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MANIPULACIÓN Y MANEJO DE MODELO ANIMAL RATÓN (Mus
musculus) Y OBSERVACIÓN DE MACRÓFAGOS Y ESPLENOCITOS
Salazar, L.,Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE. Departamento de Ciencias de la Vida. Carrera de
Ingeniería en Biotecnología. Inmunología. Sangolquí – Ecuador. Julio 02, 2014.
RESUMEN
La experimentación con animales de laboratorio, principalmente con ratones, ha sido fundamental para los
avances en el campo de la biomedicina y la Inmunología. Se han llevado a cabo varios estudios a nivel de
laboratorio para la obtención de macrófagos y esplenocitos a partir de ratones, con la finalidad de estudiar la
actividad inmunitaria de éstas células que constituyen la primera línea de defensa con agentes extraños. En el
presente trabajo se han desarrollado técnicas de manipulación, vías de administración y necropsia en ratones de
laboratorio machos de nueve semanas de vida, cuyo peso promedio fue 20,49g. Posteriormente se obtuvo
macrófagos del líquido peritoneal con medio RPMI 1640 y condiciones de incubación de 37°C y al 5% de CO2
durante cuatro horas. Se observó los macrófagos en el microscopio invertido. Posteriormente se obtuvo
esplenocitos del bazo y se realizó la observación en microscopio invertido y el conteo celular en cámara de
Neubaer. El conteo de esplenocitos dio como resultado 0 células viables.
Palabras claves: Ratón, Mus musculus, obtención de macrófagos, obtención de esplenocitos, cámara de
Neubaer.
ABSTRACT
Experiments with laboratory animals, mainly mice, has been fundamental to advances in biomedicine and
Immunology. There have been several studies conducted at the laboratory for obtaining macrophages and
splenocytes from mice, in order to study the immune activity of these cells that are the first line of defense with
foreign agents. In the present study we have developed handling techniques, routes of administration and
necropsy in male laboratory mice, nine weeks old, whose average weight was 20.49 g. Peritoneal fluid
macrophages later with RPMI 1640 medium and incubation conditions of 37 ° C and 5% CO2 for four hours was
obtained. Macrophages were observed in an inverted microscope. Subsequently splenocytes spleen was
obtained and observation was performed on an inverted microscope and cell counting in Neubauer chamber.
Counting 0 splenocytes resulted viable cells.
Keywords: mouse, Mus musculus, obtaining macrophages, obtaining splenocytes, Neubauer chamber.
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1. INTRODUCCIÓN
La experimentación con modelos animales inició
antes de los años 1600 y se utilizó para estudios de
anatomía, fisiología e histología. Actualmente, la
investigación con animales sigue siendo de gran
importancia en diversas áreas de estudio, como:
investigación en cáncer y enfermedades infecciosas,
sanidad humana y animal, desarrollo de procesos
biotecnológicos, investigación genómica,
neurociencias, farmacéutica y ensayos
inmunológicos (Granados-Zúñiga, 2010). A pesar
de la dificultad que representa extrapolar los
resultados obtenidos a humanos, la experimentación
con animales representa varias ventajas, como: fácil
manipulación, alta fecundidad, bajo costo y
reproducibilidad (Salguero et al., 2007).
1.1. Mus musculus como modelo experimental
La especie más utilizada en la investigación
científica es el ratón (Mus musculus). Posee un
pequeño tamaño, peso adulto de 25-30 g. El olfato
es muy desarrollado y tiene un sentido muy agudo
de la audición y el tacto. Las funciones de la cola
son termorregulación y equilibrio. Son animales de
hábitos nocturnos La determinación del sexo se
realiza observando la distancia ano-genital, que en
los machos suele ser aproximadamente el doble que
en las hembras (Santos, s.f.).
MANEJO Y SUJECIÓN: El ratón se sujeta con
firmeza por la base de la cola y se coloca una
superficie rugosa donde pueda agarrarse. Se pinza la
piel del cuello con el pulgar y el índice de la otra
mano. A continuación se levanta al animal y se
atrapa la cola entre el dedo anular y meñique. El
ratón se debe sujetar firmemente, con la finalidad de
que no muerda al investigador (Zúñiga et al., 2001;
Hedrich, 2004).
VÍAS DE ADMINISTRACIÓN: Las vías más
comunes para la administración de sustancias son:
subcutánea, intravenosa e intraperitonial. La vía de
administración peritoneal se aplica en el cuadrante
inferior derecho o izquierdo del abdomen. La
jeringa se introduce con el bisel hacia arriba,
paralelamente a la columna vertebral, para evitar
penetración en las vísceras, con 10º respecto al
abdomen. Se recomienda introducir un volumen de
hasta 3 ml (Hedrich, 2004).
