m148.206.53.231/tesiuami/uam20346.pdf · 2021. 4. 22. · alfrew minjares carramco 691-94-64 7631...
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J NOKBRE:
TELEFONO:
EIATR1CLIL.A:
m:
CAXRERA :
TRINJ?sIRE:
HRS/SDlANA:
/-I ALFREDO MINJARES CARRANCO
691-94-64
7631 1761
"c b3s Rtc.
BIOLOGIA EXPERIi*fEXTAL
- .11 .. 86-P
I 40
LUGAR DE
REALIZACION: LAB. BIOLkIA MOLECULAR ( S-254 ). UAM-I.
FECHA INICIO:
FECHA TERELINO:
m: /
IS - 04 - 86
20 - 10 - 56
HA. LUISA VILLARREAL O.
PROF. ASOCIADO "C".RESPOXSABLE DEL L4B. DE BIOLOGIA PfOLECULAR. D.C.B.S. IJA,Y-I.
RECAHBIO CELULAR ADEXOEIPOFISIARIO 1): VITRO /-
-- TITULO:
e, 1
TUTOR d II * L h W
R ECAHB I O
.
I
j a de las dilermtea f8-s dol p~pgraua p o M sor íntegrada an un
oonooimimto general de l a biologf8 d. 18 bipdf id. anterlor quo
poárá sor apiícadn posteríomenta 81 mejor edtpdi. y tratiniento
de lu neoplasiu y otras manífestaaionoi pato16gí-8 de a d 8
dikiaaa.
MATERIALES Y METODOS.
I. Material Blolbglco.
Se utlllzarh ratas Wlstar macho para eliminar las varla-
ciones del ciclo estral, de 2 meaes de edad (* 300 grs) . quai serán sacrificadas por decapitaclbn en grupos de al menos seis .
indivlduoa,
A todas las ratas eacrlflcadas se les extrae de manera
estéril la hlpbflsls anterior (adenohlpbflsls), colocando lau
glándulas en medio 199.
Se utillzarh ashlsmo células glandulares de adenomas provl-
nlentes de pacientes Intervenidos qulrórglcaiente en diferen-
tes Instituciones.
!
11, Diapersibn Celular.
La dlepersl6n de las cklulas glandulares se llevar6 a
cabo de la slgulente manera: ( e )
1 a) DlsDeralbn nechniear Laa glándulas obtenidas se colec-
tan con una jeringa y se paean a presida por una aguja de 25 am
X 16 mm, con lo que se obtienen fragmentos giandiieres pequeiSos
b) DlsDarslbn Bnzimbticar Los fragmentos glandulares sa 1
dispersan a su vez lncsbhndolos en una solucibn de Trlpslna- I
EDTA (0.25-0.025 % en SSBH) a 37W por f 60 min. Se resuspenden
con plpeta Pasteur y se centrlfugan a 1000 rpi durante 10 Pin. I
Al botbn celular resultante se le retira el sobrenadante
y. por medio de centrifugaclones a 1000 rpm 10 i ln , se lava dou
veces con ai-199 complementado (+l.
111. Cultim Celular.
Deapu6a de 1s diepereidn s e ouenta e l ndnicnu, celular por
medio del heaocitbmetro y se determina e l poroentsje de viabilidad
mediante tincidn v i ta l con azul tripan. ik acuerdo a l o obtenido - --
6 se ajaata e l vo l ben p.n obtener UM denaidad de 10
bles por ml. de Y 4 9 9 oon?lenentado y sembrar en plaaas &ti-
posos.
aire y 55 de GO2
0610, via- , *
c * E l cultivo se anticne s 37OC en una atiPd8fen d. 958 de
r ” oon humdnd uturante.
I .
r ” 11 IT. Autorndio(prffa,
r: i.
PUe8tO que i1glI O8 PdnOtroa de l a t&cnloa autorr.bio&-
fica que se preclean ~r6cticmente por ensayo y error (10) - 0.- pecfficazente loa tienpoi de pulao, lamdo J expomicibn - debm
ser ida datewdnados para nuestras condicione8 experimentales
r - i.
F’ i espeoffiaci8. aquf -0610 sa indican l o s lineadentoe generalem do
cba, 68ta e. rWl iHt
a l Aprodmsdauente 72 hre. dempu&s do haber aeabrrido l a s C’ i
c61ulas se aiiade Finídina trit iads (%-Thy) a1 hedio de cultivo
haeta lograr una ooncentnicidn eepeoffiu. n tiempo que permne-
ce e l marcador en e l mepodio es e l llamado “pul iOm I durante 61 1s
satbstancia radioactiva pueda ser inOorpor6di a IS8 o&lulas.
r-
L
F I i
P
L-
?- h (+) E499 + 2.5% FCS + 10% h e r o de Caballo + Antibibticos.
r-
Ill) Fi jado en Fi jador X0á.L (Z.A.) -1- 4 a n .
ir) Lavado en agria deatlleda(T.A.~ --- 10 mln.
Finelmente lam c&iulaa quo proaenten =roa so anei iun
observando 1.0 lam2aillaa a l microooopio 6ptico y a l do contrar
to do faaea a vario0 aumentan.
un lavado a 1.0 o(l1iilaa. con e1 i l n de que oe ollmtnon 1.8
mol&culam niaroadra que no fueron fnoorponidao oovalantemonto. S.
l l eva a cabo OllmiMndO e1 nmdlo rndloaotlvo y 8diCl@~11dO medio
H-199 con un ex00.6 da %'%&din8 "fria" ( no mrorida). En eata mor
dio ae Incuban durant. un deti-rdnado tiempo, en lam mlemai oon-
diolonem que lam da aultlto ( N 0 C , 95$ alro, 5% C02 1,
c) Pomteriormonte aa deaprenden le8 a&lulaa de1 fondo del
poso Incubando aan soluoldn de Pcipsína a l 0.25% an 538 a 37OC
durante 1 min . üeipuii se centrlfuga a 1000 r p ~ 10 mln y ae
lava con moiuoi6n MUM brlanowda.
d) Ian c6lulaa ma f i j a n con una mesda de Etanol-Aoldo Ac6-
durQnte 10 min y a* fi jan a l a flanu a un portaobjotaa. tloo 3:l
e) lai prepamoionem a0 oubron en oaclu.ldad sumorp;i&ndolam
en ennilmI6n K o W R'R)-2 fundida a 10°ü y oe maatfenon la.@ en
rofrlgeraoidn. E l tiempo quo d u o esfa e x ~ o d c l b n do l a emulaídn
puede Variar d. 2 iOmii.8 a rilgWlOü mO6e#.
f) Al oabo do l a expoaleidn lam lsmlnlllaa ae rovolan de 1.
siguiente manera:
i) Bafio revelador Bodak Dokt01 111 en agua a ~ O O C --- 2 a n .
1.55 a 2ooa --- i o a e b
il) Bafio de paro an a y . o doido ao6tico a1
. ,
- ", . .." _- I
c
-
c
V. Identiflaaci6n y Controles.
Para poder identificar l o s tipos celulares hlpoiisiarios
l a presentes en l i s laminillas que se iM1iCan. se ut1lir;ará
-tinaión poliCrbmla8 de.uTolladm en e l laborstorlo de Eiologfi
L'oleeular de 18 U U C I (25).
