manual 2014

FACULTAD DE CIENCIAS

MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA II.

Semestre 2014-1

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA II.

Reglamento interno de higiene y seguridad del laboratoriode biología molecular de la célula II 2

Normas de seguridad en el laboratorio 3

Formas de expresar la concentración de una solución 5

Unidades físicas 5

Unidades químicas 5

Cálculos y medidas de utilidad en bioquímica 5

Ejercicios 7

Práctica1. Propiedades generales de los lípidos 8

Práctica 2. Membranas y ósmosis 12

Práctica 3. Transporte a través de la membrana 18

Práctica 4. Carbohidratos 22

Practica 5. Fermentación de la glucosa por la levadura de panificación 27

Práctica 6. Estudio del bombeo de protones por levaduras. Efecto de los inhibidores de lacadena de transporte de electrones y de los desacoplantes 30

Practica 7. Metabolismo de lípidos. Conversión de grasas a sacarosa 33

Práctica 8. Reducción del 2-6 diclorofenol-indofenol (DCPIP) dependiente de la actividadfotosintética de cloroplastos aislados de Spinacea oleraceae (espinaca)

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1

Práctica 9. Actividad enzimática de la Pirúvico Transaminasa 42

Anexo I 45

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REGLAMENTO INTERNO DE HIGIENE Y SEGURIDAD DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA II

ART. 1 La observancia del presente reglamento es obligatoria para el personal académico, alumnos y

personal administrativo que labora en el laboratorio de Biología Molecular de la Célula II. Este

reglamento deberá darse a conocer a cada uno de los integrantes.

ART 2 Se deberá conocer el sistema de alertamiento, las zonas de seguridad, las rutas de

evacuación y las medidas de seguridad establecidas en el laboratorio.

ART. 3 Mientras se esté en el laboratorio es obligatorio el uso de bata. Usar guantes y lentes de

protección cuando maneje material tóxico por contacto, radioactivo o contaminado infeccioso.

ART. 4 Mientras se esté en el laboratorio, queda estrictamente prohibido fumar, beber, comer,

aplicarse cosméticos y el uso de celulares.

ART. 5 Queda prohibido sentarse en las mesas de trabajo.

ART. 6 Se deberán conservar limpias y ordenadas las mesas de trabajo.

ART. 7 Es obligación del alumno revisar y contar perfectamente el material de cristalería que le sea

entregado para la realización de la práctica así como revisar el buen funcionamiento de los aparatos

eléctricos. Lo mismo aplica para la devolución del material. Cualquier anomalía presentada del

material o los equipos debida al mal uso de éste (pérdida, rotura o descompostura) será

responsabilidad del alumno.

ART. 8 Se deberá evitar pipetear líquidos con la boca. También se deberá evitar dejar las pipetas

dentro de los frascos de reactivos y / o soluciones.

ART. 9 Es deber del alumno consultar con el profesor que imparte la práctica, cualquier duda en el

procedimiento y/o en el manejo del equipo.

ART. 10 Es obligatorio que se sigan las recomendaciones del uso de aparatos e instrumentos de

laboratorio, las cuales se les serán indicadas por el profesor que imparte la práctica.

ART. 11 Es deber del profesor de la materia nombrar una comisión de seguridad, la cual estará

encargada de vigilar el seguimiento de este reglamento así como de evitar dejar sin vigilancia el

laboratorio durante el periodo que abarque la clase.

ART. 12 Las personas a las quienes se le sorprenda haciendo mal uso de los equipos, materiales,

instalaciones, etc. propios del laboratorio serán sancionados conforme a la Legislación Universitaria

según la falta cometida.

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NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Conocer el sistema de alertamiento, zonas de seguridad, rutas de evacuación y medidas de seguridad establecidas en el laboratorio.

En caso de incendio: Ponerse a salvo. Activar el servicio de Bomberos de la UNAM, extensiones 20565 ó 20566 o a la Central de Emergencias 55 (red digital UNAM). Dar aviso.

En caso de presentarse un lesionado grave: Activar de inmediato al Servicio Médico de Urgencias, extensiones 20202, 20140 o marcar la Red de Emergencias 55.

Regla del yo-yo. Primero mi seguridad.

Al activar el servicio médico de urgencias. Proporcionar la ubicación. Dar referencias de vías de acceso.

Mecanismo de lesión.

Número de lesionados.

Solicitar apoyo a Bomberos, vigilancia, etc.

Mantener el área de trabajo, el equipo y los aparatos tan limpios como sea posible.

Se deberá trabajar con bata obligatoria.

Mientras se esté en el laboratorio queda prohibido comer, beber y fumar.

No arrojar a los desagües o lavaderos residuos sólidos (grasa, papel, cerillos, etc.), depositarlos en los botes de basura.

Para desechar ácidos fuertes y otras sustancias corrosivas, abrir primero la llave del agua hasta tener un flujo conveniente para diluir y arrastrar la sustancia y vaciar lentamente el material que se desee eliminar.

No arrojar a la tubería de desagüe varias sustancias simultáneas ya que podrán reaccionar entre sí, hágalo de una en una, dejando correr el agua para espaciarlos.

Muchos productos químicos son peligrosos porque son tóxicos o inflamables por lo que antes de iniciar un experimento, se debe revisar las etiquetas de los reactivos que se van a emplear, en busca de cualquier advertencia de peligro, prestando especial atención a las precauciones indicadas para su manejo.

Nunca dejar sustancias sin identificar con una etiqueta, y si se trata de reactivos preparados, anotar también la fecha de su preparación.

Utilizar una espátula cuando manipulemos sustancias sólidas para evitar el contacto con la piel y no las llevemos a la boca en ningún momento.

Para percibir el olor de un material, no acercarlo directamente a la nariz, hay que aproximar los vapores a la cara soplando con la mano sobre la boca del recipiente que se mantendrá a unos 20 cm de distancia.

Cuando mida líquidos peligrosos, utilizar una probeta, pero si se requiere de mayor precisión, colocar el líquido dentro, de un recipiente estrecho (probeta) y llenar la pipeta por inmersión o utilizando una pera de hule.

Nunca pipetear líquidos con la boca, sino usando propipetas.

Para cada reactivo utilizar una pipeta diferente y de ser posible enjuagarla con agua inmediatamente después de terminar de usarla.

Cuidar el no derramar en las mesas ácidos o álcalis fuertes, pero si esto ocurre, limpiar y enjuagar bien con agua tanto la mesa como el exterior de los frascos.

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El mismo cuidado debe tenerse cuando se trabaje con solventes volátiles ya que la mayoría son inflamables.

Cuando se trabaje con vapores irritantes, tóxicos o inflamables utilizar la campana de extracción.

No mantener el mechero encendido al trabajar con sustancias inflamables como son el éter, alcohol, acetona, benceno, thiner, etc.

Para preparar una disolución de un ácido o de una base concentrada y muy especialmente el ácido sulfúrico, vierta SIEMPRE EL ÁCIDO SOBRE EL AGUA y nunca al revés, ya que el calor generado para la disolución, puede hacer hervir el agua con la consecuente salpicadura del ácido a la cara y manos de operador.

Al calentar líquidos en tubos de ensaye no apunte la boca del mismo hacia ninguna persona ya que el líquido puede hervir violentamente y ser proyectado a gran distancia.

La vidriería es frágil por lo que debe manejarse con cuidado. El material de medición (probetas, buretas, pipetas o matraces aforados) no deben someterse a calentamiento. Si se necesita insertar un tapón de hule en un tubo de vidrio o un termómetro, lubríquelo con unas gotas de agua y haga girar el tubo dentro del tapón mientras lo va introduciendo (proteja su mano con un trapo).

Todo producto químico aunque no lo sea, debe ser manejado como si fuera tóxico.

No dejar quemadores, mecheros, parrillas, lámparas. etc. encendidos sin que alguien que los atienda.

Las manos y la ropa, así como el piso y los bancos del laboratorio deberán estar secos cuando se utilicen aparatos eléctricos.

Se deberá consultar al profesor responsable para efectuar el desecho adecuado de sustancias como la acrilamida sin polimerizar, bromuro de etidio, éter, isótopos radiactivos o cualquier sustancia que sea considerada peligrosa.

Todos los accidentes por triviales que parezcan, deben comunicarse inmediatamente al profesor.

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FORMAS DE EXPRESAR LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCIÓN

Una solución es una mezcla en que dos o más sustancias se han unido en una dispersión homogénea. A la sustancia que se encuentra en mayor proporción se le llama disolvente y soluto al compuesto que se encuentra en menor proporción. La solubilidad de un soluto es la máxima cantidad que se disolverá en una cantidad dada de disolvente a una temperatura específica. Se pueden utilizar varias formas para expresar la concentración de una solución:

UNIDADES FÍSICAS% p/p ó w/w, Porcentaje en masa: es la cantidad de soluto en gramos por cada 100 g de solución.% v/v, Porcentaje volumen: es la cantidad de soluto en ml por cada 100 ml de solución.% p/v ó w/v, Porcentaje en masa/volumen: es la cantidad de soluto en gramos por cada 100 ml de solución.ppm, partes por millón: es igual a los miligramos de soluto en un Litro de solución (mg/L).Densidad, expresa la cantidad de gramos del soluto por cada mililitro de solución (g/ml).

UNIDADES QUÍMICASMolaridad (M): ___No. de moles de soluto___ volumen de la solución (1L)Molalidad (m): _No. de moles de soluto_ peso del solvente (kg)Normalidad (N): ____No. de equivalentes____ Volumen de la solución (1 L) El número de equivalentes es igual al peso molecular entre la valencia. La valencia es el número de iones H+ ó OH- sustituidos o sustituibles.

Fracción mol (X): No. de moles de soluto # de moles totales

CÁLCULOS Y MEDIDAS DE UTILIDAD EN BIOQUÍMICA

En el año de 1960 la Conferencia General de Pesas y Medidas y la Oficina Internacional de Pesas y Medidas con sede en París, Francia acordaron crear el Sistema Internacional de Pesas y Medidas (SIU o SI) con el objetivo de facilitar el intercambio de información cuantificable y universalizar su uso. El SI es básicamente una versión ampliada del sistema métrico decimal y consta de siete unidades básicas independientes para cuantificar diferentes magnitudes físicas. A continuación se describen estas unidades, además de los símbolos que se deben utilizar cuando se hace mención a éstas.

Unidades básicas del SI

Magnitud física Nombre de la unidad SímboloLongitud metro mMasa kilogramo kgTiempo segundo sCorriente eléctrica amperio ATemperatura kelvin KIntensidad luminosa candela cdCantidad de sustancia mol mol

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Muchas veces las unidades básicas o derivadas pueden ser muy grandes o muy pequeñas para representar una cantidad en particular. Para esos casos, el SI admite el uso de una serie de prefijos que permiten formar múltiplos o submúltiplos decimales de las unidades del SI. Estos prefijos se muestran a continuación:

Prefijos utilizados en el SI

Prefijo Factor Símbolo Prefijo Factor SímboloAto 10-18 a Deca 101 Da

Femto 10-15 f Hecto 102 hPico 10-12 p Kilo 103 kNano 10-9 n Mega 106 MMicro 10-6 μ Giga 109 GMili 10-3 m Tera 1012 T

Centi 10-2 c Peta 1015 PDeci 10-1 d Exa 1018 E

Cálculo y expresión de diluciones

Una dilución consiste en preparar una solución menos concentrada a partir de una más concentrada. Las diluciones generalmente se expresan como una razón matemática, por ejemplo 1:5 (o 1/5), 1:10 (o 1/10), etc. En el caso de una dilución 1:5, ésta expresa la cantidad, sea volumen o peso de una sustancia en un volumen total o final de la forma 1 volumen (o peso) en un volumen (o peso) total de 5 volúmenes. Nótese que el volumen total o final estará compuesto de 1 volumen de la sustancia a diluir y 4 volúmenes del disolvente. Para calcular la concentración final de una solución diluida, se multiplica la concentración de la solución original por la dilución expresada como fracción. Ejemplo: una solución de urea cuya concentración es de 5 mg/ml es diluida 1/10.La concentración final de la solución diluida es 5 x 1/10= 0.5 mg/ml.La ecuación más comúnmente utilizada para preparar soluciones es:

V1 x C1 = V2 x C2 donde,

V1 es el volumen de la solución concentrada que se debe añadir para preparar la solución diluidaC1 es la concentración de la solución concentrada.V2 es el volumen de la solución diluida.C2 es la concentración de la solución diluida.Al utilizar esta ecuación debe tomarse en cuenta que tanto las unidades de V1 y V2 así como las de C1 y C2 deben ser las mismas, preferiblemente ml y mol/l respectivamente.

