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~ U L T I V O DE TEJIDOS DE MA12 APARTIR DE

EMBRIONES INMADUROS 1

A1umna:Wenep;as Ordoñez Maria del Rosario. Matricula: 89339975:- Licenciatura en Biologia.

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INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL

MAYO 1995

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CULTIVO DE TEJIDOS DE I

1 MAIZ APARTIR DE I 1

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EMBRIONES INMADUROS

INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL

MAYO 1995

INDICE

Introducci6n .......................................................................................... 1

Antecedentes .......................................................................................... 4

Justificaclon ........................................................................................... 6 . .

Objetivos Generales y Especificos ........................................................ 7

Metodologia ............................................................................................. 8

Actividades realizadas ........................ ...................... ........................... 13

Objetivos y Metas Alcanzadas ............................................................ 14

Resultados ...................................................... ..,.... ................................ 15

Conclusiones ........................................................................................ 33

Recomendaciones ................................................................................. 34

Bibliografia .......................................................................................... 36

El cultivo de tejidos es una técnica, en la cual se aísla una porción (explante) de la planta proporcionandole artificialmente las Condiciones fisicas y químicas apropiadas para que las células expresen su potencial intrínseco o inducido. Todo lo anterior bajo condiciones de ascepcia para evitar contaminaciones.

La investigación en cultivo de tejidos puede cumplir un rango amplio de actividades; por ejemplo, desde la investigación básica sobre los procesos bioquímicos y morfológicos de la diferenciación celular, hasta la que realizan aquellos laboratorios que se dedican a la investigación aplicada y al desarrollo de tecnologías; para utilizar esta investigación en la propagación clonar o en el mejoramiento genético de las plantas a partir del cultivo de embriones.

El desarrollo de embriones vegetales se caracteriza por dos estados; estado temprano o de corazón (inmaduro), que es heterotrófico y el estado tardío (maduro) que es autotrófico.

Los embriones inmaduros se desarrollan a expen.sas del endosperm0 y poseen una baja cantidad de síntesis; su desarrollo depende de ciertos nutrientes como son: macroelementos, microelementos, vitaminas y hormonas que se encuentran en el saco embrionario. Una vez que se han formado los cotiledones, el embrión inmaduro pasa a ser autótrofo y se puede aislar de los óvulos y cultivarse in vitro en medio relativamente simple que contenga pequeñas cantidades de los nutrientes; para la formación de callos embriogenéticos y para su regeneración transplantando una porción de callo en medio para reproducir plántulas (regeneración).

En los recientes años la importancia en el mejoramiento del desarrollo de callos embriogenéticos a través del uso potencial de la tecnología del cultivo de tejidos, y a través de ensayos, permiten el mejoramiento del cultivo de maíz en las siguientes áreas: cultivo de anteras, variación somaclonal y transformación.

Aunque las plantas de maíz todavía no pueden ser regeneradas a partir de células individuales o protoplastos en los recientes años se han hecho muchos procesos en la regeneración de plantas de maíz a partir de callos embriogenéticos. Esto sucede por vía embriogenesis y organogénesis. La vía más común para la regeneración de plantas en tejidos compactos proliferados por el escute1.0 de embriones inmaduros de maíz es la embrioge'nesis.

Los factores para la capacidad de regeneración del maíz en cultivo in vitro son: el medio de cultivo, condiciones físicas (temperatura, pr'esión) y estados fisiológicos, tamaño de embrión, genotipo, reguladores de crecimiento, entre otros.

En el cultivo de tejidos a partir de embrión inmaduro de maíz se forman dos tipos de callos, dependiendo de la capacidad de la formación de callos según el genotipo, tenemos que cuando un endogámico es autopolinizado y cultivado en medio de cultivo adecuado, a partir de embrión cigoto produce callos de tipo I (embrión inicial por callos heterogénicos, producidos por el escutelo de un embrión cigoto);

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regenerando 3 a 7 plantas. Mientras en el cruzamiento de un endogámico con el polen padre, la regeneración es generalmente mejorada. Esto indica que los genes nucleares son importantes en la formación del embrión somático y en la regeneración.

La calidad y el número de plantas en regeneración dependen del tipo de callo y de su número de subcultivos, cuando un callo de tipo I es subcultivado en 3 semanas con intervalos de 3 a 6 meses disminuye la calidad y número de plantas originando plantas anormales genotipicamente; este problema se puede vencer parcialmente por la selección de callos embriogenéticos y de crecimiento rápido, los cuales son fi-accionados originando callos de tipo I1 y produciendo plantas aún despues de 9 meses en cultivo; y disminuye el número de plantasl anormales genotípicamente y fenotipicamente o con polen estéril.