Como cblulas control en l a aUtO~diOgI 'Bf f8 se uttilíaann
013lulets de rnldula ósen de nit. debido a rm alta t a w de reaam
blo, Estas a6iuias
37°C y en atmdufem aon humedad ciatarante de 95% aire- 5% COZ . sedn cultivadas en E499 COmplaUIerIhbo, a
VI. Comentario+
El presente proyeoto Ir4 acompabdo de up. rerisidn bi-
b l logr i f loa aonrriante a i o l a g o de todo el desarrollo d e l
ibmm. Unn vet obtenidos l o s remaltidos. se cuantlfioarán y
nnallsar(Ln con a1 fin de integrar la lniornsclón 7 l l egar a
l a s conclualones pertinentes.
I. e s o r i t u m de1 trabajo erriari directamente revisada J
aseaorada por l a X. en C. María idam v 1 1 1 8 d .
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NOiBRE :
TELEFONO:
PiATRICüLA:
CLAVE :
CABRERA :
TRIPIESTRE:
HI1S/S7Ei4NA :
LUGAR DE REALIZACION:
FEcfiA 1;EICIo:
FECKA TERNINO:
ALFREW MINJARES CARRAMCO
691-94-64
7631 1761
. f
DIOLOUIA EXPLKCXEXTAL
86-P
40
-a _:
LAB. BIOLRIA HOLECULAR ( S-254 )a UAM-I.
18 - O4 - 86
20 - 10 - 56
1.21. LUISA VILLARREAL O.
PROF. ASOC1.m "C".RECFOP!SAELE DEL LAB. DZ BIOLOGIA NOLECULAB. D.C.D.S. Ubi-I.
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c AUTORRADIOGRAFIA E CELULAS ADENOHIPOFISIARIAS
EN CULTIVO -
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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA - IZTAPALAPA.
AUTORRADIOGRAFIA 2 CELULAS ADENOHIPOFISIARIAS
- EN CULTIVO
Informe Final de Servicio Social
Alfred0 Minjares Carranco. . Biología Experimental.
Matrícula: 76311761.
Gracias a todad aquellas personas que , de un modo
u otro , me han ayudado a llegar hasta este punto ;
especialmente a m i s padres , que tanto me han apoyado siempre.
L -
, 1 . .- TNTR O DU C CIO N i-
4 r. A N TEC EDE NTES
._ 9 I MATERIAL Y METODOS
9
10
i _. Material Biológico
c - Dispersión Celular *__
I"
-í
11
12
cultivo celular
RadioinrnunoanáZisis I
12
15
A utorradiograña * -
.- Observaciones Microscópicas
L . RESULTA DOS 17 . r* A deno rn as
rl.
1 7 '
Evolución in vitro
Secreción de PRL
A utorradiografia
18
18
19
22 DLSCUSION
. 26 C O N CL U S O N ES
27 -- C O MENTA RIOS
r .
28 FIGURAS Y TABLAS -. . . . r.
53 BIBLIO G R A R A L-
F -
1 /
I
. ' 1 . R ESU M E N .
. . . .
- ..
_-
AUTORRADICGRAFIA DE CELULAS ADENOHIPOFISIARIAS
EN CULTIVO . .
_.
. .
INTRODUCCION.
Ya que las unidades elementales de los seres vivos son las células
podríamos considerar que l a expresión esencial de la vida se encuentra com-
prendida en el ciclo vital de éstas.
Los diversos factores que controlan a nivel molecular el grado de
reproducción celular son aun poco conocidos. La mayoría de los investiga-
dores concuerdan en suponer que existe al menos un punto de "compromiso" en
el ciclo celular: si tal punto de restricción es rebasado, la célula se ve
I1 comprometida" a continuar con todo el resto del ciclo; en caso contrario,
el ciclo se detendrá precisamente en ese punto (35, 57). Aun cuando los
inecanismos específicos que determinan a nivel subcelular la consecución o no
del ciclo no han sido dilucidados, se sabe que ciertas condiciones provocan
la producción de señales por dichos mecanismos en sentido de arrestar a las
células; como ejemplo tenemos la limitación de nutrientes esenciales o de
factores dycrecimiento en el microambiente celular, así como la presencia
de pequeñas cantidades de inhibidores de síntesis protéica, o bien, la ca-
rencia de espacio para extender la población [inhibición por contacto] (35,
60, 63). Experimentos realizados in vitro manipulando esos factores apuntan
hacia la conclusión de que el punto de no-retorno principal se encuentra en
la fase G , ya que pr6ticamente en toaos los casos de arresto celular se
halla en las células una cantidad de DNA pre-replicativa (63). Ocasional-
mente una célula se detiene en el periodo G2 , pero este es un punto de res-
.
.
1
1 ~ . " -
, ., -~
! . .
. -. .... ..
- 2 -
tricción secundario usado infrecuentemente (57,63). Se dice que las células
que han sido arrestadas se encuentran en G Ó en G dependiendo de cuál
sea el punto de restricción utilizado (*l. O1 O2
- A su vez, la duración de la fase G1 se encuentra bajo un control
muy flexible que permite alargarla o acortarla según sea requerido (62).
La principal diferencia entre las células que se dividen rápidamente y aque-
llas que l o hacen lentamente es el tiempo que tardan dentro del período G
(35,62,63). l'
Un buen número de proyectos en biología celular se encuentran en-
caminados a descubrir cómo actúan l os mecanismos de regulación del ciclo
celular. La investigación sobre dichos mecanismos ha desembocado en el
desarrollo de un campo individual de la biología: el de la Cinética Celular.
Una técnica por otedio de la cual es posible determinar las carac-
terísticas de la cinética de desarrollo de una población celular dada, es la
autorradiografía. (8.16,34).
La autorradiografía utiliza el "rastreo" de substancias marcadas I
radiactivamente por medio de un material fotográfico (emulsión o placas)
sensible a l o s decaimientos radiactivos (9,10,24.43,59).
La prinera autorradiografía de un material biológico fue hecha por
Lacassagne y col. en 1924 (22). En un principio se le combinó con el micros
copio Óptico, alcanzando muy poca resolución; pero la técnica ha ido per-
feccionándose y díversificándose de modo que en la actualidad, combinada
-
I
con el microscopio electrónico, puede lograrse una rsolución de hasta lOOOAQ
(12J3.27) y existen muy diversas formas y materiales para llevarla a cabo
I 1 i (9,12.43.47).
('1 Cf. J. Sans, s a . (1980). Biol Cellulaire. -:95-104.