El factor de dilución representa el número de veces que fue diluida la solución concentrada. Si se hace una serie de diluciones, la concentración de la solución final se obtiene al multiplicar la concentración original por el producto de los factores de dilución.Ejemplo: si la solución de glucosa a 45 mol/l del ejemplo anterior es primero diluida 1/9 y luego 1/100, la concentración final de la solución será 45 X 1/9 X 1/100= 0.05 mol/l, con un factor de dilución de 900.Las diluciones seriadas son también muy útiles. Estas diluciones son aquellas en las cuales todas las diluciones hechas a partir de la primera o luego de la primera poseen el mismo factor de dilución.

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Ejercicios (para ser realizados por el estudiante en horas de estudio independiente)

1. Calcule las siguientes concentraciones:

• 10 M NaOH, diluido 1:20 = _____ M• 2 M HCl, diluido 1:5 = _____ M• 1000 mg/L glucosa, diluido 1:10 y luego 1:2 = _____ mg/L• 250 ml de 5% NaCl contienen ____ g de NaCl• ¿Cuánto CuSO4 . 5 H2O debe ser pesado para preparar 100 ml de CuSO4 al 5%? PM del CuSO4 . 5 H2O: 250 g/mol, PM del CuSO4 : 160 g/mol?• ¿Qué porcentaje de CuSO4 . 5 H2O es agua?

2. ¿Cuántos gramos de MgCl2 hay en 1 g de MgCl2. 3 H2O? PM del MgCl2. 3 H2O: 149 g/mol, PM del MgCl2: 95 g/mol3. ¿Cuántos mililitros de NaOH 0.4 M se necesitan para preparar 20 ml de una solución 2M?4. ¿Qué porcentaje de Mg contiene el MgCl2. 3 H2O?5. ¿Cuánto CuSO4. 5 H2O debe ser pesado para preparar 1 L de una solución que contenga 80 mg de CuSO4?6. El peso molecular de CaCO3 es 100 g/mol, ¿cuántos gramos son necesarios para preparar?:

• 1 L de 0.1 M CaCO3?• 50 mg/L de CaCO3?

7. Una solución estándar de hemoglobina contiene 200 g/L. ¿Cuántos ml deben usarse para preparar 6 ml de las siguientes concentraciones?:

• 200 g/L• 150 g/L• 100 g/L• 50 g/L

8. La solución salina normal tiene una concentración de 0.85%. ¿Cuál es su molaridad? (PM NaCl : 58.5 g/mol)9. ¿Cuántos gramos de Na2HPO4 deben ser pesados para preparar 1 L de una solución cuya concentración es de 50 mg/ml?10. ¿Cuál es la dilución final de una muestra de suero en un tubo que contiene 200 μl de suero, 500 μl de solución salina y 300 μl de reactivo?11. ¿Cuál es la concentración en mol/l de una solución que tiene 100 g de NaOH disueltos en 100 ml de agua? PM NaOH: 40 g/mol

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Práctica 1

PROPIEDADES GENERALES DE LOS LÍPIDOS

Introducción

Los lípidos son un grupo de biomoléculas que se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza. Desde el punto de vista químico, son el grupo más heterogéneo y, de hecho, no responden a ninguna composición general. Su característica general es la apolaridad o hidrofobicidad, aunque dentro de ellos existen diferentes grados: desde lípidos totalmente apolares e insolubles en agua hasta los que tienen parte de su estructura altamente polar y son por ello, capaces de interactuar con el agua a través de dicha zona.

Hablando desde un punto de vista general, los lípidos apolares cumplen funciones de almacén de energía metabólica, lubricación y protección, mientras que los polares tienen funciones estructurales, esto es, que participan en la composición de las membranas biológicas. Además de éstos, otros lípidos cumplen otras funciones más específicas, como vitaminas, hormonas, etc.

Debido a esa característica fundamental, su grado de hidrofobicidad, los lípidos pueden extraerse de materiales que los contienen mediante disolventes orgánicos más o menos apolares. Por otra parte como los procesos biológicos en los que participan tienen lugar en medios acuosos, el cuerpo humano se vale a veces, de mecanismos que facilitan su transporte, como la construcción de lipoproteínas, o la utilización de emulsionantes (sales biliares) que facilitan el contacto con las enzimas que participan en la digestión. Acerca de alguno de estos puntos trata esta práctica.

Numerosos productos naturales son ricos en lípidos. El aceite empleado normalmente en la alimentación, sea de oliva, girasol, soya, etc., es una mezcla hidrofóbica de triacilglicéridos y de ácidos grasos libres, entre los que destaca el ácido oleico. Otra buena fuente de lípidos es la yema de huevo. Un huevo de gallina, cuyo peso oscila entre 55 y 60 g, consta de clara (65 % del peso) y yema (35 %), y su composición aproximada en gramos es la siguiente:

Peso total (g) Agua (g) Proteínas (g) Lípidos(g) totales Colesterol (g)

Yema 19-20 9-10 3-3.5 6-6.5 0.2-0.25

Clara 35-36 31-32 3.5-4 0.01 ---------

Los lípidos presentes en la yema son de naturaleza variada, destacando los triacilglicéridos, el colesterol y los fosfolípidos. Mediante una extracción fraccionada se pueden separar los menos polares, solubles en acetona (triacilglicéridos y colesterol) de los más polares (fosfolípidos), que serían solubles en disolventes como la mezcla cloroformo/metanol.

Objetivos

1. Aislar el colesterol de la yema de huevo, utilizando acetona como disolvente.

2. Determinar cualitativamente el colesterol mediante una reacción específica.

3. Estudiar la solubilidad del aceite de oliva en el disolvente polar, el agua y en otro disolvente ideal para lípidos apolares, la acetona.

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Material

*1 Huevo por equipo Centrífuga*Aceite de oliva por equipo Espectrofotómetro*Papel milimétrico piceta*Lentes de protección *2 pliego de papel estraza 1 gradilla2 celdas de vidrio para espectrofotómetro recipiente para hielo2 vasos de precipitado de 50 ml 1 pipeta de 10 ml2 vasos de precipitado de 100 ml 1 varilla de vidrio2 pipetas Pasteur 2 propipetas 1 Micropipeta de 1000 µl 2 tubos de centrífuga para solventes13 tubos de ensayo Hielo1 probeta de 10 ml2 pipetas de 1 ml2 pipetas de 5 ml *material que deberá traer el alumno.

Reactivos

Colesterol 1mg/ml (disolver en cloroformo) 25 ml por grupo Acetona (poner en hielo antes de usarse) 20 ml por equipoÁcido sulfúrico concentrado 12 ml por equipo.Anhídrido acético 4 ml por equipo.Cloroformo 5 ml por equipo

MétodoA. Extracción de colesterol de la yema de huevo

1. Cascar un huevo de gallina con precaución y separar la clara de la yema, teniendo cuidado de no romper esta. Decantar la clara.

2. Añadir sobre la yema 10 ml de acetona fría y agitar con la varilla, hasta obtener una suspensión homogénea.

3. Verter el contenido en dos tubos de centrífuga y equilibrarlos.

4. Centrifugar a la máxima velocidad en la centrífuga de mesa durante 15 minutos.

5. Concluida la centrifugación (cuando la centrífuga este totalmente parada) sacar los tubos con sumo cuidado, retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur.

6. Guardar el sobrenadante, al que llamaremos extracto acetónico A1.

7. Agregar 10 ml de acetona al pellet (pastilla) restante, agitar con una varilla y repetir todo el proceso otra vez para una segunda extracción de colesterol. El segundo extracto obtenido se llamará extracto acetónico A2.

NOTA: Los tiempos de espera en las centrifugaciones pueden emplearse en ir realizando el apartado D de la práctica

B. Detección cualitativa de esteroides

1. Rotular adecuadamente los tubos del 1 al 4.

2. Pipetear en cada uno de los tubos los siguientes volúmenes (en ml) de las soluciones que se te piden:

NOTA: Utilice los lentes de protección al adicionar los reactivos.

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Prueba de Salkowski

# TUBO 1 2 3 4Colesterol (ml) 0 1 ml 0 0

Extracto A1 (ml) 0 0 1 ml 0

Extracto A2 (ml) 0 0 0 1 ml

Cloroformo (ml) 1 ml 0 1 ml 1 ml

Ácido Sulfúrico* (ml) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

* Resbalar por el tubo para formar una capa en el fondoNUNCA HAY QUE DARLE DE BEBER AL ÁCIDO

3. Se mueven los tubos en el plano horizontal, con el fin de conseguir un buen mezclado.

4. La reacción es positiva, indicando la presencia de colesterol cuando se observa una coloración azul-verde.

C. Detección cuantitativa de colesterol1. Rotular 7 tubos de ensayo del 1 al 7.

2. Pipetear (usar una propipeta) en cada uno de los tubos los siguientes volúmenes (ml) de los reactivos, de acuerdo al orden que se índica en la tabla.

NOTA: REACCIONES MUY EXOTÉRMICAS ¡CUIDADO!

Utilice los lentes de protección al adicionar los reactivos.

Prueba de Liebermann-Burchard

Curva Patrón Tubos problema

# TUBO 1 2 3 4 5 6 7

Colesterol (ml) 0 0.25 0.5 0.75 1 0 0

Extracto A1 (ml) 0 0 0 0 0 1 0

Extracto A2 (ml) 0 0 0 0 0 0 1

Cloroformo (ml) 1 0.75 0.5 0.25 0 0 0

Anhídrido acético (ml)

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Ácido Sulfúrico (ml) 1 1 1 1 1 1 1* Resbalar por el tubo para formar una capa en el fondoNUNCA HAY QUE DARLE DE BEBER AL ÁCIDO

Se dejan los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos. La aparición de un color azul-verdoso indica prueba positiva para esteroides.

3. Después de 20 minutos de reacción leer la densidad óptica a 625 nm

Resultados y procesamiento de datos

Graficar la Absorbancia contra la concentración de colesterol, calcular la pendiente y la ordenada al origen, utilizando la ecuación de la recta, calcular la concentración del colesterol en las muestras

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problema. Observar los colores del estándar, el blanco, y los extractos cetónicos (A1 y A2) en ambas pruebas.

D. Solubilidad del aceite de oliva

1. Etiquetar 2 tubos de ensayo limpios y añadir 5 ml de agua al primero y 5 ml de acetona al segundo.2. Agregar a cada uno de los tubos 60 gotas de aceite de oliva con una pipeta Pasteur limpia y seca.3. Agitar los tubos y observar los resultados.

