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MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO EN BIOGENÉTICA

Claudia Elena Espinal-Correa (Compiladora)

Universidad Cooperativa de Colombia Sede Medellín

Documentos de docencia | Course Work

coursework.ucc.edu.co No. 14, diciembre, 2015

http://dx.doi.org/10.16925/greylit.1084

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Acerca del compilador

Claudia Elena Espinal-Correa es profesora de tiempo completo de la Facultad de

Medicina de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín, Colombia.

Correo electrónico:

Cómo citar este documento Espinal-Correa, C. E., Gómez-Gallego, D. M., Ossa-Giraldo, A. C. y Solarte, V.

(2015). Manual de prácticas de laboratorio en biogenética. (Documento de

docencia No. 14). Bogotá: Ediciones Universidad Cooperativa de Colombia. doi:


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Internacional. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/


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http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

RESUMEN

La presente obra es el resultado de un esfuerzo académico que busca compendiar, a

la luz de las habilidades y destrezas de los futuros profesionales de Ciencias de la

Salud de la Universidad Cooperativa de Colombia, los conceptos de las ciencias

básicas anclados a los conceptos específicos de la práctica clínica profesional,

aminorando el divorcio histórico con las mal llamadas ciencias duras (biología,

química, física). Las ciencias básicas constituyen un soporte conceptual sobre el cual

se edifica la compresión holística del individuo como unidad orgánica –fisiológica–

psicológica y social; de su interacción resulta la fascinante complejidad de lo

viviente, complejidad cuyos parámetros de normalidad y patología son el soporte

sobre el cual trabaja el personal profesional de la salud. Formular entonces las

competencias a desarrollar en el futuro personal de salud en áreas como la

biogenética, articulado a ambientes prácticos de aprendizaje inteligentemente

diseñados para ello, aminora el divorcio académico entre básicas y clínicas y

robustece la formación académica que como institución nos ha sido dado llevar a

cabo .

Palabras clave: cultivos celulares, dermatoglifos, genealogía sanguínea, cariotipo,

electroforesis, anticancerígeno

TABLA DE CONTENIDO

Introducción • 5

Capítulo 1: Evaluación de un medicamento anticancerígeno mediante un cultivo celular in vitro • 7

8|| Metodología

8|| Temario que lo apoya

8|| Objetivos

8|| Fundamento teórico

11|| Descripción de la actividad a realizar

16|| Ejercicio de aplicación

17|| Bibliografía.

Capítulo 2: Genealogía sanguínea • 19 20|| Temario que lo apoya

20|| Objetivos



25|| Bibliografía

Capítulo 3: Dermatoglifos • 27 28|| Temario que lo apoya

28|| Objetivos



43|| Bibliografía

Capítulo 4: Extendidos cromosómicos • 45 46|| Temario que lo apoya

46|| Objetivos



50|| Bibliografía

Capítulo 5: Cariotipo • 51 52|| Objetivos



60|| Bibliografía

Capítulo 6: Biología molecular aplicada a la clínica: extracción de ADN, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y electroforesis de ADN • 63

64|| Metodología

64|| Temario que lo apoya

64|| Objetivos



77|| Ejercicio de aplicación

79|| Bibliografía

Anexos • 81

Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética

5

INTRODUCCIÓN

itar la formación médica por competencias implica no solo un marco conceptual

sobre el cual estas se sustentan, sino formular un componente que haga referencia a

las habilidades prácticas en el marco del desempeño profesional del médico.

Además, implica que la dotación de habilidades prácticas también están enmarcadas en el

cumplimiento de normas legales vigentes que regulan el área del diagnóstico clínico y las

pruebas clínicas que ello requiere.

Introducir al estudiante en la adquisición de habilidades que le permitan un adecuado

manejo del componente clínico durante su práctica profesional, en el área de la genética

clínica y molecular, implica regirse por los acuerdos normativos del Ministerio de Salud

Nacional, que reglamenta y da potestad a los profesionales de la salud para hacer uso de los

diagnósticos genéticos específicos para la determinación de patologías de origen

cromosómico, todas aquellas ligadas al cromosoma X y al cromosoma Y, y las ligadas a

leucemias.

En este orden de ideas se inscribe el presente manual, con el propósito de articular las

conceptualizaciones teóricas en un contexto práctico que garantice el desarrollo de

habilidades diagnósticas de interpretación de pruebas genéticas y técnicas moleculares,

estas últimas como herramienta diagnóstica.

Así pues, la competencia específica y la conclusión de este componente práctico

quedan adscritas al desarrollo de las habilidades necesarias para reconocer patologías

genéticas, de tal suerte que en su práctica profesional diaria el médico general pueda contar

con los elementos conceptuales y prácticos para tomar una decisión adecuada en la

anamnesis, el diagnóstico, el pronóstico, la elección y la interpretación acertada de los

resultados de las pruebas diagnósticas remitidas.

La competencia específica adquirida hace parte de aquella formulada en el plan de

curso de esta, así como la evidencia, número de créditos y temas.

Con el presente manual de prácticas de laboratorio se pretende que el estudiante de

pregrado de Medicina de la Universidad Cooperativa de Colombia tome el curso y sus

prácticas obedeciendo a las siguientes competencias previas y desarrollando las que debe

adquirir, como son:

1. Identificar las estructuras de los seres vivos que les permiten desarrollarse en un

entorno y que puedo utilizar con criterios de clasificación.

2. Identificar condiciones de cambio y de equilibrio en los seres vivos y en los

ecosistemas.

C


6

3. Explicar la variabilidad en las poblaciones y la diversidad biológica como

consecuencia de estrategias de reproducción, cambios genéticos y selección

natural.

4. Identificar aplicaciones de algunos conocimientos sobre la herencia y la

reproducción al mejoramiento de la calidad de vida de las poblaciones.

5. Comprensión lecto-escritora.

6. Comunicación grupal asertiva.

7. Uso de las tecnologías de la información y la comunicación (TIC).

La competencia específica a desarrollar es la siguiente: “explicar los determinantes

biológicos y genéticos inherentes a la condición de normalidad para establecer los estados

de salud enfermedad a partir de los conocimientos avalados por la comunidad científica”.

Ser competentes en este sentido implica:

Clasificar los componentes celulares, sus funciones y patologías asociadas.

Diferenciar los componentes de la genética mendeliana y no mendeliana.

Identificar los principios básicos de técnicas de diagnóstico molecular.

Justificar el empleo de técnicas moleculares en las ciencias de la salud.

Utilizar técnicas de diagnóstico molecular.

Las prácticas son el apoyo y la extensión del curso de Biogenética, el cual está

diseñado para proveer a los programas de Ciencias de la Salud de las conceptualizaciones

científicas pertenecientes a las ciencias básicas, fundamentando el quehacer disciplinar de

los programas adscritos con el método científico desarrollado en disciplinas como la

biología, la genética y la biología molecular, lo que permite un alcance académico de

mayor impacto.

Las prácticas proporcionan a los estudiantes de las ciencias de la salud las

herramientas analíticas necesarias para comprender la relación entre los procesos biológicos

a nivel celular, y su incidencia en el desarrollo de patologías o en el mantenimiento de la

homeostasis corporal. Las prácticas están organizadas en sesiones consecutivas, las cuales

se realizarán en los laboratorios de biología molecular o laboratorios multifuncionales o

similares de la Universidad Cooperativa de Colombia. Cada sesión está estructurada con

una breve introducción teórica de los conceptos más importantes y básicos, necesarios para

la mejor comprensión y desarrollo de la parte experimental que se hará a continuación.

Dicha parte experimental consta de actividades individuales o en grupo. Así mismo, al final

de cada sesión, el profesor puede suministrar un cuestionario que ayudará a consolidar los

aspectos prácticos más relevantes de la sesión.

Para el buen aprovechamiento de las prácticas se debe leer previamente el tema a

desarrollar, el cual puede ser objeto de evaluación. Además, el docente debe de evaluar y

realizar un control de asistencia de los estudiantes.


7

Capítulo 1

Evaluación de un medicamento anticancerígeno mediante un cultivo celular in vitro

Diana Maryory Gómez-Gallego*

Resumen

Los cultivos celulares son una serie de técnicas que permiten aislar, mantener y

multiplicar células in vitro (“en vidrio”= en recipientes en el laboratorio). Los

cultivos celulares son una herramienta esencial en diversas investigaciones y

aplicaciones biomédicas, se usan por ejemplo en la evaluación de la actividad o

toxicidad de sustancias y fármacos. El objetivo de esta práctica es explicar los

principios básicos sobre las técnicas de cultivos celulares y aclarar por qué el efecto

de un fármaco en el ciclo celular puede ser evaluado mediante estos. Para lograrlo,

se realizarán dos sesiones de laboratorio, en la primera cada equipo de estudiantes

hará su propio cultivo celular manejando técnica aséptica; estos cultivos serán

sometidos al fármaco anticancerígeno, se cosecharán y las células se gotearán en una

placa. En la segunda sesión se realizará un cálculo de índice mitótico (mediante

conteo de la placa), con el cual el estudiante establecerá el efecto del fármaco.

Palabras clave: cultivo celular, cultivo primario, línea celular, ciclo celular,

fármaco anticancerígeno, colcemid.

* Ingeniera biológica y estudiante de maestría en Microbiología y Bioanálisis. Profesora instructora de la

Facultad de Medicina de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín, Colombia. Correo electrónico: [email protected].

mailto:[email protected]


8

Metodología Se llevará a cabo en dos momentos o sesiones diferentes.

Temario que lo apoya Ciclo celular y anticancerígenos.

Objetivos

General Establecer los principios básicos por los cuales una sustancia bioactiva con posibles

efectos anticancerígenos puede ser evaluada mediante cultivos celulares in vitro.

Específicos Evaluar el efecto sobre el ciclo celular de linfocitos de una droga

anticancerígena.

Determinar el efecto de la droga anticancerígena.

Establecer el principio por el cual una droga anticancerígena, que tenga efecto

de acumulación en el ciclo celular, determina su actividad anticancerígena.

Fundamento teórico

Cultivos celulares

“Los cultivos celulares han constituido una fuente de

conocimiento extraordinaria en un amplio abanico de

especialidades de las ciencias básicas y aplicadas a la salud.

Se trata de un conjunto de técnicas que están contribuyendo

de forma decisiva al avance de las ciencias biomédicas por

su aplicaciones diagnósticas e incluso terapéuticas y que

permiten encarar nuevas líneas de investigación orientadas

hacia la industria farmacéutica, la agricultura, la

toxicología, etc.” [1]

Actualmente se entiende por cultivo celular el conjunto de técnicas que permiten el

sostenimiento de células in vitro en condiciones especiales propicias para su

supervivencia y multiplicación, manteniendo al máximo sus propiedades

metabólicas, fisiológicas, bioquímicas y genéticas [2].

El cultivo de células de mamífero nació como una valiosa herramienta de

investigación en 1950 cuando la primera línea celular, HeLa, fue exitosamente


9

cultivada a partir de células humanas de cáncer de cérvix. Sin embargo, fue solo

hasta mediados de 1980 que cultivos reproducibles y confiables de células de

mamífero fueron logrados [3].

El desarrollo del cultivo de células ha dado lugar a nuevas aproximaciones

experimentales sobre la fisiología celular, en las cuales las células aisladas y

funcionalmente diferenciadas pueden ser mantenidas en cultivo en condiciones que

permiten la manipulación directa de su medio ambiente y la medición de los

cambios resultantes en la función de un solo tipo de células [3].

Tipos de cultivos celulares

Los cultivos de células animales pueden clasificarse según su capacidad de

adherencia, y según si han sido recientemente aisladas de un órgano determinado o

proceden de células que hayan experimentado algún tipo de transformación.

Según su capacidad para crecer adheridas o no a una superficie determinada, lo

que está muy relacionado con el tipo de célula de la cual derivan, pueden clasificarse

en:

Cultivo en monocapa: generalmente provienen de órganos. Forman una

monocapa que cubre la superficie del recipiente en que están en crecimiento y

su multiplicación es inhibida cuando establecen contacto entre sí.

Cultivo en suspensión: corresponde a células que crecen en medio líquido sin

unirse a una superficie.

Cultivo primario: cuando proviene de células que han sido recientemente

disgregadas de su tejido u órgano original.

Líneas celulares: están constituidas por células que se diferencian genética y

morfológicamente de las células originarias. Pueden provenir de un cultivo

primario sometido a procesos de transformación o de células derivadas de

tumores. Tienen una capacidad ilimitada de división [2, 4].

Aplicaciones de los cultivos celulares

Actividad intracelular: replicación y transcripción del DNA, síntesis de

proteínas, metabolismo energético, metabolismo de fármacos, ciclo celular,

diferenciación, apoptosis.

Flujo intracelular: procesamiento del RNA, receptores de hormonas y su

resultante señal de traducción, tráfico de membrana, flujo de metabolitos,

movilización de calcio, transducción de señal.

Farmacología: acción de una droga, interacciones ligando receptor, resistencia

a un fármaco.

Inmunología: epítopos de la superficie celular, hibridomas, citoquinas y

señalización, inflamación.

Genómica: análisis genéticos, transfección, infección, transformación,

inmortalización, senescencia.

Ingeniería de tejidos: constructos de tejidos, matrices y “scaffolds”, células

madres, propagación, diferenciación.


10

Toxicología: infección, citotoxicidad, mutagénesis, carcinogénesis, irritación,

inflamación.

Interacciones célula-célula: morfogénesis, control paracrino, cinética de la

proliferación celular, cooperación metabólica, adhesión celular y

motricidad, modelos organotípicos para prótesis médicas e invasión.

Productos y secreciones celulares: proteómica, biotecnología, diseño de

biorreactores, etc. [4].

El desarrollo de los cultivos celulares se debió en gran parte a las necesidades

de las dos principales ramas de la investigación médica: la producción de vacunas

antivirales y el estudio de las neoplasias [4].

Requerimientos para un óptimo crecimiento celular

Requerimientos nutricionales

Medios de cultivo: compuesto que brinda a las células los nutrientes esenciales balanceados

cuantitativamente. Contiene aminoácidos, hidratos de carbono, iones inorgánicos,

vitaminas, entre otros.

Suero: compuesto no definido que tiene una gran variedad de componentes con actividad

promotora del crecimiento celular.

Requerimientos fisiológicos

Temperatura: generalmente 37°C

pH: entre 7,2 y 7,4

Tensión de gas (CO2): generalmente 5%

Presión osmótica: Isoosmótica

Humedad relativa: cercana a la saturación (95%)

Requerimientos ambientales

Esterilidad

Técnica aséptica

Esterilización

Antibióticos y fungicidas

Frascos de cultivo [5, 6]

Ciclo celular y cáncer

El ciclo celular representa un proceso fisiológico controlado por medio del cual una célula

se divide para formar dos células hijas. Gracias a este proceso los tejidos crecen en los

organismos pluricelulares. En un organismo en homeóstasis, el equilibrio entre

proliferación y muerte celular programada (apoptosis) se mantiene regulado para garantizar

la integridad de los órganos y de los tejidos del cuerpo.


11

El término cáncer denota un muy amplio y complejo grupo de enfermedades que se

caracterizan por alteraciones del ciclo celular que conducen finalmente a la destrucción de

estos procesos fisiológicos coordinados, lo que tiene como consecuencia un descontrol

celular que ocasiona una proliferación autónoma, desordenada, irreversible y progresiva

[7].

Fármacos anticancerígenos

Diferentes agentes químicos han sido utilizados para el tratamiento del cáncer durante cinco

décadas y todavía siguen teniendo un papel importante. Durante este tiempo, muchas

drogas con diversos mecanismos de acción han sido sintetizadas y adaptadas para uso

clínico.

La mayoría de fármacos quimioterapéuticos anticáncer que se usan en clínica

incluyen agentes que atacan específicamente el ciclo celular con el fin de inhibir el estado

de hiperproliferación de las células tumorales y luego inducir la apoptosis, que es el

resultado deseado de la quimioterapia [8]. Basados en su modo de acción, estos fármacos

quimioterapéuticos pueden subdividirse en grupos distintos: 1) fármacos que interfieren con

la síntesis de ADN; 2) fármacos que introducen daño en el ADN; y 3) fármacos que inhiben

la función del huso mitótico [8-10].

La separación precisa de los cromosomas replicados para ser repartidos a las células

hijas durante la mitosis depende de la formación de un huso bipolar compuesto

principalmente de los microtúbulos (MT). Dado que los MT son estructuras altamente

dinámicas cuya organización espacial es fundamental para la función correcta del huso, los

agentes físicos y químicos que interfieren con el comportamiento de los MT interrumpen

infaliblemente la mitosis [11, 12].

Quizás el más notable de estos agentes químicos es la colchicina, derivada de las

plantas del género Colchicum. La colchicina y su análogo colcemid (menos tóxico) han

sido conocidos por ser potentes inhibidores de la división celular a través de sus efectos

sobre el ensamblaje del huso: este compuesto se une a los monómeros de alfa y beta

tubulina inhibiendo la polimerización de los MT. Dado que la despolimerización no se ve

afectada, el huso mitótico se disocia rápidamente o no se forma y las células se acumulan

en un estado de metafase, en muchos casos por un período prolongado, parando el ciclo

celular [11-13].

