Revista Enología N° 4Año III Setiembre-Octubre 2006

Se conoce la existencia de cepas de levadura que producen toxinas que resultan inhibitorias para el desarrollo y metabolismode otras levaduras. Sobre esta base de conocimiento y sobre los conceptos del control biológico, se busca la utilidad de estacaracterística particular con un enfoque beneficioso, que se constituya en una herramienta para la enología. Con este propó-sito este trabajo evalúa el efecto de levaduras con característica killer sobre levaduras cuyo accionar resulta perjudicial parala calidad del producto vino.

It's well known the existence of yeast strains that produce toxins with inhibitory effects on other yeast metabolism and deve-lopment. According to this and the biological control concepts, the utility of this special characteristic is looked for, to genera-te a beneficial tool for the enology. Based on this purpose, this work analyses the effect of yeasts with killer characteristic overother yeast, which activity results prejudicial to the quality of wine product.

LEVADURAS KILLER COMO POTENCIALES AGENTES DE CONTROL DE CONTAMINANTES DE BODEGAS PATAGONICAS

Christian A. Lopes 1,2,*; Marcela P. Sangorrín 1,*; Adriana R. Marongiú 1 y Adriana C. Caballero 1

1Departamento de Química, Laboratorio de Microbiología y Biotecnología, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional delComahue, Buenos Aires 1400 (8300) Neuquén, Argentina.2Departamento de Biología Aplicada, Laboratorio de Microbiología Agrícola, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacionaldel Comahue. Cinco Saltos, Río Negro, Argentina.*Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas de la República Argentina (CONICET)

Palabras claves: Pichia anomala, biotipo killer, biocontrol,Dekkera/Brettanomyces

Keywords: Pichia anomala, killer biotype, biological control,Dekkera/Brettanomyces

RReessuummeenn

Levaduras pertenecientes a diferentes géneros habitantesnaturales de mostos de fermentación vínica y superficie deequipamiento de bodegas, han sido asociadas desde haceaños al deterioro del vino debido a los efectos provocadospor las mismas en diferentes etapas del proceso fermenta-tivo. Entre los géneros más ampliamente difundidos estánDekkera/ Brettanomyces productores de etil-fenoles y res-ponsables en muchas ocasiones de la pérdida total del vinoen el cual logran desarrollarse.

Bajo la premisa de que la utilización de cepas de levadurasproductoras de toxinas killer podría ser una herramienta útily efectiva en el control de las especies contaminantes, seevaluó esta capacidad en 10 cepas killer de referencia y 55aislamientos killer indígenas. Las levaduras contaminantesutilizadas correspondieron a las especies Candida boidinii(9 aislamientos), Hanseniaspora uvarum (21 aislamientos),P. guilliermondii (2 aislamientos), Geotrichum silvicola (4aislamientos) y a una especie no identificada (22 aislamien-tos) aisladas de superficies de tanques de fermentación y

toneles de tres bodegas regionales y asociadas con algúntipo de alteración en ensayos de laboratorio. Paralelamentese evaluó el mismo panel de levaduras killer frente a sietecepas de B. bruxellensis de colección. En general, seobservó que las cepas killer no-Saccharomyces indígenasfueron capaces de arrestar el crecimiento o matar al 84%de los aislamientos contaminantes, mientras que ningunade las 30 cepas killer indígenas de la especie S. cerevisiaetuvo esa capacidad. Particularmente el aislamiento 3Mai5de la especie P. anomala, presentó actividad killer frente al71% de las cepas de Brettanomyces y la cepa killer de refe-rencia Kluyveromices lactis var. drosofilarum (K10) fue laúnica capaz de inhibir el desarrollo de los dos aislamientosde P. guilliermondii indígenas. Los aislamientos indígenaspodrían presentar nuevas variantes de las toxinas queresultarían de gran interés tanto en la industria vitivinícolacomo en otras industrias biotecnológicas para el control decontaminantes.