Discusión

1. ¿Por qué desde el inicio se desecha la clara de huevo?

2. ¿De qué está compuesta la yema de huevo? Y ¿qué se disuelve de ésta al agregar acetona?

3. ¿Por qué escoger acetona y no otro solvente como por ejemplo etanol?

4. ¿De qué tipo de lípidos está formado el aceite de oliva?

Conclusiones

¿Se cumplieron todos los objetivos?

Referencias

1. Mathews CK, van Holde KE. Bioquímica. 3a. ed. España: McGraw-Hill Interamericana; 2003

2. Voet D, Voet JG, Pratt C. Fundamentals of biochemistry. USA: John Wiley and Sons; 1999.

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Práctica 2

MEBRANAS Y OSMOSIS.

Introducción

La sustancia más abundante, con diferencia, que difunde a través de la membrana celular es el agua. Es preciso recordar que, a través de la membrana del eritrocito, en condiciones normales difunde por segundo en ambos sentidos una cantidad de agua equivalente a unas 100 veces el volumen de la propia célula. Aun así, normalmente, la cantidad que difunde en ambas direcciones está tan exactamente equilibrada que se produce prácticamente un movimiento neto de agua nulo. Por tanto, el volumen de la célula permanece constante. Sin embargo, en ciertas condiciones, se puede desarrollar una diferencia de concentración para el agua a través de una membrana, al igual que se pueden producir diferencias de concentración para otras sustancias. Cuando esto ocurre, se produce un movimiento neto de agua a través de la membrana celular, lo que hace que la célula se hinche o se contraiga, dependiendo de la dirección del movimiento neto. Este proceso de movimiento neto de agua causado por una diferencia de concentración de la misma se denomina ósmosis.Desde que, Pfeffer en 1887 fue el primero en describir la conducta osmótica de las células vivas, esto ha sido un punto central en la Biología. En 1908 Nernst reconoce que el agua puede pasar a través de las membranas biológicas libremente pero no los iones, introduciendo así el concepto de la membrana "semipermeable".Para la investigación de las propiedades osmóticas de las células vegetales, Overton empleo el método de plasmólisis, desarrollado largamente por Nageli, de Vries y Pfeffer. Este método se basa en la observación de la reducción y aumento del protoplasma en la pared celular (plasmólisis) por la acción de una solución hipertónica de solutos inocuos (ej. sacarosa). Este fenómeno es reversible al remover el soluto. Por otra parte, la barrera osmótica de células viables es también impermeable a pigmentos de plantas (ej. antocianinas) y en el caso de células dañadas, con venenos, se anulan estas propiedades osmóticas. Overton también midió los cambios de peso producido por variación de la tensión del soluto externo. La más sencilla interpretación de estas observaciones fue que el agua es permeable a la barrera osmótica, mientras los solutos adicionados eran impermeables.

Objetivos

1. Observar la membrana que delimita a la célula.2. Identificar el proceso de ósmosis mediante la observación en el microscopio de los cambios que

sufre la célula vegetal y animal al modificar la concentración del líquido extracelular.3. Distinguir las soluciones hipotónica, hipertónica e isotónica, basándose en los cambios en masa o

volumen que cada solución provoque en la célula vegetal.4. Realizar una prueba de fragilidad osmótica de eritrocitos.

Material

Por equipo:16 tubos de ensaye de 12 X 15 cm8 tubos para centrífuga1 gradilla8 Celdas para espectrofotómetro3 pipetas de 5 ml3 pipetas de 1 ml2 pipetas PasteurPapel filtro5 vasos de precipitado de 250 ml2 vasos de precipitado de 500 ml2 propipetas

1 probeta de 50 ml1 espátula1 horadador del #111 picetaBalanza granataria digitalEspectrofotómetroCentrífugaMicroscopio ópticoMicropipetas de 200 l y 1000 l1 probeta de 100 ml

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ReactivosPor grupo:300 ml NaCl al 4%, 6% y 0.9%500 ml Amortiguador de fosfato 1mM con NaCl al 1%, pH 7.4

Material que debe traer el alumno*:

10 ml Rojo Neutro al 0.5% preparado en Amortiguador de fosfatos 1 mMAgua destilada

*Solicitar en el bioterio de su facultad 5ml sangre total (rata, cobayo, etc.) con EDTA ó heparina (por grupo)*1 cebolla fresca*1 papa fresca*1 cronómetro

*6 portaobjetos*1 cuchillo*6 cubreobjetos*Sanitas*1 Navaja de un filo*1 par de guantes desechables por alumno*5 reglas graduadas o vernier

Método

I. Célula VegetalCebolla1. Hacer dos cortes transversales y paralelos en una cebolla con una separación de un poco más de

un centímetro de longitud. 2. En los extremos de los cortes, seccionar longitudinalmente, formando una ventana, desechar las

dos primeras hojas y conservar la tercera.3. En la cara interna de esta última hoja, se le deberá de desprender una membrana transparente.

No utilice la membrana de la parte externa (que parece más brillosa). 4. Monte un fragmento de epidermis en el portaobjetos y coloque una gota de rojo neutro.5. Coloque un cubreobjetos y vea al microscopio.6. Observar al microscopio y dibujar7. Reemplazar la solución en que esta disuelto el rojo neutro de la preparación por una solución de

cloruro de sodio al 4%.8. Para efectuar esta maniobra se toma un poco de solución de cloruro de sodio al 4% con una

pipeta Pasteur y se deposita una gota sobre un lado de la preparación, entre el portaobjetos y el cubreobjetos se coloca un pedacito de papel filtro en el lado opuesto a fin de aspirar, por capilaridad, la solución amortiguadora de fosfatos con rojo neutro.

9. Realice un dibujo de los cambios que se observan10. Reemplazar la solución de cloruro de sodio al 4% por la de cloruro de sodio al 6%.11. Observar al microscopio y dibujar12. Para finalizar, reemplazar la solución de cloruro de sodio al 6%, por agua destilada, utilizando la

técnica indicada anteriormente.13. Observar al microscopio y dibujar.

Papa1. Utilizando un horadador (#11) realice perforaciones sobre una papa fresca

2. Obtenga varios cilindros de papa y realice cortes de 1 cm de largo de éste, hasta obtener 15 piezas. Nota: escoger la mejor porción de papa que no tenga entrenudos y quitar la cáscara.

(1)(2)

1cm

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3. Medir (diámetro y largo) y pesar cada cilindro de papa y anotarlos en la tabla 1.4. Colocar 5 trozos de papa en cada uno de los siguientes tratamientos:

Vaso con 50 ml solución isotónica (NaCl 0.9%).Vaso con 50 ml solución hipertónica (NaCl 6%).Vaso con 50 ml solución hipotónica (Agua destilada).

5. Dejarlos por 30 minutos a temperatura ambiente.6. Transcurrido el tiempo sacar los trozos, secarlos con papel absorbente.7. Volver a medir y pesar.8. Anotar los datos de cada cilindro en la siguiente tabla:

Tabla 1. Datos individualizadosDiámetro (cm) Largo (cm) Masa (gr)

inicial final inicial final inicial final

Solución isotónica

Solución hipertónica

Solución hipotónica


Calcular los promedios y desviaciones estándar (DE) para cada tratamiento de los cilindros de papa al inicio y al final del experimento.Elaborar una tabla con los datos anteriores con el formato que se muestra a continuación

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Tabla 2. Promedio ± DE de cada tratamiento

Tratamiento

diámetro (cm) largo (cm) Masa (gr)inicial

Promedio ± DE

finalPromedio ± DE

inicialPromedio ± DE

finalPromedio ± DE

inicialPromedio ± DE

finalPromedio ± DE

Calcular los cambios relativos que sufrieron los cilindros de papa. Para hacer esto se tomará como valor de referencia el valor inicial de cada magnitud, como en el ejemplo siguiente:

Cambio relativo en masa (%)= 100*(masa final)/ (masa inicial)

Obtener los valores promedios de cada tratamiento y su desviación estándar correspondiente.

Tabla 3. Cambios relativos (%)

Tratamiento % diámetro % largo % masa

Elaborar graficas de barras con los datos de ambas tablas (2 y 3) independientemente. Cada barra deberá estar al lado de su contraparte, por ejemplo la barra que represente la longitud

inicial en agua destilada deberá estar junto a la barra de longitud final de esa misma solución. Incluir los valores de desviación estándar en cada barra.

Hubo diferencias en los parámetros medidos antes y después del tratamiento? ¿En qué casos? ¿Por qué?¿En qué tabla o grafica se aprecian mejor estas diferencias?¿Fueron significativas las diferencias en todos los casos?

II. Estructura y fragilidad osmótica de eritrocitos

Eritrocito1. En tres portaobjetos colocar una gota de sangre y una gota de la solución como se indica a

continuación:Sangre total + agua destilada.Sangre total + sol. de NaCI al 6%.Sangre total + sol. salina fisiológica.

2. Colocar un cubreobjeto y observar al microscopio.3. Dibujar lo observado

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Fragilidad osmótica de eritrocitos

1. Solicitar en el bioterio de su facultad 5 ml de sangre de algún animal (rata, cobayo ó hámster) utilizando como anticoagulante EDTA ó heparina y colocarla a 4°C hasta su uso.

2. Numerar 7 tubos del #1 al #73.4. Pipetear las soluciones en los tubos como lo indica la siguiente tabla:

Tubos 1 2 3 4 5 6 7

El % concentración de NaCl resultante en cada tubo es:

0 0.1 0.4 0.46 0.5 0.6 0.86

Sol. NaCl 1% pH 7.4 (ml) 0 0.5 2.0 2.3 2.5 3.0 4.3

Agua destilada (ml) 5 4.5 3.0 2.7 2.5 2.0 0.7

Mezclar por inversión

Sangre total (l) 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

Mezclar por inversión

5. Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos.6. Mezclar nuevamente y centrifugar a 2000 r.p.m. durante 5 minutos. 7. Leer en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm, utilizando el tubo 7 como

blanco. 8. El tubo 1 equivale al 100% de hemólisis, mientras que el número 7 equivale al 0%. 9. La lectura del espectrofotómetro de cada tubo, dividido entre las unidades de lectura del tubo

1, multiplicado por 100, indica el porcentaje de hemólisis.


En el caso de la prueba de fragilidad osmótica de eritrocitos. En los sujetos normales se obtiene una curva sigmoidea casi simétrica. El extremo inferior de la curva corresponde al comienzo de la hemólisis, la porción media corresponde a la salida de la hemoglobina en gran cantidad y el extremo superior a la hemólisis total. Un aumento de la fragilidad osmótica desplaza la curva hacía la derecha, mientras que una disminución la desplaza hacia la izquierda.

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Se ha sugerido que los dos parámetros más significativos son:a) La concentración de solución salina en la cual se obtiene 10% de hemólisis.b) La concentración de solución salina que produce 90% de hemólisis.Normalmente se obtiene un 10% de hemólisis a una concentración de solución salina que varía de 0.48% a 0.44% mientras que el 90% de hemólisis se produce a una concentración que va de 0.44% a 0.36%.La relación entre la concentración de la solución salina y el porcentaje de hemólisis en condiciones normales es la siguiente:

% Solución salina0.300.350.400.450.500.85

% Hemólisis97-10090-9950-955-450-60

La fragilidad osmótica de eritrocitos se incrementa en algunos padecimientos como esferocitosis congénita, anemia hemolítica adquirida, enfermedad hemolítica del recién nacido debido a la incompatibilidad ABO y puede estar disminuida en talasemia, anemia de células falciformes, ictericia y anemia por deficiencia de fierro.