- 3 -
Aunque hoy en día exist.en métodos bioquímicos para el conteo de
decaimientos radiactivos, la técnica autorradiográfica, además de presentar
una sensibilidad potencial mayor, presenta la ventaja sobre aquellos de que
c s posible estudiar la incorporación de precursores etiquetados en el tejido -
o las células intactas (34.62). Es precisamente esta ventaja la que hace
tan Útil la técnica en la determinacih de los paránietros de la cinética
celular. 3 La adición de timidina etiquetada ( H-Thy) a. un cultivo celular
conduce al marcaje de todas aquellas células que se encuentran en fase S
durante el tiempo de aplicación de la marca ("pulso"). Determinando la ra-
zón de las células inarcadas con respecto a todas las células de la población
se obtiene el Indice de Marcaje (LI), que es una estimación de l a actividad
proliferativa de esa - población ceiular particular (34,42,62). Siguiendo la
entrada de las células marcadas en las subsecuentes mitosis es teóricamente
posible determinar otros parámetros celulares por medio de el método del
11 Porcent aje de Yitosis Etiquetadas" (PLM), como se indica sucintamente en
la íig. 1 (8,16,42). Este método ha probado ser muy Útil y es el más usado
en estudios cinéticos. aunque en la práctica se presentan a veces di.ficulta-
des - problemas en la identificación de mitosis, declinación de la calidad
autorradiográfica y/o aumento del "ruido de fondo", por ejemplo - que difi-
cultan el análisis de los estudios y su extrapolación a otras poblaciones
celulares (42,62).
- 4 -
ANTECEDENTES.
La iiipófisis, o Pituitaria, es una glándula endócrina que descansa
en una depresión del Esfenoides, la "silla turca", en la base del cerebro,
al cual se eiicuentra unido por el tallo infundibular.
Es posible distinguir al menos tres partes diferentes en la glán-
dula: el lóbulo posterior.0 Neurohipófisis, un lóbulo intermedio a modo de
tabique -"Pars 1nterioedia"- y el lóbulo anterior o AdenohipÓfisis.(64).
La glándula es aplanada en su superficie superior y alargada en el plano
transversal; sus nedidas pronedio en el humano son de 1.3 cm (transversal)
por 1.0 cm (sagital) por 0.5 cm (vertical); de ella, aproximadamente el 75%
corresponde a la hipófisis anterior.(64).
A pesar de su pequeño tamaño. la Adenohipófisis elabora 7 hormonas
diferentes - FCH, PRL, LH, MSH, GH; ACTH Y TSH - ,controlando centralmente
el ambiente hormonal del organismo (65). Los transtornos que sufre reper-
cuten en toda la econonía, de ahí su importancia biológica y médica, y la
relevancia de l o s estudios que sobre ella se hacen. Son de especial impor-
tancia las manifestaciones neaplásicas de esta glándula. (que no sólo afectan
endocrinológicaacnte al individuo, sino que pueden llegar a provocar trans-
tornos por coapresión de estructuras adyacentes), tanto por su frecuencia de
aparición como por la dificultad existente en su diagnosis y tratamiento
(17,531. . Aunque Leblond y i*!alker clasificaron a la hipófisis anterior como
un Órgano sin renovación celular (25 ) , estudios autorradiográficos posterio-
res mostraron que, aunque baja, existe una incorporación de 3H-timidina
dentro de los 'nÚcleos de las células adenohipófisiarias normales de rata
i .. . . .. J
- 5 - i I
i -- in vivo (31), pudiendo más bien clasificarse entre los Órganos "estables de
baja proliferación como el parénquima hepático o el renal" (13).
Mastro y col. (20,21,33), por una parte, y otros investigadores
(7,52), por 'otra, encontraron que ciertas condiciones experimentales, como
variaciones en la duración del fotoperíodo y la castración, modificaban la
tasa de incorporación de 3H-timidina en la glándula, sugiriendo mecanismos
neuroendócrinos que pudieran estar involucrados en el control de su recambio
celular.
Por otro lado, estudios diversos hechos sobre pituitaria de rata
en cultivo de órganos (1,19,38) han demostrado que los diversos tipos celu-
l a r e s presentes en ella mantienen su estado diferenciado in vitro al menos
I ~
durante los primeros días de cultivo. Del mismo modo, diferentes autores ~
hafi encontrado que las células de los tumores de pituitaria humana mantienen
su funcionalidad in vitro a corto (28.38) y a largo plazo (26,39,40), habieg
do sido establecidas, incluso, líneas tumorales funcionales de adenohipóf i-
sis humana (37,38.44).
No obstante la gran cantidad de estudios,autorradiográficos (14,
15,48) y de otros tipos (29,45), que se han realizado y se siguen realizando
sobre la hipóiisis anterior, la gran mayoría de ellos van encaminados al
estudio de rutas metabólicas o procesos bioquímicos hormonales en tanto que con escasos todavía los conocimientos sobre algunas características esencia-
l e s de la biología de las células adenohipofisiarias, tanto normales como tuuorales. Son poco conocidas aun, por ejemplo, las l í neas de diferencia-
ción que dan origen a las diversas estirpes celulares presentes en la glán-
dula, así como sus índices de proliferación, la duración de sus ciclos y
los factores y mecanismos que regulan estos procesos (.64,68). La escasez de
- 6 - ,. ,
dicho conocimiento limita l o s alcances del tratamiento médico que se pueda
dar a enfermedades provocadas por neoplasias hipofisiarias, que en la actua-
lidad sólo pueden ser controladas pero no "curadas"(11,17,53): "actualmente,
las aproximaciones terapéuticas corrientes (radiación, cirugía y tratamiento
iaé6:co) están dirigidas a aliviar los efectos compresivos locales y/o las
consecuencias sistémicas de la hiperfunción pituitaria. Por tanto, todas
ellas deben ser consideradas como terapias ad juntas más que definitivas"(53)
E1 panorama se complica al comprobar que l os tumores adenohipofi-
siarios se distinguen por presentar enormes variaciones entre s í y grandes
diferencias clínicas, no sólo entre l os diferentes grupos endocrinológicos
sino también dentro de un mismo tipo hormonal.
Es factible admitir que dicha heterogeneidad morfológica y funcio-
nal es el reflejo de variaciones en los parhetros biológicos de las líneas
celulares presentes en la glándula. que, como se ha dicho, son aun escasa-
mente conocidos. Es, por ejemplo, un hecho aceptado que en ciertos tumores
el p. ' t rÓn de ploidía del DNA nuclear puede ser relacionado con la malignidad
del tunor (3). En el Único estudio que con este enfoque conoceinos, hecho
sobre neoplasias hipofisiarias por citofluoro!netría en cultivo de Órganos,
Anniko y col. no halleron una clara correlación entre el patrón aneuploide
tumoral y e l grado de proliferación celular, aunque sus datos sugieren que
e l porcentaje de células en fase S podría ser un indicio de la agresividad
del tumor (3.4). u..
e- La aparición de tumores, en general, constituye una de las causas L
principales de transtornos fisiológicos graves yfo muerte en todo el mundo
( 3 9 , 4 4 , 6 3 ) . Ec , por tanto, una tarea fundamental determinar cÓn10 y porqué
F el control normal sobre la reproducción celular se desvía en algunas ocasio-
L nes. ;\To obstante, para entender esta pérdida de control es necesario cono-
c
I
I
* _ .
/,.. - 7 -
I , "
. ,. . . l cer virtualmente cada aspecto del desarrol lo celular, no sólo en caso de
anomalías sino también en e l de l a s cé lulas riornales, pues para entender -. ...I
cuál es l a f a l l a en e l sistema de control es necesario conocer cómo e l sis-
tema oprera 'normalmente: "Es e l estudio de a 5 o s estados, el normal y e l
-. ariormal, a través de l os prograims ¿e investigación que comparan uno con
_.I otro, l o que puede ser más f ruc t í f e ro que e l solo estudio de l estado anormal
_<
en s í mismo" (63). De ahí l a relevancia de determinar e l índice de etique-
ta j e , e l índice rnitótico, l a fracción pro l i f e ra t i va y l a duración del c i c l o
celular en poblaciones celulares, normales y/o anormales, en las que dichos
paráinetros se 6esconozcan.
