito para almacenamiento con Nitrógeno líquido

39. Formato del material necesario para criopreservar CPH (Formato I)

40. Formato de registro del procedimiento para criopreservar CPH (Formato II)

41. Racks numerados

42. Diagrama del sitio de almacenamiento en el depósito de N2 (l)

43. Pipetas automáticas de 200 μL y 1000 μL

44. Puntas desechables para pipetas automáticas de 200 y 1000 μL

45, Solución Salina Fisiológica

46. Conocer la ubicación del material y reactivos

47. Leer el manual de procedimientos

48. Leer las instrucciones sobre el uso de la bolsa criogénica

49. Contenedor para desechos punzo cortantes potencialmente infecciosos

50. Recipiente y bolsas para los desechos

51. Masking tape.

RESPONSABLE DEL PROCESO: ________________________________________________

FECHA: _____________________________________________________________________

REGISTRO DEL PROCEDIMIENTO DE CRIOPRESERVACION DE CPH

FORMATO II

IDENTIDAD DE LA MUESTRA

Nombre: OSEGUERA MARTINEZ JOSE ANGEL Edad: 37 Peso: 68 Kg

Dx: TUMOR GERMINAL MEDIASTINO Registro: S/R Cama: Externo

Tx. para Movilizar SP: NEUPOGEN 300 g/12 HRS X 5 DÍAS Gpo Sanguíneo/Rh: 0 positivo

Equipo de Aféresis: CS-3000, VACIADO DE CAMARAS Vol. Sanguíneo Procesado: 14.161 L

No. Procedimiento

realizado: 1

Serologia: VIH NEG

HVC NEG

HVB NEG VDRL NEG

CITOMETRÍA HEMÁTICA DEL PACIENTE

CLASE DE RECOLECCIÓN

Aféresis: X Autóloga: X Alogénica: Proceso adicional:

Médula Ósea: Autóloga: Alogénica: Proceso adicional:

Otros:

CRIOPRESERVACIÓN

No. Unidad: 14507 (pre-donante) Programa Cryomed: 9v.19

Bolsa criogénica: Cryostore CS 250 n Lote: C 14098 Caducidad: 8 – 2009 Marca: OriGen

DMSO: (DMSO) HYBRI-MAX Lote:35K23334 Caducidad: 03/07 Marca:

Volumen CPH: 95 ml (BOLSA 1) Bolsa 1: 35 ml Bolsa 2: 35 ml Bolsa 3: 25 ml

Volumen Sol. Criogénica (DMSO

20%)

Bolsa 1: 35 ml Bolsa 2: 35 ml Bolsa 3: 25 ml

Volumen Total Bolsa 1: 70 ml Bolsa 2: 70 ml Bolsa 3: 50 ml

Sitio en Reservorio: II Bolsa 1 Rack: No: 1A

Bolsa 2 Rack No: 2A Bolsa 3 Rack: No: 3A

Fase en N2 (l): Líquida Hora de inicio del proceso: 11:10 Hr Hora final: 14:00

Hr

Leucocito K/μL Eritrocitos M//μL

Neutrófilos %: Hb g/dl

Linfocitos% Hto %

Monocitos%: Plaquetas K/μL

Eosinófilos% CMN K/μL

Basófilos% Células CD34 células/μL

RESULTADOS DE LA COSECHA DE CPH

Leucocitos: 166.0 K/μL Eritrocitos: 1.43 M//μL

Neutrófilos 23.0 %: Hb: 2.26 g/dl

Linfocitos: 13.1 % Hto: 9.86 %

Monocitos 38.6 % Plaquetas: 232.0 K/μL

Eosinófilos: 0.151 % CMN: 85.82 K/μL

Basófilos: 25.2 % Células CD34: 3810 células/μL

Fecha de Recolección: 04/04/2006

Volumen de Recolección: 95 mL Viabilidad precongelamiento: 95 %

Leucocitos Totales: 15770 (x 106) Viabilidad post-DMSO: 65 %

CMN Totales: : 8152.9 (x 106) Viabilidad post-descongelamiento: %

Células CD34 Totales: : 361.95 (x 106) Hemocultivo cosecha:

CMN/Kg: : 119.89 (x 106/Kg) Hemocultivo post-DMSO:

Células CD34/Kg: : 5.32 (x 106/Kg) Hemocultivo post-descongelamiento:

Observaciones:

_____________________________________________________________________________

Nombre del Receptor:

_____________________________________________________________________________

Médico Solicitante:

_____________________________________________________________________________

Realizó procedimiento:

_____________________________________________________________________________

Vo.Bo. Dr.

_____________________________________________________________________________ Fecha

_____________________________________________________________________________

REGISTRO DE LA TEMPERATURA Y NIVEL DE N2 (l) DEL CONTENDOR

FORMATO III

FECHA HORA TEMPERATURA

(ºC)

NIVEL DE

N2 (l)

OBSERVACIONES

Nivel mínimo para cubrir los diferentes espacios de marco de aluminio (Rack) para bolsas de

500 mL:

Nivel A = 9 pulgadas; Nivel B = 16 pulgadas; Nivel C = 22 pulgadas; Nivel D = 28

pulgadas.

REGISTRO DEL NIVEL DE N2 (l) DE LOS CILINDROS INFRA

FORMATO IV

CILINDRO INFRA 1 CILINDRO INFRA 2

Fecha Hora Nivel Cambio Observaciones Fecha Hora Nivel Cambio Observaciones

9.14 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍAS

Boletín ISO 9001; 2000. I: Núm. 1, 2002. Hospital Universitario Dr. José

Eleuterio González, mayo.