Realizar una gráfica de Absorbancia contra concentración de NaCl y otra de % hemólisis contra concentración de NaCl.

Conclusiones¿Se cumplieron todos los objetivos?

Referencias

1. Kleinzeller, A. Ernest Overton’s Contribution to the Cell Membrane Concept: A Centennial Appreciation. News Physiol Sci. 1997.12:49-53.

2. Guyton AC, Hall JE. Tratado de Fisiología Médica. 10ª. ed. Mc Graw-Hill/Interamericana; 2001.

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Práctica 3

TRANSPORTE A TRAVÉS DE LA MEMBRANA

Introducción

El transporte a través de la bicapa lipídica de las membranas es un requerimiento universal entre los organismos vivos. Sin embargo, el agua no puede pasar realmente a través de bicapas lipídicas sintéticas y solo difunde a través de tales barreras muy lentamente con una alta activación de energía (Ea> 10 kcal/mol). En contraste algunas membranas de células son altamente permeables al agua tal que el movimiento total del agua a través de la membrana es como si no estuviera presente en absoluto y la energía de activación (Ea< 5 kcal/mol) es equivalente a la difusión del agua en solución. Adicionalmente, desde hace mucho tiempo se sabe que el transporte de agua a través de la membrana varía enormemente entre tipos celulares y aun dentro de un tipo celular la permeabilidad del agua puede cambiar dramáticamente en la presencia de ciertos compuestos.

Las células mantienen sus actividades biológicas importando y exportando varias sustancias tales como iones y moléculas polares. Las membranas biológicas son intrínsecamente impermeables a estos compuestos pero éstos son capaces de cruzar las membranas para la función normal de la célula. Existen dos factores principales que determinan si una molécula puede atravesar la membrana: 1) la permeabilidad de la molécula en una bicapa lipídica y, 2) la disponibilidad de una fuente de energía. La permeabilidad es conferida por dos clases de proteínas de membranas: las bombas y los canales. Las bombas usan una fuente de energía para transportar iones o moléculas (ejem. transporte activo). Lo canales, en cambio, permiten que los iones fluyan rápidamente a través de la membrana (por ejem. Transporte pasivo o difusión facilitada).

La levadura Saccharomyces cerevisiae puede usar diferentes fuentes de carbón para su crecimiento, pero evolutivamente ha seleccionado mecanismos para utilizar eficiente y preferencialmente a la glucosa y fructuosa. En estos organismos, la glucosa regula la utilización del carbón principalmente por la represión o activación de la transcripción de numerosos genes que codifican enzimas implicadas en el metabolismo del carbón, además una molécula puede afectar la fisiología de la levadura en muchos niveles (cambios en la concentración celular de metabolitos, modificación y eventualmente degradación de algunas enzimas y alteración en la estabilidad de un número de RNAm.

Existen sensores de glucosa en la membrana de la levadura como son los transportadores de glucosa (HeXose Transporter: HXT). En la membrana plasmática de S. cerevisiae, existen al menos 20 transportadores de glucosa. Los más relevantes son Hxt1 y Hxt3, con una baja afinidad por la glucosa, con una alta capacidad de transporte y Hxt2, Hxt4 y Hxt7 con una alta afinidad y una capacidad baja de transporte.

Objetivo

Establecer el tipo de transporte por el cual las células de un cultivo aerobio de levaduras de Saccharomyces cerevisiae introducen la glucosa.

Método

MaterialPiceta 1 matraz Erlenmeyer de 1000 ml4 matraces Erlenmeyer de 250 ml26 tubos de ensayo2 gradillas8 tubos de espectrofotómetro

2 propipetas4 tubos de centrífuga4 pipetas de 5 ml 4 pipetas de 10 ml1 vaso de precipitados de 250 mlSoporte, anillo metálico y tela de alambre con asbesto

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Pinzas para tubos2 mecherosProbeta 10 ml1 micropipeta de 100 L c/puntas1 micropipeta de 1000 L c/puntas*Material que debe traer el alumnoSanitas ó servitoallas*Guantes y cubrebocas*Canicas de diferente tamaño limpias*Algodón y papel

Material biológicoUn sobre de levadura seca activa*

EquipoVórtexIncubadora con temperatura controlableEspectrofotómetro AutoclaveCentrífuga

Soluciones (ver anexo I)Reactivo de arsenomolibdato500 ml de solución de glucosa 0.3 % (abreviado como Glc)Sol. Gluosa 0.15 mg/ml (Curva estándar)2, 4-dinitrofenol 0.05 % abreviado DNP)Reactivo de Somogyi (sol. 1 y 2)

Procedimiento

NOTA: Para la determinación de glucosa en el medio, se determinará por el método de Nelson-Somogyi que es específico para azúcares reductores.

El método de Nelson-Somogyi consiste en calentar un azúcar reductor con una solución alcalina de tartrato de cobre produciéndose así óxido cuproso, que reacciona con arsenomolibdato dando un color azul. En la mezcla de reacción se incluye sulfato de sodio para minimizar la entrada de oxígeno atmosférico a la solución lo cual podría causar reoxidación del óxido cuproso

A. Incubación de las células

Pesar 50 mg de levadura seca activa para c/u de las 4 condiciones experimentales.

1. Numerar y preparar los siguientes tubos (tubos problema):

i. levadura + 1 ml de solución de glucosa.

ii. levadura + 1 ml de solución de glucosa + 0.1 ml de solución 2, 4-dinitrofenol.

iii. levadura + 1 ml de solución de glucosa + 0.1 ml de KCN

iv. levadura + 1 ml de solución de glucosa y a continuación este tubo debe ponerse en agua hirviendo 20 min.

2. Resuspender las células con el vórtex

3. Agregar las suspensiones a 4 matraces Erlenmeyer que contengan 100 ml de sol glucosada (Glc). Etiquetar los matraces. Tomar 1 alicuota de 10 ml (tiempo cero) y proceder con el paso 5.

4. Tapar los matraces y colocar en incubadora a 37ºC y con 200 rpm de agitación tomar alícuotas de 10 ml a los 15, 30, 45 y 60 min.

5. Centrifugar a 2500 rpm durante 5 min.

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B. Determinación de azúcares por el método de Somogyi

Colocar las soluciones (ml) de acuerdo a la tabla:

Tubos problema Curva estándar

Tubo: i ii iii iv 1 2 3 4 5 6

Sobrenadante 0.1 0.1 0.1 0.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

Sol. de glucosa 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

H2O 0.9 0.9 0.9 0.9 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

Reactivo Somogyi 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

COLOCAR ESTOS TUBOS TAPADOS DURANTE 20 min EN BAÑO MARÍA. DESPUÉS, ENFRIARLOS CON AGUA DE LA LLAVE

R. Arsenomolibdato 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

AGITAR UNA VEZ QUE HAYA CESADO LA EFERVESCENCIA, DEBE DILUIRSE CADA TUBO CON AGUA DESTILADA HASTA OBTENER UN VOLUMEN TOTAL DE 10 ml.

Calibrar el espectrofotómetro con el tubo 1 de la curva estándar. Leer la absorbancia a 540 nm de longitud de onda.

Graficar absorbancia contra cantidad de glucosa en microgramos, tomando como referencia las lecturas de los tubos 1 al 5. Trazar una línea recta, calcular su pendiente y ordenada al origen, escribir la ecuación que relacione cantidad de glucosa contra la absorbancia.

Conociendo la absorbancia de cada tubo problema, calcular la concentración de glucosa, utilizando la ecuación de la curva patrón (tubos 1 al 5)

Calcular la cantidad de glucosa presente en los tubos i al iv en los diferentes tiempos con base en la ecuación de la curva patrón obtenida.

Resultados y procesamiento de los datosConociendo la absorbancia de cada tubo experimental, calcular la concentración de glucosa, utilizando la ecuación de la curva patrón.

Presentar una serie de tablas con los resultados obtenidos

Tabla 1. Densidad óptica a 526 nm.

Tratamiento

Absorbancia

Tiempo (min)

0 15 30 45 60

Control

DNP*

KCN**

calor

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Tabla 2. Cantidad de glucosa remanente en el medio de crecimiento.

Tratamiento

Absorbancia=A526 interpolada de la curva patrón

Glucosa (mg)

0’ 15’ 30’ 45’ 60’

Control

DNP*

KCN**

calor

Con estos datos calcular los moles de glucosa transportada, teniendo en cuenta los moles teóricos iniciales del experimento. Indicar la cantidad en masa y mol de glucosa inicial.

Hacer una gráfica de mg de glucosa remanente contra tiempo, de cada una de las condiciones evaluadas.

Discusión

¿Hubo diferencias notables entre la cantidad de glucosa remanente en los lotes tratados con venenos comparados con el control?

¿A qué se debieron las diferencias? ¿Fue diferente el efecto del KCN y el DNP?

¿Qué tipo de mecanismo de transporte opera en la levadura para el caso de la glucosa? Haciendo los cálculos para cada uno de los matraces experimentales, pueden hacerse inferencias sobre el tipo de transporte para glucosa en la levadura. La suposición de transporte activo y pasivo será confirmada o rechazadas de acuerdo con las definiciones planteadas en la introducción contrastadas por los resultados experimentales.

¿Cuáles otros factores influyen en el transporte de glucosa y otros solutos al interior de las células? Hacer una investigación adicional sobre el transporte de glucosa en la levadura.

Presentar un modelo del transporte de glucosa y los sitios de acción de los venenos utilizados.

Conclusión

1. ¿Se cumplió el objetivo?

Referencias

1. Berg J. M., Tymoczko J. L. y Stryer L. Biochemistry. 6a. ed. EUA: Editorial W. H. Freman and Company; 2007.

2. Gancedo M. J. The early steps of glucose signalling in yeast. FEMS Microbiol. Rev. 2007.32(4): 673-704

3. Rintala E, Wiebe MG, Tamminen A, Ruohonen L, Penttilä M. Transcription of hexose transporters of Saccharomyces cerevisiae is affected by change in oxygen provision.BMC Microbiol.2008. 8:53.

22

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=





Práctica 4

CARBOHIDRATOS

Introducción

Los carbohidratos son polihidroxialdehídos y polihidroxicetonas o compuestos que, por hidrólisis, se convierten en aquéllos. Un carbohidrato que no es hidrolizable a compuestos más simples se denomina monosacárido. Un carbohidrato que por hidrólisis da dos o más moléculas de monosácaridos por hidrólisis se conoce como polisacárido. Un monosacárido se puede clasificar aún más: si contiene un grupo aldehído, es una aldosa, si contiene una función cetosa, es una cetosa. Según el número de átomos de carbono que contenga, el monosacárido se conoce como briosa, terrosa, pectosa, hexosa y así sucesivamente. Una aldohexosa, por ejemplo, es un monosacárido de seis carbonos con una función aldehído, mientras que una cetopentosa es un monosacárido de cinco carbonos con un grupo cetónico. La mayoría de los monosacáridos naturales son pentosas o hexosas.Los carbohidratos que reducen los reactivos de Fehling (o Benedict), se conocen como azúcares reductores. Todos los monosacáridos, sean aldosas o cetosas, son azúcares reductores, como lo son también la mayoría de los disacáridos, siendo una excepción importante la sacarosa (azúcar común), que no es reductora.