En estudios hechos sobre tunores di ferentes a l os pi tui tar ios t a l
t i p o de estudios ha podido hacerse por medio del anál is is de l a incorpora-
ción de t h i d i n a t r i t i ada i n vivo ; en tmores sólidos, sin embargo, l a
tC-cnica .es aplicable sólo a l a s células individuales -- i n v i t r o (36). Hasta
donde sabemos se carece de estudias autorradiográficos con este enfoque
sobre neoplasias hipof is iar iac.
De acuerdo con l o anterior y l levados por l a idea de que l o s mode-
l os de estudio .- i n v i tro (cuyas ventajas han s ido expuestas por nuestro mismo
grupo de trabajo antriorniente [is]). pwden ayudar a dilucidar cómo se CO-
rrelacionan l o s parámetros biológicos con l a s manifestaciones c l ín icas de
Ins iieopl.asias, hemos estudiado l a incorporación de 3H-timidina a l DNA d e
células dispersas de adenomas h ipo f is iar ios en cul t ivo de te j idos por medio
d e 'autorradiografía. al mismo tiempo que seguimos de manera concomitante e l
patrón de secreción de PRL a l medio. ut i l i zándolo simplemente como un índice
de funcionalidad celular bajo l a s condiciones en que se mantiene e l cultivo.
En e l presente reporte se exponen l o s hallazgos de este estudio,
de naturaleza básica, que se enmarca dentro de un programa interdiscipl ina-
r i o más general sobre l a Biología Celular de l a Adenohipófisis que se ha
venido realizando en e l laboratorio de Biología Molecular de l a UAM-I en
coordinación con otras instituciones, corno son e l Inst i tuto de Investigacio-
ncs Biom6dicas de l a UNAY, e l hospital 20 de Noviembre de l ISSSTE y e l des-
aparecido Centro Médico Nacional de l I1.ISS.
i
L
- "
.. HATERIAL Y l,ETOD(3s.
Material BiolÓkico:
a) Para obtener cé lulas control para e l cul t ivo se ut i l izaron
l i ipó f i s i s de rata, a s í como f ibrobl~astos de mesenterio y / o médula Ósea de
rata - por presentar un a l t o recambio celular - cono controles para e l
proceso autorradiográfico.
de ovario de hhs t e r chino (células "CHO") obtenidas a través del doctor
Alfonso González del IIEl de l a UNAM.
Se emplearon con estos f ines también células
Las ratas uti l izadas fueron machos, para ev i ta r l a s variaciones
que pudiera provocar e l cic1.0 estra l , de l as variedades Iv'istar o Long-Evans
y de aproximadaiaente 300 grs de peso. Los animles fueron sacri f icados por
decapitación en grupos de a l 'menos s e i s individuos para, posteriormente.
extraer l a hiphfisis anterior de manera e s t é r i l por renoción de l os huesos
par ieta les y occipi ta l y da l a inasa encefhlica. Las glándulas se colectaron
en medio 199 compleinentado para después proceder a dispersar sus células
(ver 1;,5s sdelante). Los fibrobl-astos se' obtuvieron por iiiedio de l a extrarir:-
ción estéril y posterior dispersión de l o s mesenterios, mientras que l a s
cé lu las de médula Ósea provinieron de l os féaures y fueron colectadas d i -
rectoiiiente en e l medio de ci i l t ivo.
b) E l material b io lógico humano se obtuvo en los hospitales 20 de
Sovicmbre, Instituto Nacional de Neiirología y e l Hospital General del Centro
1,lbdico >!aci.onal. Constó de 32 edcnonas hipof is iar ios, de l o s cuales sólo
pudieron cultivarse exitosaxente 16 casos. Todas l a s neoplasias fueron
extraídas quirhgicamente por v ia transesfenoidal, principalinente, o frontal
y col.ectadus de :vanera e s t é r i l en un reci.piente con medio de cultivo. A
P par t i r de esta colecta algunas porciones se destinaron para su observación
microscópica. Un nÚnicro variable <'e fragmentos txnor.iles fueron procesados
, L
r.
k
1 ii I
-
-10 -
para su cult ivo (in monocapa como se describe en seguida.
Dispersión Celu lar : - Se- l l e vó a cabo de acuerdo a l a metodología adaptada por e l grupo
de trabajo del laboratorio de Biol.ogía ?lolecular de l a U.Ql-I descrita previa
iiciite (18), de l a siguiente nanera:
a) Dispersión Xecánica: Las glándulas colectadas se lavan con
soliición salina balanceada de ihnk (SS3H) y se disectan inicialmente con
.p inzas en punta y agujas de 25 X 16 m para separar l a h ipó f i s i s anterior
de l o s restos sanguíneos, ncurohipofisiarios y d e t e j i do conectivo que p u d i e
:m ex is t i r . Luego se corta e l t e j ido adeiioliipofisiario en fragmentos de
aprox. 1 pun con ayuda de dos bistur ís encontrados. Todo e1l.o se rea l i za
en una caja de ? e t r i conteniendo c:edio de cul t ivo es té r i l .
2
b) Dispersión Enzii?Stica: Los pque5,ns fragiiicntos glandulares se
colocan en 5 m l de una solución de Tripsina 0.25%- EDTA 0.025% en SSBH y
se incuban a 37QC durante un t i -npo,to&l de 60-90 min.
Cada 15 niin se r e t i r a e l sobrenadante y se colecta en un tubo de
centrífuga. aiiadiendo un volÚmen de medio de cul t ivo igual a l de l sobrena-
dante retirado; a l t e j i do no disperso se añade o tro volÚ.ien de Tripsina-UTA
se rcscspende 1 inin con pipeta Pasteur y se incuba nuevamente a 37QC. Una
vez que se ha dispersado todo e l t e j i do h ipo f is iar io , se centrifuga l a sus-
pensión celular a 1000 rpm durante 10 m i n y e l botón resultante se lava cop
aedio de cult ivo, resuspendiéndolo fi~ndr;.ente e n 1 Ó 2 m l d e éste.
En l o s casos en que se usaron f i b f ob lus tas de neseñterio l a sus-
pensión celular se obtuvo dispersando los ncsentcrjos en igual forma.
I
*.
r
- ll -
Cultivo Celular: ..
Despuks de l a dispersión se cuenta e l número céli.lar por mdio
de una cámara inejorada de Neubauer y se determina l a v iabi l idad mediante
t inción v i t a l con Azul Trípano d e l s iguiente !nodo: se toma suspensión celu-
l a r con una pipeta de 'Thorns hasta l a x irca "0.5" y liiego Azul T r í p a n o hasta
l a marca "11" ; se ag i ta durante 1 min y se l l e va a l a c&aara de Xeubauer
(después de descartar l a s primeras 5 gotas), contando a l microscopio sobre
l a cuadrícula externa.