Ocurren modificaciones en los cultivos in vitro manifestándose como mutaciones heredables a las progenies de las plantas regeneradas; ésto se le conoce como variación somaclonal, ésta variación resulta tanto de las diferencias genéticas que preexisten en las células somáticas del explante como defectos inducidos por los componentes del medio de cultivo. La variación s80maclonal puede usarse para recuperar la variación genética de la variedad. Existen dos tipos de variación somaclonal.

Variación somaclonal no controlada (espontánea). Esta variación puede parecer como una fuente nueva de gran potencial en el mejoramiento del maíz utilizando material genético para un amplio cambio de características incluyendo resistencia a enfermedades, tamaño de plantas, en la morfología de las hojas maduras; éstas alteraciones tienen un impacto en el mejoramiento del maíz, la variación somaclonal en el maíz disminuye la cantidad de endosperma defectuoso o mutaciones de la planta de semillero.

Variación somaclonal impuesta. Es a través de la selección de células resistentes a características específicas para que se originen variantes somaclonales. Esta variación se realiza en callos de tipo I1 los cuales son expuestos a la patotoxina producida por microorganismos patógenos. DespuCIs que el callo ha crecido activamente en presencia de la toxina produce plantas resistentes.

Por otro lado, cuando los callos embriogenéticos son expuestos a concentraciones bajas de herbicidas (imidazolinas) al seleccionar callos que se convierten en resistentes herbicidas; después del quinto y sexto ciclo de selección son más tolerantes al herbicida; que los callos no seleccionados. Cuando los callos resistentes se regeneran las plantas crecen hasta su madurez.

En general, la variación somaclonal es muy útil para incorporar nuevas características o para modificar las que ya tiene la planta en efecto, la variabilidad genética inherente al somacultivo permite mejorar significativamente el valor agronómico.

LOS somachales mutanes pueden enriquecerse durante el cultivo in vitro con las Características de resistencia a enfermedades, herbicidas y tolerancia al stress químico o ambiental.

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Para el fitomejoramiento del maíz principalmente para la producción de plantas Y diploides se ha utilizado el cultivo de anteras; en la práctica esta técnica es muy importante para regenerar plantas diploides y de esa manera salvar varias regeneraciones de líneas puras que necesitan ser reguladas para la obtención de líneas homogéneas.

Las anteras cultivadas in vitro producen callo y el porcentaje de &tos y de plánhlas dependen del genotipo. El control de la naturaleza del cromosoma duplicado y la frecuencia fisiológica del desarrollo desordenado durante el proceso de regeneración todavía no se llega a controlar obteniéndose plantas con muchas anormalidades como la carencia de mazorcas en d.esarrollo, liberación de polen asincrónico y formación de pelo. Sin embargo, durante los siguientes años la eficiencia del cultivo de anteras de maíz tendrá que implementarse considerablemente para la producción de maíz.

Es de gran interés en la investigación la aplicación de la técnica de transformación en plantas de importancia económica. La electroporación es la técnica que se usa en los laboratorios de investigación para la transformación genética y así obtener m mayor rendimiento de cosecha de maíz por medio de la intervención del plásmidio de agrobacterium; donde la transformación origina el desarrollo de técnicas directas para la liberación del DNA. Se ha encontrado que la electroporación del protoplasma de maíz produce plantas transgénicas y algunas plantas fértiles. En la selección de cultivo celular de maíz en callos organizados son utilizados agentes mutagénicos; incluyendo tratamientos con sulfonato de etilmetano (EMS), N-metil-N’-Nitrosoguadinina (MNNG) y azida de sodio. Las variantes al usar MNNG en cultivos de temporada la recuperación de un genotipo aumenta mientras que al usar EMS es ineficaz. Una frecuencia de recuperación de un genotipo al usar azida de sodio en los callos no mejora las variantes. La selección de agentes mutagénicos pueden ser más importantes en el cultivo de regeneración.

La capacidad de variabilidad genética en la regeneración de las plantas de maíz a partir de callos depende de la adaptación de un germoplasma a las temperaturas de las regiones; sobre todo las variedades de maíz tropical y en líneas endogámicas en donde la adaptación a estas temperaturas son desarrolladas en programas de investigación en la aplicación de las técnicas de cultivol in vitro.