EUTANASIA: Según Zúñiga et al. (2001) la
eutanasia es el acto de sacrificar animales mediante
métodos que induzcan una inconsciencia rápida y
muerte con mínimo dolor y estrés. Un método de
eutanasia es la dislocación cervical, la cual produce
inconsciencia inmediata y muerte. En ratones se
sitúan pulgar e índice a cada lado del cuello junto a
la base del cráneo o, de modo alternativo, se
presiona una varilla junto a la base del cráneo,
paralelamente con la otra mano, se tira rápidamente
de la base de la cola, produciendo la separación de
las vértebras cervicales y el cráneo (Banister et al.,
s.f.)
1.2. Macrófagos
Según Strauss-Ayali et al. (2007) citado por
Larocca (2010), los macrófagos son células del
sistema inmune que poseen capacidad fagocítica y
microbicida; por lo tanto, desempeñan un rol
importante en la inmunidad anti-infecciosa. Se
derivan de los monocitos de la sangre, después de su
migración a través del torrente circulatorio. Son
células especializadas que se encuentran en la
mayoría de tejidos conjuntivos y en órganos, como:
hígado (células de Kupffer), sistema nervioso
central (células microgliales) y pulmones
(macrófagos alveolares). Además de ingerir
microbios, los macrófagos ingieren células muertas
del anfitrión, secretan citocinas, actúan como
células presentadoras de antígenos (CPA) y
promueven la angiogenia y fibrosis (Abbas,
Lichtman & Pillai, 2012).
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1.3. Esplenocitos
Según García (1994) los esplenocitos son células
del sistema inmune que se encuentran
principalmente en el seno del bazo. Se encargan de
reconocer y fagocitar células sanguíneas
envejecidas o malformadas y microorganismos.
1.4. Cámara de Neubauer
La cámara de Neubauer se emplea para el conteo de
células en un medio líquido. Está adaptada al
microscopio de campo claro o de contraste de fases.
Está formada por un portaobjetos de cristal en cuyo
tercio central se encuentran tres plataformas de las
cuales la central, que está situada 0,1 mm por
debajo de las laterales, presenta una cuadrícula
subdividida en 9 cuadrados de 1 x 1 mm cada uno
(1 mm2). Para facilitar el conteo celular, cada
cuadrado se divide nuevamente en 16. En la cámara
de Neubauer mejorada el cuadrado central se divide
en 25 cuadrados terciarios (Fuentes, Castiñeiras &
Queraltó, 1998; Ramos & Martínez, 2008).
El objetivo del presente trabajo es aprender técnicas
de manipulación, vías de administración de
sustancias y necropsia en ratones de laboratorio,
para posteriormente obtener macrófagos de líquido
peritoneal y esplenocitos del bazo y realizar el
conteo celular en cámaras de Neubaer.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Modelo animal
Se empleó ratones de laboratorio machos de
aproximadamente nueve semanas de vida, cuyo
peso promedio inicial fue de 20.49g. Durante el
período de experimentación los animales de
mantuvieron bajo condiciones controladas.
2.2. Manipulación
Para la manipulación de los ratones se empleó la
técnica de restricción a mano descrita en Zúñiga et
al., 2001 y Hedrich, 2004. En la figura 1 se observa
el método de sujeción de los ratones utilizado en los
ensayos.
Figura 1. Restricción a mano.- Se sujetó el ratón
por la base de su cola y se colocó en una superficie
donde pueda sostenerse. Se agarró un pliegue de
piel en la parte posterior del cuello (cerca de las
orejas). Se fijó la piel floja a lo largo de la espalda y
la cola del ratón. Se colocó al ratón con el lado
ventral hacia arriba y se atrapó la cola entre el dedo
anular y meñique.
2.3. Control de peso
Se pesó cada ratón dos veces por semana por un
periodo de dos semanas. En la siguiente figura se
puede observar el procedimiento empleado para
determinar el peso de los ratones.
2.4. Inmunización
Mediante la vía de administración intraperitoneal se
inyectó aproximadamente 0,3 ml de una solución
tampón denominada PBS (Phosphate Buffered
Saline). Posteriormente, se administró 0,2 ml de
tioglicolato fluido de concentración 30 mg L-1
mediante vía intraperitoneal, con la finalidad de
estimular los macrófagos del ratón. En la figura 2 se
observa la administración de tioglicolato.