ObjetivosAl terminar esta práctica, el alumno será capaz de entender la naturaleza de los carbohidratos y la importancia práctica del conocimiento de los mismos, determinándolos cualitativamente con diversos reactivos y reconociendo las diferencias entre azúcares reductores y no reductores. Además determinará la presencia de azúcares reductores en algunos alimentos mediante las pruebas de Benedict y Fehling

Material Reactivos1 espátula Glucosa al 5 % en 10 ml de agua (por grupo)1 vaso precipitado de 50 ml Manosa al 5 % en 10 ml de agua (por grupo)2 gradillas Fructuosa al 5 % en 10 ml de agua (por grupo)1 tela de asbesto Sacarosa al 5 % en 10 ml de agua (por grupo)1 cristalizador Tártaro de sodio y potasio 17.5 g40 tubos de ensaye Citrato de sodio 17.3 g3 vasos de precipitado de 250 ml Na2CO3 anhidro 10 g5 pipetas Pasteur CuSO4.5H2O 3.5 g5 pipetas graduadas de 5 ml NaOH 5 g1 piceta α-Naftol al 0.2%1 parrilla Timol al 1% en etanol2 propipetas Acido sulfúrico concentrado1 vaso de pp de 50 mlpinzas para tubo

Material por equipo (que los alumnos deben traer)**1 sobre de canderel o de nutrasweet (preparar una solución al 1 % en 10 ml de agua) por grupo*azúcar de mesa (preparar una solución al 5 % en 10 ml de agua ) por grupo*1 lata de refresco de dieta sin colorante*1 lata de refresco normal sin colorante*1 lata de jugo de manzana*Lentes de protección *Papel estraza

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Preparación de soluciones por grupoα-Naftol, disolución al 0.2%Timol, disolución al 1% en alcohol etílico

Reactivo de FehlingSolución A (3.5 g de CuSO4 en agua y aforar a 50 ml).Solución B (17.5 g de tartrato de sodio y potasio, y 5 g de NaOH en agua y aforar a 50 ml)

Reactivo de Benedict En 60 ml de agua disolver 17.3 g de citrato de sodio y 10 g de Na 2CO3 anhidro. Esta mezcla se añade lentamente y con agitación a una solución previamente preparada de 1.73 g de CuSO 4

pentahidratado en 15 ml de agua. La solución final se afora a 100 ml.

Procedimiento

Reacciones de reconocimiento de carbohidratos

A. Prueba con α-naftol.Esta reacción es general para los carbohidratos y se aplica para detectar la presencia de éstos

en los materiales biológicos. Mediante la acción del ácido sulfúrico concentrado se forma furfural a partir de las pentosas; 5-hidro-ximetilfurfural a partir de las hexosas.

Numerar una serie de nueves tubos.Adicionar a cada tubo las cantidades de sustancias indicadas en la tabla 1

Tabla 1: Preparación de los tubos para la prueba de α-naftolTubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9Glucosa (ml) 1Fructosa (ml) 1Manosa (ml) 1Sacarosa (ml) 1Jugo de manzana (ml) 1Refresco normal sin colorante (ml) 1Refresco de dieta sin colorante (ml) 1Canderel o Nutrasweet (ml) 1Azúcar de mesa (ml) 1Solución α-naftol (gotas) 5 5 5 5 5 5 5 5 5H2SO4* (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1* En todos los tubos de ensayo se vierte con cuidado, por la pared. En el contacto con las capas, aparece una coloración violeta

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B. Prueba con Timol.Numerar una serie de nueves tubos.Adicionar a cada tubo las cantidades de sustancias indicadas en la tabla 2

Tabla 2: Preparación de los tubos para la prueba de TimolTubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9Glucosa (ml) 1Fructosa (ml) 1Manosa (ml) 1Sacarosa (ml) 1Jugo de manzana (ml) 1Refresco normal sin colorante (ml) 1Refresco de dieta sin colorante (ml) 1Canderel o Nutrasweet (ml) 1Azúcar de mesa (ml) 1Solución timol (gotas) 5 5 5 5 5 5 5 5 5H2SO4* (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1* En todos los tubos de ensayo se vierte con cuidado, por la pared. En el contacto con las capas, aparece una coloración roja

C. Prueba de Fehling

La coloración azul de la solución cúprica de cobre (II), en un medio alcalino (NaOH), cuando se calienta en presencia de azúcares reductores, se reduce a oxido de cobre (I) generándose un precipitado de coloración que va de amarillo a rojizo.

1. Numerar una serie de nueve tubos.2. Adicionar a cada tubo las cantidades de sustancias indicadas en la tabla 1

Tabla 3: Preparación de los tubos para la prueba de FehlingTubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9Solución A (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1Solución B (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1Glucosa (gotas) 3Fructosa (gotas) 3Manosa (gotas) 3Sacarosa (gotas) 3Jugo de manzana (gotas) 10Refresco normal sin colorante (gotas) 10Refresco de dieta sin colorante (gotas) 10Solución de canderel o nutrasweet (gotas) 10Solución de azúcar de mesa (gotas) 103. Calentar a ebullición durante 5 minutos.4. La formación de un precipitado rojizo y la decoloración de la solución indica prueba positiva para

azúcar reductor.

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D. Prueba de BenedictEn esta prueba los azúcares reductores por tener un grupo ceto o aldehído potencialmente libre reducen la sal cúprica de cobre (II), en medio alcalino, a óxido de cobre (I). Generándose un precipitado que va de amarillo a rojo. Dependiendo de la concentración del azúcar.

1. Como en la prueba anterior, preparar una serie de nueve tubos.2. Añadir las soluciones como se indica en la tabla 2

Tabla 4: Preparación de los tubos para la prueba de Benedict

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9Reactivo de Benedict ( ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1Glucosa (gotas) 5Fructuosa (gotas) 5Manosa (gotas) 5Sacarosa (gotas) 5Jugo de manzana (gotas) 10Refresco normal sin colorante (gotas) 10Refresco de dieta sin colorante (gotas) 10Solución de canderel o nutrasweet (gotas) 10Solución de azúcar de mesa (gotas) 103. Calentar a ebullición durante 5 minutos y dejar enfriar a temperatura ambiente.4. La presencia de un precipitado cuya coloración varía desde amarillo hasta rojo, con decoloración

de la solución, indica prueba positiva.

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1. Anotar los resultados en el siguiente cuadro y describir lo que se observa en cada tubo (color, formación de precipitado, etc)

Muestra Pruebaα-Naftol

Prueba Timol

Reacción de Fehling

Reacción de Benedict

Glucosa

Fructosa

Manosa

Sacarosa

Jugo de manzana

Refresco normal sin colorante

Refresco de dieta sin colorante

Canderel o Nutrasweet

Azúcar de mesa

Discusión

1. Comparar los resultados y diga qué tipo de azúcar son la glucosa, manosa y sacarosa?2. ¿Los alimentos probados contenían azúcares reductores? Discutir la respuesta.3. ¿Las determinaciones en esta práctica son cuantitativas o cualitativas? ¿Por qué?4. Para qué tipo de carbohidratos utilizas las pruebas de Timol y α-naftol?5. ¿Qué similitud en su composición presentan el reactivo de Fehling y el reactivo de Benedict? 6. ¿Qué efecto puede tener en el organismo, la presencia de azúcares reductores en los alimentos?

Conclusiones


Bibliografía

1. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega; 2005.

2. Morrison RT, Boyd R N. Química Órganica. 5a ed. México: Ediciones Addison-Wesley Longman; 1998.

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Práctica 5

FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA POR LA LEVADURA DE PANIFICACIÓN

IntroducciónHay dos diferentes vías en la célula que pueden ser llevadas a partir de los alimentos: la

fermentación y la respiración celular. Ambas vías inician con los mismos pasos, a este proceso se le llama glucólisis, la cual es el rompimiento de los átomos de glucosa (6 carbonos) en dos moléculas de tres carbonos llamadas ácido piruvico. La glucólisis es conocida probablemente como la vía más vieja en donde se produce ATP.

Hay varios tipos de procesos de fermentación, dos de las tipos más conocidos de fermentación son: la fermentación del ácido láctico y la fermentación alcohólica. La fermentación alcohólica es realizada por las levaduras y algunas especies de bacterias. El producto final de este vía fermentativa es el etanol y el dióxido de carbono (CO2). La levadura de panificación Saccharomyces cerevisiae es capaz de efectuar la glucólisis a partir de la glucosa hasta etanol en condiciones anaerobias y hasta anhídrido carbónico en condiciones aerobias. Los humanos han utilizado esta vía para producir de manera industrial bebidas y vinos. En el caso que nos ocupa, se estudiará el transcurso de la glucólisis en condiciones anaerobias, observando la producción de una cantidad considerable de gas, lo que nos permitirá seguir la reacción con respecto al tiempo

ObjetivoQue el alumno observe y conozca la producción de etanol por medio de la fermentación alcohólica.

Material2 pipetas de 10 ml y 1 ml1 vaso de precipitado de 50 ml y 100 ml1 gradilla1 mechero, tripíe, malla de asbesto1 pipeta Pasteur2 tubos de ensayo de 10 ml2 tubos de centrífugapropipetas1 varilla de vidrioPinzas para tubos*2 jeringas de plástico de 10 ml con aguja, nuevas.*1 o 2 bloques de parafina (veladora).*guantes y cubrebocas*1 g de levadura fresca *material que deberá de traer el alumno por equipo.EquiposCentrífugaBalanza granataria

Reactivos1. 10 ml de glucosa al 5% en amortiguador de acetato (se debe hervir antes de usarse para reducir

el contenido de oxígeno disuelto)2. Amortiguador de acetato: 12.112 g de acetato sódico cristalizado y 0.78 ml de ácido acético

glacial en 500 ml de agua destilada3. Solución de 2,6-diclorofenol-indofenol sódico al 2%4. Solución sulfocrómica: 1 g de dicromato potásico en 50 ml de ácido sulfúrico 0.5 N5. Etanol 10 mM. Medir 0.29 ml de etanol y aforar en 50 ml de agua destilada.

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Método

1. Pesar 1 gramo de la levadura y disolverla en 10 mililitros de la solución de glucosa al 5% en buffer de acetato. La suspensión se prepara agitando con una varilla la levadura hasta que la suspensión sea homogénea, es conveniente efectuar el procedimiento de mezclado con relativa rapidez procurando que no entre aire en la disolución, a esta suspensión adicionarle 1 ml de 2,6 diclorofenol-indofenol sódico.

2. Inmediatamente después de preparada, tomar 3 ml. de la suspensión con una jeringa de 10 ml, posteriormente se coloca la aguja de la jeringa en la parafina para evitar la entrada de oxigeno, este paso se hace por duplicado.

3. A intervalos de 10 minutos (1 hora de incubación), se va tomando la nota del volumen del contenido de la jeringa y el color de la suspensión. Es importante utilizar jeringas cuyos émbolos cierren herméticamente y sean de fácil desplazamiento, ya que, de lo contrario, las lecturas de gas producido pueden resultar alteradas. La producción de gas no es inmediata, ya que la levadura consume el poco oxígeno disponible, primero, mediante la oxidación aerobia de la glucosa. El color del indicador de óxido-reducción indica el ambiente rédox del interior de la jeringa (azul = alcalino; rosa = ácido; coloreado = oxidado; incoloro = reducido).

4. Después de 1 hora de fermentación se toman los 3 ml de la suspensión y se colocan en un tubo de centrífuga. Se centrífuga a 2000 rpm 5 minutos, terminada la centrifugación se toma 1 ml del sobrenadante para la determinación de etanol.