La eficacia del uso de la técnica de cultivo celular tiene futuras perspectivas en el mejoramiento genético implicando la habilidad al regenerar eficazmente las plantas a partir de cultivos de protoplast0 o células individuales obtenidos de varios explantes de tejidos y genotipos que están en el medio de cultivo en suspensión, a través de la selección de una técnica apropiada para la transformación celular por técnicas semejantes a la electroporación o microinyección.

En las industrias privadas como en las instalaciones públicas y agencias para el d ~ ~ ~ o l l o del campo han aumentado su interés en esta tecnológia para el mejoramiento genético y regeneración de plantas de intt:rés económico.

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ANTECEDENTES

El maíz es uno de los cereales de mayor importancia en la alimentación de la población mundial y en la industria alimenticia animal. Principalmente en países que presentan un rápido crecimiento demográfico. Siendo indispensable intensificar el cultivo de maíz en la producción agraria, a partir de variedades mejoradas actuales adaptadas a las condiciones locales del clima, del suelo y sobre todo bajo condiciones de humedad.

El incremento del rendimiento del cultivo de maíz es posible gracias al empleo de maíz híbrido altamente productivo con la ayuda de tkcnicas agronómicas mejoradas tales como abonos (especialmente nitrogenados), uso de pesticidas y herbicidas más efectivos. Sin embargo, el incremento del cultivo del maíz no se debe contemplar solamente desde el punto de vista de la alimentación de la población mundial, sino también como un constituyente en el problema económico en la mayoría de los países en vía de desarrollo.

México es uno de los países más importantes consumidores de maíz, como producto básico en la alimentación de la población., especialmente en las clases populares. La producción de maíz en México es de bajo rendimiento; teniendo que importar grandes cantidades de maíz para satisfacer 1.a gran demanda interior. Este bajo rendimiento se debe al agotamiento de fertilidad del suelo, una baja potencialidad de rendimiento en las variedades criollas y en muchos casos la falta de humedad adecuada.

El problema en la producción y mejoramiento en el cultivo de maíz, consiste en la selección de líneas autofecundadas de la primera generación, que tengan una alta habilidad combinatoria, sin introducir una variabilidad muy amplia. La desventaja en el uso de líneas de la primera generación es la dificultad de determinar contaminaciones, cruzamientos extraños, la modificación en regeneraciones continuas. También los problemas de la resistencia a herbicidas, insecticidas e insectos; los cuales requieren cada vez mejores prácticas de control, ya sea que éstos incluyan el mejoramiento genético del cultivo; para hacer ésto se requiere de gente capacitada, investigación científica; técnicas a través del cultivo de tejido.

El establecimiento de los principios biológicos del cultivo de órganos y tejidos ha sido acreditado al alemán Haberlandt, fisiólogo vegetal, quien los enunció por primera vez en 1902. Para 1934, P.R. White pudo cultivar raíces de tomate continuamente in vitro proporcionandoles extracto de levadura. Los ingredientes esenciales resultaron ser algunas vitaminas B, en especial B1 (tiamina). En 1939, 3 investigadores: Nobecourt y Gautheret en Francia y White en 10s EUA, reportaron en forma independiente el cultivo indefinido de tejido de callo vegetal en un medio sintético. El descubrimiento de las citokininas y del control hormonal de la regeneración de tallos y raíces logradas de callo de tabaco por Skoog y SUS

colaboradores en 1948 en la Universidad de Wisconsin estableció las bases para

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manipular la iniciación de órganos y proporcionó el principio en que se basa toda micropropagación. Otro avance importante fue el logro de la regeneración de estructuras de tipo embrión (embriones somáticos o embrioides) de suspensiones de células de callos. Otros progresos importantes compredieron el descubrimiento de la formación de plantas haploides a partir de granos de polen en desarrollo, el aislamiento de protoplastos vegetales y la hibridación artificial (parasexual) protoplastos vegetales en cultivos asépticos.

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JUSTIFICACI~N Y NATURALEZA DEL PROYECTO

Es importante aprender las técnicas de cultivo de tejidos, ya que a partir de estas técnicas básicas se pueden derivar múltiples líneas de investigación, con el fm de obtener mejoras en la productividad de los cultivos básicos, ofi-eciendo alternativas para los problemas alimentarios de la población.

Debido a que CIMMYT es un organismo Internacional que aplica la tecnología y la investigación con el fin de mejorar la productividad de los cultivos básicos, y que cuenta con todo el equipo tecnológico necesario, es una importante oportunidad poder realizar el Servicio Social en esta Institución y poder adquirir experiencia en este tipo de trabajos de investigación, que tienen grandes perspectivas para el mejoramiento de los cultivos básicos en el país.