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Figura 2. Administración de tioglicolato vía
intraperitoneal. Se sostuvo al ratón mediante la
técnica de restricción a mano. Se desinfectó la
región abdominal con una torunda de algodón y
alcohol. Se introdujo la aguja con el bisel hacia
arriba, paralelamente a la columna vertebral, con
10º respecto al abdomen y se administró 0,2 ml de
Tioglicolato.
2.5. Disección del ratón
Se realizó una disección del ratón, con la finalidad
de observar los principales órganos internos. Se
extrajo el intestino y el corazón realizando cortes en
las bases de los órganos. Para abrir el cráneo se
realizó un corte a nivel del hueso occipital,
posteriormente se cortó el nervio ocular y se extrajo
el cerebro. Se midió las dimensiones de estos tres
órganos.
2.6. Obtención y observación de macrófagos
Tres días después de la inmunización, se sacrificó
cuatro ratones por la técnica de dislocación cervical,
para lo cual se agarró cada ratón de la cola y se lo
colocó en una superficie para que se sostenga,
posteriormente se aplicó una fuerte presión en las
vértebras cervicales con la ayuda de un mango de
bisturí, con la finalidad de ocasionar una muerte
instantánea. Se colocó el ratón sobre una superficie
y se llenó la cavidad peritoneal con 10 ml de medio
RPMI (contiene L-glutamina, buffer HEPES 25mM
y bicarbonato de sodio) frío. Se realizó cortes en el
pelaje para exponer el área abdominal y se recuperó
el líquido inyectado con la misma jeringuilla, a
continuación se vertió en una caja Petri y se
adicionó medio RPMI fresco. Se lleva a incubación
con 5% de CO2, a 37ºC por un período de cuatro
horas. Luego del período de incubación se observó
los macrófagos adheridos a la placa Petri en el
microscopio invertido a 40X. 24 horas después se
realizó una tinción Giemsa y se volvió a observar en
el microscopio invertido a 40X.
2.7. Obtención, conteo y observación de
esplenocitos
Siete días después de la inmunización con
tioglicolato se sacrificó cuatro ratones mediante la
técnica de dislocación cervical. Se realizó la
disección del ratón y se extrajo el bazo.
Posteriormente se colocó el bazo en una caja Petri
con medio RPMI y se trituró con el pistón de una
jeringa estéril, hasta obtener fragmentos pequeños.
A continuación se filtró el medio con una gasa en
tubos Falcon. Se llevó los tubos a centrifugación a
1500 rpm por 5 minutos a una temperatura de 4°C.
A continuación, se eliminó el sobrenadante y el
pellet fue resuspendido en 5ml de medio RPMI.
Se tomó 1 µl del medio y se diluyó en 9 µl de azul
Tripán. Para realizar el conteo se empleó una
cámara de Neubauer. Se colocó 10 µl de esta
dilución en el orificio de la cámara, para distinguir
las células vivas de las muertas. Se colocó la cámara
de Neubauer en el microscopio óptico a 40X y se
procedió a realizar el conteo de esplenocitos. En la
siguiente figura se ilustra las regiones de la cámara.
En este ensayo el conteo se realizó en el cuadrado 1.
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Figura 3. Cámara de Neubauer. El conteo de
células puede realizarse en los cuadrados 1,2 ó 3. En
cada caso se aplicará una fórmula para la
determinación de la concentración celular.
Se calculó la concentración de células mediante la
siguiente fórmula:
Donde:
C.C.= concentración celular, F.D.= factor de
dilución, Vo =volumen final.
Se colocó una concentración celular de 5x106
esplenocitos en una alícuota de 200 ul en cinco
pocillos de una P96 y posteriormente se llevó al
microscopio invertido para la observación de
esplenocitos.
3. RESULTADOS
3.1. Sobrevivencia
Se evaluó la sobrevivencia de los ratones
diariamente durante todo el período de
investigación. Cada una de las especies fue
sacrificada mediante dislocación cervical. No se
observó otras causas de mortalidad. En la siguiente
figura se representa la sobrevivencia de los ratones
durante las dos semanas de duración del ensayo.
Figura 4. Sobrevivencia. Se observa que el número
de ratones se mantiene constante durante los siete
primeros días. Al día siete se sacrificó cuatro
ratones para realizar la obtención y observación de
macrófagos. Al llegar al día 11, se sacrificó las
especies restantes para realizar el conteo de
esplenocitos, por lo que la población se reduce a
cero. No se observó otra causa de mortalidad en los
ratones, a parte de la dislocación cervical.
