INSTITUTO DE BIOTECNOlOGíA

LíNEA 7ACTIVACIÓN Y REGULACiÓN DE LA RESPUESTA INMUNE

7.1 Papel del correceptor C043 en la regulación de las funciones de linfocitos T tanto desde elpunto de vista de 105 mecanismos de adhesión como de transmisión de señales deactivación celLJlar

7.2 Estudio de las vías de transmisión de señal a través de C043. Análisis de 105 requerimientosestructurales de la molécula C043 necesarios para la transmisión de señales de activación

En linfocitos T, la especificidad antigénica estádeterminada por el receptor para el antígeno(TcR). La transmisión y amplificación de las se-ñales de activación intracelulares generadas porla interacción específica del TcR con su complejo[MHC-Agl está a cargo del llamado complejo C03.Además del complejo TcR-C03, las células T pre-sentan en su superficie una serie de molécu-las llamadas moléculas accesorias o correceptorasinvolucradas en regular las fases de reconoci-miento, activación y efectos de los linfocitos 1.La función de dichas moléculas puede ser la deestabilizar la interacción física entre célula T yAPC (adhesión) y/o la de participar en los fenó-menos de activación y transimisión de señal ha-cia el interior de la célula efectora. Entre éstasse encuentran C02, C04, C08, CD 11a/ CD 18,C045, VLA-4, VLA6 y C043.

La molécula C043, también conocida comogpL 115, sialoforina o leucosialina, se expresa enla superficie de todas las células hematopoyéti-cas, excepto en eritrocitos. Si bien la estructurade esta molécula se conoce relativamente bien,poco se sabe acerca 'de sus funciones en lasuperficie de las células linfoides. Sin ser la cau-sa primaria del padecimiento (el gene de C043 seencuentra en el cromosoma 16). se ha descritoque los linfocitos T de los pacientes afectadoscon la inmunodeficiencia de Wiskott-Aldrich(asociada al cromosoma X) carecen de C043 en

su superficie celular, o bien expresan formasanómalas de la molécula. La capacidad de res-puesta de las células T y B de estos individuosestá severamente comprometida, por lo cual,además de una grave trombocitopenia, estospacientes presentan numerosas infeccionesrecurrentes.

PROGRAMA 7.1Papel del correceptor C043 en la regulaciónde las funciones de linfocitos T tanto desdeel punto de vista de 105 mecanismos de adhesióncomo de transmisión de señales de activacióncelular

7.1.a Papel del correceptor C043 en la regula-ción de las interacciones celulares

Debido a su larga estructura cilíndrica (45 nm).es probable que C043 ejerza un papel importanteen la regulación de las interacciones adhesivas delos linfocitos con otras células. Hemos demostra-do que C043 puede interaccionar de una maneraespecífica con C054 (lCAM-l), aunque queda pordeterminar si esta interacción regula la adhesiónde linfocitos T con otras células, o bien si C043tiene, como es el caso de C054, más de un con-trarreceptor. Por medio de un análisis de estruc-tura/función se delinearán los requerimientos

INFORME ANUAL 1994

estructurales necesarios para que C043 funcionecomo molécula de adhesión. Para ello se estángenerando mutaciones a partir del cONA deC043 en la región extracelular de la molécula.Cada mutante se expresará posteriormente enun hibridoma T murino, antígeno-específico, ysu capacidad de regular fenómenos de adhesióncelular con C054 u otros ligandos será evaluada.