Descripción de la actividad a realizar

Primera sesión: cultivo celular primario

Materiales y reactivos

Reactivos

Medio de cultivo RPMI 1640 + glutamax

Suero fetal Bovino _ México


12

Antibiótico: 10.000 und/ml penicilina; 10.000 µg/ml de streptomicina

L-glutamina 200 mM

Phitohemaglutinina (PHA) (10 µg/ml)

Alcohol etílico 70%

Materiales

Frasco de cultivo T25 falcón

Toallas desechables

Pipeta estéril de 10 mL

Pipeteador

Gradilla para tubos vacutainer

Muestra

1 mL de sangre periférica

Equipos

Cámara de flujo laminar vertical

Incubadora de CO2

Microscopio invertido

Micropipeta y puntas de 100-1000 µL

Micropipeta y puntas de 20-200 µL

Equipo de seguridad personal requerido

Pijama institucional

Bata de laboratorio para fluidos limpia

Tapabocas

Guantes de látex/vinilo

En el caso de personas con cabello largo, sujetador de cabello

Tiempo estimado

20 minutos.

Procedimiento

1. Verificación de condiciones de asepsia, esterilidad y requerimientos para efectuar el

procedimiento de cultivo celular (hecho por el analista del laboratorio).

2. Inicio de la práctica para los estudiantes: desplazamiento del analista con los estudiantes

al cuarto de cultivo.

3. Dentro de la cámara de flujo laminar se realiza lo siguiente:

Adicionar 8,2 ml de medio de cultivo previamente atemperado a 37°C al frasco de

cultivo.


13

Adicionar 1 ml de sangre periférica.

Adicionar 0,5 ml de suero fetal bovino.

Adicionar 0,1 ml de antibióticos.

Adicionar 0,1 ml de l-glutamina.

Adicionar 0,1 ml de PHA al frasco de cultivo.

Agitar suavemente y llevar a la incubadora de CO2 por 72 horas, con las siguientes

condiciones: 37,5°C, 5% CO2.

Segunda sesión: reconocimiento de mitosis e índice mitótico


Muestra

Placa con extendidos cromosómicos de la práctica anterior. Recuerde que aquí encontrará

placas con mitosis normales y placas cuyo índice mitótico ha variado por efecto de la droga

anticancerígena; lo anterior se mide con el cálculo del índice mitótico.

Equipos

Microscopio


Bata de laboratorio limpia

Tiempo estimado

2 horas.

Procedimiento

Previo a esta sesión, y tras 71 horas de cultivo, el analista del laboratorio agregará a la

mitad de los cultivos 0,1 mL de la droga anticancerígena y dejará la otra mitad sin el

fármaco. Trascurrida una hora procederá a cosechar la muestra: lavado, centrifugado (para

concentrarlas), hipotonización, fijación, goteo en láminas portaobjetos, tinción y

conservación de las placas.

A los estudiantes en grupos de a cinco se les entregará las placas con extendidos

cromosómicos para observar lo que se describe a continuación, y, con ello, harán el cálculo

en dichas placas del índice mitótico, que finalmente es lo que indica el efecto de la droga

anticancerígena.

Haciendo un uso correcto del microscopio, colocar la placa para empezar a

observarla. Comience un barrido de la placa ordenadamente, como se indica en la figura 1.

13


14

Figura 1. Correcto barrido de la placa con extendidos cromosómicos. Laboratorio de

Biología Molecular, Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín

a) Identificación de núcleos activos (color rosado-violeta) e inactivos (color morado). La

principal diferencia es el tamaño; las células que se encontraban en el momento de la

obtención de cromosomas en actividad, presentan núcleos más grandes que las que no

estaban activas en el ciclo celular. Por otra parte, la coloración de los núcleos

inactivos es más intensa.

b) Identificar metafases y, en ellas, distinguir la morfología de los cromosomas.

c) Una vez identificadas las diferentes estructuras a encontrar en la placa, proceda a

calcular el índice mitótico, contando 500 núcleos (entre metafases, núcleos activos y

núcleos inactivos).

IM = Metafases

x 100 (1) Núcleos totales

Núcleos totales= Núcleos activos + Núcleos inactivos + Mitosis= 500

Recordar: la observación en el microscopio debe empezarse en el objetivo de menor valor

(4x), para empezar a enfocar e identificar campos adecuados. Debe pasarse luego al

objetivo de 10x (imagen 1) y por último al de 40x (imagen 2), en el cual se hará el conteo e

identificación de estructuras.


15

Figura 1. Extendidos cromosómicos de linfocitos T humanos. Aumento 10x. Tomada en el

Laboratorio de Biología Molecular, Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín

Figura 2. Extendidos cromosómicos de linfocitos T humanos. Aumento 40x. Tomada en el

Laboratorio de Biología Molecular, Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín


16

Ejercicio de aplicación

En la búsqueda de nuevas posibilidades terapéuticas para el tratamiento del cáncer, que

minimicen los efectos colaterales, se han reportado numerosos hallazgos que demuestran

la actividad antitumoral de extractos derivados diferentes especies de macroalgas marinas.

En un trabajo experimental realizado por un grupo multidisciplinar de científicos se

evaluó el efecto antitumoral del extracto de dos especies de macroalgas; específicamente se

realizó una evaluación sobre el efecto en el ciclo celular en células cancerígenas aisladas y

cultivadas de una biopsia de un paciente con diagnóstico de cáncer de encía.

Metodología

Las células en fase exponencial de cultivo fueron tratadas con 20 µg/mL de los diferentes

extractos por un tiempo de 4 horas, al término del cual se detuvo la acción de los extractos

mediante un lavado con medio de cultivo y posterior cosecha de las células (sedimentación,

hipotonización, fijación, goteo en láminas portaobjetos y tinción de las placas). Posterior a

esto, se hace un análisis de índice mitótico mediante recuento en placa (ecuación 1), usando

un microscopio con el objetivo de 40x. Se contaron 1000 células en total por cada

tratamiento utilizado (cada uno de los 2 extractos de algas marinas). Además de los

extractos, se usó como control positivo células tratadas con colcemid, un agente inhibidor

del ciclo celular, y como control negativo, células sin ningún tratamiento.

Resultados

La figura 3 resume los hallazgos encontrados.

Figura 3. Índice mitótico (IM) de los diferentes tratamientos. Elaboración propia.

0%

5%

10%

15%

20%

25%

Controlnegativo

Colcemid Extracto 1 Extracto 2

Índi

ce m

itótic

o (I

M)

Tratamiento

Índice Mitótico (IM) de los diferentes tratamientos


17

Análisis

Según los resultados anteriores, responda:

1. ¿Los extractos 1 y 2 tienen efecto en el ciclo celular? ¿Por qué?

2. ¿Cuál fue el agente (colcemid, extracto 1 o extracto 2) que presentó mayor efecto de

inhibición o bloqueo del ciclo celular? ¿Por qué?

3. ¿Sobre qué fase del ciclo celular están actuando los extractos 1 y 2? ¿Por qué?

Bibliografía

[1] Gil-Loyzaga, PE. Cultivo de Células Animales y Humanas. Aplicaciones en

Medicina Regenerativa. Madrid: Visión Libros; 2011.

[2] Pontificia Universidad Javeriana. Cultivos celulares. Bogotá D.C. Disponible en:

http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/c

ultvos.htm.

[3] Meleday P, O´Connor R. General Procedures for Cell Culture. En: Celis J, Carter

N, Simons K, Small J, Hunter T, Shoton D, editores. Cell Biology. Filadelfia:

Elsevier Science; 2007. p. 13-20.

[4] Freshney R. Culture of Animals Cells: A manual of basic technique. 4ª ed. New

York: Wiley-Liss; 2000.

[5] Rooney D., Czepulkowski B. Human cytogenetics: a practical approach.

Washington DC: Oirl Press; 1987.

[6] Howe B, Umrigar A, Tsien F. Chromosome preparation from cultured cells. JoVE.

2014; (83).

[7] Meza-Junco J, Montaño-Loza A, Aguayo-González A. Bases moleculares del

cáncer. Rev. invest. clín. 2006 Feb; 58(1): 56-70. Disponible en:

http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-

83762006000100008&lng=es

[8] Schmidt M, Bastians H. Mitotic drug targets and the development of novel anti-

mitotic anticancer drugs. Drug Resist Updates. 2007; 10(4-5): 162-81.

[9] Lee S, Schmitt CA. Chemotherapy response and resistance. Curr. Opin. Genet.

Dev. 2003; 13(1): 90-6.

[10] Jackson MA, Stack HF, Waters MD. Genetic activity profiles of anticancer drugs.

Mutat Res-Fund Mol M. 1996; 355(1-2): 171-208.

[11] Kirsch-Volders M, Parry EM. Genetic toxicology of mitotic spindle inhibitors used

as anticancer drugs. Mutat Res-Fund Mol M. 1996; 355(1-2): 103-28.

[12] Rieder CL, Palazzo RE. Colcemid and the mitotic cycle. J Cell Sci. 1992; 102(3):

387-92.

[13] Jha MN, Bamburg JR, Bedford JS. Cell cycle arrest by colcemid differs in human

normal and tumor cells. Cancer Res. 1994; 54(18): 5011-5.


18


19

Capítulo 2

Genealogía sanguínea

Víctor Alfonso Solarte-David*

Resumen

Los patrones heredables sanguíneos en las familias constituyen una herramienta

elemental en el análisis de la herencia. Dichos patrones genealógicos sanguíneos son

predecibles y obedecen a los postulados de la genética mendeliana para un carácter o

para alelos múltiples, los cuales determinan el tipo de sangre ABO, ilustrando los

conceptos de dominancia, codominancia y recesividad. La genealogía sanguínea

permite establecer características heredables, útiles en trasplantes, compatibilidad

gestacional y enfermedades, entre muchas otras aplicaciones en áreas como la

epidemiologia. Los patrones sanguíneos en una familia pueden ser fácilmente

analizados mediante la construcción de un árbol sanguíneo genealógico, para lo cual

solo se requieren los datos documentados de los grupos sanguíneos y, en algunos

casos, la hemoclasificación.

Palabras clave: alelo, dominancia, codominancia, recesividad.

* Ingeniero biomédico, especialista y magíster en Biotecnología y doctor en Ciencias Biomédicas de la

Universidad Nacional de Colombia. Actualmente es profesor de tiempo completo de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín, Colombia. Correo electrónico: [email protected].



20

Temario al que apoya

Herencia mendeliana y no mendeliana.

Objetivos

Objetivo general

Reconocer las características heredables de tipo sanguíneo según las leyes de Mendel.

Objetivos específicos

1. Realizar la práctica de hemoclasificación.

2. Construcción de un árbol genealógico.

3. Evaluar estadísticamente la probabilidad de la heredabilidad del tipo sanguíneo.

Fundamento teórico

Los llamados grupos sanguíneos humanos obedecen a una clasificación sanguínea en

concordancia con las características de los grupos proteicos ABO o Rh presentes o no en la

membrana de los glóbulos y en el suero. Dicho sistema de clasificación se ha mantenido a

lo largo de las ciencias biomédicas por hechos y registros que datan desde la antigüedad,

según Echeverry [1]. El descubrimiento del sistema ABO se le atribuye a Karl Landsteiner

en 1901, quien recibió el Premio Nobel de Fisiología en 1930 por sus trabajos en la

caracterización de los tipos sanguíneos o sistema ABO. Su denominación de grupos o

sistema proviene de los tres tipos de grupos proteicos identificables en las superficie de los

glóbulos rojos: antígeno “A”, antígeno “B”, o ninguno de los anteriores “O”. Su

conocimiento, papel y efecto en los sistemas humanos radica principalmente en que de ellos

depende el éxito de transfusiones sanguíneas, como lo afirman Lefrere y Berche [2].

En la mayoría de los casos, cada individuo con un grupo sanguíneo porta anticuerpos

contra los antígenos leucocitarios que no posee, de ahí la reacción inmunitaria al ser

transfundido con grupos sanguíneos denominados incompatibles (de diferente tipo

sanguíneo), dando lugar a situaciones de riesgo, tales como hemólisis, anemia, fallo renal,

shock o muerte. El mecanismo mediante el cual se generan anticuerpos contra un antígeno

al que nunca se ha sido expuesto aún no está completamente dilucidado, sin embargo, hay

supuestos teóricos que sostienen que algunos antígenos bacterianos son lo bastante

similares a los antígenos A y B y son estos anticuerpos los que reaccionan contra los

glóbulos rojos incompatibles tras una transfusión, según Kirkwood y Lewis [3].

La heredabilidad de los grupos sanguíneos sigue la dinámica de la llamada herencia

mendeliana para un carácter; los grupos sanguíneos son heredados de los progenitores y

controlados por un solo gen llamado ABO, localizado en el cromosoma 9 (9q34.1-q34.2).

Esta heredabilidad se rige por un sistema de alelos múltiples (L) que determina la presencia

de los aglutinógenos en los glóbulos rojos, y que son los siguientes:


21

LA, que determina el aglutinógeno A.

LB, que determina el aglutinógeno B.

LO, que no determinan aglutinógeno alguno.

Los alelos múltiples que determinan el tipo de sangre ABO permiten ilustrar los

conceptos de dominancia, codominancia y recesividad, lo que explica que las personas

posean tipos sanguíneos AA, AB, BB, AO, BO, OO, con base en la recombinación alélica de sus

padres.

Los individuos tipificados con el grupo sanguíneo A poseen glóbulos rojos que

expresan proteínas antigénicas de tipo A en su superficie, y anticuerpos contra los antígenos

B en el suero de su sangre. Caso contrario, los individuos tipificados con el grupo

sanguíneo B poseen glóbulos rojos que expresan proteínas antigénicas de tipo B en su

superficie y anticuerpos contra los antígenos A en el suero de su sangre. Los individuos con

sangre del tipo O no expresan ninguno de los dos antígenos (A o B) en la superficie de sus

glóbulos rojos, pero pueden producir anticuerpos contra ambos tipos; en cambio, los

individuos tipificados AB expresan ambos antígenos en su superficie y no producen ninguno

de los dos anticuerpos. Con base en lo anterior, el tipo O puede ser transfundido sin ningún

problema a cualquier persona donante de sangre con cualquier tipo sanguíneo del grupo

ABO y el tipo AB puede recibir sangre de cualquier donante, todo esto teniendo en cuenta el

grupo Rh, como lo anotan Dodd, Lincoln y Soto [4].

Dipta y Hossain afirman que existen otros tipos de grupos sanguíneos, tales como

Bombay, el cual es poco frecuente y en este se heredan dos genes recesivos del tipo hh en

correspondencia con el fenotipo denominado Oh, y, por tanto, no producen la proteína H

que es la precursora de los antígenos A y B. De esta forma, no supone ningún problema la

presencia de anticuerpos A o B en el suero pues los antígenos respectivos no son

producidos al no existir su precursor. Las personas con este grupo sanguíneo, sin embargo,

sí producen anticuerpos para H, el cual está presente en los glóbulos rojos excepto en

aquellos con fenotipo hh, por tanto solo son compatibles con donantes del mismo tipo hh.

Es decir, las personas con el grupo sanguíneo con el fenotipo Bombay pueden ser

únicamente transfundidas con personas del mismo grupo sanguíneo [5].

Factor Rh

El factor Rh (encontrado en el mono Rhesus, de ahí su nombre factor Rh) fue descubierto

por Karl Landsteiner y Wiener en 1940. El factor Rh, al igual que los antígenos

eritrocitarios, se define como una proteína estructural de membrana anclada a las células

sanguíneas dándoles una entidad particular y que, como ABO, tiene la condición de ser

aglutinógena de los glóbulos rojos; dicha proteína es codificada por la acción de 3 genes

alelos. Se define como individuos con fenotipo Rh positivo aquellos que expresan el

antígeno D en sus eritrocitos y Rh negativo quienes no presentan este antígeno (el 85% de

la población lo posee aproximadamente). Existen variaciones o polimorfismos en la

http://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna


22

secuencia de aminoácidos de esta proteína, identificándose más de 45 variantes antigénicas

del factor Rh, lo que da lugar a diferentes tipos poblacionales, según Kirkwood y Lewis [3].

Su importancia radica en los procesos de transfusión clínica, de ahí que el

conocimiento previo de estas características proteicas eritrocitarias en los pacientes sea

fundamental para no poner en riesgo la vida. La transfusión de sangre de un individuo Rh+

a un Rh- conduce a la formación, lo que conlleva a la aglutinación de la sangre y, por tanto,

a la formación de coágulos en el torrente sanguíneo. De igual modo, se puede producir una

reacción inmunitaria en el caso de las mujeres gestantes al momento del parto por

diferencias entre el factor Rh de la madre en relación con el del hijo; si la madre es Rh- y el

feto es Rh+ y posee los anticuerpos contra Rh+, puede destruir las células Rh+ del feto. En

este caso se recomienda que si la madre decide tener un segundo hijo deberá someterse a

tratamientos que limiten los anti-Rh [6].