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OBJETIVOS GENERALES:

Aprender y entender los fundamentos de la tecnica. de cultivo de tejidos de maíz, las aplicaciones y perspectivas de estas para aumentar la productividad de este cultivo basico en el país.

OBJETIVOS ESPECIFICOS:

A partir del dominio de las tecnicas de cultivo de tejidos de maíz, involucrarse con las líneas de investigación que se siguen en el Laboratorio de Ingenieria Genetica Aplicada, con el fm de entender en la practica las potencialidades de estas técnicas y la forma en que actualmente se estan utilizando como herramienta para la investigación y el desarrollo de nuevas tecnologias.

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METODOLOGIA

Colecta de mazorcas del genotiplo de interes

V I Esterilización

V 1

Extracción de embriones

Sembrar embriones de .7-1 ;hm en medi.0 C M con nitrato y incubar a 26°C

V 1 Despues de 7 dias se cortan raices y se colocan

los embriones en medio C M normal

'W I Se cambian los callos a medilo MSR

y se llevan a la camara de cultivo

?+

Se cambian los callos verdes a medio MSR fiasco

\ Se cambian plantulas con tres hojas a MSE mayenta

V Cuando hay buena formación de raíces

se cambian las plantulas a suelo preparado

Despues de 1 semana se llevan las plantulas al invernadero para continuar su desarrollo

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Cosecha:

Después que las mazorcas fueron polinizatlas, se tiene que verificar periódicamente el desarrollo del embrión hasta que este alcanza el tamaño deseado (entre .7-1 m.). En cuanto el embrión ha alcanzado el tamaño deseado que en tiempo varia dependiendo del genotipo (aprox. 16 días), se cosecha la mazorca y se lleva al laboratorio donde se conserva en bolsas de papel bien etiquetadas con las fechas de polinización y genotipos, dentro del cuarto .fria hasta su utilización.

Medios de CuJtivo:

Todos los medios de cultivo utilizados se preparan de acuerdo al protocolo del Laboratorio de Cultivo de Tejidos del CIMMYT (Bohorova et al 1992).

Esterilización:

Después de haber seleccionado la mazorca con el tamaño de embrión deseado, se procede a esterilizar el material de la siguiente forma: *En la campana de flujo laminar, las mazorcas se colocan en una solución de alcohol al 70% durante 20 seg. *Posteriormente se pasan a un vaso de precipitados conteniendo una barra magnética y la solución de cloro al 20% con 10 gotas de Tween 80 (agente tensoactivo). *Se agita durante 30 minutos. *Transcurridos los 30 min. se realizan 3 lavados con agua esterilizada de 5 minutos cada uno, desechando cada vez el agua en otro recipiente.

Extracción:

Después de que se esterilizaron bien las mazorcas se procede a la extracción de los embriones, de la siguiente manera: *En la campana de flujo laminar, se saca la mazorca y se coloca en una caja petri 100x15 m m .

*Con un bisturí se corta un poco la parte superior de los granos y con una espátula se extrae el embrión para colocarlo en medio CIM con nitrato. *El embrión se coloca de tal forma que el escútelo quede en la parte superior. *El numero de embriones que se colocan por caja petri varia de acuerdo a nuestros objetivos, lo importante es no ponerlos muy juntos ni muy separados. *Se mide el tamaño inicial de los embriones y se escribe este dato en la caja petri ademas del genotipo, numero de mazorca y fecha de extracción.

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Observaciones: *Todos los procedimientos anteriores se hacen llevando acabo las medidas de esterilidad necesarias, para evitar en lo posible la contaminación, por ejemplo:

Los instrumentos que se utilizan para la extracción de los embriones se lavan bien con jabón y agua y se sumergen unos minutos en cloro.

Dentro de la campana se coloca un fiasco con alcohol donde se sumergen los instrumentos de trabajo y se flamean en el mechero cada vez que se van a utilizar.

Es recomendable utilizar un juego de espátulas para que mientras se utiliza uno y se flamea, el otro ya se enfi-ió.

Antes de empezar cualquier trabajo en la campana, es recomendable prenderla 30 min. antes de empezar a trabajar y limpiarla perfectamente con alcohol.

Antes de empezar a trabajar en la campana es necesario lavarnos bien las manos con agua y jabón, y cada vez que se metan las manos en la campana o lo creamos necesario se tienen que fiotar con alcohol (para lo cual se puede utilizar un aspersor).