5. A este mililitro del sobrenadante se le adiciona 0.5 ml de solución sulfocrómica diluida, se mezcla y se calienta en baño de agua hirviendo; aparece un color verde, percibiéndose el olor característico del acetaldehído.

6. Por otra parte en otro tubo colocar 1 ml de etanol (10 mM) y adicionar 0.5 ml de solución sulfocrómica diluida, se mezcla y se calienta en baño de agua hirviendo esto corresponde al control positivo de la producción de etanol por la fermentación alcohólica. La presencia de etanol se puede comprobar mediante su oxidación con ácido sulfocrómico a acetaldehído.


Hacer una gráfica de los mililitros de gas producidos (ordenadas) frente al tiempo (abscisas), indicando en el mismo los cambios de color observados.

Discusión1. Explique por qué la formación de gas no se produjo inmediatamente en el experimento. 2. ¿Por qué se debe hervir la solución de acetato de sodio y ácido acético?3. Describe brevemente la glucólisis y sitúa el experimento dentro de este proceso4. ¿Qué nos indica el cambio de color en la reacción?5. ¿Para qué es la solución 2,6 diclorofenol-indofenol sodico y la sulfocrómica?6. ¿Cuáles son las reacciones que son irreversibles en el proceso de la glucólisis?7. ¿Qué gas es el que se produce durante el experimento?8. En la industria, ¿qué importancia tiene esta levadura?


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Referencias

1. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega. 2005.

2. Alberts B, et al. Molecular Biology of the Cell, 4a. ed. New York. Garland Science. 2002.

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Práctica 6

ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES POR LEVADURASEFECTO DE LOS INHIBIDORES DE LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES Y DE LOS DESACOPLANTES

Introducción

El metabolismo energético es la base de las funciones celulares. Una adecuada transferencia de electrones a través de una serie de reacciones redox garantiza la obtención de sustratos energéticos necesarios para el óptimo funcionamiento de las células.

En la membrana interna mitocondrial se encuentran la cadena respiratoria, que está formada por proteínas que se ensamblan en complejos multiprotéicos denominados I, II, III y IV. El complejo I denominado NADH-deshidrogenasa recibe los electrones de la oxidación del NADH y los transfiere a la coenzima Q, la cual se desplaza libremente a través de la membrana interna mitocondrial; el complejo II, succinato deshidrogenasa se encarga de transferir los electrones del succinato a la coenzima Q, sin translocar protones; el complejo III, citocromo c-coenzima Q oxidoreductasa recibe los electrones de la coenzima Q y los transfiere al citocromo c, un transportador electrónico protéico soluble que se encuentra en el espacio intramembranal; y el complejo IV o citocromo oxidasa acopla la oxidación del citocromo c con la reducción del oxígeno molecular a agua. Las reacciones globales de los complejos I, II, III y IV son exergónicas y la energía liberada en ellas crea un gradiente de protones a través de la membrana interna mitocondrial al resultar los protones bombeados al espacio intermembranal. Este gradiente de protones libera la energía suficiente para que tenga lugar la síntesis de ATP por la ATP-sintasa.

Un método indirecto el cual se utiliza ampliamente para evaluar la funcionalidad mitocondrial es el desarrollado por Mosmann en 1983, el cual se basa en la reducción de MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol) por las deshidrogenasas mitocondriales. En términos generales, las sales de tetrazolio al reducirse pasan al estado formazán, el cual es un compuesto de color azul e insoluble en agua. El empleo de esta técnica nos permite evaluar la actividad de los complejos de la cadena respiratoria bajo diferentes condiciones experimentales.

Objetivos

1. Relacionar el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por las levaduras2. Evaluar el efecto de diferentes inhibidores y los desacoplantes de la cadena de transporte de

electrones en la funcionalidad mitocondrial a través de la reducción de MTT. 3. Correlacionar los cambios de pH con la reducción de MTT.

Material4 vasos de precipitado de 100 ml2 Pipetas de 5 y 10 ml6 tubos eppendorf de 2 ml1 micropipeta de 100 L y 1ml con puntasEspectrofotómetroPotenciómetro4 Celdas de espectofotómetroPicetaMicrocentrífugaSolución de glucosa al 10 %Solución de dinitrofenol 40 mM en etanolSolución de azida de sodio 400 mMAgua destiladaSolución MTT (5mg/ml)

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Isopropanol ácido (192 ml de isopropanol + 8 ml de HCl)*base de unicel*Levadura (Saccharomyces cerevisiae) 200 mg/ ml

*lo debe traer el alumno

Método

Experimento 1 (control)1. Diluir 5ml de la levadura con 40ml de agua destilada2. Determinar el pH de la solución repitiendo la medición dos veces (total tres) con intervalos de 3

minutos para obtener la línea basal3. Adicionar 5ml de glucosa al 10%, agitar y medir el pH4. Determinar el pH de la solución cada 5 min (4 veces) y luego cada 10 min (2 veces más)

Experimento 2 (dinitrofenol)1. Diluir 5ml de la levadura con 40ml de agua destilada2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.2 ml de la solución de dinitrofenol 40mM, concentración

final de 200 M3. Determinar el pH de la solución repitiendo la medición dos veces más con intervalos de 3 minutos

para obtener la línea basal4. Esperar 5minutos5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control

Experimento 3 (azida de sodio)1. Diluir 5ml de la levadura con 40ml de agua destilada2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.5 ml de la solución de azida de sodio 400mM,

concentración final de 5mM. Agitar con cuidado3. Determinar el pH de la solución repitiendo la medición dos veces más con intervalos de 3 minutos

para obtener la línea basal4. Esperar 5 minutos5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control

Experimento 4 (Reducción de MTT)

1. Tomar 1.5 mililitros de las soluciones de levaduras de los experimentos 1, 2 y 3 a los 15 minutos después de haber adicionado los inhibidores y colocarlo en un tubo eppendorf de 2 ml (Todo se realiza por duplicado).

2. Agregar a cada tubo 12µl de MTT (5mg/ml) e incubar los tubos 20 min a 37°C.3. Pasado el tiempo de incubación, sacar los tubos y observar la coloración.4. Centrifugar los tubos a 12000 rpm durante 3 min.5. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de isopropanol-ácido.6. Leer las muestras a 570nm.


1. Hacer una gráfica de los experimentos 1, 2 y 3, usando los valores de las lecturas de pH contra tiempo.

2. Discutir el significado de los cambios de pH en el experimento control, con dinitrofenol como desacoplante y con azida de sodio como inhibidor.

3. Para el experimento 4 hacer una curva en porcentaje considerando la absorbancia de los tubos control como el 100% de la capacidad de las mitocondrias de las levaduras de reducir el MTT y ver qué efecto tienen los inhibidores y/o desacoplantes empleados.

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4. Hacer una relación de las vías que producen estos cambios, tomando en cuenta que las levaduras poseen una ATPasa de protones en la membrana mitocondrial que se encarga de sintetizar ATP; y que tienen otra ATPasa de protones en la membrana plasmática cuya función es similar a la bomba de Na+/K+ en las células de los mamíferos.


Referencias

1. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Immunol. Methods. 1983. 65: 55–63.

2. Peña A. Studies on the mechanism of K+ transport in yeast. Arch. Biochem Biophys. 1975. 167:397-409.

3. Pardo JP. La ATPasa de H+ de la membrana plasmática de los hongos. Mensaje Bioquímico. 1990. 13:119-172.

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Práctica 7

METABOLISMO DE LIPIDOS

CONVERSION DE GRASAS A SACAROSA

Introducción

Durante el proceso de germinación, se llevan a cabo diversos cambios. En condiciones favorables, a la imbibición de agua en las semillas siguen muchas actividades. El protoplasma se hidrata y sus enzimas empiezan a funcionar y se desencadenan procesos que activan diferentes reacciones químicas que inicial el crecimiento.Existen programas metabólicos que han evolucionado para garantizar el uso rápido y eficiente del almacenamiento de las reservas para la iniciación de la germinación de las semillas. La movilización del almacenamiento de lípidos implica la inducción coordinada de un número de vías bioquímicas con diferentes localizaciones subcelulares. El primer paso en la descomposición de lípidos esta catalizada por lipasas que hidrolizan a los ácidos tricarboxílicos para producir ácidos grasos libres y glicerol. Los ácidos grasos se introducen a organelos denominados glioxisomas donde la β-oxidación y el ciclo del glioxilato se producen. Los glioxisomas son estructuralmente similares pero metabólicamente distintos de los peroxisomas, los glioxisomas contiene dos enzimas que son únicas para el ciclo del glioxilato la malato sintasa y la isocitrato liasa.El ciclo del glioxilato, que es una forma modificada del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, tiene lugar en la mayor parte de las plantas y microorganismos, pero no ocurre en los animales superiores. El objetivo primordial del ciclo del glioxilato es el de permitir a las plantas y a los microorganismos, la utilización de los ácidos grasos o del acetato, en forma de acetil CoA, como única fuente carbonada, sobre todo para la biosíntesis de glúcidos a partir de los ácidos grasos. El ciclo del glioxilato elude mediante un rodeo, las etapas de desprendimiento de CO2 del ciclo de los ácidos tricarboxilícos. Sin embargo, la escisión del isocitrato se produce a través de una ruta en la que se eluden tres de las reacciones del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. El isocitrato es escindido en primer lugar por la isocitrato liasa, para formar succinato y glioxilato. La malato sintasa cataliza a continuación la condensación del glioxilato con otra molécula de acetil-CoA para formar malato. El malato se oxida entonces, a oxalacetato, que puede condensarse de nuevo con el acetil-CoA e iniciar otra vuelta del ciclo del glioxilato. A cada vuelta del ciclo se incorporan dos móleculas de acetil-CoA y se forma una molécula de succinato. Este último se emplea con fines biosintéticos, particularmente como precursor en la gluconeogénesis.

Objetivos

Demostrar que los lípidos de las semillas de ajonjolí son transformados a sacarosa

Cuantificar la cantidad de lípidos, carbohidratos y proteínas de semillas germinadas y no germinadas

Explicar las diferencias en ambos tipos de semillas tomando en cuenta el ciclo de glioxilato durante el proceso germinativo.

Materiales2 frascos de boca anchaligas8 paquetes de gasaspapel aluminiocharola20 tubos de ensayegradillarecipiente para hielo

4 vasos de precipitado de 50 ml1 vaso de precipitado de 250 ml1 vaso de precipitado de 500 ml4 pipetas 1 ml2 pipetas 5 ml2 pipetas 10 ml2 pipetas PasteurMicropipetas 100 l y 1 ml con puntas

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8 tubos eppendorf2 embudospapel filtro2 propipetas2 pipetas Pasteurbalanzagranatariaespátula2 morteros

8 celdas de espectrofotómetrohielo4 jeringas con aguja (3 ml)*2 cucharitas de plástico*guantes desechables*sanitas ó servitoallasmechero, tripíe, tela de asbestoparafilmPiceta

*material que debe traer el alumnoEquipoespectrofotómetromicrocentrífuga

ReactivosMezcla cloroformo-metanol 2:1Solución amortiguadora de fosfatos 0.1M, pH 7.5, 3mM de MgCl2Reactivo de Biuret.Solución patrón de glucosa 150 µg/ml.Solución patrón de caseína 20 mg/mlSolución de NaCl al 1%Sol. de hipoclorito de sodio al 1%.Sulfato de sodio anhidroFenol 5%

Material biológico10 gr de semillas de ajonjolí*

ProcedimientoConsta de varios pasos los cuales se numeran a continuación

I. Germinación de las semillas

1 Pesar 4 lotes de semillas de ajonjolí de 2.5 g cada uno.2. Lavar 2 lotes de las semillas con 50 ml de sol. de hipoclorito de sodio y enjuagarlas con agua previamente hervida y enfriada.3 Colocar en cada uno de dos frascos de boca ancha, 2.5 g de semillas, tapar con 2 capas de gasa sosteniéndolas con una liga. Guardar los dos lotes de semillas restantes.4. En una bandeja con un poco de agua colocar los dos frascos boca abajo. Mantenerlos frascos en la bandeja con agua durante 4 días tapados con papel aluminio, a temperatura ambiente.