Genograma

El patrón de segregación o heredabilidad de los antígenos del sistema ABO y del Rh a nivel

familiar es importante y útil en el campo de la genética médica ya que, desde el punto de

vista de las probabilidades, muestra mediante los llamados genogramas (o mapas

genealógicos) una correlación hereditaria de estos genotipos y fenotipos. La construcción

de un genograma consiste en un formato que permite dibujar un árbol genealógico que

registra información sobre los miembros de una familia y la relación entre sus generaciones

cercanas, mostrando características hereditarias específicas que se quieran rastrear. Para su

creación se hace uso de símbolos cuyo reconocimiento, interpretación y uso es conocido y

avalado por la comunidad científica [7, 8].

En la tabla 1 se muestran los simbolismos más importantes para construir un

genograma [8].

Tabla 1. Simbolismos utilizados en la construcción de genogramas

Símbolo Significado

Hombre

Mujer

Sujeto principal

Fallecido

Embarazo

Muerte al nacer

Aborto espontaneo

Aborto inducido

Adoptado

Mellizos (igual en mujeres)


23

Gemelos (igual en mujeres)

Nota. McGoldrick y Gerson [8]



Información de grupos sanguíneos familiares.


Ninguno.

Tiempo estimado

1 hora y 45 minutos.

Genograma familiar

Recopilar en lo posible la mayor cantidad de información familiar tras las generaciones con

su correspondiente tipo sanguíneo personales y construir el genograma. Indique las

probabilidades de heredabilidad al tipo de sangre en cada persona, edad y si presenta

patologías que puedan asociarse a la herencia, entre otros que usted considere pertinentes.

Ejercicios

Analiza los siguientes casos clínicos.

Caso 1.

En el siguiente árbol genealógico (figura 1) realizado a un mamífero con cariotipo 60, XY

(XX: hembra, XY: macho), se indica la transmisión de una anomalía genética (ilustrada con

los círculos y cuadrados en color gris), la cual lleva a una enfermedad neurodegenerativa en

su adultez. Estudios clínicos muestran que la anomalía se produce por un solo gen ligado al

sexo, y está situado en el cromosoma X.


24

Figura 1. Árbol genealógico. Elaboración propia.

1. Explica si la anomalía es de tipo dominante o recesivo.

2. Indica los posibles genotipos para los individuos con la anormalidad (letra “A” para

alelo dominante, letra “a” para alelo recesivo).

3. Contando solo son la información dada en este caso, ¿considera usted que el carácter

podría ser autosómico?

4. ¿Qué recomendaciones daría usted a una pareja que desea tener hijos, si se sabe que en

la familia por parte de la mujer se presenta esta anomalía genética?

5. Si el padre tiene el síndrome y la madre no, ¿qué probabilidad tiene el hijo de padecer el

síndrome?

Caso 2

El siguiente árbol genealógico (figura 2) muestra en gris personas albinas. A partir de este

establecer si el albinismo está determinado por un gen dominante o recesivo y si está ligado

o no al sexo.

Figura 2. Árbol genealógico. Elaboración propia


25

Bibliografía

[1] Echeverry MA. Grupo sanguíneo y factor Rh en los vascos. Buenos Aires: s.n.; 1949.

[2] Lefrere JJ, Berche P. Karl Landsteiner discovers the blood groups. Transfus Clin

Biol. 2010 (Feb); 17(1): 1-8.

[3] Kirkwood EM, Lewis CJ. Inmunología médica básica. 2 ed.; 1990.

[4] Dodd BE, Lincoln PJ, Soto A. Inmunología de los grupos sanguíneos. México: El

manual moderno; 1976.

[5]

Dipta TF, Hossain AZ. The Bombay blood group: are we out of risk? Mymensingh

Med J. 2011 (Jul); 20(3): 536-40.

[6] Scheffer PG, de HM, van der Schoot CE. The controversy about controls for fetal

blood group genotyping by cell-free fetal DNA in maternal plasma. Curr Opin

Hematol. 2011 (Nov); 18(6): 467-73.

[7] Lasanta Sáez MJ. Instrumentos para el conocimiento de la familia: el genograma.

[8] McGoldrick M, Gerson R. Genogramas en la evaluación familiar. Barcelona: Gedisa;

2005.


26


27

Capítulo 3

Dermatoglifos


Resumen

Este capítulo intenta promover en el estudiante el reconocimiento la genética

asociada a los dermatoglifos a través del reconocimiento de los principales patrones

normales de las líneas dermatopapilares de las manos y los pies, expresando los

resultados en una fórmula dactiloscópica resumida. Con base en el temario, la

fundamentación teórica y las actividades que se proponen, se espera que el

estudiante logre establecer la frecuencia de los patrones palmares; comparar los

patrones individuales con los padres y hermanos para establecer el tipo de herencia

de estos rasgos; discutir las aplicaciones de estos estudios en las poblaciones como

marcadores genéticos y como ayuda diagnóstica para algunos síndromes genéticos;

reconocer la gran variabilidad que puede presentar una característica determinada

por varios pares de genes; realizar la verificación de la distribución continua y

normal de una característica poligénica; manejar los parámetros estadísticos en el

procesamiento de datos de rasgos genéticos multifactoriales; y, establecer relaciones

entre algunas características específicas de estos rasgos en su grupo con otros rasgos

diferentes no patológicos.

Palabras clave: dermatoglifos, genética, líneas dermatopapilares.





28

Temario que lo apoya

Penetrancia.

Expresividad.

Pleiotropía.

Fenotipos influidos por el sexo.

Herencia mitocondria.

Mosaicismo somático.

Mosaicismo germinal.

Huella genómica.

Síndromes de Prader-Willi y de Angelman.

Disomía uniparental.

Inactivación del x.

Mutaciones dinámicas.

Características principales de la población humana.

Ley de Hardy-Weinberg.

Equilibrio Hardy-Weinberg.

Factores que modifican el equilibrio.

Estratificación.

Unión dirigida.

Consanguinidad.

Selección natural.

Deriva génica.

Cuellos de botella.

Efecto fundador.

Migración.

Aplicaciones de la ley de Hardy-Weinberg.

Cálculo de riesgos.

Árbol genealógico e interrogatorio familiar.

Exploración física en genética clínica.

Dermatoglifos.

Objetivos

Objetivo principal

Reconocer la genética asociada a los dermatoglifos.


1. Reconocer los principales patrones normales de las líneas dermatopapilares de las manos

y los pies, expresando los resultados en una fórmula dactiloscópica resumida.

2. Establecer la frecuencia de los patrones palmares entre los estudiantes de la clase.


29

3. Comparar los patrones individuales con los padres y hermanos para establecer el tipo de

herencia de estos rasgos.

4. Discutir las aplicaciones de estos estudios en las poblaciones como marcadores

genéticos y como ayuda diagnóstica para algunos síndromes genéticos.

5. Reconocer la gran variabilidad que puede presentar una característica determinada por

varios pares de genes.

6. Realizar la verificación de la distribución continua y normal de una característica

poligénica.

7. Introducir al estudiante en el manejo de parámetros estadísticos en el procesamiento de

datos de rasgos genéticos multifactoriales.

8. Establecer relaciones entre algunas características específicas de estos rasgos en su

grupo con otros rasgos diferentes no patológicos.

Fundamento teórico

Las primeras referencias sobre el uso de las impresiones digitopalmares datan de antiguos

documentos chinos encontrados en cavernas, las cuales eran usadas, según se supone, para

identificación de un individuo. Entre 1684 y 1686 se describieron científicamente por

primera vez las figuras palmares y planares formadas por la epidermis de algunos primates.

Esta descripción fue hecha por Grez, Bidloo y Malphighi. En 1823 Purkinge clasificó las

“huellas dactilares” en nueve tipos diferentes y, más tarde, Faulds y Herschel, las

introdujeron como factor de identificación personal. En 1888 Galton publicó un trabajo en

el cual clasificaba las impresiones digitopalmares en tres categorías: arcos, presillas y

verticillos. Galton indicaba, además, en su trabajo la metodología para operar con estas

impresiones. De esta manera nació la aplicación de estas características en el estudio de la

genética humana [1-3].

Con el término dermatoglifos, propuesto por Cummins en 1926, se designan las

crestas dermopapilares y sus configuraciones. Los dermatoglifos son consecuencia de

modificaciones especializadas de la piel que resultan en ondulaciones de su porción

epidérmica [4]. Estas ondulaciones están presentes en la palma y en superficies digitales de

la mano, en la planta y en las superficies digitales de los pies [5]. Las áreas donde se

presentan los dermatoglifos o crestas dermopapilares están desprovistas de glándulas

sebáceas, de pelos y tienen cierto grado de pigmentación, pero abundan en estas áreas

terminaciones nerviosas. El significado funcional y evolutivo de las crestas dermopapilares

probablemente esté relacionado con funciones tactiles-sensitivas y de afinamiento de la

capacidad prensil [3].

Los dermatoglifos se diferencian embriológicamente durante el curso del cuarto mes

de vida fetal y se elevan a la superficie de la piel tiempo después, primero en la pulpa de los

dedos, luego en la palma y finalmente en la planta de los pies. Una vez formados no sufren

alteraciones o modificaciones debidas al ambiente en el curso de toda la vida del individuo.

Sin embargo, durante el periodo de vida intrauterina en que los dermatoglifos están en

formación, pueden verse alterados por factores que interfieren en el normal desarrollo

embrionario [5, 6]. Estos factores pueden ser genéticos, como las alteraciones


30

cromosómicas numéricas y estructurales, o ambientales, tales como los efectos

teratogenéticos inducidos por enfermedades maternas o el uso de drogas y alcohol durante

el embarazo. Respecto al tipo de herencia de estos caracteres hay consenso en que se trata

de rasgos de herencia poligénica, con mayor heredabilidad que muchos otros caracteres

antropométricos, ejemplos también de herencia poligénica [7].

Dada su transmisión hereditaria, son patrones únicos para cada individuo que

muestran una gran diversidad tanto por sus detalles como por las combinaciones que

presentan en una persona determinada. Además, existen variaciones considerables en las

frecuencias de las diferentes configuraciones dermatoglíficas tanto en los dos sexos como

en los diferentes grupos étnicos, desde el punto de vista embriológico y genético [8].

En la actualidad existe una gran cantidad de trabajos en los cuales relacionan las

diferentes configuraciones con factores tales como raza, grupos sanguíneos, aberraciones

cromosómicas y desórdenes metabólicos hereditarios. Dichos estudios son posibles debido

a que estas huellas no sufren ninguna alteración después de que se han formado

embriológicamente, entre el tercero y séptimo mes de vida intrauterina. Los estudios sobre

dermatoglifos destacan la relación de ciertos patrones anormales con una serie de

síndromes genéticos y cromosómicos, como son la trisomia 21 (síndrome de Down), turner,

patau, entre muchos otros [9].

Las poblaciones muestran diferentes tipos de disposiciones dermatoglíficas:

Los patrones dérmicos normales están presentes en la mayoría de la población.

Los inusuales están presentes en un porcentaje pequeño de la población sana y en

algunos de los síndromes malformativos.

Los anormales están presentes en un alto porcentaje de síndromes malformativos

de origen mono o poligénicos, cromosómicos o ambientales y también en alguna

ocasión en personas sanas.

Los dermatoglifos están relacionados con las crestas epidérmicas (figura 1) que

forman un sistema de líneas paralelas en campos pequeños de la superficie del

estrato corneo. Los poros de las glándulas sudoríparas se localizan a lo largo del

centro de estas crestas. Las depresiones entre las crestas se conocen como surcos.

Internamente, bajo la epidermis, se encuentra el estrato germinativo, los pliegues

glandulares y los pliegues de los surcos [9].


31

Figura 1. Representación diagramática de los pliegues de la piel con la nomenclatura de las

estructuras de la epidermis y la dermis. Andrade et al. [9]

La nomenclatura empleada para identificar las diferentes áreas en las manos se

muestra en las figuras 2 y 3.

Figura 2. Nomenclatura y posición de áreas y trirradios en manos. Andrade et al. [9]


32

Figura 3. Nomenclatura y posición de áreas y trirradios en pies. Andrade et al. [9]

Dimensiones

El ancho entre dos crestas es la distancia existente entre los puntos centrales de dos crestas

consecutivas. Para calcular esta distancia promedio se traza una línea de un centímetro que

corte en ángulo recto una serie de crestas y se cuenta el número de ellas cortado por la

línea. Para cuantificar las impresiones dactiloscópicas se emplea también el conteo total de

crestas o CTC (figura 4).

Figura 4. Conteo de crestas en los arcos. (a) Por definición, carecen de trirradios y el

conteo de crestas es 0-0. (b) Los bucles con el trirradio tienen en este caso 16-0. (c) En el

espiral, el número de crestas a cada uno de los trirradios puede ser diferente: 10-16.


33

Para esto se cuenta en cada una de las impresiones digitales el número de líneas que

son cortadas por una recta que une el centro geométrico del trirradio con el centro de la

configuración palmar (figura 5).

Figura 5. Los trirradios están conformados por la confluencia de tres sistemas de crestas:

(a) el centro geométrico de confluencia del trirradio se denomina punto del trirradio.

Idealmente es la confluencia de las tres líneas, puede estar representado por un punto (b), p

la terminación de una cresta (c). En otros casos (d, e) están en espacios abiertos

intersticiales.

Principales configuraciones

Algunos elementos pueden ser detallados en el estudio exacto de los dermatoglifos, algunos

de ellos se identificarán según la nomenclatura empleada para su descripción (figura 6).

Figura 6. Nomenclatura empleada en la descripción de las formas finas que presentan las

crestas. Andrade et al. [9]


34

Isla o punto: es una pequeña cresta de forma redondeada que contiene un solo poro.

Cortada: es un fragmento de una cresta más largo que una isla y puede contener dos o tres

poros.

Línea intersticial: es una pequeña línea angosta, muy rara vez contiene poros; en general,

son más bajas que las crestas y no se consideran cuando se hace el conteo de crestas.

Cerco: es una bifurcación y posterior unión de una cresta que rodea un surco formando una

laguna.

Bifurcación: es la división de una línea formando una Y.

Peine: es la configuración de una línea en la cual tres o más crestas confluyen.

Anastomosis: es la unión de dos líneas por intermedio de una línea subsidiaria.

Campos abiertos

Son áreas llenas de líneas paralelas o casi rectas. Se designan generalmente con la letra

“O”. Entre las configuraciones más frecuentes en estas áreas están los arcos, que se forman

cuando las líneas son un poco curvas, y los abanicos, que se forman en áreas por múltiples

bifurcaciones de las crestas. Si las bifurcaciones se hacen en sentidos opuestos, el resultado

es una configuración que se conoce como escalera.

Trirradios

Los trirradios se forman cuando hay discontinuidad en líneas paralelas. Geométricamente,

el punto del trirradio (figura 5a) es el punto de encuentro de tres líneas radiales que hacen

entre ellas ángulos cercanos a 120°. En la figura 5 se presentan los diferentes tipos de

confluencia de las líneas; en cada caso el punto geométrico del trirradio se encuentra

marcado con un círculo. Idealmente, el trirradio está representado por una bifurcación de la

cual irradian tres líneas; algunas veces el centro está marcado por una isla (figura 5b) o por

el fin de una cortada (figura 5c). En algunos casos el centro geométrico no reposa sobre

ninguna línea (figura 5d y 5e). Si el trirradio ocurre en una región con un peine, el punto

geométrico se toma en el punto donde los tres ángulos sean lo más cercano posible a los

120° (figura 5e). Las configuraciones con arcos verdaderos carecen de trirradios.

Impresiones digitales

En las impresiones digitales se reconocen tres tipos principales de configuraciones:

presillas, verticilos o torbellinos, y los arcos.


35

Figura 7. Las presillas (L). Pueden ser de diferentes tipos: a) varilla: cuando están

conformadas por líneas caso paralelas con una cresta central, b) en forma de aro o argolla

cuando el centro es libre, c) presilla convergente o invadida, y d) ganchosa o nutable. Los

arcos en tienda e) son los únicos arcos que poseen trirradio. Andrade et al. [9]

Presillas o asas (L): generalmente son configuraciones formadas por líneas que

entran y emergen por el mismo margen del modelo, poseen solamente un trirradio, situado

al lado opuesto de donde se abre el dibujo. Las presillas pueden ser de diferentes tipos

(figura 7): en varilla, cuando están conformadas por líneas casi paralelas con una cresta

central (figura 7a), o en forma de aro o argolla cuando el centro es libre (figura 7b); en la

figura 7c se esquematiza la presilla convergente o invadida, y en la figura 8d la ganchosa o

nutable; los arcos en tienda (figura 7e) son los únicos arcos que poseen trirradio. Algunas

configuraciones presentan un patrón característico de dos trirradios, como las presillas

dobles o los verticilos (figura 7d y 7e). Tres trirradios son también posibles en confi-

guraciones que presentan verticilos y presillas, como la esquematizada en la figura 12.