Incubación:

Todos los embriones se incuban a 26°C en obscuridad y se esta pendiente de su desarrollo y de la contaminación.

En general las cajas petri con embriones contaminados se desechan salvo que se observen embriones no contaminados que se puedan separar y pasar a medio nuevo, teniéndolos bajo observación constante.

Subcultivo:

*Después de siete días de la extracción y la colocación de los embriones en CIM con nitrato, se les corta a los embriones la raíz y se col'oca en medio nuevo CIM sin nitrato y se vuelven a colocar a 26°C en obscuridad. *Se revisa el desarrollo de los embriones periódicamente y cuando se empiece a formar un buen callo, se coloca en medio nuevo de h4SR caja petri para colocarlos en la cámara de crecimiento a 20°C en luz. *Cuando los callos colocados en MSR empiezan a regenerar hojitas o pequeñas plantulas se colocan en medio MSR fiasco hasta que se desarrollan plantulas de aprox. 10 cm. con mínimo 3 hojas bien formadas. *Después se colocan en MSE mayenta para el desarrollo de las raíces. *Cuando las raíces ya se formaron se colocan las plantulas en suelo preparado dentro de unos vasos de unicel y se mantienen en la c;ámara de cultivo durante una xmana para después traspasar las plantas al invernadero hasta terminar SU desarrollo.

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La etapa ideal para el subcultivo de los materiales depende de muchos factores y varia de acuerdo al genotipo; dependiendo de las observaciones que tengamos respecto del tipo de material que se este trabajando y sus respuestas a los diferentes factores (temperatura, luz, reacción al medio, manipulación,etc..), será el criterio a seguir para subcultivar en el momento adecuado nuestro material.

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Material Básico para un Laboratorio de Cultivo de Tejidos

1.- En el área de preparación: Refrigerador, balanzas (una macrobalanza y una de precisión), potenciómetro, plancha eléctrica con agitador magnético, fiascos Erlenmeyer (125,250 y 500 ml), botellas y material de vidrio o plástico.

2.- En el área de lavado y esterilización: Autoclave manual o automático (grande o de mesa), destilador de vidrio, gradillas para secad.0, bandejas de aluminio y de plástico de varios tamaños, recipientes de pliktico grandes, estufas para esterilización y secado.

3.- En el área de transferencia: Gabinete de flujo laminar: Microscopio de disección con luz incidente, e instrumentos de disección: cuchillas no. 10 y no. 11, mangos para cuchillas, agujas de disección, pinzas, tijeras, navaja de afeitar. También se necesitan frascos con alcohol, mechero de gas, mascaras, guantes, marcadores a prueba de agua, bandejas y basurero.

4.- En el área de incubación: Un cuarto con temperatura, iluminación y humedad relativa controladas, estanterías con iluminación para los cultivos, bandejas, termómetros de máxima y mínima, y gradillas para tubos de varios tamaños.

5.- En el área de examinación: Microscopio estereoscópico, microscopio compuesto, lentes de aumento, y elementos ópticos complementarios.

6.- En el área de crecimiento in vivo: Macetas, suelo, bandejas, cámaras de alta humedad.

Tanto el material como los reactivos y todo lo nec,esario para que se lleve a cabo el proyecto de Servicio Social fue proporcionado por el CIMMYT a través del Laboratorio de Ingeniería Genética Aplicada.

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ACTIVIDADES REALIZADAS

Cosecha Se colectan mazorcas de maíz y se llevan al laboratorio (envueltas en bolsas de

papel), y se efectúa el pretratamiento de refrigeración. a baja temperatura durante 1 a 7 días, con el objeto de conservar el material hasta que se utilice.

Medios de Cultivo Se preparan los medios de cultivo necesarios, de preferencia una semana antes de

utilizarlos para verificar la contaminación basados en el protocolo del Laboratorio de cultivo de Tejidos del CIMMYT (Bohorova et al 1992).

Esterilización

mazorcas a trabajar segun se a descrito en la metodología. En la campana de flujo laminar se va a realizar el proceso de esterilización de las

Extracción de Embriones Inmaduros de Maíz Se extraen los embriones con una espátula pequeña sembrándolos en el medio de

cultivo CIM con nitrato. Colocando el embrión de tal forma que el escútelo quede en la parte superior, pero puesto a la superficie del medio de cultivo.

Posteriormente se enumeran y miden el tamaño inicial de cada uno de los embriones con el objeto de llevar el control de desarrollo.