E1 níinero t o t a l de células está dado por l a fórmula
II't = 0.4(D X NC X V t )
r-n donde ?It = número t o t a l de células; V = dilución ( e n fste caso 1:20);
Nc = núm,-ro proxxi io de células contadas, y V t = volúnen t o t a l de l a sus-
p:."s:iÓii (61). De xvc rdo a l nú i x r o obtenido se ajusta e l volÚnen para obte-
ncr una densidad de 5 X 10 5 células v iables por m i l i l i t r o de suspensión.
E1 nadio d e cu l t i vo ut i l i zado fue M-199 (Microlab) 2n todos l o s
CBSOS, excepto ci2 e l de I ~ R S células C!I0 cn que se u t i l i z ó medio esencial
m i n i m 0 (PlDf.Gibco). En aiabos casos e l medio se conpleiiientó con 20% de suero
f e t a l d 2 ternera (Nicrolab), 1% de L-glutanina (MicrolaS) y 0.1% de Ant ib ib -
t i cos (5000 U1 Pfnicil ina-5 iig "strcpt~!:icii?a/inl. Nicro1::b).
Se sembraron 0.5 Ó 1.0 r n l de suspensión celular en cada uno de
3 Ó 4 pozos de cajas de plást ico e s t é r i l e s (sup: 2.1 cm . Linbro), sembrando
un pozo "hermno" con células control por cada pozo con células h i p o f i s i p
rins. La d e x i d a d de l a s cé1ul.a~ control fue de 2.0 X 10 céls/ml a l momen-
t o de l a sierzbra.-
2
5
Los cul t ivos se incubron en todos l o s casos a 37°C en una atmóc-
fera de 95% COZ, 5% O
tes períodos que osci la ion entre una y cira'iro semanas.
y humedad a saturación, y se mantuvieron por diferen- . 2
c_
c .
I
i
!
- 12 -
Radio inmünoangx: I t I i 1
En e l caso de l a s cé lulas tuaorales, cada tercer día e l inedio de
19s pozos fue colectado y almacenado a -40 W para l a posterior deterinina-
cióii d e PRI;por radioinnunoanálisis (KIA ) y fue sustituido por medio 199 i I
I !
I do reactivos de un equipo comercial (Anersham) y medio de cu l t i vo completo ,
I
co.ipl? lentado fresco.
La hor:nona se ensayó por e l método del doble anticuerpo, util izan- 1
como blanco de reactivos o como diluyente. Estos ensayos se realizaron en
e l laboratorio d,? Endocrinología Comparada del IIBN (UNAM) . I
._ Aiitorradiogra_:
A tiempos que vari.aron en torno a l 7? d í a de cult ivo, se marcaron
las c6l:il~as hipof is iar ias y sus re.sspectivos controles con :I-tiriidina (?!u-
clear Corp. In.;act. esp. 12mCi/33ol), adicionando ésta hasta alcanzar l a
concentración deseada en e l pozo de cult ivo. Se probaron t res concentra-
ciones diferentes: 2.5 uCi/ml , 0.1 uCi/rnl y 0.05 uC i/ml , por ser l as
3
reportadas en l a l i teratura (32,15). 1
Se ensayaron, de l misio modo, l o s tiempos de piilso radiactivo de.
0.5, 12. 24, 45 y 72 horas.
i í
Despubs del p l s o radiact ivo se rea l i zó un lavado con ;.I-199 " f r ío"
I
- ! (no radiactivo) de 10 min a 37 "C y o t ro con SSBH. Posteriormente se cose-
charon l a s cé1ul.a~ añadiendo 0.5 ;il de. solución de tripsina-EDTA a cada pozo.
e incubando durante aprox. 2 min (hasta observar a l micro.scopio l a separa-
ción de l a s células de s u sustrato), se pipet& l a suspensión y se co1ect.Ó
en un tubo de ctntrífuga con 3 ml d e M-199. Se centrifugó 10 min a 1500 rpm
y los botones SE! f i j a ron lentafiiente y con agitación en metanol-&)do acét ico
, . - 13 -
3:1 . E l f i jador se mantiene durante 30 irin de manera i n i c i a l y luego se
dan bafios de 10 i-iin hasta que salga claro.
. .
Las células f i j adas se gotearon sobre portaobjetos limpios ge lat i -
nizados y se' secaron a l a flama.
Las priizxacioncc se ciiIiri-.ron COR
a cualquiera de l a s dos tbcnicas siguientes:
3~sj~bn fotográf ica de acuerdo
a) Técnica de inmersión ("dipping"):
Se iitil i.:-u ei-:;ilsí&n actorradioyhfica NTY-2. Fsta viene ge l i f i ca -
da dentro de una bote l la de pl.i?stico que se col~oca en un baño M?ría a 40 *C
hasta f u n d i r e l gel (usual. te h5-50 nin).
Se v ier te li.iit.uiiente un p c o de eiulsi.Óii f u n d i d a en un recipiente
pequeso de plástico ( f i g 2), se diluye 1:l con agua destilada t i b i a y se
mznt iene en bario' !íuría a 40 QC dtirmte a l mnos 20 nin para permitir l a
sal ida de burbiijas.
para conprobar que ya í10 haya espuma.
Se puede introducir un portaobjetos l i np i o , s in c&lulas
' Se introducen, lriitaneiite y con movi.niento uniforíiie, l os porta-
objetos de dos en .dos -unidos por sus revcrsos- en e l recipiente plást ico
con enulsión, se sacan de i gua l aodo y se col.ocan en posición ver t i ca l , de-
j.5jiiIolos secar 6 u r z n t e v2ri-s ior,?s. h a V ~ Z secas l as preparaciones se
colocan en una caja estanca a l a luz j u o t o con sobres de sílica g e l como
desccante. (9, 41, 43).
b) T6cnica d e mondado ("stripping"):
Se u t i l i za enulsión autoiradiográfica .4i3.10 , que viene en forma
de película adherida a un 'soporte d e v idr io , con l a superf icie sensible del
lado opuesto a t a l soporte.
Se cortan rectángulos de pel ícula del tamaño adecuado para cubrir
l a laminilla.
para ev i tar que pequefias chispas e léctr icas velen l a emulsión.
E 2 corte debe !cicerse con una navaja de manera f i r m y lenta
Los rectángulos de pel ícula se ponen a f l o tar durante 2 min en
un recipiente con agua entre 28 QC y 30 QC, con l a superf icie sensible de l a
e!.iul~siÓn hacia abajo. La 1.aniii;i.ll.a a cubrir se ?;i;rodiice en el agua forman-
do un ángulo de 45" con l a svper f ic ie y con e l l a se recoge e l rectángulo
de emulsión f lotante de Bodo que cubra a l a s células.
Lrs preparaciones se invierten iii~iedi~atamente despuSs dc sacarlas
del agua y se colocan verticalmente para dejarlas secar durante varias horas
Una vez secas, se colocan en una caja a prueba de l u z junto con sobres de
desecante. (9,24).
Las preparaciones autorradiogrAficas elaboradas por cualquiera de
estas t&cnicas pueden ser "regeneradas" para disminuir e l n ive l de "ruido"
a l expoierlas a vapores d e peróxido de hidrógeno, que oxida l a plata metá-
l i c a que exj~sta inicialmente en l a emulsiÓn.regenerando l o s cr i s ta l es de
haluro ¿e p l a t a , siguiendo e l riiftodo descrito a continuación: se colocan
t res papeles f i . l t ro de taaaiio adecuado e n e l fondo de una caja para. t inción
y se enpapan con una solución de peróxido de hidrógeno a l 3% ; ].as l a m i n i -
l l a s s'e colocan en una r e j i l l a para t i x i o n e s y se introducen en l a caja,
sin que entren en contacto con e l agca oxigenada. La caja se tapa hernéti-
camente y l as laminil las se conservan a h í a temperatura ambiente -durant$
10--12 hrs.
y se guardan en una caja oscura con desecante. (IO).