II. Preparación de los extractos

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1. Homogenizar en un mortero a baja temperatura (colocar en hielo), 2.5 g de semillas germinadas y por separado 2.5 g de semillas sin germinar, cada lote con 10 ml de solución amortiguadora de fosfatos pH 7.5, MgCI2 3 mM.2. Centrifugar 15 000 rpm durante 15 minutos. Si es necesario filtrar los sobrenadantes a través de varias capas de papel filtro, a que los filtrados salgan claros. Guardar los extractos en frío mientras se utilizan.

III.- Determinación de proteínas

Curva Patrón Tubos Problema

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Sol. Patrón de caseína (ml) - 0.25 0.50 0.75 1 - - - -Ext. Enz.Sin germ.(ml) - - - - - 1 - - -Ext. Enz. Germinado (ml) - - - - - - 1 - -Ext. Enz. Sin germ. Diluido 1:10 (ml)

- - - - - - - 1 -

Ext. Enz. germinado Diluido 1:10 (ml)

- - - - - - - - 1

NaCl 1%(ml) 6 5.75 5.5 5.25 5 5 5 5 5Reactivo de Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 4El tubo 1 corresponde al blanco. Después de 30 min. Leer a 540 nm.

IV.- Determinación de carbohidratos

Curva Patrón Tubos Problema

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sol. Patrón de glucosa (ml)

- 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 - - - -

H2O Destilada (ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.5 0.5 0.5 0.5

Ext. Enz. Sin germ. 1:20 (ml)

- - - - - - 0.5 - - -

Ext. Enz. Germinado 1:20 (ml)

- - - - - - - 0.5 - -

Ext. Enz. Sin germ. Diluido 1:50 (ml)

- - - - - - - - 0.5 -

Ext. Enz. germinado Diluido 1:50 (ml)

- - - - - - - - - 0.5

Fenol (ml) 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6

H2SO4* (ml) 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6*En todos los tubos de ensayo se vierte con cuidado, por la pared

Calibrar el espectrofotómetro con el tubo 1. Leer la absorbancia a 485 nm.

NOTA: Las diluciones se realizan con solución amortiguadora de fosfatos pH 7.5.

V. Determinación de lípidos

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1. Lavar y secar perfectamente dos vasos de precipitados de 25 ml y pesarlos.2. Tomarlos dos lotes de semillas restantes (uno sin germinar y otro germinado) y pasar cada grupo

de semillas por separado a un mortero para macerarlas con 10 ml de sol. Cloroformo-metanol fría (Evitar que las semillas germinadas pasen con agua).

3. Separar el sobrenadante pasándolo a u tubo para centrifuga convenientemente rotulado.4. Volver a homogenizar las semillas con 5 ml de cloroformo-metanol y pasar el sobrenadante a su

respectivo tubo de centrífuga.5. Centrifugar a 3000 r.p.m. durante 5 minutos.6. Si se observa agua en el sobrenadante, filtrar a través de sulfato de sodio anhidro.7 Pasar los sobrenadantes a sus respectivos vasos y eliminar los solventes mediante calentamiento

en baño María y pesar los vasos nuevamente.8. Por diferencias, calcular la cantidad de lípidos en cada lote de semillas.

Resultados y procesamiento de los datos

1) Graficar absorbancia vs. mg de proteína y obtener lo siguiente:a) Pendiente, ecuación de la recta y ordenada al origen (tomar en cuenta diluciones)b) Calcular lo siguiente para cada lote de semillas (germinados y sin germinar)

Miligramos de proteína/ml de extractoMiligramo de proteína/gramo de semillas

2) Graficar absorbancia vs. mg de carbohidratos y obtener lo siguiente:a) Pendiente, ecuación de la recta y ordenada al origenb) Calcular lo siguiente para cada lote de semillas (germinados y sin germinar)

Microgramos de carbohidratos/ml de extractoMicrogramos de carbohidratos/gramos de semilla

3) Calcular por diferencia de peso miligramos de lípidos/gramo de semilla.

4) Completar la siguiente tabla:

Lípidos(mg/ml)

Carbohidratos (µg/ml)

Proteínas(mg/ml)

SemillasgerminadasSemillas no germinadas

5) Comparar los resultados obtenidos en los lotes de semillas germinadas contra los obtenidos en los lotes de semillas sin germinar.

Discusión

1. ¿Hubo diferencias entre la cantidad de lípidos, carbohidratos y proteínas de semillas germinadas y no germinadas?2. ¿A qué se debieron las diferencias en dichos casos y por qué se realizaron diluciones?3. ¿Qué importancia tiene el ciclo del glioxilato para el proceso germinativo?4. ¿En qué procesos metabólicos de la semilla interviene los lípidos, proteínas y carbohidratos?5. ¿Qué ventaja evolutiva pueden tener los organismos que realizan el ciclo del glioxilato?6. ¿Qué procesos metabólicos ocurren durante la germinación de las semillas?7. Mencione alguna utilidad desde el punto de vista biotecnológico del ciclo del glioxilato

Conclusiones

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Referencias1. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega.

2005.2. Theodoulou FL, Eastmond PJ. Seed storage oil catabolism: a story of give and take. Curr Opin

Plant Biol. 2012.15:322-328.

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Práctica 8

REDUCCIÓN DEL 2-6 DICLOROFENOL-INDOFENOL (DCPIP) DEPENDIENTE DE LA ACTIVIDAD FOTOSINTÉTICA DE CLOROPLASTOS AISLADOS DE Spinacea oleraceae (espinaca)

Introducción

En los vegetales superiores los cloroplastos se presentan generalmente como cuerpos ovales de aproximadamente 5 a 10 μm de largo. Es en los cloroplastos donde se llevan a cabo las reacciones fotosintéticas de las células eucarióticas.El proceso fotosintético en plantas superiores, lo podemos separar en dos fases: la primera, llamada fase luminosa ó fotoquímica, requiere de la energía luminosa y sus productos principales son: ATP, NADPH y O2. La segunda fase, también llamada la fase obscura de la fotosíntesis, requiere del ATP y de NADPH para transformar, por medios bioquímicos, al CO2 en carbohidratos y otros productos.En 1937, Roberto Hill observó que un homogenizado de hojas conteniendo cloroplastos intactos, tenía la capacidad de reducir el oxalato de potasio férrico (un aceptor artificial de electrones) en presencia de la luz con desprendimiento de O2. La reacción podría representarse de la siguiente manera:

Luz H2O + Aceptor de electrones ½ de O2 + Aceptor de e- reducido

La absorción de la luz por los pigmentos fotosintéticos es el primer evento de la fotosíntesis, siendo la clorofila el principal pigmento en bacterias fotosintéticas, algas y plantas superiores. Actualmente se sabe que las reacciones fotoquímicas de la fotosíntesis se llevan a cabo en el sistema de membranas tilacoidales, que se encuentran en el interior de los cloroplastos, mientras que en las reacciones de la fase obscura se realizan en el estroma.

El proceso fotosintético representa un punto crítico de gran importancia dentro de los ciclos naturales del carbono y del oxígeno.

Muchos de los herbicidas (como el DCMU) empleados por el hombre para combatir malezas, y ciertos contaminantes, actúan inhibiendo la fotosíntesis y provocando con ello la muerte del vegetal.

ObjetivoDeterminar colorimétricamente la actividad fotosintética de los cloroplastos en diferentes condiciones mediante la reducción del DCPIP.

Material y Métodos

SolucionesLas siguientes soluciones se prepararán para todos los equipos:

Medio de aislamiento de cloroplastos.Preparar 500 ml de una solución con agua desionozada, que contenga sacarosa 400 mM, tricina 20 mM, KCl 20 mM, MgCl2 5 mM, se ajusta el pH a 8.0 con KOH

Medio de transporte de electrones.Preparar 500 ml de una solución con agua desionizada, que contenga sacarosa 100 mM, MgCl2 5 mM, KCl 10 mM, tricina 15 mM, KCN 0.5 mM, se ajusta el pH a 8.0 con KOH.

Medio de reacción con DCPIP.Tomar 400 ml de medio de transporte de electrones y agregar la cantidad necesaria para obtener una solución 0.3 mM de DCPIP en el medio de transporte de electrones.

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Acetona al 80%.Tomar 80 ml de acetona y agregarle 20 ml de agua destilada, guardar a 4°C.

Herbicida comercial, DCMU (dicloro metil urea) 3 mM.NOTA: Se prepararán 10 ml de DCMU 3mM disueltos en etanol, el DCMU preparado se encontrará en el congelador, en donde se guardara nuevamente para los siguientes grupos que realicen la práctica.

Matraz de 250 ml2 vasos de precipitado de 50 ml6 tubos de centrífuga7 tubos de ensayo6 tubos de espectrofotómetro1 probeta de 100 ml y 50 mlMicropipeta de 100l Micropipeta de 1000l2 pipetas graduadas de 10 ml2 pipetas graduadas de 5 ml2 pipetas graduadas de 1 mlrecipiente metálico para hervirSoporte, anillo, mecherotela de asbestoAgitadores de vidrio

*Material que debe traer el alumno

Pipeta Pasteuragua destilada*Cubreobjetos y portaobjetos*1 lámpara de luz incandescente con foco de 100 wattsHielo picado1 licuadora1 charola grande*1 reloj (cronómetro)*Papel aluminio*Toallas de papel o sanitas*Parafilm*5 paquetes de gasa*Papel filtro*Hojas frescas de espinaca*base de unicel*Espejo*tela negra

Precaución: El aislamiento de los cloroplastos debe realizarse a una temperatura entre 2°C-5°C y en obscuridad.

A. Obtención de cloroplastos

1. Seleccionar 40 g de hojas integras y frescas de espinaca, lavarlas con agua de la llave, procurando que el agua no caiga directamente sobre las hojas y secarlas con toallas de papel

2. Cortar el tallo, la nervadura principal y el ápice de cada hoja y desecharlos3. Colocar los pedazos de hoja en un vaso de licuadora previamente enfriado en hielo y agregar

100 ml de medio de aislamiento frío, homogenizar a la velocidad más alta por unos segundos, destapar la licuadora y con una espátula mover los pedazo de hoja de arriba hacia abajo, para cuando se mójense de nuevo no dañar los cloroplastos por daño mecánico, homogenizar nuevamente por unos segundos, hasta obtener pedacitos muy pequeños de hoja de aprox. 3 mm de diámetro.

4. Filtrar la suspensión usando 8 capas de gasa colocadas en embudo y este a su vez en un matraz, repartir equitativamente el filtrado en 6 tubos de centrífuga de 15 ml cada uno y balancear los tubos.

5. Centrifugar por 5 min. a 4000 rpm, decantar el sobrenadante y desecharlo.6. El sedimento de todos los tubos se resuspende con 2.0 ml de medio de aislamiento de

cloroplastos ayudándose de una pipeta Pasteur. Durante toda la práctica la suspensión de cloroplastos se mantiene en baño de hielo y tapados con un pedazo de tela negra.