- Papel de C043 en la regulación de los fenóme-nos de adhesión intracelular: identificación denuevos ligandos; definición de dominios de laregión extracelular involucrados en dicha fun-ción.

y ROSENSTEIN y G. PEDRAZA

I 994/P/S/DG FM

Oebido a que no existe un ligando activador deC043, y aunque hemos demostrado que C054(lCAM-l) es un ligando para C043, hemos bus-cado otras alternativas para estudiar con mayordetalle las funciones correceptoras de C043.Para ello hemos reemplazado al ligando activa-dor por anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigi-dos en contra de la molécula C043 y/o el TcR, yhemos entrecruzado estos reactivos en la super-ficie de Iinfocitos T. Esta metodología nos permi-tió llegar a las siguientes conclusiones:

a) C043 es una molécula correceptora; es decir,que para transmitir señales de activaciónrequiere de las señales transmitidas por el TcR.

b) Para que C043 desempeñe sus funciones demolécula correceptora requiere de la integri-dad de su región intracitoplásmica y ha deencontrarse en el mismo complejo macromo-lecular que el TcR.

e) Porque se ha reportado que la expresión deC043 es anormal en pacientes con el síndro-me de inmunodeficiencia de Wiskott-Aldrich,estudiamos las funciones correceptoras deC043 en linfocitos aislados de pacientes con

este síndrome. No encontramos diferenciaentre la capacidad de transmitir señal a travésde C043 en las células de los pacientes de Wis-kott-Aldrich, comparada con las células de in-dividuos normales. Por lo que se puede con-cluir que la molécula C043 expresada porestos individuos es funcional, y que su inmu-nodeficiencia se debe a otra alteración mo-lecular.

-C043, un correceptor de linfocitos TG. PEDRAZA, G. HOLLANDER, S. BURAKOFF E Y ROSENSTEIN

1 993/P/S/DGFM

PROGRAMA 7.2Estudio de las vías de transmisión de señal através de (043. Análisis de los requerimientosestructurales de la molécula (043 necesariospara la transmisión de señales de activación

Simular la interacción de una molécula de super-ficie con su ligando reemplazando al ligando porun anticuerpo específico para la molécula desuperficie, ha resultado ser una buena estrategiapara estudiar los mecanismos de transmisión deseñal de diferentes moléculas.

7.2.a Regulación de la fosforilación de proteínasintracelulares a través de la activación mediadapor (043

Los experimentos iniciales se han enfocado aevaluar la actividad de tirosina kinasa analizan-do los substratos cuyos residuos de tirosinasean fosforilados a consecuencia de los proce-sos de activación medidos por C043.

Las células C043+ son estimuladas simulandola interacción de C043 y del complejo TcR-C03con sus respectivos ligandos por entrecruza-miento de C043 y/o el TcR mediante anticuerposmonoclonales. Los resultados preliminaressugieren que la estimulación de los linfocitos Ta través de la molécula C043 modifica los patro-

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGíA

nes de bandas fosforiladas, comparando concélulas control, sin estimular o estimuladas através del TcR. Se proseguirá a identificar lossubstratos que contengan residuos de fosfotoro-sina después de la activación vía CD43.

-Identificación de las vías de transmisión deseñales de activación a través de CD43

v. ICRAS, G. PEDRAZA E Y ROSENSTEIN

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7.2.b Identificación de dominios reguladoresde diferentes funciones en la regiónintracitoplásmica de CD43

Con el objeto de definir regiones involucradasen regular las diferentes funciones de CD43 (ac-tivación celular, adhesión y cambios en la afinidadde la adhesión) se hará un análisis mutacional

de la porción intracitoplásmica de esta molécu-la. Se dispone de un sistema experimental quepermite estudiar la activación de linfocitos T deuna manera CD43-dependiente y CD43-específi-ca. Las diferentes mutantes que se generen en lamolécula serán analizadas en este modelo expe-rimental tanto en lo que se refiere a la capacidadde mediar adhesión con CD54 u otros posiblesligandos, como a la capacidad de transmitir se-ñales de activación.

-Regulación de la afinidad de CD43 por su(s)Iigando( s): anál isis estructura-función

y ROSENSTEIN y G. PEDRAZA

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-Análisis mutacional de la región intracitoplásmi-ca de CD43 estudio de las vías de señalización

G. PEDRAZA, S. BURAKOFF E Y ROSENSTEIN

I 994/S/DGFM/DFCI