Incubación

formación y desarrollo de callos. Se colocan los embriones en un cuarto obscuro a una temperatura de 26°C para la

Subcultivo

manteniendo en observación constante todo el proceso de desarrollo de las plantas. Se realiza el subcultivo de los callos y las plantulas de acuerdo a la metodología,

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OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

La mayor parte de las metas y objetivos planteados al inicio de este trabajo se han llevado acabo, resultando una experiencia de trabajo muy hctifera y en muchos aspectos llegando a superar los objetivos planteados al principio.

Los resultados obtenidos de este trabajo van mas alla de el aprendizaje y planteamiento de una simple técnica, ya que basándose en esta técnica pueden derivarse diferentes ramas de investigación y aplicación en el futuro:Esta técnica puede llegar a ser una opción y una herramienta innportante para el desarrollo de otras líneas de investigación.

La oportunidad de realizar el trabajo de servicio social en CIMMYT a sido una experiencia importante dentro de mi desarrollo profesional, ha sido una forma de poner en practica los conocimientos adquiridos y ver las perspectivas de la biología dentro de este campo de investigación. El tener acceso a la tecnología de vanguardia en este ramo resultara una experiencia importante para mi futuro desarrollo profesional.

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RESULTADOS

Área de preparación: Se utiliza principalmente para preparar los medios de cultivo, y cuenta con un espacio para almacenar materiales de vidrio y de plástico, y los reactivos químicos. En esta área se cuenta con mesas de trabajo para la preparación de los medios y para colocar las balanzas, el medidor de pH, los platos calientes con agitación, el horno de microondas, el agua bidestilada, ademas de contar con una campana de extracción, un refrigerador, un congelador y dos lavaderos.

FOTO1. Mesas de trabajo con todo el equipo necesario para la preparación del medio.

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FOTO 2. Medidor de pH, balanza, y parrilla caliente con agitación. Instrumentos basicos para la preparación de los medios de cultivo.

FOTO 3. Gabinete con el material de vidrio, donde se guarda el material despues de ser esterilizado en el autoclave.

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FOTO 4. Gabinete con todos los reactivos químicos, refrigerador para los reactivos que lo necesiten, y balanza analítica.

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Área de transferencia: En esta área del laboratorio se realiza el trabajo de excisión, inoculación y transferencia de los explantes a los medios de cultivo. Dado que este trabajo demanda los más altos niveles de limpieza ambiental, se tienen instaladas 8 campanas de flujo laminar, ubicadas en un lugar alejado de las puertas y con un mínimo de corriente de aire, con el fm de prolongar la vida útil de los filtros. Ademas de las campanas de flujo laminar, en esta área se encuentran unos gabinetes para colocar el medio ya preparado que se va a utilizar y unos carritos con el material sucio listo para lavarse y esterilizarse.

FOTO 5. Campanas de flujo laminar, carrito para material sucio, congelador para reactivos de uso fkecuente, gabinete de incubación y estanteria para el medio.

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FOTO 7. Carrito con todo el material sucio listo para llevarse a esterilizar en el autoclave.

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FOTO 8. Cámaras de flujo laminar donde se trabaja todo el material en condiciones estériles.

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Área de observación y examen: En esta área se localizan todos los microscopios (estereos, compuesto, e invertido), una centrifuga, un lavadero, alcohol, agua bidestilada, vortex, y gabinetes con filtros y material de uso frecuente. El objetivo de esta área es realizar observaciones periódicas de los cultivos, tanto en medios semisólidos como en líquidos, ademas de tener a la mano todo lo necesario para realizar el bombardeo.

FOTO 9. Mesas de trabajo donde se encuentran los microscopios, la centrifuga, vortex, y el material de uso frecuente para llevar acabo el bombardeo.

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Área de incubación: Los cultivos se incuban en un cuarto apropiado denominado cámara de crecimiento. En esta área se les proporciona a los cultivos un buen control de la temperatura (20-28"C), de la iluminación (1000 a 5000 lux) y de la humedad relativa (70%-80%). En este cuarto se tienen instaladas estanterías metálicas para colocar los cultivos, ademas de una ventilación constante para evitar zonas de recalentamiento por efecto de la luces.

Ademas de la cámara de crecimiento se cuenta también con 3 gabinetes de incubación con temperatura de 26°C para cultivos estáticos en oscuridad.

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FOTO 10. Cámara de crecimiento donde se mantienen los cultivos.

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FOTO 1 1 . Remlador de temDeratura.

FOTO 12. Gabinete a 26°C con los materiales para mantenerse en obscuridad.