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B. Cuantificación de clorofila

1. Para determinar la concentración de clorofila (Chl), colocar en dos tubos de vidrio 5 ml de acetona al 80% y 20 L de la suspensión de cloroplastos.

2. Cubrir con parafilm los tubos, agitarlos bien e incubar el tubo en la obscuridad por 5 minutos a 4°C.

3. Centrifugar los tubos a 5000 r.p.m. durante 5 minutos, y colocar el sobrenadante en tubos de espectrofotómetro.

4. Leer su absorbancia a 645 y 663 nm calibrando el cero de absorbancia con acetona al 80% (Esto se hace por duplicado).

5. Una vez obtenida la absorbancia sacar el promedio de las dos lecturas de cada longitud de onda leído y aplicar la siguiente formula.

6. La clorofila total en g/ml se calcula con la siguiente fórmula:

Recuerde que la cuantificación se realiza por duplicado.

[Chl en μg] = [ 8.05 (PromedioAbs663) + 20.29 (Promedio Abs645)] 5 = _____g en 20 l Chl

Tenemos que en 20 l _____g

_____l 60 g de Chl

Calcule el volumen necesario para tomar 60 g de chl, después poner la chl como se indica en la siguiente tabla.NOTA: Limpie la punta de la micropipeta antes y después de tomar la suspensión de cloroplastos.

C. Determinación de la reducción del DCPIP

1. Para determinar la reducción del DCPIP preparar 5 tubos de espectrofotómetro como se indica en la tabla siguiente:

Tubos de espectrofotómetro 1 2 3 4 5

Medio de transporte de electronesml 3 0 0 0 0

Medio de reacción con DCPIP (300 M) ml 0 3 3 3 3

Herbicida comercial l 0 0 0 0 50

Suspensión de cloroplastos g 60 g 0 g 60g 60 g 60 g

2. Colocar los tubos en una gradilla de unicel.3. Tapar los tubos con papel parafilm y mezclar su contenido invirtiéndolo suavemente. Evitar la formación de burbujas.4. Tapar el tubo 4 con papel aluminio.5. Medir inmediatamente la absorbancia de cada uno de los tubos a la longitud de onda de 660 nm ajustar a cero con el tubo 1. Anotar los resultados tiempo cero. 6. Colocar todos los tubos frente a una lámpara de 100 watts a 10 cm de distancia durante 1 minuto y tomar nuevamente lectura en el espectrofotómetro. Repetir este proceso 4 veces más.

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D. Observación de cloroplastos1. Tomar, con una pipeta Pasteur una gota de la suspensión de cloroplastos y observarla al microscopio a 10X y 40X, hacer un diagrama de sus observaciones.

E. Resultados y procesamiento de datos

1. Hacer una gráfica de Absorbancia contra tiempo, interpretarla y discutirla.

F. Discusión

1. ¿Hubo reducción del DCPIP en todos los casos?2. ¿A qué se debieron las diferencias en dichos casos?3. ¿Cuál es el sitio de inhibición del DCMU?5. ¿Qué paso en los cloroplastos cubiertos con papel aluminio?


Referencia

1. Voet D, Voet JG, Pratt C. Fundamentos de bioquímica.2a ed. México: Editorial Médica Panamericana; 1999.

2. King-Díaz B et al. A diterpene -lactone derivative from Pterodon polygalaeflorus Benth is a Photosystem II Inhibitor and Uncoupler on Photosynthesis. Z. Naturforsch C, 2006. 61: 227-233.

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Práctica 9

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA PIRÚVICO TRANSAMINASA

Introducción

Las reacciones de transaminación son catalizadas por las aminotransferasas y se llevan a cabo en todos los organismos durante el metabolismo de aminoácidos. Estas enzimas se encuentran prácticamente en todos los tejidos pero abundan en el corazón, cerebro, riñones, testículos e hígado y en los vegetales durante la maduración de las semillas. En la reacción enzimática se realiza la transferencia de un grupo amino (-NH2) de un aminoácido a un cetoácido. La transaminasas más abundantes en la naturaleza son: la glutámico-oxaloacética (GOT) y la glutámico-pirúvica (GPT), la cual es también conocida como Alanina aminotransferasa la cual cataliza la transferencia del grupo amino de la Alanina al α-cetoglutarato. Los productos de esta reacción reversible de transaminación son el piruvato y el glutamato como es presentado en la siguiente reacción:

GPT L-Alanina + α-Cetoglutarato ------> Piruvato + L-Glutamato

En el plasma, la actividad de estas enzimas es indicador de algunas patologías, tales como el infarto o el traumatismo del músculo esquelético, ya que ambos provocan un aumento en dicha actividad enzimática. Para medir cuantitativamente la actividad de la GPT, se mide la cantidad de cetoácido (ácido pirúvico) obtenido durante la reacción. Los cetoácidos reaccionan en forma estequiométrica con la 2,4 -dinitrofenilhidrazina, dando lugar a un compuesto café-rojo (2,4-dinitrofenilhidrazona) que tienen un máximo de absorción a 505 nm.

ObjetivosMedir la actividad enzimática de la Alanina aminotransaminasa en un extracto crudo de semillas de chícharo mediante un método espectrofotométrico.

Determinar parámetros cinéticos, tales como Km y Vmax de la transaminasa extraída de chícharos frescos.

Material

1 Centrifuga 6 tubos de centrifuga1 charola para hielo 15 tubos de ensayo1 Gradilla para tubos 1 Pipeta graduada de 10 ml1 Pipeta Pasteur 3 Pipetas de 1 ml3 Pipetas graduadas de 5 ml 2 Pipetas graduadas de 10 ml1 Vaso de precipitados de 600 ml 1 Mechero1 Tripié con tela de asbesto Espectrofotómetro6 tubos para espectrofotómetro Micropipeta de 100l con puntas1 Embudo de vidrio Micropipeta de 1000l con puntas1 Mortero con pistilo

Chicharros en vaina*Navaja filosa*5 paquetes de gasa* *Material que debe traer el alumno

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ReactivosSolución patrón de piruvato (Ácido pirúvico 1 mM).Sustrato (Alanina/α-cetoglutarato 1 mM/ 1mM).Solución amortiguadora de Tris-HCl 0.1 M pH 7.5 y EDTA 4%.Solución amortiguadora de Tris-HCl 40 mM pH 7.5 y EDTA 0.25 mM.Reactivo de Color (Solución de 2,4-dinitrofenilhidrazina al 0.01% en HCl 1.0 N).Prepara al momento.Solución de Hidróxido de sodio 0.4 N.

Procedimiento

A. Procedimiento de obtención de la enzima1.- Poner el mortero en la charola con hielo (baño de hielo).2.- Pesar 10 gramos de chícharos, sin vaina, picarlos con una navaja sobre el mortero frío.3.- A los trozos de chícharo, adicionar 20 mililitros de la solución amortiguadora de Tris-HCl 40 mM y macere hasta obtener una suspensión homogénea (manteniendo siempre el mortero en el baño de hielo).4.- Filtrar la suspensión homogénea de chicharos a través de cuatro capas de gasa, y con ayuda de un embudo de vidrio recuperar el filtrado en un tubo de centrífuga.5.- Equilibrar los tubos de centrífuga, y centrifugar a 3 000 rpm por 5 minutos.6.- Recuperar con una pipeta Pasteur la parte líquida (sobrenadante), teniendo cuidado de no tocar el “botón”. El sobrenadante colocarlo en un tubo de ensaye y etiquetarlo como “enzima”, mantener la enzima siempre en baño de hielo.

B. Efecto de la concentración de sustrato y curva patrón

1.- Preparar un baño a 37ºC.2.- Prepare los siguientes tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

Curva Patrón Piruvato Tubos problema

Reactivos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Patrón de piruvato (ml) 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 --- --- --- --- --- --- ---

Agua destilada (ml) 1.2 1.1 1.0 0.8 0.6 0.4 --- --- --- --- --- --- ----

Sustrato (ml) --- --- --- --- --- --- 0 0.05 0.10 0.20 0.40 0.80 1.0

Tris-HCl 0.1M pH 7.5 (ml) --- --- --- --- --- --- 1.0 0.95 0.9 0.8 0.6 0.2 0

“Enzima” (ml) --- --- --- -- --- --- 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Incubar A 37°c por 30 minutos

Sol. 2-4 dinitrofenilhidrazina (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Agite vigorosamente y espere 20 minutos

NaOH 0.4 N 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Deje reposar por 5 minutos

Leer la absorbancia a 505 nm


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1.- Tabular los datos obtenidos de la absorbancia para la curva patrón:

ml de solución patrón µmolas de pirúvico Absorbancia a 505 nm00.10.20.40.60.8

2.- Realizar una gráfica usando como en el eje de las X las µmolas de pirúvico y en el eje de las Y la absorbancia. Si los puntos no quedan dentro de la recta, normalice haciendo una regresión por mínimos cuadrados.

3.- Tabular los siguientes datos:

Tubo No. Sustrato µMolas de Alanina

Absorbancia505 nm

Producto µmolas de pirúvico/30 minutos

78910111213

4.- Con ayuda de la curva patrón calcule las µmolas de pirúvico obtenidas en cada uno de los tubos de incubación5.- Para determinar Km y Vmax, grafique la inversa de la vo (velocidad inicial: µmolas de pirúvico/min) como ordenadas, versus la inversa de la concentración de sustrato [S] (µmolas de alanina).


Cuestionario

1.- ¿Qué método para graficar se utilizó para calcular la Km y la Vmax de la transaminasa?2.- ¿Todas las transaminasas deben tener el mismo valor de Km?3.- ¿La Km obtenida en este experimento representa gran afinidad por su sustrato? Explique.4.- ¿Qué trascendencia tiene la determinación de Km para el metabolismo de aminoácidos?

Referencia1. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega.

2005.2. Alberts B, et al. Molecular Biology of the Cell, 4a. ed. New York. Garland Science. 2002.

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Anexo I

Soluciones Práctica 3

REACTIVO DE SOMOGYISolució

n 1Disolver en 600 ml de agua destilada 25 g de carbonato de sodio anhidro (Na2CO3), 25 g de tartrato doble de sodio y potasio, 20 g de bicarbonato de sodio y aforar a 1000 ml. Para que se disuelvan mejor las sales, puede calentarse un poco

Solución 2

Disolver 15 g de sulfato de cobre (CuSO4) en 80 ml de agua destilada. Agregarle 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. Aforar a 100 ml

Mezclar 25 partes de la solución 1 con 1 parte de la Solución 2 en el momento de usarse.

REACTIVO DE ARSENOMOLIBDATOSolució

n 1Disolver 25 g de molibdato de amonio [(NH4)2MoO4)] en 450 ml de agua destilada, más 25 ml de ácido sulfúrico concentrado

Solución 2

Disolver 3 g de arseniato sódico heptahidratado (Na2HAsO4 7H2O) en 25 ml de agua destilada

Agregar la solución 2 a la 1, mezclar y colocar en incubación a 37º C durante 24 h. A esto se le conoce como maduración de la solución.Guardar en frasco ámbar

Reactivo de Biuret.

CuSO4 0.75 gTartrato de Na y K 3 gDisolver en 250 ml de agua destiladaAñadir 150 mL de NaOH 10%Aforar a 500 mL con agua destilada

DinitrofenolPM: 184.1 Disolver en etanol

α-cetoglutaratoPM: 146.10

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manual 2014

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