3.2. Peso promedio
En la siguiente figura se observa el peso promedio
de los ratones durante las dos semanas de
experimentación.
Figura 5. Peso promedio de los ratones vs.
Tiempo. Se muestra el peso promedio de los
ratones durante el período de experimentación. Se
observa el mismo patrón de crecimiento que en el
análisis del peso individual.
0
2
4
6
8
10
0 5 10
Nú
me
ro d
e r
ato
rne
s vi
vos
Días
SOBREVIVENCIA
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3.3. Órganos internos
En la Tabla 2 se presenta la medida de los órganos
(cerebro, bazo e intestino) de los ratones 5, 6,7 y 8
que fueron sacrificados el cuarto día para realizar el
cultivo de macrófagos.
Tabla 2. Medición de órganos de los ratones 5,
6,7 y 8.
# DE
RATÓN
Cerebro (cm) Bazo (cm) Intestino
(cm)
Largo Ancho Largo Ancho Largo
5
1,25
1 1,3 0,5 34
6 1,2 0,8 1,5 0,4 30
7 1,5 0,9 1,5 0,4 45
8 1,5 1 1,4 4 31
3.4. Obtención y observación de macrófagos
Se observó los macrófagos adheridos en la caja Petri
y teñidos mediante tinción Giemsa. Además se
observó restos celulares en la mayoría de cultivos de
macrófagos. No fue posible realizar conteo celular
porque no se obtuvo un número considerable de
macrófagos. En la siguiente figura se muestra la
observación de macrófagos en el microscopio
invertido.
Figura 6. Observación de macrófagos (circulo),
eritrocitos (flecha negra) y desechos celulares
(flecha roja) de rató teñidos con Giemsa en
microscopio invertido 40X, luego de 24 horas de la
incubación.
3.3 Conteo de esplenocitos
En la Tabla 3 se presenta los resultados del conteo
de esplenocitos teñidos con azul Tripán de los
ratones 1, 2, 3 y 4.
Tabla 3. Número de esplenocitos en un volumen
de 5ml de suspensión celular. Se observa que el
número promedio de esplenocitos obtenidos a partir
de los ratones 1, 2, 3 y 4 es de 1,1172x107. No se
observó esplenocitos en la suspensión celular
obtenida a partir del ratón 2.
# DE RATÓN # DE
ESPLENOCITOS
1 11.562x106
2 0
3 23.125 x106
4 10.0 x106
PROMEDIO 11.172 x106
En la siguiente figura se muestra los esplenocitos
observados al microscopio invertido.
Figura 7. Observación de esplenocitos de ratón en
placa 96P con microscopio invertido 40X (Sánchez,
2014)
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4. DISCUSIÓN
Según Soriguer & López (1986) citado por
Medarde (2013) el comportamiento social de los
ratones varia notablemente dependiendo de la
disponibilidad de recursos alimenticios. Cuando la
disponibilidad de alimento es abundante, los ratones
tienden a formar grandes grupos donde el
comportamiento agresivo no es frecuente. Además,
existen diferencias de comportamiento entre machos
y hembras, siendo los machos más territoriales y
agresivos. En el presente ensayo todos los ratones
fueron sacrificados por dislocación cervical; por lo
tanto, no se observó muertes ocasionadas por
comportamiento violento, a pesar de que todos los
ratones eran machos. Probablemente, no
presentaron conductas violentas debido a que la
disponibilidad de alimento y espacio fue adecuada
para cada una de las especies.
El peso aproximado de un ratón de 9 semanas de
vida es de 20-25g (Pierce, 2009). El peso promedio
inicial de los ratones fue de 20.49g (Figura 5), lo
cual está dentro del intervalo establecido por la
bibliografía. Sin embargo, si se analiza el peso
inicial de cada ratón por separado se observa gran
variación, desde 15.82 g hasta 27.26g. Durante la
segunda medición, se determinó que el peso
promedio aumentó a 22.44g y posteriormente, se
inoculó los ratones con tioglicolato vía
intraperitoneal. Al realizar la tercera medición, se
observó que el peso disminuyó a 22.19g, mientras
que en la cuarta medición aumentó a 23.4 g (Datos
no mostrados). Según Roitt (2008), el tioglicolato es
un estímulo no inmunológico que induce la
activación de los macrófagos y la respuesta inmune
en el ratón. Por lo tanto, la disminución de peso
observada en la tercera medición está asociada con
el estrés ocasionado en los ratones debido a la
inoculación de tioglicolato. Además, Jonas (1976)
citado por Fuentes (s.f.) define que otros factores
como: edad, sexo, constitución genética, nutrición,
exposición al ambiente y manejo sanitario,
producen cambios en el estado fisiológico de los
ratones de laboratorio, que conducen a un
incremento o pérdida de peso.