Por asepsia en el establecimiento y ulterior manipulación de los cultivos es preciso adoptar algunas precauciones durante las tareas que se llevan a cabo en la cámara de transferencia, así:

1) Antes de comenzar a trabajar, desinfectar la mesa y las paredes de la cámara con etanol70%. Igualmente es conveniente desinfectar la parte externa de los recipientes que contienen los medios de cultivo o el agua estéril, antes de introducirlos en la cámara.

c 2) Es necesario que las manos y, eventualmente, los antebrazos del cultivador sean desinfectados con etanol70%. El uso de máscaras y gorros no es impresindible, pero reduce la contaminación si se opera en flujos laminares de aire estéril.

3) Los instrumentos metálicos empleados se deben flamear previamente con etanol 95%. El material de vidrio utilizado como soporte para las disecciones (generalmente cajas Petri) debe estar esterilizado al igual que las pipetas que comúnmente se usan en trabajos con suspensiones celulares y protoplastos.

4) Se deben realizar las operaciones de transferencia y disección lo más cerca posible a la llama del mechero. Evitar exposiciones prolongadas de los explantes o de los medios de cultivo en recipientes abiertos.

FOTO 13. Material e instrumental básico para la extracción de embriones.

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El desarrollo de los embriones vegetales se caracteriza por dos estados distintos: el estado temprano, que es heterotrófico, y el estado tardío, que es autotrófico. Los embriones globulares heterotróficos se desarrollan a expensas del endosperma y poseen una baja capacidad de síntesis; el desarrollo de los embriones en estado de 'corazón' depende de ciertos nutrimentos como hormonas, aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, purinas y pirimidinas que se encuentran en el saco embrionario.

FOTO 14. Embriones recién extraídos y colocados en medio CIM con nitrato, listos para colocarse en el gabinete de incubación a 26°C en obscuridad. Se puede observar que los embriones se encuentran con el escutelo en contacto con el medio.

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FOTO 15. Embriones despues de 1 semana en CIM con nitrato a 26"C, listos para cortarles la colita y traspasarlos a CIM normal a 26°C obscuridad hasta el desarrollo de callo.

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FOTO 16. Callos en medio CIM normal después de 3 semanas a 26°C en oscuridad, listos para cambiarse a MSR y transladarse a la cámara de crecimiento.

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FOTO 17. Callos en la cámara de crecimiento después de 4 semanas en medio MSR, listos para pasarse a MSR fiasco.

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FOTO 18. Medio MSR frasco después de 7 semanas con plantulas bien formadas y listas para transferirse a MSE mayenta.

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FOTO 19. Medio MSE mayenta con plantulas de 9 semanas ya con raíces y listas para pasarse a suelo preparado.

FOTO 20. Plantas de 10 semanas en suelo preparado, después de una semana de permanencia en la cámara de crecimiento y listas para llevarse al invernadero para continuar su crecimiento.

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ENFOQUE DE LAS INVESTIGACIONES DEL LABORATORIO DE INGENIERIA GENETICA.

En el laboratorio de Ingeniería genética aplicada la técnica de cultivo de tejidos se esta utilizando básicamente para la transformación Genética en los vegetales, en este caso maíz y trigo. Esta técnica de ingeniería genética, o técnica del ADN recombinante o manipulación genética, podría d e f ~ s e como la técnica con que se forman artificialmente combinaciones nuevas de material hereditario (ADN, A R N ) mediante la inserción de moléculas de ácido nucleicos - producidas fuera de la célula - dentro de virus, plásmidos bacterianos u otro vector de ácido nucleico; estos vectores incorporan las nuevas moléculas de ácido nucleico dentro de un organismo hospedante, en el cual éstas no se hallan presentes en condiciones naturales pero pueden ser replicadas.

Básicamente, hay dos sistemas para introducir genes en el genoma de las plantas: la transferencia directa y la transferencia mediada por bacterias del género Agrobacterium. El primero consiste en la introducción directa de genes empleando técnicas como la microinyección o el bombardeo de partículas de oro con un acelerador de partículas. El segundo utiliza las propiedades biológicas de la bacteria del suelo Agrobacterium sp. para introducir el ADN foráneo. En el caso del Laboratorio de Ingeniería Genética Aplicada del CIMMYT se utiliza la transferencia directa por bombardeo de partículas de tungsteno mediante un acelerador de partículas. La transferencia directa por medio de partículas de tungsteno es una

I ~ técnica novedosa que se desarrollo recientemente, y se trata de la introducción de I ADN en la célula mediante la utilización de microproyectiles a alta velocidad como

transportadores de ADN, las moléculas de ADN, atrapadas dentro de las partículas de tungsteno, son disparadas a la célula mediante un acelerador de partículas.