IInnttrroodduucccciióónn

Muchas especies de levaduras han sido relacionadas desdehace años con el deterioro del vino. Este deterioro por partede levaduras puede ocurrir en distintas etapas durante laproducción del vino y puede relacionarse tanto con el des-arrollo de los microorganismos, con la consecuente forma-ción de películas o flóculos, como con la síntesis de altas

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concentraciones de compuestos indeseables como sulfurode hidrógeno u otros volátiles sulfurados, ácido acético,varios ésteres y fenoles volátiles (Fleet, 1998; Du Toit yPretorius, 2000). El almacenamiento de los vinos previo a suembotellamiento, que ocurre tanto en tanques de fermenta-ción como en barricas o toneles, es un momento crítico parael desarrollo de levaduras contaminantes.

Tanques de fermentación o barricas incompletos son hábi-tats ideales para el desarrollo de levaduras oxidativas odébilmente fermentativas productoras de películas ensuperficie usualmente pertenecientes a los génerosCandida y Pichia (ej. C. boidinii y P. membranifaciens). Estaslevaduras se han sociado a contaminaciones relacionadascon una higiene inadecuada de los establecimientos(Stratford, 2006). No obstante, los vinos pueden también serdeteriorados por especies fermentativas de los génerosDekkera, Zygosaccharomyces, Saccharomyces ySaccharomycodes. Sin dudas, especies del géneroDekkera (anomorfo Brettanomyces) representan el mayorproblema asociado a levaduras en la industria vitivinícoladebido a la producción de compuestos fenólicos volátiles(Loureiro y Malfeito-Ferreira, 2003). Trabajos recientes tam-bién relacionan a la especie Pichia guilliermondii como posi-ble responsable del deterioro del vino debido a su capaci-dad de producir una alta cantidad de compuestos fenólicosvolátiles en ensayos de laboratorio (Dias et al., 2003;Martorell et al., 2006). Estudios en desarrollo están tratandode elucidar si esta especie debería ser tenida en cuentacomo una levadura contaminante peligrosa en la industriavitivinícola.

Muchos métodos de control han sido propuestos para pre-venir la contaminación del vino con levaduras haciendo par-ticular énfasis en los géneros Dekkera/ Brettanomyces; entreestos métodos se incluyen una adecuada higiene de labodega, el sulfitado, y la filtración. Sin embargo, estos pro-cesos pueden no ser muy efectivos particularmente duranteel añejamiento de los vinos. En la búsqueda de nuevasestrategias de control, algunos autores han sugerido la utili-zación de cepas de la especie S. cerevisiae seleccionadas ogenéticamente manipuladas portadoras de actividad killerfrente a levaduras contaminantes particulares (Shimizu,1993; Du Toit y Pretorius, 2000). En este contexto, la búsque-da de levaduras killer productoras de toxinas capaces deinhibir el desarrollo de estos microorganismos indeseablesse vislumbra como una posibilidad interesante en enología.De hecho, toxinas de las especies P. anomala y K. wicker-hamii han sido recientemente propuestas para el control deDekkera/ Brettanomyces (Comitini et al., 2004) mientras quetoxinas de K. phaffi han demostrado ser útiles en el controlde levaduras apiculadas de los géneros Kloeckera/Hanseniaspora (Ciani y Fatichenti, 2001).

Con el objetivo de desarrollar un eficiente sistema de biocon-trol basado en interacciones killer, se evaluó la capacidad de10 cepas killer de referencia y 55 aislamientos de levaduraskiller indígenas de inhibir el crecimiento de levaduras relacio-nadas con la producción de efectos indeseables aisladas desuperficies de bodegas de la región Nor-Patagónica(Sangorrín et al., 2005). Paralelamente se evaluó la sensibili-dad de cepas de B. bruxellensis de colección frente almismo panel de levaduras killer. Finalmente, se detectó unaislamiento killer indígena perteneciente a la especie P. ano-mala con un amplio espectro killer frente a levaduras conta-minantes particularmente frente a cepas de B. bruxellensis yuna cepa de referencia de la especie K. lactis var. drosofila-

rum con actividad killer frente a los aislamientos de P. gui-lliermondii.