Las presillas pueden ser:

Cubitales: cuando el modelo se abre hacia la línea media del cuerpo (o hacia el dedo

meñique) estando este en posición anatómica. Posee un solo trirradio, situado al lado

opuesto de donde se abre el dibujo.

Cuando el modelo se abre hacia fuera de la línea media del cuerpo (o hacia el dedo

pulgar) posee un solo trirradio.

En la figura 8 se muestra una presilla; si esta figura corresponde a la mano derecha, es

asa radial, y si pertenece a la mano izquierda corresponde a un asa cubital.


36

Figura 8. Presilla

Verticilos rizos o remolinos (W): este grupo incluye todas las muestras cuyas líneas

presenta contornos circulares en forma de “S”, elípticas o espiriliformes. Los verti¬cilos

constituyen los patrones más complejos y variables. Una forma simple (w) consta de un

patrón concéntrico circular o elíptico (figura 9a y 9b). Las configuraciones pueden ser muy

variadas (figura 9), y se pueden encontrar figuras con dos o tres trirradios, los cuales se

diferencian por la configuración central y la orientación de las figuras.

Generalmente pueden ser de dos tipos:

Verticilo simétrico: formado por líneas concéntricas. Posee dos centros y dos

trirradios situados a lado y lado del dibujo (figura 9a).

Verticilo espiral: formado por líneas en espiral. Posee un centro y dos trirradios

a lado y lado del dibujo (figura 9b).

Figura 9. Verticilos simples (a y b) y bucles o asas dobles. Andrade et al. [9]

Arcos (A): con configuraciones formadas por líneas que van de uno a otro margen del dedo

y que forman elevaciones en el eje medio de este, lor arcos pueden ser:

35


37

Arco plano o simple: cuando las elevaciones son suaves y no poseen trirradio (figura

4a).

Arco tienda: cuando las elevaciones son pronunciadas y poseen un trirradio, situado

hacia el eje medio de la configuración (figura 7e).

Existen otras configuraciones más complejas y menos frecuentes como:

Presilla doble o verticillo-presilla: posee dos centros y dos trirradios situados a lado y lado

del dibujo. Para lo relacionado con el recuento de crestas se lo considera verticilo (figura

10).

Arco atienda prensilla (figura 11).

Verticilos con tres trirradios.

Verticilo-presilla con los dos trirradios a un mismo lado.

Configuraciones sin trirradios.

Figura 10. Presilla doble o verticillo-

presilla

Figura 11. Arco atienda prensilla

La palma de la mano

Existen seis áreas bien definidas que corresponden a las regiones o los plie¬gues

embrionarios. Estas son las áreas hipotenares (figura 2, H), tenares (Th), y las interdigitales

I, II, III y IV. Normalmente existen cuatro trirradios interdigitales en la base de los dedos y

son denotados con a, b, c, d (figura 2). Un trirradio adicional puede presentarse en el área

interdigital y en esos casos se denota como a’, b’, c’, d’, según el área interdigital en la cual

se encuentre localizado.

Trirradios hipotenares: el principal es un trirradio localizado en la palma y próximo

al lugar de pliegue de la mano, normalmente en el eje o cerca del eje del cuarto

metacarpiano, y se conoce como t (tabla 1). Cuando la posición de este trirradio es más

distal, tiene el aspecto de una T invertida, cuyo pie estaría dirigido hacia la eminencia

hipotenar, a la que se le llama t’. La posición t” es mediopalmar, muy distal y tiene forma

de Y mayúscula. Una medida objetiva para la situación de t viene representada por la

mag¬nitud del ángulo que forman los trirradios extremos a y d con el trirradio t,

37


38

denominado ángulo de Penrose, o atd (figura 13). El ángulo atd tiene diferentes valores

según sea la localización del trirradio t; en individuos normales tiene un valor promedio de

48º, y cuando se forma un ángulo mayor de 56º el ángulo recibe el nombre de distal. Para

determinar la posición del trirradio t, se mide el ángulo atd; los tres puntos pueden ser

localizados con exactitud, pero si el trirradio t está colocado hacia el lado cubital de la

palma, como ocurre algunas veces con individuos que padecen el síndrome de Down, la

abertura del ángulo no indicará su posición distal. Además, algunos piensan que como la

mano tiende a ser más larga y estrecha con la edad de la persona, el valor del ángulo

dependerá en gran parte de la edad.

Por último, pueden encontrarse diferencias hasta de 10º en la medición del ángulo, lo

cual depende de si los dedos están separados o superpuestos en el momento de tomar la

huella de la palma.

Ocasionalmente, puede encontrarse más de un trirradio axial, en este caso, para la

medición del ángulo atd se tiene en cuenta el más distal.

Tabla 1.

Tipo de posición del ángulo de Penrose según su medida

Nota. Elaboración propia

Figura 12. Varios tipos de patrones en el área hipotecar. W, verticilos: L, bucles; T, arcos

en tienda; A, arcos simples. Los superíndices determinan la dirección: r, radial; u, ulmar; c,

calpar; d, patrón doble; s, espiral. Andrade et al. [9]

Medida del ángulo

Tipo de posición

<45°

Posición t

45°-56°

Posición t’

‘ > 56°

Posición t”


39

Figura 13. Medida del ángulo atd de la palma de la mano. Observe que entre más distal

esté el trirradio t, més pequeño es el ángulo. Andrade et al. [9]

Pliegues de flexión

Son diferentes a los dermatoglifos, pero se asocian con estos. En la palma suele haber tres

de ellos, aunque en algunos casos los dos pliegues distales se pueden fusionar formando un

solo horizontal. Esta única línea resultante se ha denominado de diferente manera: pliegue

del simio, línea de los cuatro dedos, pliegue transversal único (figura 14).

Figura 14. Pliegues de flexión. Andrade et al. [9]


40

Relación entre dermatoglifos y algunos rasgos patológicos y no patológicos

1. En algunos síndromes, los valores promedio del ángulo atd soncomo se muestra en la

tabla 2.

Tabla 2.

Relación entre dermatoglifos y algunos rasgos patológicos y no patológicos

Síndrome Ángulo

Turner (X0) 66º

Down (trisomia 12) 81º

Patau (trisomia 18) 108º


2. Con los grupos sanguíneo. Ciertos autores han encontrado relaciones con los grupos

sanguíneos del sistema ABO y el sistema MN, con el sistema Lewis, con el factor Rh, etc.

Hesh dice que existe una posible relación entre rizos y el grupo B, y entre asas y el

grupo A.

3. Con la estatura. Algunos sugieren que hay un mayor número de rizos en personas altas.

Fórmula dactiloscópica

La fórmula dactiloscópica consiste en la expresión resumida, por medio de símbolos, de los

patrones dermatoglíficas verificados en los dedos de las manos. Se presenta según el

sistema propuesto por Vucetich (1858-1925), famoso dactiloscopista yugoslavo, como una

fracción en la cual el numerador resume los patrones de los dedos de la mano derecha y el

denominador los de la mano izquierda. Según este sistema, todos los arcos están designados

por la letra A en el pulgar y el número 1 en los otros dedos. Los verticilos son designados

por la letra V en el pulgar y con el número 4 en cualquiera de los otros dedos. Las presillas

se consideran internas cuando el trirradio está a la derecha del observador y se designan con

la letra I (en el pulgar) y con el número 2 para los otros dedos. La letra E y el número 3 se

emplean para presillas externas, con el trirradio izquierdo o externo.

Ejemplo: E-3333/I-2222

Significado: mano derecha, presillas externas que se abren para el lado ulnar en todos los

dedos. En la izquierda, todas son presillas internas.

La planta del pie

Las impresiones plantares son homólogas a las verificadas en las palmas de las manos,

como se observa en la figura 3b. Las únicas diferencias con¬sisten en considerar el área

tenar como distal si está cerca del área halucal (del dedo gordo), y proximal, la cercana al

calcáneo. Con respecto a los trirradios correspondientes a los dedos II a V, son designados


41

como a, b, c, d, respectivamente. El trirradio de la región halucal se denota como e, y,

dependiendo de su posición, pueden ser empleadas las letras e para el más proximal y e’

para el más distal.

Un trirradio generalmente muy próximo al área halucal es el trirradio p (proximal).

Cuando está desplazado hacia el área hipotenar distal puede llamarse p’ o p” dependiendo

del desplazamiento.


Materiales

Papel para dermatoglifos

Tinta

Rodillo

Talcos

Tiza

Fotocopiadora

Estereoscopio

Regla milimetrada

Compás de dos puntas

Transportador


Pijama institucional

Bata de laboratorio

Tiempo estimado

Una hora y 45 minutos.

Procedimiento

Recolectar los datos dactilopalmartes necesarios y plantear la fórmula dactiloscópica de

usted y sus padres, según convención que aparece en la tabla 3

Tabla 3.

Convenciones para recolectar datos dactilopalmartes

Arcos A ---- pulgar 1 ---- otros dedos

Presillas, tirradio a la derecha Interna o tenar I ----- Pulgar 2 ---- otros dedos

Tirradio a la izquierda Externa o Ulnar E ---- pulgar 3 ---- otros dedos

Vertilicios V ---- pulgar 4 ---- otros dedos

X: si no puede definir por cicatriz o daño de la impresión



42

Diligenciar las siguientes tablas.

Fórmula observada:

Mano

Pulgar

índice

Medio

Anular

Meñique

Derecha

Izquierda

Ejemplos:

1. Fórmula observada:

Mano

Pulgar

índice

Medio

Anular

Meñique

Derecha

V

4

4

4

4

Izquierda

V

4

4

4

4

2. Fórmula observada:

Mano Pulgar índice Medio Anular Meñique

Derecha

A

3

3

4

1

Izquierda

V

2

2

2

2

Mano derecha: arco en el pulgar, presillas en los dedos índice y medio, verticilo en el

anular y arco en el meñique. Mano izquierda: verticilo en el pulgar, presillas tenares o

internas en los otros dedos.

Conteo total de crestas (CTC).

Otro de los parámetros descriptivos de las impresiones dactilares es el CTC, que se

efectúa trazando con lápiz una línea (línea de Galton) entre el trirradio más próximo y el

centro nuclear de la figura.

Nota: No se cuentan las líneas del trirradio.

Si la figura tiene dos trirradios (verticilos, círculos concéntricos, etc.) se considera el conteo

mayor.

Par los arcos en tienda, arcos planos y abanicos que no tienen trirradio, su conteo es de

cero. CTC = Conteo del número de líneas en las impresiones de los diez dedos.

Conteo total de crestas (CTC):


43

Mano

Pulgar

índice

Medio

Anular

Meñique

Total

Derecha

Izquierda

Localizar los trirradios digitales a, b, c, d. Si existen otros adicionales se designarán como

a’, b’, c’, d’.

Localizar los trirradios palmares y determinar si hay uno o más y describir su

posición: trirradio axial proximal (t), en forma de Y invertida, axial distal (t”), una Y en

posición normal, o un trirradio en posición intermedia entre t y t’.

Para clasificar el trirradio palmar puede usarse el ángulo de Penrose: atd. Este ángulo

es formado por los segmentos de recta que se trazan uniendo los trirradios digitales a y d

con el trirradio palmar. Entre más distal esté el trirradio palmar menor será el ángulo atd. Se

considera que es t para ángulos menores de 58º.

Bibliografía

[1] Gómez BD. Determinación de patrones dermatoglíficos digitales en un grupo de la

Universidad de Antioquia y la universidad de San Buenaventura. Medellín. [Tesis de

grado]. Universidad de Antioquia, Medellín; 1977.

[2] Thompson and Thompson. Genética médica. Ed. Salvat. S.A.; 1968.

[3] Beiguelman B. Citogenética humana. Río de Janeiro: Guanabara Koogan; 1982

[4] Egozcue J, Antich, J, Ballesta F et al. Genética médica. Barcelona: Es-paxs; 1976.

[5] Penrose LS. Memorandun on Dermatoglyphic Nomenclature. Birth Defects Orig

Series IV. 1968; (3): 1-13.

[6] Schaumann B, Alter M. Dermatoglyphics in medical disorders. New York:

Springer-Verlang; 1976.

[7] Vargas MV. Dermatoglifos en individuos con síndrome de Down. [Tesis para optar

el título de bióloga], Universidad Nacional de Colombia, Bogotá; 1982.

[8] Thompson JS, Thompson MW. Genética Médica. Salvat Editores, S.A; 1979.

[9] Andrade E, Bueno ME, Burbano C, Chaparro A, García LF, Matta N, Nates G,

Usaquén W. Manual de guías de laboratorio. Genética mendeliana, poblaciones,

citogenética y genética molecular. Bogotá: Universidad Nacional de Colombia,

Facultad de Ciencias, Departamento de Biología, Unidad de Genética y Biología

Molecular; 2006.


44


45

Capítulo 4

Extendidos cromosómicos

Víctor Alfonso Solarte-David*, Diana Maryory Gómez-Gallego**

Resumen

Los extendidos cromosómicos permiten examinar el material nuclear condensado en

metafase, siendo actualmente la metodología básica implementada en el estudio de

cariotipos. Son útiles en el diagnóstico de enfermedades y síndromes relativos a

ganancias o pérdidas importantes de material genético, y, con tratamientos

adecuados, pueden ser teñidos con patrones de bandas, que permiten determinar

cambios estructurales importantes en el diagnóstico de enfermedades, sirviendo

también en la determinación de polimorfismos poblacionales y aspectos de

reproducción, entre muchas otras aplicaciones a nivel de investigación. La obtención

de extendidos cromosómicos presenta limitantes respecto a la cantidad de células y

la necesidad de que estas sean cultivadas in vitro, sin embargo ofrecen un

acercamiento importante como modelos para el desarrollo de nuevos fármacos.

Palabras clave: cariotipo, cromosomas, fases del ciclo celular, modelo in vivo/vitro.


Universidad Nacional de Colombia. Actualmente es profesor de tiempo completo de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín, Colombia. Correo electrónico: [email protected]. ** Ingeniera biológica y estudiante de maestría en Microbiología y Bioanálisis. Profesora instructora de la

Facultad de Medicina de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín, Colombia. Correo electrónico: [email protected].




46


Cultivo celular y obtención de extendidos cromosómicos.

Objetivos

Objetivo principal

Obtener cultivos primarios a partir de sangre periférica humana, estableciendo los

principios básicos de cultivo celular in vitro.


1. Establecer los principios básicos para la obtención de extendidos cromosómicos a partir

de cultivos primarios de sangre periférica humana.

2. Identificación de estructuras cromosomales.

3. Adquirir pautas básicas para el reconocimiento de los cromosomas humanos en el

microscopio.

Fundamento teórico

Extendidos cromosómicos

El laboratorio de citogenética es fundamental para la genética clínica. La citogenética es el

campo de la genética que se encarga del estudio de la morfología y la función de los

cromosomas y sus patologías relacionadas, causadas por un número o una estructura

anormal de estos. Los cromosomas son estructuras complejas ubicadas en el núcleo de las

células, compuestos por DNA, histonas y otras proteínas, como lo afirman Saez y Cardoso

[1]. Durante la división celular, específicamente durante la mitosis, se condensan tanto que

pueden ser fácilmente observados y analizados en un microscopio óptico. Para recoger

células con sus cromosomas en este estado condensado, es necesario hacer un extendido

cromosómico, con el cual se puede distinguir entre células normales y malignas por el

número y morfología de los cromosomas, según Freshney [2].

Se pueden usar distintos tejidos para obtener preparaciones de cromosomas, por

ejemplo, sangre periférica, piel, medula ósea, fluido amniótico, entre muchos otros.

Los cultivos de sangre periférica son en general los más empleados para hacer

extendidos cromosómicos en las investigaciones de citogenética clínica. Solo

ocasionalmente, cuando hay indicaciones clínicas especiales, se deben efectuar extendidos

cromosómicos a partir de dos tejidos diferentes del mismo individuo. El más usado

comúnmente es la biopsia de piel que solamente presenta un complejo cromosómico

diferente al de los linfocitos cuando se presentan mosaicismos genéticos, como aparece en

el trabajo de Rooney y Czepulkowski [3].

Aunque las técnicas específicas difieren según el tejido usado, el método básico para

obtener preparaciones de cromosomas es el siguiente (figura 1):


47

Figura 1. Preparaciones de cromosomas. Fuente: Freshney [2]

Cultivo de las células en un medio apropiado y empleando un mitógeno adecuado.

Acumulación de células en metafase ya sea en cultivo (por utilización de colchicina,

colcemid u otro agente sincronizador) o en preparaciones directas.

Tratamiento hipotónico que conduce a un aumento del volumen celular provocado

por la entrada de líquido a las células, lo que permite la lisis por métodos físicos de la

célula en metafase y dispersión de los cromosomas.