Clark DA, et al. Medical schools and hospitals. Interdependence for service. J

Med Educ 1985; 60:22-38.

Clark DA y Sheps CG. Administración de hospitales universitarios. OPS.

Boletín núm. 58.

Conde E, Sierra J, Iriondo A et al. 1994. Prognostic factors in patients who

received autologous bone marrow transplantation for non-Hodgkin's lymphoma.

Report of 104 patients from the Spanish Cooperative Group GEL/TAMO.Bone

Marrow trasnspl; 14:279-286.

Freedman A., Gribben J., Neuberg D., et al 1996. High dose therapy and

autologous bone marrow transplantation in patients with follicular lymphoma

during firt remission. Blood 88: 278.

He Y, Wheatley K, Clark O, et al. 2003 Early versus deferred treatment for early

stage multiple myeloma. Cochrane Database Sits Rev (1): CD004023.

Hot M, Hellquist L, Holmberg E, et al. 2003. Initial versus deferred melphalan-

prednisone therapy for asymptomatic Rajkumar SV, Gertz MA, Lacy MQ, et al.

Thalidomide as initial therapy for early-stage myeloma. Leukemia 17 (4): 775-9.

Juliusson G, Celsing F, Turesson I, et al.200. Frequent good partial remissions

from thalidomide including best response ever in patients with advanced

refractory and relapsed myeloma. Br J Haematol 109 (1): 89-96.

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chemotherapy cycle is predictive in poor prognosis aggressive non-Hodgkin's

lymphomas: Study of 113 cases. Blood :(Abstr).

Philip T, Guglielmi C,Hagenbee et al . 1995. Autologous bonemarrow

transplantation as compared wiyh salvage chemotherapy in relapses of

chemotherapy.sensitive non Ho JanIFEk M, Kaplan M, Neuberg D, et al: Early

restaging gallium scans predict outcome dgkin lymphoma. New England Journal

of Medicine, 333; 1540-45.

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thalidomide plus dexamethasone for newly diagnosed myeloma. J Clin Oncol 20

(21): 4319-23.

Richardson P, Schlossman R, Jagannath S, et al. 2004. Thalidomide for patients

with relapsed multiple myeloma after high-dose chemotherapy and stem cell

transplantation: results of an open-label multicenter phase 2 study of efficacy,

toxicity, and biological activity. Mayo Clin Proc 79 (7): 875-882.

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significance of chromosomal abnormalities in patients with blastic peripheral B-

cell lymphoma. Blood, 94:3114-3120.

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for non-Hodgkin's lymphoma in first remission. Blood 81:1968-1969.

Ship An, Abellof KH, Antman G et al.1999. International Consensus conference

on high-dose therapy with hematopoietic stem cont/cell transplantation in

aggressive non Hodgkin’s lymphomas report of the jury. Journal of Clinical

Oncology, 17: 423-29.

COMENTARIOS FINALES

El objetivo primordial de los Bancos de Sangre y Servicios de Medicina Transfusional

es la calidad en todos sus aspectos. Los procedimientos habituales incluyen el control

de los reactivos, la eficiencia del laboratorio, el mantenimiento de los equipos y la

documentación de los errores y accidentes.

Para describir los componentes de un sistema de calidad, se utilizan los criterios de la

Organización Internacional de Estandarización (ISO).

En el presente trabajo se aplican los principios básicos inmunológicos para el estudio

de los antígenos presentes en los elementos formes de la sangre y su comportamiento

serológico. Se presentan las técnicas importantes del estudio de los grupos sanguíneos y

sus anticuerpos, que ayudan a que la transfusión sanguínea se convierta en un

procedimiento seguro y confiable.

El Manual de Procedimientos para Inmunohematología Banco de Sangre. Fue realizado

después de sintetizar la información necesaria para obtener un trabajo escrito que, de

forma sencilla incluí los conceptos y procedimientos que se realizan de manera rutinaria

en el departamento donde laboro. Esta herramienta se presenta actualizada

bibliográficamente y sobre todo haciendo hincapié en los métodos y equipos modernos

utilizados.

Gracias a la experiencia que se me ha permitido obtener durante más de cinco años en el

Servicio de Medicina Transfusional puedo decir que los Bancos de Sangre tienen como

principal preocupación el uso correcto de los componentes de la sangre, la cual tiene

un amplio uso en hemoterapia así como en la industria médico-farmacéutica, por lo que

debe estar libre de agentes infecciosos. Aunque el uso de este componente contribuye a

salvar numerosas vidas, también puede convertirse en un riesgo potencial para la salud

cuando no está sometida a un estricto control de calidad.

Con mucho entusiasmo puedo comentar que el laboratorio de inmunohematología es

sobradamente variado e interesante, en donde los estudiantes de la carreta de Químico

Farmacéutico Biólogo nos podemos desenvolver ampliamente gracias a la seguridad

obtenida durante formación universitaria. Mi trabajo me ha permito un crecimiento

significativo, ya que cada día la aplicación de la ética y responsabilidad dejan un buen

sabor de boca, considero que al ser parte del área laboral del sector salud ponemos un

granito de arena para contribuir a salvar una vida.

manual de procedimientos para inmonologÍa. banco de sangre

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