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Levaduras killer

Se utilizaron 55 aislamientos killer indígenas (25 no-Saccharomyces y 30 S. cerevisiae) y 10 cepas killer de refe-rencia (siete no-Saccharomyces y tres S. cerevisiae) (Tabla 1).

Levaduras contaminantes

Se evaluó la sensibilidad killer de 58 aislamientos de levadu-ras indígenas pertenecientes a cinco especies provenientesde superficies de tres bodegas Nor-Patagónicas designadasen este trabajo EP, DV y HC (Figura 1). Asimismo se evaluóla sensibilidad de 7 cepas de colección correspondientes ala especie contaminante B. bruxellensis.

Todos los aislamientos evaluados mostraron capacidadpotencial de producir algún tipo de alteración en vinos deacuerdo a ensayos previamente realizados a escala delaboratorio (Tabla 2).

Sensibilidad killer

La sensibilidad de cada aislamiento fue evaluada frente a lascepas killer indígenas y de referencia, enumeradas en la

Tabla 1: Identidad y origen de las levaduras killer usadas eneste trabajo.

Tabla 1. La evaluación de la sensibilidad killer se realizó porinhibición de crecimiento en placas de Agar YEPD-MB (g l-1:extracto de levadura 10, glucosa 20, peptona 20, agar 20,azul de metileno 0.003) amortiguado a pH 4,5 con buffercitrato-fosfato y adicionado con 0,003 % de azul de metilenocomo lo describe Sangorrín et al. (2001). Se realizaron sus-pensiones de cada levadura indígena (108 células/ml) y 0,1ml de estas se sembraron como césped en la superficie delmedio de cultivo. Se dejó secar y a continuación se sembra-ron estrías de las levaduras killer. Las placas se incubaron a28ºC durante 72 hs.

Cada aislamiento indígena evaluado se consideró sensiblecuando alrededor de la estría de la cepa killer se observó unhalo de inhibición de crecimiento, generalmente acompaña-do por un halo azul de células muertas. La ausencia del halode inhibición indicó resistencia del aislamiento a la toxina. Unaislamiento fue considerado neutro (N) cuando mostró resis-tencia a todas las cepas killer ensayadas. Los experimentosfueron realizados por triplicado.

Resultados y discusión

Con el objetivo de seleccionar cepas killer capaces de lle-var a cabo un biocontrol de cepas contaminantes indíge-nas, se evaluó la sensibilidad de 58 aislamientos de leva-duras contaminantes obtenidas de superficies de equipa-miento de tres bodegas Nor-Patagónicas y pertenecientesa las especies C. boidinii (9 aislamientos), G. silvicola (4 ais-lamientos), H. uvarum (21 aislamientos), P. guilliermondii (2aislamientos), una especie no identificada (22 aislamien-tos) y siete cepas de B. bruxellensis de colección (Tabla 2)frente a un panel compuesto por 10 cepas killer de referen-cia y 55 aislamientos killer indígenas pertenecientes a dife-rentes especies (Tabla 1). En general, en este trabajo se

observa que la actividad killer de las cepas y aislamientosdel panel mostró variabilidad entre aquellos aislamientoscontaminantes pertenecientes a una misma especie, conlo cual se aprecia el carácter cepa-especifico del compor-tamiento killer.

En cuanto a la actividad killer de las cepas de referencia, losespectros más amplios de acción -osea la capacidad deinhibir el desarrollo de un mayor porcentaje de especies con-taminantes- los presentaron las cepas Saccharomycescerevisiae (K1), K. lactis (K10), Williopsis saturnus (K9) yambas cepas de P. anomala (K5 y K8) (Tabla 3). No obstan-te, sólo dos de las 7 cepas de B. bruxellensis y ningún aisla-miento de la especie G. silvicola presentó sensibilidad aalguna de esas cepas killer (Tabla 3). Los dos aislamientosde la levadura contaminante P. guilliermondii presentaronsensibilidad únicamente frente a la cepa de referencia K.lactis var. drosophilarum (K10). Esta especie contaminanteha sido previamente detectada en fermentaciones vínicas enla región Nor-Patagónica y potencialmente relacionada conel aroma fenólico de los vinos resultantes (Lopes et al., 2006enviado), con lo cual, podría ser una levadura contaminantede gran relevancia en la región si se llegara a comprobaresta influencia negativa en el vino.