48

Una fijación adecuada del material con Carnoy (3 metanol:1 ácido acético glacial)

fresco y frío, permitiendo lavado de las células y conservación del material.

La dispersión de los cromosomas sobre la lámina limpia, libre de grasa, con un

método apropiado, como el goteo de las células hipotonizadas sobre la placa.

Identificación y análisis al microscopio de las estructuras cromosomales [2].


Reconocimiento de mitosis.


Muestra Placa con extendidos cromosómicos de linfocitos T y de las líneas celulares Jurkat y HeLa

suministrados por el laboratorio de Biología Molecular.

Equipos Microscopio


Bata de laboratorio limpia.

Tiempo estimado

Una hora.

Procedimiento

A los estudiantes se les entregarán las placas con extendidos cromosómicos de linfocitos T,

además de placas con extendidos cromosómicos con líneas celulares de células

transformadas Jurkat.

Reconocimiento de mitosis

Haciendo un correcto uso del microscopio, colocar la placa para empezar a observarla.

Empiece enfocando en el objetivo de 4x, pase por el de 10x y por último enfoque en 40x.

En este objetivo, comience un barrido de la placa ordenadamente, como se indica en la

figura 2.

Figura 2. Reconocimiento de mitosis


49

Durante el recorrido deberá:

Identificar núcleos activos (color rosado-violeta) e inactivos (color morado). La

principal diferencia es el tamaño, las células que se encontraban en el momento de la

obtención de cromosomas en actividad presentan núcleos más grandes que las que no están

activas en el ciclo celular; por otra parte, la coloración en los núcleos inactivos es más

intensa.

Cuidadosamente, y usando aceite de inmersión, enfocar la placa en 100x y observar

más detalladamente la morfología de los cromosomas: telómeros y centrómeros. El

estudiante debe además tratar de identificar las diferencias entre las mitosis de células

normales (linfocitos T) y células con anormalidades (Jurkat).

Figura 3. Ejemplo de morfología de los cromosomas. Gómez, Ossa y Espinal [4]


50

Bibliografía

[1] Saez F, Cardoso H. Citogenética básica y biología de los cromosomas. Programa

Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico, Departamento de Asuntos

Científicos, Secretaría General de la Organización de los Estados Americanos; 1973.

[2] Freshney R. Culture of Animals Cells: A manual of basic technique. 4ª ed. Nueva

York: Wiley- Liss; 2000.

[3] Rooney D, Czepulkowski B. Human cytogenetics: a practical approach. Washington,

D.C.: Oirl Press; 1987.

[4] Gómez D, Ossa A, Espinal C. Extendidos cromosómicos de la línea celular Jurkat.

Medellín: Laboratorio Biología Molecular, Facultad de Medicina, Univeridad

Cooperativa de Colombia; 2013.


51

Capítulo 5

Cariotipo


Resumen

El patrón cromosómico de una especie es único, y puede ser ordenado y

caracterizado mediante patrones específicos en sus cromosomas, lo cual es llamado

cariotipo. El estudio del cariotipo se realiza mediante la citogenética, la cual hace

uso de técnicas que permiten identificar patrones o porciones específicas en los

cromosomas, haciendo posible la construcción de cariogramas o ideograma

(diagrama en el cual se ordena los cromosomas en metafase según sus

características, bajo reglas establecidas en común acuerdo a nivel internacional). El

cariotipo humano consta de 46 cromosomas (23 pares al ser organismo diploide -

2n), los cuales están organizados en 22 pares autosómicos y un par sexual (XX:

mujer, XY: hombre); cada brazo en cada cromosoma ha sido caracterizado y se han

establecido bandas y subbandas que los identifican. Estas características únicas y

comunes en nuestra especie han permitido establecer y correlacionar anormalidades

cromosómicas a enfermedades como la leucemia mieloide crónica (cromosoma

filadelfia) o síndromes como el Down (trisomía del cromosoma 21), entre muchos

otros. Además, ha permitido establecer polimorfismos que identifican a poblaciones.

El cariotipo es una herramienta elemental en el área clínica debido a que se han

identificación de manera confiable gran cantidad de anormalidades cromosómicas

asociadas a enfermedades, que ahora se encuentran en bases de datos y, así, al

alcance del diagnóstico oportuno.

Palabras clave: cromosomas, centrómero, metafase, ideograma.





52

Objetivos

Objetivo principal

Identificar las diversas estructuras cromosomales, su clasificación mediante métodos de

tinción y morfología, y reconocer algunas patologías asociadas con alteraciones

cromosómicas.


1. Introducir a los estudiantes en los conceptos básicos de las técnicas de cultivo celular.

2. Identificación de estructuras cromosomales.

3. Adquirir pautas básicas para el reconocimiento de los cromosomas humanos en el

microscopio.

4. Clasificar cada uno de los cromosomas en una mitosis mediante la realización de un

ideograma.

5. Cálculo del índice mitótico.

6. Definir un arreglo cromosómico sistemático (cariotipo) para la mitosis con bandas R a

analizar, respecto al tamaño relativo de cada cromosoma en relación con la longitud

genómica total haploide femenina.

7. Realizar una representación diagramática de cada uno de los cromosomas (ideograma)

del cariotipo con bandas.

8. Identificar la problemática presentada por el paciente y sus repercusiones.

Fundamento teórico

La historia de la citogenética humana es relativamente corta. Fue solo hasta 1956 que Tjio y

Levan reportaron el número correcto de cromosomas en el hombre, cultivando células del

pulmón fetal. Hasta los últimos años de la década de los cincuenta, las células utilizadas

para el análisis cromosómico provenían de tejidos proliferativos (por ejemplo, médula ósea)

o células que podrían ser cultivadas in vitro usando las técnicas de cultivo de tejidos (por

ejemplo, fibroblastos, tejidos embrionarios) [1].

Nowell, en 1960, realizó un descubrimiento que revolucionó el análisis cromosómico

en el hombre: una sustancia llamada fitohemaglutinina, extraída del fríjol rojo (Phaseolus

vulgaris), que, al adicionarla a la sangre en un medio rico en nutrientes, estimulaba la

división de los linfocitos. De esta manera, fue posible obtener un mayor número de células

a partir de una muestra más accesible. Además, los tratamientos hipotónicos fueron

determinantes para la mejor visualización y conteo de los cromosomas [2].

Inicialmente los 22 pares de autosomas se clasifican, según el tamaño y la posición del

centrómero, en siete grupos identificados con letras de la A a la G:

Grupo A: al cual pertenecen los cromosomas más grandes, metacéntricos o

submetacéntricos (pares 1-3).


53

Grupo B: pares 4 y 5, grandes submetacéntricos.

Grupo C: constituido por siete pares cromosómicos (6-12), medianos, con centrómero en

posición medial o submedial. Dentro de este grupo se encuentra también el

cromosoma X, que podría ubicarse entre los cromosomas 7 y 8 por tamaño.

Grupo D: en él se localizan los cromosomas acrocéntricos grandes (pares 13, 14 y 15).

Grupo E: a él pertenecen los cromosomas 16, 17 y 18, pequeños metacéntricos o

submetacéntricos.

Grupo F: dos pares de cromosomas 19 y 20, pequeños y metacéntricos.

Grupo G: corresponde a dos pares de cromosomas acrocéntricos pequeños, (pares 21 y 22).

Por tamaño y morfología, el cromosoma Y corresponde a este grupo.

De esta manera, los cromosomas podrían ser ubicados dentro de un grupo, pero la

posición dentro del grupo se hacía más o menos tentativamente [3]. A principios de los

setenta se desarrollaron las técnicas de bandeo que permi¬tieron no solo la identificación

exacta de la totalidad de los pares cromosómi¬cos, sino también la detección de la mayoría

de las alteraciones estructurales. Caspersson, Zech y Johansson encontraron que al teñir con

quinacrina o compues¬tos relacionados y observar en el microscopio de fluorescencia, en

cada par cromosómico se produce un patrón específico de bandas brillantes y opacas que

llamaron bandas Q (QFQ) por la utilización de la quinacrina [4].

Arrighi Hsu y Summer descubrieron un método específico de bandeamiento que tiñe

el área pericentromérica, las constricciones pri¬marias de los cromosomas 1, 9 y 16, y el

segmento distal del brazo largo del cromosoma Y [5]. Estas áreas contienen

heterocromatina constitutiva (regiones ricas en G C), de ahí el nombre de bandas C (BCG).

Seabright publica una técnica basada en la desnaturalización y renaturalización del DNA,

que produce un patrón de bandas claras y oscuras que corresponde a los patrones opacos y

brillantes de las bandas Q. Esta técnica fue llamada bandas G por la utilización de Giemsa

como colorante (GTG) [6].

Las bandas R, descritas por Dutrillaux y Leujeune, tienen carac¬terísticas de tinción

opuestas a las bandas Q o G y por esto reciben el nombre de bandas R (de reversa). Tanto

las bandas Q como las G y R permiten un análisis claro y preciso de la morfología de los

cromosomas [7].

No obstante, las bandas G y R presentan una ventaja sobre las bandas Q al ser

preparaciones permanentes y no requerir equipos ópticos y de ilumi¬nación especiales. Las

bandas Q no necesitan maduración ni procedimientos térmicos o enzimáticos, y son una

herramienta importante en el estudio de segmentos heterocromáticos, particularmente en

estudios de paternidad, usando como marcador la región heterocromática del cromosoma

Y.

Otra técnica selectiva son las bandas N, descritas por Matsui y Sasaki [8], y

Goodpasture y Bloom [9]. Estas bandas tiñen los tallos y los satélites de los brazos cortos

de los cromosomas acrocéntricos y son de especial im¬portancia en el estudio de anomalías

que incluyen los brazos cortos de estos cromosomas. 55


54

Los patrones de bandeamiento obtenidos con la banda Q se usaron para construir un

ideograma humano con el objeto de establecer una nomenclatura unificada de cada uno de

los pares cromosómicos. Según lo establecido en la Conferencia de París en 1971, un sitio o

seg¬mento de un cromosoma puede ser fácilmente identificado describiendo: el número del

cromosoma, el símbolo de brazo (p = brazo corto, q = brazo largo), el número de la región

(área localizada entre dos límites adyacentes bien definidos) y el número de la banda. El

centrómero se utiliza como pun¬to de referencia para la numeración de las regiones o

bandas, de tal manera que para los brazos la numeración se efectúa desde el centrómero

hacia el telómero [10].

No fue sino hasta 1973 que se empezaron a desarrollar técnicas para obtener

cromosomas en estados tempranos de la división celular, en los cuales se observan ma¬yor

número de bandas y subbandas. Estos cromosomas son más alargados entre más temprano

sea el estadio de división celular, de tal manera que mientras en metafase tardía (técnicas

convencionales de cultivo) se observa un total de 300 bandas por complemento haploide, en

metafases medias se observan entre 320 y 554 bandas, y en profase tardía cerca de 2000

bandas. Esto demuestra que el número de bandas observadas en metafase resulta de la

fusión progresiva de las bandas y subbandas de la profase temprana [7].

La aplicación de estos métodos de bandeo y la estandarización de la nomen¬clatura

han permitido la correcta identificación de las anomalías ocurridas durante la división

celular. Las anomalías cromosómicas pueden ser de dos tipos: de número (aneuploidias o

poliploidias) o de estructura (translocaciones, inversiones, deleciones).

Las anomalías numéricas se pueden originar:

Por la no disyunción, es decir, por la migración de las dos cromátides de un

cromosoma (mitosis o meiosis II) o de dos cromosomas de un bivalente (meiosis I)

a un mismo polo.

Por un retraso anafásico que ocurre cuando un miembro de un par cromosómico

no efectúa la sinapsis y, por lo tanto, no se une correc¬tamente al huso, por lo que

no tiene ningún desplazamiento hacia los polos, quedando por fuera durante la

división.

Las anomalías estructurales se producen principalmente durante la reparación de

las lesiones cromosómicas inducidas por agentes teratogénicos in¬ternos o

externos del organismo. Estas variantes cromosómicas anómalas se pueden

clasificar en:

Variantes inestables (fragmentos acéntricos) que se pierden en el curso de las

divisiones celulares.

Variantes semiestables (cromosomas dicéntricos y anillos) que tienden a fallar en

el curso de las divisiones normales, dado que no existe coordinación entre los

centrómeros.


55

Variantes estables (deleciones, duplicaciones, inversiones, isocromosomas y

translocaciones) que son capaces de pasar inalteradas a través de la división celular

pero que, en muchos casos, dan lugar a proble¬mas meióticos, aunque pueden

alterar la composición cromosómica de los gametos y, en consecuencia, a la

fertilidad y a la progenie de los portadores.

Los cultivos de sangre periférica son, en general, los más empleados en las

investigaciones citogenéticas para la mayoría de pacientes.

En condiciones normales los linfocitos circulantes no se dividen espontáneamente en

cultivos; la estimulación de los linfocitos se logra agregando un agente mitógeno (cualquier

sustancia extracelular, como proteínas complejas que estimulan la proliferación de los

leucocitos). Los más usados son las lectinas vegetales como concanavalina A o

fitohemaglutinina (PHA). La PHA estimu¬la la fracción de los linfocitos T y es obtenida

del fríjol común (Phaseolus vulgaris), el pokeweed mitogen es obtenido de la Phytolaca

americana, la concanavalina A, de Canavalia ensiformis, y la Favina, del haba Vicia faba,

que muestra excelentes resultados como estimulante de los linfocitos en al¬gunas especies

animales [12].

La muestra sanguínea se toma con un anticoagulante, uno de los más indicados en

humanos es la heparina (liquemine) a una concentración de trabajo de 5000 UI; otros

anticoagulantes como el citrato y el EDTA no permiten una adecuada estimulación de los

linfocitos T para la obtención de extendidos cromosómicos. El cultivo de los linfocitos T

presentes en la muestra de sangre generalmente se lleva a cabo en medio de cultivo RPMI

1640 o Ham´s F-12, suplementado con suero fetal bovino (SFB) entre el 5 y 10% Vol. Los

tiempos de cultivo en una muestra de un paciente que no posea registro de tiempo de ciclo

in vitro se debe estandarizar según el comportamiento propio de células de cultivo para

cada especie. Se pueden ensayar inicialmente con tiempos de duración de cultivos que

pueden estar entre 48, 54, 60, 66 y 72 horas de cultivo, según la especie, tomando de

referencia el tiempo de cultivo de linfocitos humanos (72 horas, en las que las células

alcanzan a realizar tres ciclos), el cual es ampliamente conocido [13].

Durante el cultivo de las células lo que se busca son células en estado metafásicos en

los posibles estadios tempranos de replicación, por esto es necesario contemplar técnicas de

sincronización para asegurar la presencia de un mayor número de células en metafase. Para

ello se puede recurrir a una sincronización del cultivo, es decir, llevar a todas las células

que por naturaleza se encuentran dispersas en las diferentes fases del ciclo celular a una

sola fase. Para la sincronización celular se puede utilizar sustancias que metabólicamente

depriven a la célula de elementos fundamentales en el proceso de duplicación, lo que

propiciaría una condición de paro o estancamiento, hasta que se realice una suplementación

exógena del componente deprivado. Entre estas sustancias antimitóticas está el MTX que no

permite la síntesis de timina y el 5-fluoruracilo (5-FU) que ha demostrado la sincronización

parcial de células en la fase S, más precisamente donde se ha duplicado la eucromátina e

inicia la duplicación de la heterocromatina, tanto la constitutiva como la facultativa. Este

último hecho nos permite distinguir desde el punto de vista duplicativo el cromosoma X

57


56

inactivo, lo cual resulta de gran importancia en el momento de identificar los cromosomas

sexuales en especies donde aún no se han caracterizado. El bloqueo producido por el MTX

puede ser liberado con la adición en el medio de BrdUrd que se incorpora vía exógena

(timinas en donde el grupo metilo se sustituye por un bromo) para suplir la deficiencia que

induce el tratamiento con la droga ya que es un análogo de la T. Luego de 15 horas

posliberación en células humanas del bloqueo, las células están pasando por estadios

tempranos replicativos en metafase, lo que permite aumentar la resolución de las bandas

observadas debido al menor grado de compactación de los cromosomas [14].

También se usan antimitóticos que se involucran directamente con la polimerización

o despolimerización, como colcemid o colchicina, los cuales paran el crecimiento de las

células justo en la mitosis (fase M del ciclo), permitiendo un mayor porcentaje de células en

las que se pueden visualizar cromosomas condensados. De un lado, el colcemid produce

una estructura menos compacta y la colchicina produce efectos de compactación más

rápida, por lo tanto, dependiendo de los objetivos del experimento, se puede seleccionar

uno u otro compuesto. En algunos casos se pueden combinar el bromuro de etidio a

concentraciones de 5 µg/ml más el colcemid durante una hora para lograr extendidos

prometafásicos de alta resolución combinado con alto número de mitosis. La técnica de

cultivo de linfocitos empleada en la mayoría de los laboratorios es la de Moorhead et al.,

comúnmente conocida como el método de secado al aire [15-17].