Después de este tiempo l a s laminillas se extraen, se d.ejan secar
La caja con preparaciones se almacenó a 49C para exponer l a enul-
s i & a l marcador radiactivo. La baja temperatura ayuda a d i sminu i r los
- 15 .-
! i . ,,
-_<
c
I.
artefactos producidos por l a interacción quínica entre e l especííien y l a
eiiiulsión y reduce e l tiempo de exposici6n (10,41). E l periodo de exposición
debe ser determbado ernpiricainente para l a s condiciones experimentales par-
t iculare~s de cada laboratorio; cil nucstro caso, se eiisayaron diferentes t i e 2
pos d e exposi~ci~bn lincicndo prcparccioncs con c6lul.a~ d e inédula &;ea y con
cé1ul.a~ hipof isiarius de l - i t u marccdüs con 0.1 i iCi/rnl durante 24 horas y
revelando duplicados de cada t ipo ce lular a l a s 3, 4 , 5 y 7 senanas. De
i s l a 1 foraa, se cubrieron y revelaron por t~r ip l icado lmj f i i l las s i n células
cono control del "ruido de forido".
E l revelado de l o s autorradiogranas se l l e vó a cabo en todos l o s
casos de acuerdo a l~as instruccioncs de l fnbricxnte:
Baño Revelador Kodak D-19 1:l 2 nin a 15°C (NTB-2)
o bien, Kodak D-19 sjn d i l u i r 5 lain a 20°C (AR.lO)
Bafío de paro con S O desti lada 30 scg ?I l8QC 2
Baño Fijador Kodak
Lavado con H O desti lada 2
5 m i n a 18°C
3 nin a 18% (2 veces)
e l proceso se l l eva a cabo sin agitación, en un cuarto oscuro con luz de
seguridad roja ( f i l t r o !!kitten ?!o. 1). Las l ~ n i n i l . l a s deben mntenerse a
I cisperatura an!~ientc aiitcs d e l 1-evcl~ado <!uraiite 2 Ó 3 hrs y ,dejarse secar
después del proceso en un lugar l i b r e de polvo. (24).
Observaciones Kicroscópicas:
Las observaciones de l a s células en cul t ivo se hicieron en l a s
placas multipozos con un invertoscopio (Seiss.West Gemany) a lOOX y 400X,
en canpo c laro y en contraste d e fases.
Las preparaciones fueron observadas y fotografiadas en un micros-
> --- I
c ión e identi f icación bajo e l microscopio electrónico de transmisión . procedimiento fue real izado en e l hospital 20 de Noviembre del ISSSTE.
Este
* .
I
- 16 - r ,
P-
*.__
.--.I I
. . i . ! . j
sumen en l a s tablas I-A y I-B. 'En je l lq
l o s pacientes varió desde 25 hasta 66 ai?< i ' :
ambos sexos y que las manifestacionesi c l í $ ' . i l o s casos pudo documentarse' hiperpr4acti , ,
t i n a circulante es de alrrededor d e 25 ngi
Las tablas 11-A y 11-B ' reduken
. . . -
, ,
l a observación microscópica de corte6 de
resultaron ser cromófobos a l microscbpio i
ción AYE, excepto l o s casos 10 y 12 que pt
A l microscopio electrónico de t t
8 Prolactinomas. (casos 2,j.i.q
presentar células redonileadas, con gr$nul$
nm de diámetro y RER muydesarrollado 
- 18 -
2 Adenomas Mixtos GH-PRL (casos 1 y 12). La fig 8 muestra uno de
esos tumores como se observa al microscopio Óptico. Pueden apreciarse nu-
merosas células cromófobas con islotes de células acidófilas.
El patrón de creciniento in vivo de la riayor parte de los adenoms I
fue sinusoidal, presentándose un patrón de crecimiento sólido en los casos
2, 6, 7 , 1 1 , y 14 (tablas 11-A y 11-B).
Evolución In Vitro:
Después de la dispersión del material neoplásico se obtuvo, en
todos l o s casos, una viabilidad superior al 85%. Puesto que el número de
fragmentos procesados en cada caso era diferente, se obtuvieron diferentes
cantidades de céliilas, que variaron entre 1.25 X 10 5 6 y 2.0 X IO . No podemos hablar propiamente de un "patrón de crecimiento" ~
vitro de las células twnorales, no obstante, en prácticamente todos los
tumores estudiados la evolución del cultivo presentó estadios sucesivos muy
semejantes; éstos van desde células dispersas y cordones celulares, en el
inicio, hasta aglomerados celulares en forma posterior; finalmente se obs-
va - a l rededor del 1OQ día de cultivo - un aumento en número de ciertas
células scmcjantes a fibroblastos o a células de tejido conectivo. Esta
evolución en un caso típico se observa en las fotografías de la fig 9.
SiicreciÓn de Prolactjna:
Los patrones de secreción individuales de PRL al medio de cultivo
de 8 de las neoplasias estudiadas, obtenidos por medio del radioinnunoanáli-
sis, se muestran en. conjunto en las gráficas de las figuras 10 y 1 1 . Los
casos no ilustrados no presentaron niveles significativos de esta hormona en
~
Autorradiograf $a:
a) Duración de l Tulso:
Los resultados obtenidos a part i r de l a s
pruebas con diferentes tjempos de pulso se resumen en l a tabla 111. En ésta
e l número de cruces indica e l grado de narcaje obtenido, entendido como una
combinación del número de gránulos por núcleo - siempre superior a 20 gráng
los/núcleo - con e l porcentaje de células marcadas (+ = menos del 5% de
células marcadas y pocos gránulos por núcleo; f+tt = más de 30% de células
inarcadas e incontables gránulos/nÚcleo). S i bien los f ibroblastos se marcan
desde e l primer tiempo de pulso, las células h ipo f is iar ias sólo hasta que se
les incuba 48 Ó 72 hrs con e l isótopo radiactivo. Se decidió adoptar e l de
-1 I -
-- 19 -
el ciedio (excepto en e l caso 12, di.agnosticado como adenoma mixto, que pre-
sentó 40 ng/ml de PRL en e l 59 día d e cultivo). Los casos i lustrados co-
rresponden, en general, a l o s diagnosticados como Prolactinomas a l microsco-
pio electrónico; no obstante, es conveniente resaltar que e l caso 6 corre?
ponde a un Ade:!ioina de Células Mulas y que 1.0s casos 13 y 14 no presentaron
en l o s pacientes hiperprolactinemia (cf . tablas I-A y I-B), s in embargo &
secretaron nive les s ign i f i cat ivos de PRL i n vitro.