En relación a los aislamientos killer indígenas evaluados,ochenta y cuatro porciento de los mismos correspondientesa especies no-Saccharomyces fueron capaces de matar oarrestar el crecimiento de alguno de los 58 aislamientos con-taminantes evaluados (Tabla 3). Por el contrario, ningún ais-lamiento indígena de la especie S. cerevisiae mostró capa-cidad killer frente a las cepas contaminantes (Tabla 3). Estodemuestra el espectro restringido de acción de la/s toxina/sproducidas por la especie S. cerevisiae con respecto a lasotras especies killer, e indicaría que un cultivo iniciador per-teneciente a esta especie con capacidad killer, y sin modifi-caciones genéticas, no sería suficiente para combatir laslevaduras contaminantes en bodegas.

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Figura 1: Localización de las 3 bodegas estudiadas (DV, HCy EP) en la región Nor-Patagónica (Región Vitivinícola SurArgentina). Zonas en gris oscuro: áreas cultivadas. Adentro:Sudamérica- Argentina- Patagonia. Fuente: InstitutoNacional de Vitivinicultura, Argentina.

ESPECIES(Número deaislamientos)Candidaboidinii(9)Geotrichumsilvicola(4)Hanseniasporauvarum(21)Pichiaguilliermondii(2)Especie noidentificada(22)

Brettanomycesbruxellensis(7)

Tabla 2: Levaduras contaminantes utilizadas en este trabajo yefectos perjudiciales detectados en ensayos previos(Sangorrín et al., 2005).

Por otra parte, únicamente los aislamientos indígenascorrespondientes a las especies P. anomala y P. kluyverifueron capaces de inhibir el crecimiento de G. silvícola y lohicieron en alto porcentaje (75% en todos los casos). En par-ticular, el aislamiento 13 correspondiente a la especie killer P.anomala (3Mai5) mostró el espectro más amplio de activi-dad killer y fue capaz de combatir el 71% de las cepas de B.bruxellensis (Figura 2). Este resultado concuerda con repor-tes previos donde se menciona el amplio espectro interge-nérico de la toxina killer de esta especie (Magliani et al.,1997). Debido a la capacidad de inhibir el desarrollo de unamplio rango de microorganismos no emparentados, laactividad de la toxina killer de P. anomala ha atraído enorme-mente la atención (Magliani et al., 1997; Schmitt y Breinig,2002). Se ha reportado el uso de esta u otras especies delmismo género de levaduras en el biocontrol de levadurascontaminantes en diversas industrias alimenticias talescomo la producción de aceitunas en salmuera (Llorente etal., 1997; Santos et al., 2000), y más recientemente para elbiocontrol de B. bruxellensis en vino (Comitini et al., 2004). Eneste trabajo, los cinco aislamientos de B. bruxellensis quemostraron sensibilidad al aislamiento indígena P. anomala3Mai5, fueron sin embargo resistentes a las toxinas produci-das por las cepas de referencia de la misma especie. Elcomportamiento killer del aislamiento indígena 13 de P. ano-mala frente a las especies contaminantes, diferente alobservado en las dos cepas killer de referencia de la mismaespecie, podría indicar la presencia de una nueva toxinakiller en poblaciones indígenas de la especie P. anomala(Figura 2).

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Tabla 3. Sensibilidad killer de los aislamientos indígenas provenientes de las superficies de equipos de bodegas y de cepas deB. bruxellensis frente a levaduras killer indígenas y de referencia.

a)

b)

Figura 2: Espectros de actividad killer de levaduras pertene-cientes a la especie P. anomala frente a las contaminantes debodegas Nor-Patagónicas. A: cepas de referencia K5 y K8. B:aislamientos indígenas 13, 14, 15 y 16.