Una vez realizado el cultivo y la correspondiente fijación de las mitosis, las placas del

extendido obtenido en principio tendrán tres tipos de células: estimuladas, es decir que

están pasando por una fase del ciclo diferente a la metafase y conllevan el ciclo mitótico,

generalmente son de color rosado y de mayor tamaño que los núcleos no estimulados;

núcleos inactivos o células que no lograron acoplarse a las condiciones de cultivo y no

mantienen un menor tamaño que las células estimuladas y se visualizan de un color

morado; y células en mitosis propiamente en metafase. Es importante realizar una medida

del número de mitosis en relación con el número de células totales en el ciclo (estimuladas

mitóticas), ya que pueden ser indicativos directos que evidencian problemáticas

patológicas, entre otras. Una de estas medidas es el índice mitótico, el cual da el porcentaje

de células totales sin tener en cuenta las no estimuladas en correlación con el número de

mitosis obtenidas, y se calcula de la siguiente manera:

IM= ((cantidad de mitosis)) ⁄ ((células totales)) x 100.

El número de células totales a contar por placa generalmente es de 2000 a 3000

células, a un aumento de 40x, procurando realizar el conteo recorriendo la placa con la

fijación de una manera ordenada.


57



Microscopio.

Placa con extendido cromosómico.

Aceite de inmersión.

Placas para coordinar la posición de las mitosis (placas forradas con cinta de papel).


Pijama institucional.

Bata de laboratorio.

Guantes de látex/vinilo.

En el caso de personas con cabello largo, sujetador de cabello.

Tiempo estimado

Una hora y 45 minutos.

Elaboración de un cariotipo

Metodología

Conteo cromosómico

A cada estudiante se le asignará una fotografía de una mitosis que será el objeto de estudio,

y con la cual el estudiante realizará el cariotipo.

Localización del centrómero

Los cromosomas metafásicos se encuentran en estructuras en forma de diadas (dos

cromátidas) unidas por el centrómero identificado por ser un estrechamiento en el

cromosoma. La identificación del centrómero permite determinar los dos brazos que posee

un cromosoma: p o brazo corto y q o brazo largo.

Cálculo del índice centromérico (IC)

Se obtiene relacionando la longitud del brazo corto (Lp) con la longitud total de cada

cromosoma (LT,i) y se expresa en porcentaje según la siguiente relación:

𝐼𝐶𝑖 =𝐿𝑝,𝑖

𝐿𝑇,𝑖𝑥100 (1)

Cálculo del índice braquial (IB)

Se obtiene mediante la relación de la longitud del brazo corto (Lp) respecto al brazo largo

(Lq), mediante la siguiente relación:

𝐼𝐵𝑖 =𝐿𝑞,𝑖

𝐿𝑝,𝑖 (2)


58

Clasificación del cromosoma por ubicación del centrómero

Una vez determinados el IC y el IB se procede a la clasificación de los cromosomas en

metacéntricos, submetacéntricos, acrocéntrico y subtelocéntrico mediante el criterio que se

muestra en la tabla 1.

Tabla 1.

Calcificación cromosómica morfológica

IC IB Clasificación

50-46 1-17 Metacéntrico

45-26 1.7-3 Submetacéntricos

25-25 3-7 Acrocéntrico

<15 >7 Subtelocéntrico


Apareamiento de cromosomas homólogos

Calculados el IC o el IB y asociándose con la longitud de cada cromosoma junto con la

morfología del bandeo, se pueden organizar los cromosomas homólogos. Una correlación

que puede ayudar en el apareamiento de cromosomas homólogos y más aún en el caso de

cromosomas con coloración homogénea es el índice de homología.

𝐼𝐻𝑖 =𝐿𝑝,𝑖

𝐿𝑇,𝑖𝐿𝑞,𝑖 (3)

Este valor depende del error de la medida y la presencia o no de polimorfismos en los

cromosomas, pero junto con el bandeo pueden ayudar en el reconocimiento de los

cromosomas homólogos.

Longitud relativa (Lr)

Para proponer el cariotipo es necesario establecer un orden dentro de los cromosomas, lo

cual se logra calculando la longitud relativa de cada par homólogo, expresado en

porcentaje, lo cual se obtiene al dividir el tamaño del cromosoma entre la longitud total del

grupo haploide femenino (lthf). Para el caso de un organismo con genoma 2n se tiene:

𝐿𝑙𝑡ℎ𝑓 =∑ 𝑐𝑟𝑜𝑚𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎 𝑖𝑛

1

2 (4)

Al tratarse de una hembra con cromosomas sexuales XX la anterior correlación se

aplica, por el contrario para el caso de tratarse de un macho XY, lthf se halla restando la

longitud del cromosoma Y y sumando dos veces el cromosoma X. Para el caso de trisomías

y aneuploidías somáticas o sexuales se rearregla el genoma a condiciones de normalidad, y


59

para el caso de la trisomía se elimina el cromosoma causante de la trisomía. Para el caso de

aneuploidías se multiplica por dos el cromosoma unitario en ausencia de su homólogo.

Después, el cálculo de la longitud relativa de cada cromosoma se obtiene de la

siguiente manera:

𝐿𝑟,𝑖 =𝐿𝑇,𝑖

𝐿𝑡ℎ𝑓𝑥100 (5)

Esquema general de clasificación cromosómica

Los cromosomas de una especie cualquiera pueden ser organizados en grupos. En el caso

del genoma humano se han clasificados en los que se muestre en la tabla 2.

Tabla 2.

Esquema general de clasificación cromosómica

Grupo A Grandes cromosomas metacéntricos o submetacéntricos

Grupo B Cromosomas submetacéntricos

Grupo C Cromosomas submetacéntricos de tamaño medio

Grupo D Cromosomas acrocéntricos de tamaño medio con satélites

Grupo E Cromosomas subtelocéntricos Cromosomas submetacéntricos

relativamente cortos

Grupo F Cromosomas metacéntricos relativamente cortos

Grupo G Cromosomas acrocéntricos cortos con satélites


El estudiante podrá contar, además, con ejemplos de cariotipos de trabajos anteriores como

una guía para el desarrollo del cariotipo.

Idiograma

Se construirá un patrón de bandas manteniendo la proporción de longitud de cada

cromosoma en el genoma, bosquejando la problemática cromosómica y posibles

polimorfismos, entre otros. Un ideograma para el caso de cromosomas humanos según

diferentes patrones de bandeos se muestra en la figura 1.


60

Figura 1. Ideograma para humano normal.

Bibliografía

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62


63

Capítulo 6

Biología molecular aplicada a la clínica: extracción

de ADN, reacción en cadena de la polimerasa y electroforesis

Ana Claudia Ossa-Giraldo*

Resumen

Desde el descubrimiento de la composición y estructura del ADN por Watson y

Crick, se han logrado grandes avances en el entendimiento de las complejas

interacciones y comportamientos al interior de la célula, desde el punto de vista

molecular. El estudio de las interacciones de aquellas moléculas biológicamente

activas, conocido como biología molecular, ha brindado interesantes herramientas

para la detección, caracterización y evidencia de estas. Dichas herramientas, a su

vez, han permitido su aplicación ya no solo en la investigación básica sino también

en diferentes campos biomédicos como el diagnóstico clínico, el pronóstico, el

tratamiento de patologías o el uso en el campo forense, entre muchos otros, que son

transversales a las profesiones u oficios biomédicos como la medicina de humanos,

la medicina veterinaria y la odontología, entre otros. Existen innumerables técnicas

y protocolos que se pueden usar para cualquiera de los objetivos mencionados. En

este capítulo se estudiarán algunas de sus aplicaciones y se llevará a la práctica tres

técnicas moleculares básicas que permiten la obtención, replicación y visualización

del ADN a partir de cualquier muestra biológica que contenga células nucleadas.

Palabras clave: biología molecular, ADN, reacción en cadena de la polimerasa

(PCR), electroforesis.

* Microbióloga y bioanalista, especialista en Microbiología Clínica y estudiante del doctorado en Ciencias

Básicas Biomédicas de la Universidad de Antioquia. Actualmente, es profesora auxiliar de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín, Colombia. Correo electrónico: [email protected]



64

Metodología

Se realizarán dos prácticas demostrativas de técnicas de biología molecular enfocando su

aplicación a la clínica, con la discusión de casos clínicos cuyo diagnóstico es guiado por la

biología molecular.


Biología molecular en la clínica, extracción de ADN, reacción en cadena de la polimerasa

(PCR) y electroforesis en gel de agarosa.

Objetivos

Objetivo principal

Entender y aprender las técnicas de biología molecular descritas y su aplicación en las áreas

clínicas.


1. Extraer ADN de calidad a partir de muestras biológicas como sangre periférica de

humano.

2. Verificar la calidad del ADN extraído.

3. Entender y aplicar los principios básicos de la reacción en cadena de la polimerasa

(PCR).

4. Realizar electroforesis de ADN en gel de agarosa.

5. Integrar los conocimientos adquiridos sobre técnicas de biología molecular y su

aplicación en la práctica clínica.

Fundamento teórico

Biología molecular en la clínica

La posibilidad de estudiar ácidos nucleicos a partir de muestras biológicas ha abierto un

amplio campo para las ciencias médicas y biológicas, toda vez que su obtención permite

hacer estudios específicos del material genético de diversas especies para evaluar su

estructura y funcionalidad, lo que, en la perspectiva clínica, se ha traducido en un avance en

el descubrimiento, entendimiento, diagnóstico e intervención de un sinfín de patologías

para las cuales, antes del conocimiento de la biología molecular, su abordaje era limitado o

imposible.

Se puede describir un sinnúmero de aplicaciones clínicas de las técnicas de biología

molecular, las cuales se emplean de manera rutinaria en investigación –y cada vez más

habitualmente en el campo asistencial– alrededor de todo el mundo, incluyendo países en

vía de desarrollo como el nuestro. Si bien esta práctica se limita al entendimiento de tres de

las técnicas de biología molecular, a continuación se enumeran algunos ejemplos de la

aplicación de esta disciplina científica, incluyendo otras técnicas:


65

Trasplante de órganos: Colombia y Medellín se han convertido en referentes en

trasplantes de órganos, gracias al trabajo arduo de diversas especialidades y equipos

interdisciplinarios en biomedicina. Parte del proceso y resultado exitoso del trasplante

de órganos ha sido posible gracias a las técnicas de biología molecular, especialmente

la PCR, a través de la cual se pueden amplificar y estudiar los genes del complejo

mayor de histocompatibilidad (CMH I y II) de los donantes y futuros receptores de

órganos, permitiendo encontrar el receptor más parecido al donante desde el punto de

vista genético, el cual tiene el mejor pronóstico de aceptación biológica del injerto [1,

2].

Diagnóstico de patologías hereditarias: diversas enfermedades padecidas por el humano

tienen un origen genético y, en muchos casos, hereditario, y para muchas de estas ya

se tiene la posibilidad de hacer diagnóstico rápido y preciso a través de técnicas de

biología molecular. Un ejemplo de ello es la detección de alteraciones estructurales

de una secuencia específica del material genético por medio de técnicas como PCR

con hibridación alelo específica, la cual es usada comúnmente para la detección de

polimorfismos en el diagnóstico de enfermedades como la hemofilia A y la anemia de

células falciformes [3].

Diagnóstico precoz y prevención de enfermedades: otra aplicación de la biología

molecular en la clínica se ha direccionado por el diagnóstico temprano de patologías

o sus desencadenantes, para prevenir la aparición o complicación de estas. En este

sentido, se puede mencionar la posible detección prenatal del gen RHD que codifica

para la glicoproteína del RH (factor RH) en fetos que son hijos de madres RH negativo,

para prevenir en estos la aparición de la anemia hemolítica del recién nacido o

eritroblastosis fetal [4].

Tratamiento de patologías: las técnicas de biología molecular e ingeniería genética

también han permitido desarrollar moléculas de uso terapéutico en diferentes

patologías. Un clásico ejemplo de ello es la utilización de insulina recombinante

idéntica a la humana. Antes, la insulina para el tratamiento de pacientes diabéticos

insulinodependientes se hacía con una insulina obtenida del páncreas del ganado

porcino y vacuno; sin embargo, dado que dicha hormona no es idéntica a la humana,

se generaba en algunos pacientes el desarrollo de anticuerpos contra esta, que

finalmente les impedía seguir usándola como tratamiento. Gracias a las técnicas de

ingeniería genética y biología molecular, actualmente se usa insulina recombinante

idéntica a la humana, lo cual ha eliminado el rechazo inmunológico de los pacientes y

optimizado su tratamiento [3, 5].

Diagnóstico y seguimiento de enfermedades infecciosas: este diagnóstico se ha basado

tradicionalmente en la detección del microorganismo en una muestra clínica a través

del cultivo de esta y el consecuente crecimiento del microbio infectante. Dicha

metodología de diagnóstico requiere desde 24 horas hasta meses (como el caso del

cultivo de Mycobacterium tuberculosis), tiempo que, en muchas ocasiones, puede

significar un pronóstico pobre para el paciente. La necesidad de hacer más eficiente el

67


66

diagnóstico microbiológico de las infecciones se ha solucionado a través del uso de

pruebas rápidas basadas en la detección de antígenos y anticuerpos y, en los últimos

años, por el empleo de técnicas de biología molecular que permiten detectar ácidos

nucleicos del microorganismo infectante en muestras del paciente en tiempos

reducidos, y con una sensibilidad y especificidad comparable con los cultivos

tradicionales. De esta manera, se puede acelerar el diagnóstico de pacientes,

proporcionando la posibilidad de un tratamiento oportuno; un ejemplo de ello, en el

campo humano, son las pruebas de diagnóstico molecular de Mycobacterium

tuberculosis, las cuales reducen el tiempo de diagnóstico microbiológico de meses

(requerido a veces para el crecimiento en cultivo de esta bacteria) a días u horas. Así

mismo, encontramos en el mercado pruebas moleculares para el diagnóstico de

chlamydia trachomatis, neisseria gonorrhoeae y virus de la inmunodeficiencia

humana 1 (VIH-1) o para el control de la terapia en infecciones como las causadas por

el virus de la hepatitis C (VHC), citomegalovirus y bordetella pertusis, entre otros [5,

6]. En el campo veterinario también se ha visto un importante impacto de la detección

con técnicas de biología molecular de microorganismos causantes de infecciones,

como es el caso de brucella abortus, el cual causa abortos en el ganado, generando

importantes pérdidas económicas, y su detección temprana puede significar una

intervención oportuna para evitar esas pérdidas económicas al ganadero [7].

Medicina forense: las ciencias forenses se han visto igualmente beneficiadas con el

avance de la biología molecular. Actualmente, se usan múltiples técnicas moleculares

para el esclarecimiento de asuntos legales alrededor del mundo. Se puede hablar

entonces de las llamadas “pruebas de paternidad”, que se han convertido en un evento

cotidiano en nuestro medio; estas son realizadas con protocolos moleculares que

permiten identificar con amplia precisión el posible progenitor de un individuo en

casos legales que requieren dicho esclarecimiento. Otro uso común en el campo

forense es la detección y estudio del ADN del agresor en víctimas de diversos delitos

como los sexuales, lo que permite, en un gran número de casos, identificar con

certeza el victimario entre la lista de sospechosos [3].

Medicina veterinaria y zootecnia: las herramientas moleculares han generado grandes

avances en la medicina veterinaria y zootecnia, a través de los cuales se ha podido no

solo mitigar la morbimortalidad en los animales, sino conocer a profundidad las

diversas especies, así como beneficiar y aumentar la productividad económica a partir

de la crianza de animales. Ejemplos de ello son los diagnósticos oportunos de

patologías que afectan a los animales, como las enfermedades infecciosas (como se

mencionó) [7], y la posibilidad de conocer inequívoca y tempranamente el sexo en

aquellas especies a través de técnicas moleculares, el cual es imposible identificar

anatómicamente por la ausencia de dimorfismo sexual de algunos animales, como es

el caso de las aves, principalmente las exóticas [8, 9]. Así mismo, la ingeniería

genética ha abierto un campo de posibilidades de perfeccionamiento de las especies

con miras a una mayor producción, como lo es el cruce genético de ciertas especies


67

bovinas, la fertilización in vitro o la modificación genética de animales para que sean

más resistentes a ciertas condiciones ambientales o patológicas o para que produzcan

en mayor cantidad y calidad aquellos productos derivados, como la carne y la leche

[10, 11].