Se observó que los órganos internos de los ratones
estaban en buenas condiciones y no presentaron
lesiones. Se determinó las dimensiones del bazo,
intestinos y cerebro, ya que según Zúñiga et al.
(2001) son los órganos de mayor interés en las
investigaciones biomédicas. Las medidas del bazo
fueron semejantes en los cuatro ratones analizados;
al igual que las medidas del cerebro. Se observó
mayor variación en la longitud del intestino, desde
30 cm hasta 45 cm de largo (Tabla 2).
La incubación de macrófagos debe realizarse a
37°C, al 5% de CO2 por un periodo de 4-5 horas
(Porras et al., 2003). En el presente ensayo, se
aplicó las condiciones mencionadas en la
bibliografía; sin embargo, 24 horas después de la
incubación se realizó una tinción Giemsa para
visualizar de manera más precisa las células. No se
obtuvo resultados favorables y se observó gran
cantidad de lisis celular y unos pocos macrófagos,
por lo que no se realizó conteo celular.
El colorante azul Tripán se empleó para observar la
viabilidad celular de esplenocitos. De tal manera,
que cuando se realizó el conteo de células en la
cámara de Neubauer no se observó esplenocitos
viables. Probablemente una de las causas que
influenció en estos resultados desfavorables es que
no se empleó condiciones totalmente estériles
durante el procedimiento (Porras et al., 2003).
Además debido a la falta de práctica de los
estudiantes, el tiempo de preparación de la cámara
de Neubauer con la suspensión celular, para llevarla
al microscopio óptico fue muy largo, pudiendo
ocurrir lisis celular.
5. CONCLUSIONES
El ratón (Mus musculus) es el modelo animal más
empleado en la investigación biomédica. La
aplicación correcta de técnicas de manipulación,
vías de administración y necropsia, asegura en gran
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parte la fiabilidad de los procedimientos y
resultados.
Los ratones se encontraban en buen estado al
empezar el experimento, pues su peso promedio fue
de 20.49g, el cual está dentro del rango aceptable
según bibliografía. Los ratones se mantuvieron bajo
condiciones controladas y no presentaron
comportamientos agresivos, por lo que no se
observó otras causas de muerte, a parte de la
dislocación cervical. Este patrón se observa en la
figura 4, pues la sobrevivencia se mantiene
constante hasta los días donde se sacrificaron los
ratones. El comportamiento no agresivo de los
ratones se explica en gran parte a que no tenían que
competir entre ellos por conseguir alimento, pues
diariamente se les suministró la cantidad adecuada.
Los animales no presentaron ninguna anomalía en
sus órganos internos.
Los macrófagos son células que se adhieren a la
superficie donde se cultivan. Se pudo observar
macrófagos en el microscopio invertido; sin
embargo, no fue posible realizar conteo celular,
debido a que la tinción Giemsa se efectuó 24 horas
después de la incubación, período en el cual ocurrió
lisis celular.
Al realizar el conteo de esplenocitos en la cámara de
Neubauer, no se observó células viables. Los
resultados desfavorables se atribuyen a falta de
experiencia en los estudiantes y a que no se realizó
el procedimiento bajo condiciones estériles.
6. RECOMENDACIONES
Los ratones de experimentación deben mantenerse
en un bioterio bajo condiciones estériles y
controladas. El investigador debe tomar las medidas
de bioseguridad pertinentes al manipular ratones,
como el uso de guantes y mandil. Las técnicas de
manipulación deben ser empleadas con precisión
para evitar mordeduras o comportamientos
violentos del ratón. El trato hacia los animales de
laboratorio debe ser respetuoso aplicando los
principios de Bioética, por ejemplo: la técnica de
dislocación cervical debe ser rápida para provocar
una muerte con el mínimo sufrimiento a la especie.
Es muy importante conocer la cepa de los ratones
con los cuales se está trabajando y su procedencia.
Los procedimientos detallados en el presente ensayo
deben ser realizados en una cámara de flujo laminar,
con la finalidad de tener un medio aséptico y de que
no haya interferencias que podrían afectar los
resultados. Así también, para proteger la salud del
investigador.
7. REFERENCIAS
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