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Caracterización a nivel de cepas

Debido a que tanto la sensibilidad killer como la producciónde efectos enológicamente indeseables fueron variablesdentro de cada una de las especies estudiadas, se evaluóla diversidad intraespecífica de las levaduras con el objetivode encontrar una relación entre la identidad al nivel decepas y los efectos causados por los aislamientos. Comométodo de caracterización se empleó el biotipo killer, esdecir los perfiles de sensibilidad frente al panel de cepaskiller. Las diez cepas killer de referencia utilizadas en estetrabajo fueron propuestas como panel de levaduras killer envarios trabajos científicos para la taxonomía de levadurasbasadas en los perfiles de sensibilidad (Vaughan-Martini etal., 1996; Boekhout y Scorzetti, 1997; Sangorrín et al.,2002). En este trabajo, se utiliza un nuevo panel de levadu-ras que incluye a representantes de especies que no estánincluidas en el panel de referencia (K1- K10) y que permiti-rían tener resultados más exhaustivos en estudios de sensi-bilidad de diferentes aislamientos, tanto para análisis dediversidad como para control biológico de distintos microor-ganismos (Tabla 4).

La relación entre el número de aislamientos y el número deperfiles obtenidos, demuestra que las especies más diver-sas resultaron H. varum y la especie no identificada, mien-tras que la que menor diversidad intrespecífica mostró fueG. silvicola (Tabla 5). Las especies de levadura H.uvarum/K. apiculata son habitantes comunes de las etapasiniciales de los procesos de fermentación vínica, superficiede uvas y de equipos de bodegas en la región Nor-Patagónica (Lopes, 2004) y de muchas otras regiones pro-ductoras de vino en el mundo (Schutz y Gafner, 1993; Torijaet al., 2001; van Keulen et al., 2003). Aún cuando el creci-miento controlado de estas especies de levaduras en losestadios iniciales de la fermentación se ha asociado con unimpacto positivo sobre la complejidad química y la calidadsensorial de los vinos, su capacidad de producir elevadosniveles de ácido acético las convierte en levaduras poten-cialmente relacionadas con el deterioro de los vinos (Cianiy Maccarelli, 1998; Zohre y Erten, 2002). En este trabajo, el38 % de lo de los aislamientos de H. uvarum presentó unperfil de sensibilidad neutro (N), es decir ninguna cepa killerdel panel fue capaz de inhibir el crecimiento de los mismos(Tabla 4). Este resultado se corresponde con estudios pre-vios realizados en nuestro laboratorio en los que se eviden-cia un alto porcentaje de cepas neutras en las poblacionesnaturales de H. uvarum en la región Nor-Patagónica(Sangorrín et al., 2001), lo cual sería una desventaja si sedesea controlar a esta especie utilizando como herramien-ta la actividad killer.

Adicionalmente los resultados de la caracterización a nivelde cepas muestran que en general, dentro de la mismaespecie las cepas productoras de efectos enológicamenteindeseables son las mismas dentro de cada bodega, perono coinciden cuando los aislamientos provienen de distintasbodegas (Tabla 4).

En resumen, todas las especies contaminantes evaluadasen este trabajo fueron combatidas en mayor o menor pro-porción por alguna de las cepas killer utilizadas en este tra-bajo en ensayos en placa. La selección de la cepa killer a uti-lizar dependerá de la cepa contaminante a controlar. En par-ticular, el aislamiento killer indígena 1 de la especie P. ano-mala y la cepa de referencia K. lactis var. drosophilarum(K10) podrían utilizarse en el biocontrol de cepas de B. bru-xellensis y P. guilliermondii respectivamente o frente a otraslevaduras contaminantes de relevancia regional, una vezevaluada la actividad de las toxinas en condiciones de vinifi-cación.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Universidad Nacional delComahue por medio del proyecto I-117, y el CONICET pormedio del subsidio 1104/04 y la beca postdoctoral otorgadaa C.A.L.

Tabla 4: Número de cepas (N) de las especies aisladas debodegas según su perfil de sensibilidad a diez cepas killer dereferencia (K1-K10) y las 25 aislamientos no-Saccharomycesindígenas seleccionadas productoras de toxina killer.

NDLR: Si desea contactarse con alguno de sus autorescomuníquese con enologia@revistaenologia.com

Puede consultar la bibliografía en www.revistaenologia.com

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