En el caso del Laboratorio de Ingeniería Genética Aplicada del CIMMYT se pretende introducir genes de resistencia a insectos y herbicidas a las plantas de maíz creando plantas transformadas, por lo que se trabajan conjuntamente varias técnicas, como la de manipulación de los insectos para realizar las pruebas necesarias en callos y plantas transformadas, la técnicas de biología molecular para identificar si el genoma de las plantas bombardeadas realmente tienen los genes de nuestro interés, y la técnica de cultivo de tejidos para la extracción y mantención del material de trabajo.

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FOTO . Campana de flujo laminar con el acelerador de partículas para realizar el bombardeo.

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CONCLUSIONES

La técnica de cultivo de tejidos a partir de embriones inmaduros de maíz como se a analizado en el presente trabajo, es una técnica con varias aplicaciones en distintos campos, en este caso dentro del campo de la investigación concretamente la linea de investigación del CIMMYT resulta una técnica básica para el mantenimiento del material transformado, que en un futuro podría generar importantes aportaciones a los problemas de este grano básico en países del tercer mundo.

El laboratorio de Ingenieria Genetica Aplicada del CIMMYT, a enfocado sus investigaciones en el bombardeo de genes especificos para la resistencia a insectos y herbicidas, con lo que se pretende mediante la novedosa técnica del bombardeo y el cultivo de tejidos, obtener plantas transformadas, con resistencia a insectos y herbicidas, todas estas técnicas aplicadas al maíz y el trigo. Todo lo anterior con buenas perspectivas para el futuro de estos cultivos.

La técnica de cultivo de tejidos apartir de embriones inmaduros de maíz, es una técnica que como se a expuesto, sigue los planteamientos basicos del cultivo de tejidos, mas sin embargo, se pueden observar algunas modificaciones y adaptaciones importantes que han requerido de varios ensayos que fmalmente han llevado a el perfeccionamiento de esta técnica hasta adaptarla a los objetivos especificos de este programa de investigación.

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RECOMENDACIONES

En los laboratorios que trabajan con la técnica de cultivo de tejidos se recomienda utilizar maiz subtropical y tropical en las áreas de cultivo de anteras, micropropagación, transformación y mejoramiento de maíz.

La técnica de cultivo de embriones inmaduros de maíz descrita en este reporte utiliza el método de esterilización que usa el laboratorio de cultivo de tejidos del programa de UNDP-Proyecto de transformación de maíz del CIMMYT.

El conocimiento de la técnica de cultivo de tejidos realizada en el laboratorio de Ingeniería genética aplicada, proporciona una base para posteriores trabajos, mejorando, adaptando o ampliando la técnica de acuerdo a las necesidades de cada proyecto.

La tecnica de cultivo de tejidos apartir de embriones inmaduros que se plantea en el presente trabajo, es una técnica que sigue los planteamientos basicos del cultivo de tejidos, pero a llevado varios años el llegar a perfeccionarla y adaptarla a las necesidades y espectativas del laboratorio de Ingenieria Genetica aplicada, por lo que vale la pena mencionar, que aunque paresca una técnica sencilla, todas las adaptaciones y modificaciónes que se le han hecho, han requerido de muchos ensayos antes de concretarse en algo como lo aquí expuesto. Debido a lo anterior algunos de los pasos de esta técnica se mantienen a reserva de la Dra. Natasha Jefa del Laboratorio de Ingenieria Genetica Aplicada para cualquier aclaración.

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ASESOR INTERNO: Biol. Angelica Martinez Bernal. Profesor Asociado 'C' Tiempo Completo. Adscrito al Departamento de Biologia. Area de Botanica.

ASESOR EXTERNO: Dra. Natasha Bohorova. Jefa del Laboratorio de Ingenieria Genetica Aplicada del CIMMYT (Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo).

TIEMPO DE DEDICACION Cuatro horas diarias durante seis meses.

CRITERIOS DE EVALUACION Mediante la entrega de un reporte final.

LUGAR DE REALIZACI~N: En las instalaciones del CIMMYT en el laboratorio de Ingenieria Genetica

Aplicada, bajo la supervición de la Dra. Natasha Bohorova.

LICENCIATURA (S) QUE COMPRENDE: Licenciatura de Biologia.

NUMERO DE PARTICIPANTES: Uno.

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BIBLIOGRAFIA

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