Odontología: en el campo de la odontología, al igual que en las otras áreas biomédicas,

la biología molecular ha impactado la práctica clínica y el entendimiento de las bases

celulares y moleculares del desarrollo dental y las estructuras maxilofaciales. Por

ejemplo, a través de estas herramientas se pudo concluir que la mutación del SOSI está

relacionada con la fibromatosis gingival hereditaria, o se sabe que una mutación en el

gen que codifica para la sialofosfoproteína de la dentina genera dentinogénesis

imperfecta tipo II [12]. La aplicación de la biología molecular es útil para la

clasificación de los tumores orales, para el diagnóstico y el pronóstico del cáncer oral

o para el desarrollo de fármacos o mejoramiento de estos [13]. Además, esta

disciplina también ha permitido el estudio de las biopelículas de microorganismos

que se forman sobre las estructuras bucales y su mutua interacción [14].

Aunque los anteriores ejemplos solo cobijan una parte de la amplia aplicación de la

biología molecular, se hace evidente entonces la necesidad y obligatoriedad de que el

médico general, el médico veterinario y zootecnista, el odontólogo y todos aquellos

profesionales de las áreas biomédicas, desde sus enfoques, posean conocimientos de los

principios básicos de las técnicas moleculares y dimensionen su aplicación clínica y

práctica.

Extracción de ADN

La extracción de ADN es el método por el cual se puede recuperar este material genético de

muestras orgánicas. Dicha extracción implica la obtención del ácido nucleico, su

purificación y cuantificación, pues es necesario garantizar que el material obtenido es de

suficiente calidad para desarrollar de manera óptima otras técnicas para su estudio.

Dependiendo del tipo de muestra biológica a partir del cual se vaya a extraer el ADN, los

protocolos pueden tener ligeras variaciones (por ejemplo, es diferente asilar ADN a partir de

una célula animal que de una célula vegetal o de una bacteria gramnegativa que de una

bacteria grampositiva, en función de sus estructuras como la pared celular). Según lo

anterior, el aislamiento de ADN se puede resumir en los siguientes pasos:

Lisis celular: se usan sales y detergentes (comúnmente el SDS) que destruyen

macromoléculas por desnaturalización, llevando a la eliminación de la membrana de

la célula, y luego la nuclear, para permitir la liberación del material genético [15, 16].

Purificación del ADN: una vez lisados los núcleos y liberado el ADN, hay que separar este

material genético de los materiales contaminantes, como sus proteínas asociadas. Este

procedimiento se hace generalmente con fenol, o fenol/cloroformo y centrifugación

de manera repetida; el fenol desnaturaliza las proteínas y las precipita, lo que es 69


68

optimizado con la centrifugación. Este procedimiento permite que se separe el ADN,

el cual queda en la fase acuosa de la solución, mientras que las proteínas quedan

como precipitado [15, 16].

Precipitación del ADN: después de la separación del ADN y de las proteínas, el primero es

recuperado de la fase acuosa y se hace un proceso de precipitación con etanol frío

para su almacenaje y conservación [15, 16].

Cuantificación y control de calidad del ADN: para tener una idea de la cantidad y la

calidad del ADN extraído, se puede hacer una verificación de este por medio de

espectrofotometría, hallando la densidad óptica (DO) de la muestra a 260 y 280

nanómetros (nm), lo que permitirá, con la aplicación de algunas fórmulas, saber qué

concentración se obtuvo de ADN y su nivel de pureza [17]. Las fórmulas (relación

260/280) y su interpretación están ubicadas en la práctica de ese tema (ver página 77).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Una vez obtenida una muestra de ADN, esta se puede analizar para hallar un fragmento

específico deseado, por ejemplo, verificar si esa muestra de ADN contiene un gen mutado

que codifica para alguna proteína causante de una enfermedad. Para lograr esto de una

manera más óptima, se hace uso de la reacción en cadena de la polimerasas (PCR por sus

siglas en inglés), la cual es una técnica de biología molecular que permite amplificar

muchas veces un fragmento deseado de ADN al hacer múltiple copias de este por medio de

la enzima DNA polimerasa a través de la aplicación de diversos ciclos térmicos que generan

la desnaturalización del ADN y su replicación de manera exponencial y semiconservativa

ciclo tras ciclo. En la figura 1 se muestra un diagrama del principio de la PCR [5, 15, 17].


69

Figura 1. Imagen de reacción de cadena de la polimerasa [18]. Texto traducido por la

autora

ADN Genómico

Secuencia blanco

Ciclo 1 Produce

2 moléculas

Ciclo 2 Produce

4 moléculas

Ciclo 2 Produce 4

moléculas; 2 moléculas (en los recuadros

blancos) se unen a la secuencia

blanco

Desnaturalización: calentamiento breve para separar las hebras

Alineación: enfrentamiento para permitir que los cebadores formen puentes hidrógenos con la secuencia blanco

Elongación: la ADN polimerasa adiciona nucleótidos al extremo 3’ de cada cebador


70

Electroforesis en gel de agarosa

Finalmente, luego de extraer el ADN y someterlo al proceso de PCR, es necesario evidenciar

si la muestra problema contiene el fragmento que buscamos, para lo cual hacemos uso de la

electroforesis en gel de agarosa. Esta técnica permite separar los fragmentos de ADN por

tamaños al aplicar electricidad a este, lo que genera su desplazamiento o migración a través

del gel de agarosa dispuesto en una cámara de electroforesis. Gracias a la carga negativa del

ADN, este migrará del ánodo al cátodo de la cámara a través de los poros del gel; los

fragmentos de ADN más pequeños tendrán más facilidad de atravesar el gel, lo que les

permitirá llegar en menor tiempo al otro lado de la cámara de electroforesis en comparación

con fragmentos más pesados. Esta diferencia entre la velocidad de migración permite que

las porciones de ADN se separen y podamos comprobar si se encuentra en la muestra

problema el fragmento de ADN que buscamos, de un tamaño ya conocido, al compararlo

con una escalera de ADN de diversos pesos (tamaños) llamada marcador de peso molecular.

Para visualizar el ADN sembrado en el gel y saber la distancia de recorrido, es necesario

usar fluorocromos intercalantes del DNA para excitarlos con luz UV y realizar la

visualización correspondiente [5, 15, 17].

En la figura 2 y 3 se muestran diversas fotografías de geles de agarosa luego de la

electroforesis de fragmentos de ADN posPCR (amplicones).

Figura 2. Ensayo efecto tres colorantes. * Corrido electroforético luego de una PCR para

amplificación de genes de Mycobacterium bovis: obsérvense los pozos de siembra de las

muestras y la migración diferenciada de tres colorantes indicadores de corrido de peso

molecular diferenciado. [19]

71


71

Figura 3. PCR gen TAQM3 y TAQM4. * Corrido electroforético luego de una PCR para

amplificación de genes de Mycobacterium bovis: 1: marcador de peso molecular de 100pb;

2 y 3: controles positivos, banda de 122pb; 4-19: muestras; 20: control negativo.

Obsérvense las bandas fluorescentes de ADN con bromuro de etidio. [19]

Figura 4. Detección b-Actina, TLR2, TLR3 y TLR4.

Corrido electroforético luego de una PCR para amplificación del mRNA de b-Actina, TLR2,

TLR3 y TLR4. Obsérvense los pozos de siembra de las muestras y la migración

diferenciada de los cuatro amplicones en tres muestras (células dendríticas plasmacitoides

de dos donantes sanos y células mononucleares totales). Los tres primeros pozos

corresponden a b-Actina, luego tres pozos de TLR2, luego el marcador de tamaño

molecular, luego TLR3 que esta negativo y por último tres pozos de TLR4. [20]


72

Figura 5. Electoforesis DNA genómico.

Corrido electroforético luego de una PCR para amplificación de genes de Mycobacterium

bovis: 1: marcador de peso molecular de 200pb; 2 y 3: control positivo; 19: control

negativo; 4-18: muestras. Obsérvese en los pozos de las muestras DNA genómico en los

pozos de siembra; este es muy pesado para migrar a través del gel. [19]

Figura 6. PCR con Smear.

Corrido electroforético luego de una PCR para amplificación de genes de Mycobacterium

bovis: 1: marcador de peso molecular de 200pb; 2: control positivo; 20: control negativo; 3-

19: muestras. Obsérvese en las muestras 4, 6, 8, 10 y 12, 14 y 16 el Smear que es un barrido

de ADN generado posiblemente por una alta concentración de ADN o una inadecuada

extracción. [19]


73

Figura 6. Detección TLR5, TLR10 y TLR9.

Corrido electroforético luego de una PCR para amplificación del mRNA de TLR5, TLR10 y

TLR9. Obsérvense los pozos de siembra de las muestras y la migración diferenciada de los

dos amplicones en tres muestras (monocitos de tres donantes sanos). Los tres primeros

pozos corresponden a TLR5, seguido de tres pozos de TLR10 que están negativos,

nuevamente el marcador de tamaño molecular y, por último, tres pozos de TLR9. [20]


Se llevarán a cabo dos sesiones prácticas.

Primera sesión

Extracción de ADN por Salting Out y cuantificación por espectrofotometría.

Recursos materiales (reactivos, equipos, muestras, animales)

Bloque térmico

Centrifuga

Micropipetas

Vortex

Espectrofotómetro

Agua destilada

Agua inyectable

Alcohol al 70%

Isopropanol puro

Solución A

Solución B

Solución C

Tubos ependorff de 1,7 ml


74

Tubos ependorff de 0,5 ml

Puntas para micropipeta

Equipo de seguridad personal requerido: bata de laboratorio

Procedimiento

Extracción de ADN

1. Tomar entre 100 a 300 µl de sangre previamente homogenizada en un tubo de reacción

limpio y estéril de 1,5 ml debidamente rotulado, con el código de la muestra.

Completar a 1500 µl con solución A y mezclar por inversión.

2. Se marcará un tubo como control negativo (-) y la fecha, al cual se le hará todo el

procedimiento remplazando los µl de sangre por H2O inyectable y se procede como

una muestra normal.

3. Centrifugar a 13.000 rpm durante 3 minutos. Descartar el sobrenadante.

4. Lavar suavemente el precipitado con solución salina al 0,9% usando pipeta Pasteur

estéril; cuidar de no remover el precipitado. Descartar suavemente el sobrenadante.

5. Agregar 150 µl de solución B (precalentada a 37º C hasta lograr que se disuelvan

completamente las sales) y agitar con vórtex a 3000 rpm hasta una disolución parcial o

total del botón.

6. Agregar 50 µl de solución C y agitar con vórtex a 3000 rpm durante unos segundos.

7. Centrifugar a 13.000 rpm durante 3 minutos.

8. Transferir el sobrenadante a un tubo de reacción limpio y estéril de 1,5 ml debidamente

rotulado.

9. Agregar 200 µl de isopropanol frío. Mezclar por inversión hasta detectar la malla de

ADN.

10. Centrifugar a 13.000 rpm durante 3 minutos.

11. Descartar el sobrenadante y hacer un lavado del precipitado con 100 µl de etanol al

70%.

12. Agregar aproximadamente 200 µl de agua inyectable (estéril) (dependiendo de la

cantidad de ADN detectado cualitativamente).

13. Aplicar vórtex entre 10 y 15 segundos de 2500 a 3000 rpm hasta lograr que el botón se

desprenda y se homogenice el ADN (disuelto totalmente en la solución).

14. Incubar a 93° C durante 3 minutos para lograr la completa homogenización.

15. Almacenar a -20° C en la nevera después de la respectiva cuantificación y dilución.

Nota: cuando la sangre a disposición tiene mucho tiempo de almacenamiento en la nevera o

llega en condiciones poco óptimas (sangre lisada, con coágulos, etc), se procede a:

Lavar dos veces con solución A.

Lavar dos veces con solución salina al 0,9%.

Precipitar con 300 µl de isopropanol.


75

Cuantificación del ADN por espectroscopia

Este método es recomendable si la muestra es pura (contaminación mínima con proteínas,

fenol, agarosa u otros ácidos nucleicos).

1. Realizar una dilución 1/100 de la muestra de DNA. El volumen final mínimo debe ser

1500 μl.

2. Encender el espectrofotómetro: en el menú principal aparecerá el botón “Medir ADN”.

3. Determinar la longitud de onda: 260 nm para calcular la concentración de ADN en la

muestra; densidad óptica (DO) = 1 corresponde aproximadamente a 50 μg/ml para ADN

de doble cadena, 40μg/ml para ADN de cadena sencilla y RNA, y 20μg/ml para

oligonucleótidos de cadena sencilla. 280 nm para proteínas.

4. Colocar la cubeta de modo que la luz atraviese los lados transparentes de la celda.

5. Con el botón “Autocero” ajustar. Tener en cuenta que la cubeta debe tener el mismo

solvente que se utilizó para preparar la dilución de la muestra de ADN.

6. Descartar el solvente. Lavar la cubeta dos veces con agua destilada y secar con un

pañuelo nuevo desechable. La cubeta debe tomarse siempre por los lados opacos para

evitar que se resbale de las manos.

7. Llenar la cubeta con 1,5-2 ml de la muestra de interés.

8. Medir.

9. Escribir los resultados: relación 260/280, concentración de proteínas y concentración

de DNA.

10. Repetir desde el paso 6 al 8.

Nota: la relación entre las lecturas a 260 nm y 280 nm (DO260/DO280) indica el grado de

pureza del ácido nucleico. Las preparaciones puras de DNA y RNA deben tener valores de

1,8 y 2,0, respectivamente. Si hay contaminación con proteína o fenol, la relación

DO260/DO280 será significativamente menor a 1,8.

Realizar dilución a 10 ng/µL para la PCR en tubos de reacción de 0,5 ml según los cálculos

hechos en el numeral anterior. Almacenar a -20° C.

Segunda sesión

PCR y electroforesis.

Recursos materiales (reactivos, equipos, muestras, animales)

Kit QIAGEN Multiplex PCR

Primers de interés

Muestra de DNA humano

Tubos ependorff de 0,2 ml para PCR

Tubos ependorff de 0, 5 ml

Micropipetas


76

Puntas micropipetas

Minicentrífuga

Vórtex

Termociclador

Equipo de seguridad personal requerido: bata de laboratorio, guantes de látex nuevos, tapa-

bocas nuevo.

Procedimiento

1. Tomar las muestras de ADN (previamente cuantificadas).

2. Marcar los tubos de PCR según el ensayo a realizar.

3. Usar los tubos de 0,5 ml para hacer las mezclas de PCR.

4. Tomar 1 µL de agua del kit por cada reacción a ejecutar y adicionarla al tubo de 0,5 ml.

5. Tomar 3 µL de la mix del kit por cada reacción y adicionarla al tubo de 0,5 µL.

6. Tomar 1 µL de los primers de interés por cada reacción y adicionar al tubo de 0,5 ml.

7. Tomar la mezcla del tubo de 0,5 ml y adicionar 5 µL a cada tubo de PCR.

8. Dar vórtex a las muestras de ADN y adicionar 1 µL de muestra a cada tubo de PCR.

9. Programar el termociclador.

10. Poner las muestras y poner a funcionar el programa seleccionado o programado en el

termociclador.

11. La amplificación puede tardar hasta tres horas. Una vez termine el programa en el

termociclador, las muestras pueden ser almacenadas a -20º C.

Electroforesis en gel de agarosa

1. Pesar la agarosa haciendo el cálculo para que el gel quede al 1,5% de concentración de

agarosa (los gramos a pesar dependen del tamaño de la cama de electroforesis a usar).

2. Mezclar la agarosa con agua destilada en un Erlenmeyer y calentar en un microondas

hasta llegar al punto de ebullición. Evitar que la agarosa se derrame al llegar al punto

de ebullición.

3. Dejar enfriar la solución hasta una temperatura aproximada a 30º C y adicionar 13 ul

de bromuro de etidio. Mezclar. Nota: Este procedimiento se debe realizar en una

cámara de extracción de gases.

4. Servir el gel en la cama de electroforesis y adicionar los peines garantizando una buena

formación de los pozos de siembra.

5. Dejar solidificar.

6. Hacer un mapa del gel a servir, indicando la ubicación en cada pozo de las muestras de

productos de PCR, controles negativo y positivo, y el marcador de peso molecular.

7. Tomar 10 uL de marcador de peso molecular y mezclar con 3 uL de buffer de carga.

Servir cuidadosamente en el pozo del gel que corresponda.

8. Repetir el paso anterior para cada uno de los controles y muestras de productos de PCR

(amplicones).


77

9. Una vez se termine de servir las muestras en el gel, tapar la cámara de electroforesis y

conectar a la fuente de poder.

10. Programar un corrido de 2 horas a 120 voltios.

11. Revisar constantemente el corrido de ADN.

12. Una vez terminado el corrido electroforético, tomar el gel y visualizarlo en un

transiluminador de luz UV.

13. Analizar las bandas e interpretar los resultados.

Ejercicios de aplicación

Ejercicio 1

Paciente masculino de 24 años de edad, quien consulta a su médico por dificultad para

respirar, tos productiva de 3 meses de evolución, hemoptisis (esputos con sangre), pérdida

de peso, fiebre intermitente y sudoración nocturna. Luego del examen físico, el médico

sospecha que el paciente tiene tuberculosis pulmonar (causada por la bacteria

Mycobacterium tuberculosis). Para confirmar el diagnóstico, se decide realizar una PCR a

partir de muestras de esputo del paciente para detectar ADN de la bacteria y confirmar la

infección sospechada. En la PCR se pretende amplificar un fragmento de ADN de 250 pb

correspondientes a un gen específico de la especie M. tuberculosis. Luego de los

respectivos procedimientos de laboratorio, en la figura 7 se muestran los resultados del

corrido electroforético.