Como es posible apreci.ar,cada tumor muestra un patrón de secreción
particu’lar; aunque en todos los casos ex is te una tendencia decreciente en
l a l iberación de PRL a l medio, l a funcionalidad de l a s células es evidente
durante l a priniera semana y, en uno de l o s casos, incluso hasta e l d í a 23
de cult ivo. La mencionada disminución en l a secreción de PRL a el medio
coincide en e l tiempo con e l aumento de células semejantes a f ibroblastos
descrito en l a sección anterior. Este hallazgo ha sido ya reportado por
e l grupo de Biología Molecular de l a UAM-I anteriormente (18).
- 20 -
a. 48 horas por ser más corto y no presentar mucha diferencia con el de 72 hrs.
L.
r- L c-
b) Dosis:
La fig 12 muestra los resultados de ensayar las 3 dosis
encontradas cn 13s referencias: 2.5 ( 3 2 ) , 0.1 (15) y 0.05 (") uCi/ml de
3H-timidina. Flnalrrente se optó por ésta Última dosis por considerar que el
número de gránulos por núcleo era más fácilmente descernible y que scría
meaos dniiina para el naterial yenftico, ale:&s de representar un ahorro en
el material radiactivo.
c) Exposición:
Las fotografias de la fig 13 muestran los resultados
de exponer la emulsión a las células narcadas durante 3, 4, 5 y 7 se2anas a
4°C. Se consideró que una exposición de 4 semanas era la Óptima en cuanto a
definición de gránulos y nivel de "ruido" (gránulos inespecíficos), ya que
en la 3* semana, si bien el nivel de ruido no es alto, no se aprecia aun una
clara maduración de los gránulos de plata provocados por la marca radiactiva
en tanto que a las 5 y 7 semanas el nivel de ruido es tan elevado qiie obsta-
culiza la distinción de l a marca en las cflulas. I ! . I
I
- I
C., Así pues, de acuerdo con l o anterior, se adoptaron las condiciones 1
h.. 3 de 0.05 uCi/ml de H-timidina durante 48 hrs 'a 37OC y exposición de 4 sena c*
nas a 4°C para realizar l o s autorradiogranas de los adenomas hipof isiarios
humnos cultivados. I L,
c ,.
- , (*) Biol. Angeles Aguilar. Biología Celular, U M I . Coínunicación personal. . ' 1
~ - ,
- 21 -
Los resutados de los estudios autorradiográficos practicados sobre
H-timidina corresp.DE 3 los tumores mostraron que en ellos la incorporación de
di6 a menos del 5% de células marcadas en todos los casos - excepto el caso 12 que presentó ? 7% de células marcadas - ello no obstante el aumento
de c&l.ulas "fibroblastoides" mencionado.
Las células control presentaron un porcentaje de células en fase S i I 1 de entre el 35% y el 37.9%.
Algunzs fotografías de los autorradiogramas de adenomas y contro-
les se muestran en las figuras 14 y 15, mientras que las figuras 16 a 19
exhiben las gráficas individuales de liberacijn de PRL al medio junto con el
índice de marcaje correspondiente a cada turoor.
l' i
En los autorradiogranas de adenomas no fue posible diferenciar
unos tipos celulares de otros con'plena certeza, debido a que las tinciones
policrónica y Hematoxilina-Eosina son eliminadas por el proceso de revelado
fotográfico -si se aplican antes del cubrimiento con emulsión- o bien, si
se aplican después. son retenidas en exceso por la nisma emulsión autorradio
i gráfica, produciendo artefactos por sobretinción. Se encontró que la técni-
ca de Feulgen aplicada antes del cubrimiento es Útil para teñir los nkleos
celularzs, aunque el revelado diminuye su intensidad.
d
.1
,
-22 - i i
DISCUSION.
Como se mencionó previamente, diversos estudios (7,13,20,21,31,33)
han mostrado que e l de l a hipóf is is anterior, si bien no es un tejido con
una población celular estática y sin r'enovación como afirmaban los primeros
investigadores, s í puede considerarse coino un tejido con recambio celular
bajo. Los resultados que obtuvimos a par t i r de l a s pruebas de pulsos y ex-
posiciones concuerdan con este concepto, pues en cualquiera de las circuns-
tancias experinentadas las células de adenohipófisis normales de rata mos to
ron una incorporación de 3H-timidina muy baja. Estos resultados podrían
estar influenciados por l a edad de l o s animales utilizados(32) y es probable
,
' I
I I I i que se obtengan índices de incorporación más elevados con animles más jóve-
nes, s i bien éstos podrían pr,esentar variaciones muy grandes debido a su
misma inmadurez.
Conconitanternente, nuestros resultados muestran que las células de
adenomas humanos no presentaron un a l t o recambio celular bajo l as condicio-
nes de cul t ivo en que se nantuvieron.
En su trabajo citofluorométrico con 47 tumores hipof is iar ios,
Anniko y col. (3.4) encontraron que podrían c l as i f i ca r l o s en tres t ipos
di ferentes: en e l primer t ipo (17% de su muestra, de l o s cuales e l 37.5%
eran prolactinomas) se encuentran l a s neoplasias con un recambio celular
menor a l 5% ; el segundo t ipo (70.2% de su muestra, de l o s cuales e l 63.3%
eran tumores GH Ó GH-PRL) presentó un recambio entre e l 5% y e l 10% ; f i n a l -
mente, el tercero y menos frecuente (sólo 6 de l os casos, de los cuales 5
eran tumores GH Ó GH-PRL) correspondió a l o s tmores con más de e l 10% de
células.en fase S.
Es posible que los. tuinores cultivados por nosotros pertenezcan a l
L
c r - L
c r
en fase S. Esto está en
mixto GH-PRL, caso 12, d i c e de etiqueraje &:el
resto de nuestra muestra. No aun en nuestros re-
sultados una clara correlacib
y las tasas de proliferación e
hallazgos clínicos previos.
cómo influyen' los factores, h i
lógico, 'sobre ,el grado de r
partir de observaciones hec
St. Michael en Toronto; Can
de .algunos otrqs reportes
factores que pueden provoc
y/? la . posterior reinicia;
tumores.
con el 1 resultad$ del . , ) i
'i , I - $
estas últimas
ar en consideracih
eral 41 entorno endocrino-
corno j parece aconsejable a
de patología del hQspita1
' .
i
de :u. estado quiescente
Para estudiar 1 e$ necesario apaiizar
.. - , 24 , -
r.3
-..
F '1 Por otro lado, aun cuando l o s patrones de secreción de PRL obteni-
dos son muy variables. puede afirmame que el estado diferenciado se mantie-
ne en nuestros cultivos, ya que existen células secretoras, al menos durante
la primera .senana.
i"
C I
.. .. -.,,
i otros autores (33,371.
C . La variabilidad de los patrones de liberación de PRL in vitro
Estos resultados son compatibles con lo reportado por
- .. refleja la variación que se presenta en las manifestaciones in vivo, aunque
m b a s no presentan una relación dirccra y proporcional. . ",
*-.
El hecho de que algunos tumores secreten PRL in vitro y no in vivo
(cesos 6,13 y 14) y de que en general la liberación en cultivo sea superior
a la liberación in vivo, puede explicarse por la ausencia del factor inhibi-
dor de la secreción de prolactina hipotalámico (PIF) en l o s cultivos (37).
c-
L..
Y
L,
La coincidencia entre I'a disminución de la secreción de PRL y el
aumento de células semejantes a fibroblastos había sido reportada ya por
nuestro grupo de trabajo en relación a células adenohipofisiarias normales
de rata (18). Este hecho hallado también ahora en células tumorales humanas
abre lugar a- nuevos planteamientos: ¿Qué sucede con l as células epitelioi-
des de la glándda?, ¿se mueren o se vuelven no funcionales?. El . hallazgo
se ha presentado no sólo en nuestro laboratorio sino también en el de el
Dr. Kovacs (comunicación personal), quien ha sugerido que las células adeno-
hipofisiarias en cultivo sufren en ocasiones una "desdiferenciación", adop-
tando morfologías semejantes a células de tejido coriectivo. Tal observacióp
c r-
b
C"
L,"
F'"
b,.
P 'I
L.
C .
c-
C"
se encuentra también apoyada por otros autores que han encontrado que cier-
tas substancias alteran la morfología de l a s c&lulas de la pituitaria (56)
o que proponen incluso una rediferenciación hacia células semejantes a neu-
ronas (30).
r-
..- ' * - Por tanto cabe pregun.tar si ocurre una proliferación de células L..
r.
- 2 5 -
de t e j i d o conectivo 6 si l o que se observa después de l a primera senana
corresponde en realidad a células "redif erenciadas". Para resolver ta l es
preguntas quizás sea necesario seguir otros marcadores celulares además de
l o s hormonales.
C c c L E f c c c c c c c
' C I- i.
para marcar células adenohip
en tanto que 4 semanas a 4 autorradiogramas en l a s cond
- Los 'adenomas . .
nuestras condiciones de cu l t i vo (me
resultados quizás se vean modiflcado factores hjPtalámicos. i
,- as nebplasias e
heterogeneidad morfológica ' y
por los diferentes patrones de., sepe nque no exis
re f le jada 9 vitro
: , i
clara relación entre l a s :ma cas Y él' cc&orkGie
.~ , .
tu i tar ia , e+ nece-
- Aunque Sa t éc
f ieación de íos t ipos C ~ I
sari0 modificar y optímiz
zar la apropiadamente sobr
F . ,
n de pode2 u t i -
. .
'- Dado que nuestra mente de iprolac-
con . , e l Ijropósi- !:
ndocrinohgica.
~.1 ' : ~1
dos de ident i f icación con mayor gra
El presente trabajo ha d
y 1985) en l o s congresos de l a Soci
gía. , ,
Agradezco l a ayuda que p 1 ' j
brindada en l o s laboratorios que. trfibaja ; i
especialmente a l o s grupos de' trab4jo ?I de Endocrinología Comparada de l IIB$, . . , ; . ~ di , t o r i o de Patología y Micoscopia .EJ&tr/6
, . : . ,
ISSSTE).
. -
if iabS
en a
:icans .)
r onsequción de! este trabajo '+e fue
n en coordinación con e l nuestro,
Dr. Carlos salverde (Laboliatorio
) y del Dr. Ignacio FQl ix &bora-
ca del hospital 20 de Woviembre,
B i
..
:. . . . ..
... . _._*".."
-28 -
FIGURAS 1 TABLAS
I _"- I r
M 1 G2 1 S t G l
0000000 - (a) I P u l s o de 'il-Thy
Sólo se narcan l a s I células en fase s.
Lavado e incubado cn medio sin marca
I - - - - - -
(b)
I
100%
O
z E-2
. I
H
I i'S 20 HRC.
! I l l
5 . 10
- 29 -
FIG. 1
Es posible medir algunos par&
metros del c i c l o celular s i se
"rastrean" las células de una
población asincrónica (a), que
han sido marcadas con un pulso
de t inidina t r i t i ada (b) , a 10
largo de l a s fases sucesivas.
E l tiempo de "retraso" entre
e l t i e q o en que se da e l pulso
y l a aparición de l a primera
mitosis marcada (c) es igual a
l a duración de l a fase G 2 .
Graficando e l porcentaje de
mitosis etiquetadas que aparecen
en función del tiempo se pueden
determinar las duraciones de l a s
otras fases del c i c l o celular (d).
[Hodificadas de Alberts, B.; gJG&
p. 616 (58) ; y de Maurer-Schultzc
p. 14 (3411.
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FIG. 2
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Reactivo de S c h i f f 30'
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I 2 1 H O c o r r i e n t e 5'
Tinci.Ón de Feulgen. TinciÓn iIyE.
PIG. 3
1 - 7 1 - 32 -
Azul de Alizarina 4' 1
Verde Brillante l''(X3) [i Ac. Fosfonolíhdico 30' I
I 4
I Etanol 70% + Ac. 1
TinciÓn Policrómica.
FIG. 4
l"(X3) Fosfonolibdico 0.5%
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Etanol 95% 5' I
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Etanol 100% 5'
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A D E N O M A DE CELULAS NULAS
FIG. 7
I
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FIG. 9.
L
r- L
FIG. 9. (cont.)
E V O L U C I O N IN VITXO ( Caso 15) : A los 2(a), 5 (b), 7 (c).
12 (d) y 15 (e) dias d e cultivo. La fotograh e n (f) ,muestra
fibroblastos d e mesenterio de rata
CURSO TEMPORAL DE LA SECRECION DE PRL
AL MEDIO DE CULTIVO
X : Caso 3
O: Caso 4
6: Caso 6
0 : Caso 8
I I I I I . 1
5 10 15 20 25 30 .
DIAS DE CULTIVO
FIG. 10.
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CJ
4
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O
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-.42 -
SECRECION DE PRL AL MEDIO (cont)
: Caso 9
+ : Caso 13
4 : Caso 14
: Caso 15
I 1 I
5 10 15
DIAS DE C U L T N O
I
20 1
25
FIG. 11.
- PULCU (WS) iúlRC.4 FIEKOB. ¡<ARCA HIPOF.
___ ________----I__-
- 0.5 +
- 12 + +
- 24 + + +
48 + + + + +
72 . + + + + + +
TABLA 111.
DOSIS : 0.05 uCi/ml (a). Q.5 uCi/ml (b). y 2.5 uCi/ml
de ’H-Thy en rnédda ósea de rata.
FIG. 12.
- .*- I
- 45 -
( b ) [ 1000 X ]
( a ) [ 1000 X ]
( c ) [ 1000 X..]
EXPOSICIONES: 3 (a). 4 (b) y 7 (c) semanas en céliilas
hipofkkrias de rata.
FIG. 13.
L,,.
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- 46 -
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A UT0 R R A D I O G R A M AS A D E N O M AS H U M A N OS a 1000 x ]
( ia marca se persenta menos intensa y en menor núme-
ro de células . [ Cf. fig. 15.1)
I
FIG. 14.
( a ) [ 1000 X 1
( b ) [ 1000 x ]
A U TOR R A DIO G R A M AS C ELU LAS C O NTR O L
( Mkdula ósea (a) y fibrobiastos (b) )
. .
FIG. 15.
%-
- 47 -
- 48 -
[ 1000 x ]
I 1 W X l
CELULAS CONTROL marcadas en diferentes
etapas del ciclo celular.
FIG. 15. (cont). .
-
- .. . . . .
LI = 3.1
l l l 1 1 l l l l l l I l 1 l l l l ~ ' ' 10 15 20 Días de
c.
.... CASO 3
c.
Cultivo
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. * l Cultivo LI
c
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