Figura 7. Muestra de resultados del corrido electroforético.


78

Según los resultados, responda:

1. ¿Funcionó adecuadamente esta prueba molecular?

2. ¿Por qué no hay banda en el control negativo?

3. ¿Cuál es el resultado de la PCR?

4. ¿Cuál es la conclusión diagnóstica?

Ejercicio 2

En consulta, un odontólogo identifica en un paciente lesiones de la mucosa oral indicativas

de procesos malignos. Para confirmar su diagnóstico, el odontólogo recurre al estudio de

biopsias de las lesiones por técnicas histoquímicas y moleculares; dentro de las técnicas

moleculares, se pretende detectar mutaciones del gen p53 que está implicado en actividades

antitumorales, ya que las mutaciones en este gen están asociadas a procesos malignos

(cáncer). Para detectar dichas mutaciones, se realizó una PCR para detectar el gen p53 y

luego se secuenció este para confirmar si estaba normal (secuencia esperada de nucleótidos)

o mutado (alteración en la secuencia de nucleótidos).

1. ¿Cómo esperaría usted encontrar o visualizar el producto de esta PCR en caso de que

hubiese alguna mutación en el gen? ¿Habría alguna alteración en el corrido

electroforético del fragmento amplificado en comparación con el control positivo?

2. ¿Por qué fue necesario secuenciar el gen para confirmar si había mutación?

Ejercicio 3

En una institución de protección de fauna silvestre han recuperado de cautiverio un ave

psitácida. Para el proceso de identificación, recuperación y reproducción del ave, el

personal del centro necesita saber el sexo de este, sin embargo, no es posible hacerlo

fenotípicamente porque esta especie no presenta dimorfismo sexual. Para identificar el sexo

se toma muestra de ADN y se amplifica por PCR el gen CHD. Se sabe que los machos tienen

cromosomas ZZ (homocigóticos) y las hembras cromosomas ZW (heterocigóticos),

características que generan diferencias en los fragmentos amplificados del gen CHD pues se

conoce que el fragmento derivado del cromosoma W siempre es más grande que el Z. Así,

en los machos se obtiene una sola banda de ADN amplificado luego de una PCR y en las

hembras dos bandas de diferente tamaño (correspondientes a los fragmentos derivados de Z

y W, respectivamente). En la figura 2 se ilustra el resultado de la PCR.


79

Figura 2. Resultado de la PCR

1. ¿Cuál es el sexo del ave?

2. ¿Funcionó adecuadamente esta PCR? ¿Por qué?

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Medellín: Universidad de Antioquia; 2011.


81

Anexo 1. Normas de ingreso para la práctica de laboratorio de biología molecular o similares

Mantener niveles de asepsia y normas de bioseguridad con altos estándares es una prioridad

en las ciencias de la salud para aquellos espacios donde se trabaja con objetivos docentes,

con piezas humanas, placas con tejidos o cultivos celulares, por ello se ha elaborado un

manual particular para hacer uso de este en las presentes prácticas. Lo anterior cobija las

prácticas docentes, por esto se hace necesario su conocimiento y divulgación, previo al

inicio del curso.

Ingreso al laboratorio

1. Los estudiantes deben esperar al profesor fuera del laboratorio.

2. Una vez el profesor ingrese al laboratorio, debe esperar 10 minutos a que ingresen todos

los estudiantes, tiempo a partir del cual se cerrará la puerta y se impedirá el ingreso a los

estudiantes.

3. Al iniciar la práctica el estudiante deberá aportar el material que le sea solicitado

dependiente de cada práctica.

4. Los estudiantes que no lleven el material requerido para el laboratorio no podrán estar en

la práctica.

Medidas de seguridad

1. Los estudiantes deberán usar batas blancas, largas y limpias para entrar al laboratorio

(estándar para la Universidad Cooperativa de Colombia).

2. Los estudiantes deberán usar gafas de protección y guantes de látex en el desempeño

de la práctica cuando esta lo requiera.

3. Los estudiantes no podrán comer, beber, masticar chicle, fumar y, en general, llevar

objetos a la boca dentro del laboratorio, al igual que no deben usar teléfonos celulares.

4. El aseo del laboratorio es de primordial importancia, por lo que los estudiantes deberán

cooperar con el mantenimiento de la limpieza de sus mesones de trabajo y del material

que así lo requiera. Deberán limpiar con solución desinfectante el área de trabajo antes

de empezar y después de terminar la práctica.

5. La basura debe colocarse en los recipientes correspondientes, no deberá ser guardada

en los cajones o vertederos. Así mismo, no deberán tirarse residuos o desperdicios a los

lavabos.

6. Los estudiantes son responsables de que las llaves del agua y del gas de sus mesas de

trabajo queden debidamente cerradas al finalizar la práctica.

7. Los estudiantes deberán abstenerse de colocar sobre las mesas de trabajo cualquier

material que no sea requerido para la realización de la práctica. Todos los objetos

personales deberán ser guardados en las áreas asignadas.

8. En caso de cualquier accidente o contaminación accidental, el estudiante deberá

notificar de inmediato al profesor.

9. Los estudiantes no podrán permanecer dentro del laboratorio después de que el

profesor haya salido.

10. Los estudiantes deben lavarse las manos con agua y jabón al finalizar cada práctica (o

antes de salir del laboratorio).


82

Anexo 2. Presentación de informes

Los informes de las prácticas se entregarán a la semana siguiente de haberse realizado y

seguirán el siguiente protocolo:

Portada

1. Nombre de la universidad

2. Facultad

3. Materia

4. Grupo

5. Título de la práctica

6. Nombre del estudiante

7. Fecha

Introducción

1. Fundamentos teóricos

Materiales y métodos experimentales

1. Materiales utilizados

2. Descripción breve de las técnicas o métodos experimentales utilizados

Resultados 1. Descripción de los resultados obtenidos

2. Tablas

3. Figuras

4. Gráficas

5. Análisis de los datos

Cuestionarios

Estos deben ser suministrados por el profesor.

Discusión 1. Análisis de los resultados obtenidos

2. Observaciones

3. Conclusiones

4. Recomendaciones

Bibliografía 1. Libros

2. Artículos

3. Sitios de Internet


83

ANEXO 3. Planificación académica

Grupos de trabajo

1. Los estudiantes deberán crear grupos de trabajo el primer día del curso y estos serán

mantenidos por el resto del semestre.

2. En cada práctica se dotará a cada grupo del material de trabajo que utilizará,

responsabilizándose de su integridad para entregarlo al finalizar la práctica. El material o

equipo que sea destruido o perdido será restituido por el grupo responsable.

Obligaciones prepráctica

1. Los estudiantes deberán presentarse al laboratorio adecuadamente preparados, con los

materiales o las revisiones bibliográficas referentes a la práctica.

2. El estudiante debe leer con detenimiento la técnica a seguir y, en caso de existir dudas,

consultar con el profesor antes de iniciar la práctica.

3. Se hará en algunos casos un examen previo sobre la práctica a realizar.

Desarrollo de la práctica

1. Los estudiantes deben mantener el orden dentro de los laboratorios.

2. Al inicio de cada práctica se designará un estudiante como responsable de seguridad

para verificar que se cumplan las normas de este reglamento.

3. Los estudiantes y profesores deben planear su trabajo de manera que la práctica se

complete puntualmente, y puedan salir del laboratorio 10 minutos antes de la próxima

clase o práctica, previendo el tiempo que utilizarán para recoger, ordenar el material y

limpiar su mesa.

4. No se permite el desarrollo de actividades diferentes a la práctica durante la estancia en

el laboratorio, lo cual incluye estudiar otras materias o realizar trabajos.

5. No se permite visitas personales por parte de los estudiantes.

Obligaciones pospráctica

1. Los estudiantes deben enjuagar el equipo utilizado y disponer de los residuos generados

de la manera adecuada.

2. Los estudiantes deberán colocar el material utilizado en la zona designada para la

recolección de equipo.

3. Los estudiantes deberán verificar que las llaves de agua y gas de su mesa de trabajo

estén completamente cerradas.

Informes sobre prácticas de laboratorio

1. El informe de la práctica deberá ser entregado en la siguiente semana de su realización.

2. El informe deberá ser entregado antes del inicio de la siguiente práctica al profesor. El

profesor anotará en el formato correspondiente la constancia de recepción del informe.


84

Es responsabilidad del estudiante verificar que se diligencie ese formato. Por ningún

motivo se recibirán informes extemporáneos.

3. El informe de prácticas se considera un trabajo original generado por cada estudiante o

grupo de trabajo. El contenido de la práctica deberá ser redactado íntegramente por el

estudiante, y cuando se utilicen citas textuales, debe de indicarse la fuente. La copia de

material sin acreditar al autor se considera plagio, el cual será reportado a las autoridades

académicas de la facultad.

Sanciones

1. El incumplimiento de estas normas será sancionado por el profesor, y dentro de los

marcos que contempla el reglamento académico.

2. Se emitirá un reporte a las directivas académicas de la facultad.

3. Si los incumplimientos persisten se expondrá el caso ante el Consejo de Facultad.

4. En caso de encontrarse copias o reproducciones en el contenido de los informes de las

prácticas, se anularán ambas copias y se le enviará el informe de la falta disciplinaria a

las directivas académicas correspondientes.

Bioseguridad en los laboratorios

Pasos a seguir después del accidente

1. Exposición percutánea: lave inmediatamente el área expuesta con agua y jabón

germicida; si la herida está sangrando, apriétela o estimule el sangrado, siempre que el

área corporal lo tolere. Después, aplique solución desinfectante después de concluido el

lavado.

2. Exposición en mucosas: lave profusamente el área con agua o solución salina.

3. Exposición en piel no intacta: lave el área profusamente con solución salina y aplique

solución antiséptica.

4. Exposición en piel intacta: lave simplemente el área con agua y jabón profusamente.

Evaluación del accidente

1. Reportar accidente: todos los estudiantes y el personal que labore en el laboratorio deben

conocer la importancia de informar inmediatamente una exposición ocupacional y tener

garantías de la confidencialidad y el respeto con el cual será tratado.

2. El reporte se debe hacer dentro de las primeras 24-72 horas de presentado el accidente.


85

Tabla 1.

Convenciones para alertas de accidentalidad en el laboratorio

Símbolo Leyenda

Las superficies pueden calentarse durante su uso.

Esta es capaz de generar corrientes letales. Utilice las mismas precauciones que con cualquier dispositivo eléctrico. No opere sin la cubierta en su lugar. No

opere en humedad o ambientes húmedos en los cuales esta pueda causar daño en los componentes eléctricos internos, no opere con cables conectores con

alambres sueltos.

Radiación ultravioleta que puede ser perjudicial para la piel y los ojos, no se exponga a esta radiación sin protección ocular o de piel.

Nota.

Etiqueta de un producto químico

El etiquetado reglamentario de las sustancias y los preparados peligrosos es un medio

sencillo para informarle y alertarle sobre los peligros relacionados con su utilización.

Cuando los productos son transvasados, la etiqueta deberá ser sistemáticamente

reproducida.

1. En las etiquetas habrá, entre otras cosas, uno o varios símbolos de peligro, así como un

número restringido de indicaciones sobre los riesgos y sobre las medidas de prevención

a adoptar.

2. La etiqueta le informa inmediatamente sobre el producto y le permite evitar confusiones

y errores a la hora de utilizarlo.

3. La etiqueta es imprescindible en caso de accidente, le dará las indicaciones necesarias

sobre el comportamiento a seguir en caso de accidente.

Figura 1. Etiquetas de indicaciones para prevenir accidentes en el laboratorio.


86

Convenciones

1: identificación del producto (nombre químico de la sustancia o nombre comercial del

preparado).

2: composición (para los preparados, relación de sustancias peligrosas presentes según

concentración y toxicidad).

3: responsable de la comercialización (nombre, dirección y teléfono).

4: identificación de peligros.

5: descripción del riesgo (frases R*).

6: medidas preventivas (frases S*).

Pictograma de productos químicos

Tabla 3.

Etiquetas para riesgos de incendio o explosión

Símbolo Significado Descripción de los riegos Medidas preventivas

F – Fácilmente inflamable

Productos de fácil inflamación por la acción de

una fuente de energía (llama, chispa) a temperatura

ambiente.

Prohibido fumar. Almacenar los productos en un

lugar bien ventilado. Guardar los productos

inflamables . (Símbolo F) bien separados de los productos comburentes (O). No utilizar cerca de una fuente

de calor. No llevar ropas sintéticas.

F+ – Extremadamente

inflamable

Productos que pueden inflamarse fácilmente por la

acción de una fuente de energía (llama, chispa)

incluso por debajo de los 0º.

O – Comburente

Productos que pueden favorecer o activar la

combustión.

E – Explosivo

Productos que pueden explotar por la acción del

calor, de un choque o de un rozamiento

Prohibido fumar. Evitar el exceso de calor y proteger contra los rayos

solares. No ponerlos cerca de fuentes

de calor, lámparas, radiadores, etc.



87

Tabla 4. Etiquetas para riesgos de alteración de la salud


R – Radioactivo

Cancerígenos o problemas de esterilidad.

Productos peligrosos en caso de penetración en el organismo por la nariz, la boca o a través de la piel. Productos que pueden alterar el

conjunto del organismo o lesionar únicamente, ciertos órganos: pulmones, hígado, corazón,

nervios. Pueden causar profundas

alteraciones en el organismo, incluso la muerte. Dependiendo

del grado de toxicidad que presentan, estos productos son

calificados de “Tóxicos” y de “Muy tóxicos” o de “Nocivos”.

Ciertos de estos productos son definidos como cancerígenos, ya

que pueden provocar cáncer. Otros son definidos como

mutágenos, ya que pueden implicar mutaciones genéticas que

pueden provocar tumores.

Prohibido fumar

Utilizar equipos de protección individual (EPI) para evitar

cualquier contacto. Trabajar en locales bien

ventilados. Buena higiene: lavarse las

manos, no comer durante la utilización de los productos.

Conservar los productos en el envase de origen.

Tras el uso, lavarse bien la cara y las manos.

Verter siempre el producto en el agua y no al contrario.

T – Tóxico

T+ – Muy Tóxico

X n – Nocivo

X I – Irritante

C – Corrosivo

Productos que pueden provocar la destrucción de tejidos vivos. Queman la piel y las mucosas,

pueden producir lesiones graves que pueden provocar

cicatrices. Nota. Elaboración propia

Tabla 5.

Etiquetas para riesgos del medio ambiente


N – Peligro para el medio ambiente

Se trata de sustancias contaminantes y tóxicas para la fauna, para el aire, la

capa de ozono.

Tratar el producto y sus desechos (separe, recicle,

elimine), según la legislación.



88

Almacenamiento de sustancias teratógenas, mutagénicas y cancerígenas

Son aquellas sustancias que, con base en las monografías de la Agencia Internacional del

Cáncer (IARC), están catalogadas como:

1. Carcinógenos para los humanos o razonablemente sospechoso como cancerígenos a los

humanos.

2. Teratógenos o mutagénicas para los humanos.

3. Almacenar las sustancias carcinógenas, mutagénicas y teratógenas separadas de otras

sustancias.

4. Identificar en un croquis o un plano de laboratorio la localización de estas sustancias.

5. Limitar la cantidad almacenada de estas sustancias a lo estrictamente necesario para una

semana de trabajo.

6. Mantenga un inventario de las sustancias carcinógenas en el laboratorio.

7. Mantenga al personal femenino en estado de gestación totalmente aislado de las áreas

donde se utilicen estas sustancias.

Normas de seguridad en la utilización de equipos

1. Los equipos y aparatos nunca deben colocarse en zonas de paso, en particular en los

pasillos del laboratorio.

2. Todos los aparatos con toma eléctrica deberán cumplir las normativas de seguridad

correspondientes. Nunca deben utilizarse en zonas mal aisladas y expuestas a la

humedad.

3. Las fuentes de calor (calentadores, termobloques, etc.), sobre todo si se alcanzan

temperaturas elevadas, deberán estar debidamente señalizadas para evitar quemaduras

accidentales.

4. Todos los procedimientos de utilización de aparatos deberían contar obligatoriamente

con apartados relativos a su utilización segura.

Es necesario aclarar que para cada equipo existen ciertas normas según su empleo o

función en el laboratorio, como es el caso de neveras, congeladores, incubadoras,

termocicladores, baños serológicos, centrífugas, etc.

Ronald José Villa-Mesa Universidad Cooperativa de Colombia

Sede Barrancabermeja

manual de prÁcticas de laboratorio en …repository.ucc.edu.co/bitstream/ucc/1191/1/manual de...

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